（食品科学专业论文）大蒜素的提取工艺研究.pdf

摘要 大蒜素是大蒜中的主要活性成分，是大蒜破碎后，蒜氨酸在蒜酶催化作用下 产生的一种具有生物活性的有机硫化物，具有抗菌消炎、降血压、降i l ：l 脂、防癌 等作用，可用于多种疾病的防治，在临床上的应用也越来越广泛，作为药物或保 健品开发具有广阔前景。 大蒜素的提取方法可以分为三类：水蒸气蒸馏、溶剂提取及超临界流体萃取， 但是采用水蒸气蒸馏得到的提取物中大蒜素含量很低，导致提取物的活性很低。 本文采用单因素和正交实验相结合的方法，研究大蒜素溶剂提取工艺和超临界流 体萃取工艺并确定其最佳工艺参数，采用比色法测定提取物及大蒜素产品中大蒜 素的含量，采用g c m s 法分析测定产品中大蒜素等活性成分的相对含量。 溶剂提取工艺研究结果表明：捣碎的蒜泥在3 8 0 e 下酶解2 0 m i n ，咀9 5 乙醇 作为萃取剂、采用i g ：4 m l 料液比、于3 0 。c 下萃取蒜泥酶解物8 0 m i n ；在温度5 0 、压力o 0 1 m p a 、转速7 5 r m i n 的条件下，采用旋转蒸发仪进行减压浓缩，浓缩 至约原体积1 4 ，大蒜浓缩液中大蒜素含量为2 1 3 m g m l ，得率为2 2 6 9 k g ( 相对原 料) ；采用7 l 径为1 5 0 d a 的纳滤膜，在压力o 6 m p a ，温度3 5 。c 条件下进行纳滤除 杂，杂质截留率为8 0 7 ，大蒜索透过率为9 1 1 ：纳滤透过液在一2 0 、3 o x l o “m p a 条件下冷冻干燥1 2 h 得到大蒜素产品，产品中大蒜素含量为1 3 4 ，大蒜素得率 为1 7 0 9 & g ( e l 对原料1 。 超临界流体萃取工艺研究结果表明：大蒜切碎成尺寸为4 5 m m 疏松状碎 块，采用l l 超临界流体萃取装置，取4 0 0 9 物料装于萃取釜内，于3 8 。c 下酶解 2 0 m i n 后，在压力2 5 m p a 、温度3 5 。c 条件下萃取3 h ，萃取物离心分离后得到大 蒜素产品，产品中大蒜素含量为2 1 ，大蒜素得率为1 ，0 5 k g ( 相对原料) 。 g c m s 检测结果表明：溶剂提取工艺和超临界流体萃取： 艺得到的大蒜索 产品中，主要活性成分皆为3 一乙烯基一1 ，2 一二硫杂一4 一环己烯，3 一乙烯基一1 ，2 一 二硫杂一5 一环己烯，两者相对含量之和分别为9 1 4 3 ( 活性成分中所占比例) 、 7 1 5 8 ( 活性成分中所占比例) ，这两种活性成分皆由大蒜索转化而成，可作为衡 量产品中火蒜素相对含量的指标，因此，溶剂提取工艺得到的产品中大蒜素相对 含量更高。 关键词：大蒜素溶剂提取超临界流体萃取气质联用 a b s t r a c t a l l i c i ni st h em a i na c t i v ec o m p o n e n ti ng a r l i c ，i ti sa na c t i v eo r g a n i cs u l f i d ew h i c h i sb e i n gf r o ma l l i _ i nb yc a t a l y z e do fa l l i i n a s ew h e nt h eg a r l i cw a sc r a s h e d i th a st i l e f u n c t i o no fa n t i b a c t e r i a , l o w e rt h eb l o o dp r e s s u r ea n db l o o dg r e a s e ，p r e v e n tc a n c e r , s oa l l i c i nc o u l db eu s e dt op r e v e n tm u c hd i s e a s e ，a n di t sc l i n i c a la p p l i c a t i o ni sm o r e a n dm o r ee x t e n s i v e ，a l l i c i na sa nd r u go rh e a l t hc a r ep r o d u c ti sp r o m i s i n g t h em e t h o d so fe x t r a c t i n ga l l i c i nc a nb ec l a s s i f i e di n t ot h r e eg r o u p s ：s t e a m d i s t i l l a t i o n ，s o l v e n te x t r a c t i o n ，s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，b u tt h ec o n t e n to fa l l i c i n e x t r a c t e db ys t e a md i s t i l l a t i o ni sv e r yl o w , s ot h ea c t i v i t yo fe x t r a c t i o ni sv e r yl o w i n t h ep a p e r , t h es i n g l ef a c t o ra n do a h o g o n a le x p e r i m e n t sw e r eu s e dt od e t e r m i n et h e o p t i m a le o n d i t i o u s o fs o l v e n te x t r a c t i o na n ds u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，u s e d c o l o r i m e t r yt od e t e r m i n et h ec o n t e n to f a l l i c i ni nt h ee x t r a c t i o n sa n dt h ep r o d u c t so f a l l i c i n ，u s e dg c m st oa n a l y s et h er e l a t i v ec o n t e n to fa l l i c i na n do t h e ra c t i v e c o m p o n e n t si nt h ep r o d u c t s t h es t u d yo dt h er e s u l to fs o l v e n te x t r a c t i o ns h o w e d ：t h ec r a s h e dg a r l i cs l u r r y w a sk e p tu n d e r3 8 cf o r2 0m i n u t e s ，u s e d9 5 e t h y la l c o h o lt oe x t r a c ta l l i c i n ，t h e r a t eb e t w e e nt h eg a r l i cs l u r r ya n d9 5 e t h y la l c o h o lw a slg ：4 m l ，e x t r a c t e df o r8 0 m i n u t e su n d e r3 0 c t h e nc o n c e n t r a t e dt h ee x t r a c t i o nw i mr o t a t ee v a p o r a t i o na p p a r a t u s u n t i l1 4v o l u m el e f t ，t h er o t a t es p e e dw a s7 5r r a i n ，t h ed i s t i l l a t et e m p e r a t u r ew a s5 0 a n dt h ep r e s s u r ew a so 0 1 m p a ，t h ec o n t e n to fa l l i c i ni nt h ec o n c e n t r a t i o nw a s 2 1 3 m g m la n dt h ee x t r a c t i o nr a t ew a s2 2 6 9 k g ( r e l a t i v et o r a wm a t e r i a l ) u s e d n a n o f i r r a t i o nm e m b r a n et or e m o v ei m p u r i t i e s ，t h ed i a m e t e ro fn a n o f i l t r a t i o n m e m b r a n e w a s 1 5 0 d a ，p r e s s u r ew a s0 6 m p a ，t e l n p e r a t u r e w a s3 5 ，t h e n a n o f i l t r a t i o nm e m b r a n ec o u l di n t e r c e p t8 0 7 i m p u r i t i e s ，9 1 1 a l l i c i nc o u l dp a s s f r e e z e dd r yt h ep a s s e ds o l u t i o nf o r1 2 hi nt h ec o n d i t i o n so f 一， ，2 0 。c 3o x l om p at h e p r o d u c to fa l l i i nw a sg o t t h ec o n t e n to fa l l i c i ni n t h ep r o d u c tw a s1 3 4 ，t h e e x t r a c t i o nr a t ew a s1 7 0 9 k g ( r e l a t i v et or a wm a t e r i a l ) t h es t u d yo nt h er e s u l to fs u p e r c f i t i c a lf l u i de x t r a c t i o ns h o w e d ：t h eg a r l i cc u ti n t o t h es i z eo f4 5 n m a ，t h ev o l u m eo fk e t t l ei s1l ，p u t4 0 0 9g a r l i ci n t ot h ek e t t l ef o r i i 2 0 r a i nu n d e r3 8 ，a n dt h e ne x t r a c t e df o r3 hi nt h ec o n d i t i o n so f2 5 m p a ，3 5 ，a f t e r c e n t r i f u g e dt h ee x t r a c t i o n ，t h ep r o d u c to fa l l i c i nw a sg o t ，t h ec o n t e n to fa l l i c i ni nt h e p r o d u c tw a s2 1 a n dt h ee x t r a c t i o nr a t ew a s1 0 5 9 k g ( r e l a t i v et or a wm a t e r i a l ) t h er e s u l to fg c m ss h o w e d ：t h et w op r o d u c t so fa l l i c i ne x t r a c t e db ys o l v e n t e x t r a c t i o na n ds u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o nh a dt h es a m ea v t i v ec o m p o n e n t s ，t h e 3 - v i n y l l ，2 一d i t h i a e y c l o h e x 一4 一e n e a n d3 - v i n y l 一1 ，2 一d i t h i a c y c l o h e x 一5 一e n e , t h et o t a l r e l a t i v ec o n t e n to ft w oc o m p o n e n t sw e r e91 4 3 ( t h ep r o p o r t i o ni nt h ea c t i v e c o m p o n e n t s ) a n d7 1 5 8 ( t h ep r o p o r t i o ni nt h ea c t i v ec o m p o n e n t s ) ，t h et w oe o m p e n t s w e r ed e r i v e df r o ma l l i c i n ，t h ec o n t e n to ft w oc o m p e n t sc o u l ds c a l et h er e l a t i v e c o n t e n to fa l l i c i ni nt h ep r o d u c t s ，s ot h er e l a t i v ec o n t e n to fa l l i c i ne x t r a c t e db ys o l v e n t e x t r a c t i o nw a sm o r et h a ns u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n k e yw o r d s ：a i h e i n s o l v e n te x t r a c t i o n s u p e r c r i t i c a i 同u i d e x t r a c t i o n g c m s i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌文学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的向志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 一硌修节一肌洲年白百 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了：解南昌土学 有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 降 ，j 咱 导师签名 勃交 签字日期：坳f 年6 月u ，日 第一章绪论 大蒜属百合科葱属植物，世界各地均有栽培，大蒜作为民问药物已广泛应用 于世界各地。近年来，随着人们对保健功能食品的重视，大蒜以其丰富的营养价 值和药用价值日益受到青睐，各种大蒜制品( 保健品和药物) 相继出现，与之相关 的研究也不断增多。 1 1 大蒜和大蒜油 大蒜是百合科葱属植物蒜的鳞茎，含有大量丰富的营养物质。据检测，每百 克大蒜中含蛋白质4 4 9 、脂肪0 2 9 、碳水化合物2 3 9 、粗纤维0 7 9 、硫胺素0 2 4 m g 、 核黄素o 0 3 m g 、尼克酸0 9 m g 以及多种人体必须的微量元素，这些微量元素包 括镁、钠、铁、磷、铝、钾、锌、铜、锰、钡、钙、锶、钒、钴、镍、硒、钼、 镉，除此之外大蒜中含有人体几乎所有的必需氨基酸，其中半胱氨酸、组氨酸、 赖氨酸的含量较高，另外还有丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯 丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、胱氨酸、缬氨酸等。因此，大蒜具 有丰富的营养价值阻i 。 大蒜具有特殊的香辛气味，能促进消化、增进食欲，但更重要的是它具有显 著的保健作用和药用价值。近代医学已证实，大蒜具有抗菌消炎、降血压、降血 脂、延长凝血时间的功效，因此对冠心病、高血压、动脉粥样硬化症等有防治作 用瞄i1 3 11 4 1 。近来研究还发现，大蒜能阻断亚硝胺在体内合成、阻止癌细胞在体内 的扩散，所以它还有防癌的作用。目前，理论研究已证明，大蒜具有以上功效和 大蒜中的大蒜油有关。 大蒜出油率一般在0 2 - - - 0 4 之间，呈浅黄色，微溶于水，能溶于乙醇、 苯、乙醚等溶剂，对碱和热不稳定，对酸稳定。优质大蒜油密度为1 0 4 0 1 0 9 0 ( 2 0 ) ，折光率为1 5 5 9 - - - 1 5 7 9 ，无旋光性，有大蒜特殊的臭味和辛辣味，在空气中 长期放置会缓慢氧化使油的颜色逐渐变深1 6 。大蒜油并非由单一成分组成，它含 有多种有机化合物，主要有大蒜素( c 6 h i o s 2 0 ) 、大蒜新素( c 6 h 1 0 s 3 ) 及多种烯丙基、 丙基和甲基组成的硫醚化合物，还含有柠檬醛、牛儿醇、芳樟醇、q 一水芹烯等， 而大蒜素为大蒜油中的主要活性成分，常作为衡量大蒜油品质好坏的重要标准 1 7 1 1 8 1 。 1 2 大蒜素 1 2 1 大蒜素的结构 大蒜素的化学名称为二烯丙基硫代亚磺酸脂，分子量为1 6 2 2 6 ，其结构式如 图卜1 所示： 叫2 h - - c h 2 一气 c h 2 = c h h 2 一s = 0 图1 1 大蒜素的结构式 1 2 2 大蒜素的形成及其降解 a r t h o rs t o l l 和e w a l ds e e b e c k 早在1 9 4 8 年指出，大蒜的完整组织并无辣味， 而仅含有活性成分的前体物质，即无色无味针状结晶的蒜氨酸( a l l i i n ，一种非蛋 白氨基酸，参与高等植物的二级代谢) ，它由8 5 的s 一烯丙基蒜氨酸，2 的丙 基蒜氨酸和13 的甲基蒜氨酸组成，在组织受损时，它与位于其它部位或其它细 胞的蒜酶( a l l i n a s e ) 受力接触，同时在磷酸吡哆醛( p y r i d o x i ap h o s h a t e ) 辅酶的参与 下，先生成一种复合物，再分解成具强烈辛辣味的挥发性物质大蒜素，后者遇光、 热容易降解成各种含硫有机化合物，共同形成大蒜特有的蒜味、香味0 9 1 1 1 0 1 1 1 1 1 。 a r t h o rs t o l l 还认为大蒜中存在三种或四种y l 一谷氨酞基衍生物，s 一链烯基胱 氨酸亚砜在肽酶或转肽酶作用下生成硫代磺酸脂，可加强大蒜特有的芳香味。 长期以来，以上接触式反应理论一直得到国内外学者的公认，但张学俊等1 1 2 l 于1 9 9 6 年对该理论提出了质疑。他们认为，蒜氨酸不应该是较稳定的亚砜结构 ( s 一烯丙基一l 一半胱氨酸) 。其原因有三：第一，接触式反应靠分子运动实现， 而含量低的三分子运动接触反应不可能在瞬间完成，但事实与之相反；第二，蒜 氨酸处于具有还原性的葡萄糖聚合成的淀粉中，缺乏形成亚砜的氧化性环境及亚 砜酶；第三，亚砜结j 陶的含硫化合物较稳定，不具较强的抗菌消毒作用，但是无 损的蒜瓣同样具有消炎、抗菌的作用。据此，他们认为蒜氨酸应是硫醚结构，且 与蒜酶结合在一起，遇到空气中的氧气，立刻被氧化为亚砜。 大蒜素的降解有几种途径1 0 1 1 1 3 i ：其一是三分子的大蒜素聚合成两分子的阿 霍烯( a j o e n e ) ；其二是降解成单硫、二硫、三硫及硫氧化物；其三是热分解时形 成烯丙基次磺酸和烯丙基硫醛，后者在常温下发生d i e l s a l d e r 反应聚合成二硫 杂一环己烯化合物。 1 2 3 大蒜素的功效及应用1 1 4 1 1 1 5 l 1 1 6 11 1 7 1 ( 1 ) 具有广谱抗菌作用。大蒜素对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、腐生葡 萄球菌、福氏痢疾杆菌、宋氏痢疾杆菌、伤寒杆菌、大肠杆菌等病菌均有不同程 度的抑制和杀灭作用，特别是对金黄色葡萄球菌( 夏季皮肤感染的致病菌) 、福氏 痢疾杆菌( 是痢疾病最主要的致病菌) 及伤寒杆菌的抑制和杀灭效果更好。用大蒜 素预防和治疗人、畜及水产动物的肠道疾病效果非常显著。 ( 2 ) 能明显降低血液中的胆固醇，抑制血小板聚集，抗动脉粥样硬化，预防 和治疗高血脂及血拴。 ( 3 ) 能阻止亚硝胺在体内的合成，具有防癌的作用。 ( 4 ) 具有保健功能。大蒜素在体外的抗氧化活性优于人参，在体内( 对肝脏) 抑制过氧歧化酶的活性也高于人参，因此大蒜素能减缓人体的衰老。 ( 5 ) 应用于化妆品生产中，可以用来制造具有增白、抗皱、防晒等功效的化 妆品。 1 3 大蒜素的提取方法 国内外关于大蒜素提取方法的报道很多，主要可以分为三类：水蒸气蒸馏、 溶剂提取和超临界流体萃取。 1 3 1 水蒸气蒸馏( s t e a md i s t i l l a t i o n 简称s d ) 1 3 1 1 原理 s d 的原理【1 8 l 【1 9 j 是将水蒸气通入不溶于水或难溶于水但具有一定挥发性的 有机物中( 大蒜油具有一定挥发性) ，使该有机物在低于1 0 0 。c 的情况下随水蒸气 一起蒸馏出来，再经过进一步分离获得较纯物质。s d 是分离和纯化与水不相混 溶的挥发性有机物的常用方法。 1 3 1 2 基本工艺路线 大蒜一去皮一洗净一捣碎一酶解一水蒸气蒸馏一油水混合物一油水分离一 大蒜油 1 3 1 3 研究概况 乔旭光等1 2 0 j1 2 1 1 用s d 提取大蒜油时，着重对酶解温度、酶解时间、酶解p h 值及蒸馏时间进行了考察，得到提取大蒜油的最佳工艺参数：酶解温度3 0 v 、 酶解时间6 0 m i n 、酶解p h 值6 6 、蒸馏时间为9 0 m i n 。林松毅等2 2 1 采用s d 提取 大蒜油，并对蒸馏时问和出油率加以探讨，得出蒸馏时间以5 0 7 0 m i n 为宜，出 油率可达0 1 3 3 。魏金凤等i 矧采用s d 提取大蒜油，着重对酶解温度和时问加 以探讨，得出结论：酶解温度控制在5 0 5 5 ，酶解时间2 - - 3 h 可以大幅度提 高出油率。王晓文等口卅以吉木萨尔白皮大蒜为原料采用s d 提取大蒜油，考察了 酶解时间、酶解温度、粉碎方法和蒸馏时间等因素对出油率的影响，得到提取大 蒜油的最佳工艺条件：大蒜捣成蒜泥后，按质量比l ：7 加入水，在5 0 6 0 的 温度下，酶解3 h ，蒸馏1 5 2 h 为宜。 林剑等【2 s 1 采用s d 提取大蒜油，待蒸馏完毕后加入植物精油萃取馏出液，避 免了浸提耗用大量溶剂及相应的设备投资。贺志宇等1 2 6 i 用s d 提取大蒜油时，作 了酶解时间、酶解温度和蒸馏时间的三因素三水平的正交实验，发现酶解温度是 影响出油率的主要因素。陈雄等1 2 7 1 利用正交实验探讨了s d 及溶剂萃取两种方法 提取大蒜油的生产工艺。正交实验显示的最佳提取条件为：酶解温度3 5 ，酶 解时问4 h ，酶解p h 值6 5 ，料液比1 ：4 5 ，蒸馏时问为5 0 m i n ，得率为0 2 9 5 ； 而直接水蒸气蒸馏( 料液比1 ：4 5 ，蒸馏时间为5 0 m i n ) 其得率仅为o 1 4 2 ，可见 采用酶解后的s d 能明显提高大蒜油的得率。 1 3 2 溶剂提取( s o l v e n te x t r a c t i o n 简称s e ) 1 3 2 1 原理 大蒜油是浅黄色油状液体，微溶于水，易溶于乙醇、苯、乙醚等溶剂，利用 这一性质可以用溶剂将大蒜油浸提出来。溶剂的选择非常关键，要求该溶剂的溶 解度充足，而且浸提结束后易于分离( 沸点差异显著) ，尽量不含其它的不良气味和 溶剂残留。 1 3 2 2 基本工艺路线 大蒜一去皮一洗净一捣碎一酶解一溶剂萃取一离心分离一上清液一减压浓 缩一大蒜油 1 3 2 3 研究概况 郑志等2 8 1 研究了以乙醇为萃取剂分离提取大蒜素的最佳工艺条件：将大蒜 破碎后，加入浓度为6 m m o l l 的f e 2 + 离子，调节p h 值至6 4 ，在3 0 。c 下放置4 0 m i n ， 并尽量避免接触c u 2 + 。结果证明，在此条件下，以体积分数为9 5 的乙醇，在 3 0 。c 下浸提4 0 m i n ，大蒜油的得率可以达到0 1 以上。屈姝存等1 2 9 1 采用不同体 4 积分数的乙醇提取大蒜油，比较其大蒜素含量差异，并结合大蒜油与大蒜渣中粗 蛋白、可溶性糖、脂肪、钙、铁和锌的含量，筛选出效果较好的大蒜油提取工艺， 其研究结果表明：以较低体积分数( 3 5 7 0 ) 乙醇作为萃取剂提取大蒜油，比 高体积分数乙醇( 9 5 ) 提取的效果要好，表现在提取的大蒜油中大蒜素含量高， 其副产品蒜渣的质量好，提取工艺简单耗能少。 岳田利等咖1 提出并设计了大蒜素真空溶媒提取工艺，建立了提取液中大蒜 素含量、总硫化物含量、蒜渣中总硫化物含量与工艺参数( 浸提的真空度、浸提 的时间、乙醇的体积分数) 的关系模型，通过正交实验优选出大蒜素真空溶媒提 取的最佳工艺参数：脱臭剂加入量1 5 ，乙醇的体积分数5 5 ，浸提真空度7 7 3 0 8 1 0 4 p a ，浸提时间6 0 天。 杨锐等p 1 1 进行了乙醇浓度梯度浸提，浸提前做了使用超声处理和不用超声 处理的对比试验，结果发现：超声波提取法的得率普遍高于浸泡提取法的得率， 他认为这是由于超声波产生的强烈震动、高的加速度、强烈的空化效应和搅拌作 用等，都可以加速有效成分进入溶剂相，并且避免了高温对提取成分的影响。对 比发现在浸泡提取法中，当乙醇体积分数为4 0 时，大蒜素的得率最高：而在超 声波提取法中，随着乙醇体积分数的增大，大蒜素的得率不断增大，且当提取时 间为o 7 5 h 时，大蒜素的得率最高。由业诚等1 3 2 j 用微波辅助萃取技术萃取大蒜有 效成分，并且筛选了萃取剂，发现微波辅助萃取所用时间短，加热3 0 - - 6 0 秒就 与索氏提取法的6 小时效果一致，还得到了微波辅助萃取的最佳条件：以二氯甲 烷为萃取剂，浸泡1 0 分钟，微波加热萃取3 0 、一6 0 秒，得率可达0 - 3 1 。 1 3 3 超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n 简称s f e ) 自英国的t h o m a s a n d r e w s 发现超临界现象距今已有一个多世纪。在1 9 世 纪7 0 年代h a n n a y 和h o g a r t h 首次发表了“超临界流体( s u p e r c r i t i c a tf l u i d 简称 s c f ) 能够溶解低蒸气压的固体物质 的论文1 3 3 11 3 4 l ，为后来的科学工作者研究超 临界流体的溶解度，以及s f e 广泛应用于高附加值天然物的萃取奠定了基础。 随着新的超临界溶剂的不断发现，s c f 的研究开始倍受科研工作者的关注。早 期s c f 技术的研究主要集中在相态变化和溶剂性质上，至2 0 世纪6 0 年代，德、 美、日、英和瑞士等国都做了大量的研究，并取得了相当的成果1 3 5 j 。如啤酒花 有效成分的萃取，咖啡豆脱咖啡因，烟草脱尼古丁，奶脂脱胆固醇，从天然香料 植物或水果中制取高档香精和色素以及风味物质，从鱼油中提取药用价值和营养 价值都很高的多烯烃不饱和脂肪酸，抗生素药剂中残留溶剂的脱除等，而在啤酒 花有效成分的萃取，咖啡豆脱咖啡因等领城该技术已经成功的工业化，并且相当 成功m il a 7 1 。 1 3 3 1 原理 s c f 是指热力学状态处于临界点( p c ，t o ) 之上的流体，是气、液界面刚刚消 失的状态点，此时流体处于气态与液态之间的一种特殊状态，具有十分独特的理 化性质。s c f 的粘度接近于气体，密度接近于液体，扩散系数介于气体和液体 之间，兼有气体和液体的优点，既象气体一样容易扩散，又象液体一样有很强的 溶解能力，因而s c f 具有高扩散性和高溶解性。在其它条件完全相同的情况下， 液体的密度在相当程度上反应了它的溶解能力，而s c f 的密度与压力和温度有 关，随着压力的增大，介电常数和密度增大，s c f 对物质的溶解能力增大。s f e 就是利用s c f 在临界点附近体系温度和压力的微小变化，使物质溶解度发生几 个数量级的突变这一性质来实现其对某些组分的提取和分离，通过改变压力或温 度来改变s c f 的性质，达到选择性地提取各种类型化合物的目的弼l1 3 9 l 。 1 3 3 2 基本工艺路线 大蒜一去皮一洗净一破碎一装入萃取釜酶解一超临界流体萃取一大蒜粗提 物一离心分离一大蒜油 1 3 3 - 3 研究概况 葛保胜等柏i 研究了萃取压力、萃取温度及直接切片、发酵榨汁和发酵醇提 三利- 原料预处理方式对s f e 大蒜油的影响，得到最佳的工艺条件为：压力1 5 m p a 、 温度4 00 c ，用发酵醇提法预处理得到含较多大蒜素的大蒜油，但要得到大蒜精 油需进一步精制。陈雪峰等4 1 i 研究了温度、时问、压力对s f e 大蒜油的影h i 句， 通过正交实验得到最佳的工艺条件为：压力2 0 m p a 、温度5 0 、时问4 h ，并对 实验获得的提取物进行了鉴定。梁兵等1 4 2 1 考察了温度、压力、摹取剂用量对大 蒜油得率的影响，结果表明s f e 大蒜油的最佳工艺条件：温度3 5 4 0 、压力 1 5 m p a 、萃取剂用量5 , - - - 一6 l h * g 。 由于s f e 时大蒜原料多是块状、粉状或浆状，而高压下萃取釜的连续进出 料是很困难的，因此目前萃取釜都实施间歇式操作，原料萃取完后卸压出料或渣， 6 这样就对其工业化推广和应用产生了一定限制。基于此点臧志清等1 4 3 1 提出了用 s e 法与s f e 法相结合来提取大蒜油的工艺路线：先用乙醇浸提获得大蒜浸提液， 大蒜浸提液由泵送入高压萃取釜，经s f e 后再分离得到大蒜油，实现超临界高 压连续稳定的操作，两种方法的结合，保持了两者原有长处而回避了短处，而且 乙醇蒸发时会夹带大蒜油中部分小分子组分，使用s f e 替换，克服了夹带的缺 点，实验结果表明，萃取压力在1 0 1 4 m p a 为宜。张忠义等1 采用s f e 技术和 分子蒸馏对大蒜油进行萃取与分离，分子蒸馏属于特殊的高真空蒸馏技术，与普 通蒸馏相比，分子蒸馏温度低，受热时间短，故适合于热敏性有效成分的分离， 他将s f e 得到的萃取物再经分子蒸馏进行精制，得到的大蒜提取物经超滤后制 成大蒜注射液。 。 1 3 3 4s f e 的特点1 4 引 4 6 1 ( 1 ) 作为常用的溶剂c o ，具有临界温度低、临界压力低、化学惰性、低膨胀 性、无毒价廉等优点，是萃取天然产物最理想的溶剂。在传统的天然产物有效成 分提取方法中，需对溶剂作进一步的脱除，存在溶剂残留的问题。应用s f e 技 术萃取天然产物有效成分，没有残留的溶剂，可防止有害物质混入产品，因此， 获得的产品是天然的。 ( 2 ) s f e 没有物料的相变过程，因此不消耗相变热，节能效果明显，c o ，可 循环使用，避免了传统溶剂提取易燃易爆的危险，减少了环境污染。 ( 3 ) 传统的天然产物有效成分提取过程中，一些活性成分( 尤其是热敏性成分) 因受高温作用容易被破坏，而s f e 技术在较低温度下萃取，可有效防止热敏性 和化学不稳定成分的高温分解和氧化。 ( 4 ) s f e 选择性好，可以通过调节温度和压力来改变溶剂的溶解度，从而针 对性地分离有效成分。同时s f e 技术与g c 、i r 、l c 、g c - m s 、h p l c 相结合， 能高效、快速地进行成分分析。 当然，s f e 技术也有其局限性，如s f e 较适合那些亲脂性、分子量小的物 质的萃取，对于极性较强，分子量大的物质的萃取，要加夹带剂或在很高的压力 下进行，而且设备昂贵，目前还难以大规模的工业化。 1 3 4 不同提取方法的相互比较 综上所述，各种方法均有利有弊，不同提取方法的相互比较见表1 1 ，考虑 7 到s d 工艺得到的多是小分子含硫化合物，大蒜素含量很低，所以本实验采用s e 工艺和s f e 工艺分别提取大蒜素， 表卜1 研究并确定其最佳工艺参数。 不同提取方法的相互比较 1 4 大蒜素的检测方法 国内外关于大蒜素及大蒜提取物中含硫化合物检测方法的报道很多，主要可 以分为五类：定硫法、硝酸汞沉淀法、色谱法、生物检测法、比色法。 1 4 1 定硫法【4 7 1 大蒜中蒜氨酸的亚砜基和大蒜素的硫代亚砜基被浓硝酸氧化成硫酸根离子， 与氯化钡反应形成硫酸钡沉淀，根据硫酸钡的重量换算出大蒜素的含量。 1 4 2 硝酸汞滴定法1 4 射 大蒜提取液经三氯乙酸除去蛋白质等杂质后，离心取上清液与过量的硝酸汞 反应，生成乳白色沉淀，以硫酸高铁铵为指示剂，用k s c n 溶液滴定剩余的硝 酸汞溶液，根据消耗的k s c n 的量计算出大蒜素的含量。 1 4 3 色谱法 色谱法包括气相色谱( g c ) 、气相色谱一质谱联用( g c m s ) 、液相色谱( l c ) 和 高效液相色谱( h p l c ) 、薄层色谱( t l c ) ，并有红外光谱( i r ) 、核磁共振( 1 h n m r 和n c n m r ) 、紫外光谱( u v ) 等技术作为辅助手段，使大蒜的活性成分检测趋于 完善。 1 4 3 1 气相色谱( g c ) 1 4 9 1 气相色谱( g c ) 主要检测到的是大蒜素的降解产物，大量实验表明，g c 分析 条件中，当程序升温较快、柱温较高、范围较宽、进样温度较高时，检测到的降 解产物主要是二硫杂一环己烯衍生物，这是由于烯丙基硫醛发生了d i e l s a l d e r 反 应的结果，其次是对称或非对称的各种硫醚和硫代亚磺酸酯，其中尤以二烯丙基 三硫醚和二硫醚的含量为高；当程序升温较慢、柱温较低、进样温度较低时，检 测到的降解产物主要是二烯丙基三硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基硫醚、烯丙 基甲基三硫醚、烯丙基甲基二硫醚、烯丙基甲基硫醚等。由于它们都具有相似的、 程度不同的生理活性，为g c 法测定大蒜的活性成分提供了依据。 1 4 3 2 气相色谱一质谱联用( g c m s ) 1 4 9 l 国内外有许多关于大蒜油g c m s 的报道，多采用f i n n i g a n 一4 5 1 0 g c m s d s ， 并参考n b s 谱库和质谱数据资料。刘广军1 5 0 1 通过g c m s 分析比较了大蒜萃取 液及s d 制得的大蒜油的化学成分，发现大蒜萃取液的g c - m s 成分分析中含有 很多大蒜油中不存在的组分，其中最主要的化学成分为3 一乙烯基一1 ，2 一二硫杂 一4 一环己烯及其异构体3 一乙烯基一1 ，2 一j 硫杂一5 一环己烯。吴靖豪等用g c m s 分析大蒜油，得到其中五种有机硫化合物在7 0 e v 条件下的e i 谱数据，还采用 核磁共振、红外光谱及合成等手段，证明了大蒜油中存在结构为 c h 2 = c h c h 2 s s s c h 2 c h = c h 2 ，分子量为1 7 8 的大蒜新素。郭海忱等用毛细管气 相色谱一四极质谱联用技术分析s d 制得的大蒜油中的活性成分，其组分至少有 十五种并初步鉴别了其中十种成分。v e m i n 等应用电子轰击( e i ) 和化学电离( c i ) 技术，通过g c m s 证实大蒜中的酯类物质，并获得有机硫化物特殊的裂解方式： 1 4 3 3 液相色谱( l c ) 与高效液相色谱( h p l c ) 1 4 9 1 因气相色谱( q c ) 受温度限制，国内外学者开始探寻其它方法，液相色谱( l c ) 尤其是高效液相色谱( h p l c ) n - - j 以减少温度的限制。m o c h i z u k i 等采用l c 测定大 蒜及其制剂中大蒜素的含量，使用s e p - p a k c i 8 柱分离纯化，紫外检测波长为 210 n m ，于n u c l e o s i l5 c 1 8 柱上离子对色谱荧光测定。 近年来，室温下操作的高效液相色谱( h p l c ) 成为最有希望的分析方法，常 采用柱前衍生化紫外吸收检测法，所用仪器简单，成本低，不会引起谱峰扩展， 9 衍生化产物较稳定，大多数在室温下即可分离。国内外的报道表明，正相h p l c 法测定新鲜大蒜、干粉及各种大蒜制品，能得到很好的结果。正相h p l c 法与反 相h p l c 相比，能很好地分辨烯丙基甲基、甲基烯丙基硫代亚磺酸酯和甲基- 1 - 丙烯基甲基硫代亚磺酸酉鲁这样的对应异构体。反相h p l c 法与正相h p l c 法 样，分离度、灵敏度与定量结果均很高。针对这种情况，近几年来反相h p l c 得 到了很大发展，与s i h p l c 结合起来，可直接检测大蒜中所有的硫代亚磺酸酯 的含量。l a r r yd 指出：利用反相h p l c 可分离和定量研究大蒜中烷( 烯) 基硫代 亚磺酸酯，包括其构型异构体。m u t s h 报道了利用反相h p l c 检测大蒜中的s 一 烷( 烯) 基一l 一半胱氨酸衍生物，利用该法可分离六科一s 一烷( 烯) 基一l 一半胱氨酸亚砜 和c l 一谷氨酰基一s 一烷( 烯) 基一l 一半胱氨酸。l a w s o n 等报道用r p h p l c 分离c 一 谷氨酰基缩氨酸，并采用紫外检测。z i e g l e r 用r p h p l c 和柱前衍生化快速分离 s 一烷( 烯) 基一l 一半胱氨酸和其对应的亚砜异构体。 1 4 3 4 薄层色谱( t l c ) 【4 9 1 薄层色谱( t l c ) 分析比较简单快速，定性较好，但其分离度、灵敏度和定量 却均不及现代的h p l c 。l a r r y 用t l c 测出大蒜油中至少有五种化合物，其中四 个主要点均表现出抗霉菌活性。k a p p e nb e r g 等把大蒜素用( 水合) 茚三酮衍生化后 再t l c 测定。f u j i w a r a 报道通过与半胱氨酸反应，用p c 或t l c 分离得到二甲 基、二丙基、甲基烯丙基、丙基烯丙基以及丙基甲基硫代亚磺酸酯类。后来， m i c h a h e l l e s 用n 一乙基马来酰亚胺代替半胱氨酸与硫代亚磺酸酯反应。l a n c a s t e r 等用电泳、二因次薄层色谱和光密度分析联用对大蒜提取液作定量分析。 k e u s g e n 对蒜氨酸及其它化合物的t l c 分离方法作了改进，以一种改良的 茚三酮检测试剂优化半胱氨酸亚砜和其它氨基酸衍生物的鉴别，其分离效果良 好，另外，他还研究了灵敏的、专属性的显色反应运用于t l c 后的大蒜素检测。 1 4 4 生物检测法 周重阳等1 5 1 1 建立了用生物法测定大蒜油中大蒜素和大蒜新索等活性成分含 量的方法，他利用大蒜油( 大蒜素、大蒜新素、二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫 醚等硫化物) 能杀菌这一特点，通过对接种相同且培养基相同的大肠杆菌培养皿 定时滴加大蒜油样品和不同浓度梯度的对照品，培养1 8 小时后测量抑菌圈直径， i 比较抑菌效果后换算出大蒜素的含量。实验表明用生物检测法测得的结果与气相 色谱法测得的结果基本相一致。 1 4 5 比色法 l a w s o n l 5 2 1 于19 9 5 年提出了利用比色法定量测定大蒜素及大蒜中的硫代亚磺 酸酯，该法将纯品大蒜素作为目标测定物进行了测定并与高效液相色谱( h p l c ) 的测定结果进行了比较，结果显示两种方法的测定结果相关性很好，而且灵敏度 很高，达到了微摩尔级，不需大蒜素做外标物。 该方法的测定原理【5 2 i1 5 3 1 ：一分子l 二半胱氨酸和一分子5 ，5 一二硫代双( 2 一 硝基苯甲酸) ( d t n b ) ，反应生成一分子2 一硝基_ 5 一硫代苯甲酸( n t b ) ，n t b 在 4 1 2 n m 处具有最大吸收，摩尔消光系数为1 4 1 5 0 ( i c m 光径) 。大蒜素也可以和l 一 半胱氨酸的自由巯基反应，一分子大蒜素可以很快地与两分子半胱氨酸反应生成 两分子的s - a m c ( c 3 h 5 - 8 一s c h 2 c h ( n h ) 2 c o o h ) ，其它硫代皿磺酸酯也同大蒜 素一样可以很快地与两分子半胱氨酸反应。采用过量的半胱氨酸先与硫代亚磺酸 酯反应，反应剩余的半胱氨酸再与过量的d t n b 反应生成n t b ( 见图1 - 2 ) ，根据 4 1 2 n m 处测得的反应前后吸光度的变化值可以计算出半胱氨酸的减少量，从而得 到硫代亚磺酸酯的含量。 o + 纱，g ，、_ 2 夕s s c o o h + 给八s _ 2 v s 丫 nh2 a l l i c i ns a m c 珏、湖h + h s q 三z 图卜2 比色法测定大蒜素的反应机理图 j 1 4 6 不同检测方法的相互比较 综上所述，每种检测方法均有其优点和缺点，不同检测方法的相互比较详见 表卜2 。考虑到本实验需要精确快速的检测多批量大蒜提取物及大蒜素产品中大 蒜素的含量，而且大蒜素标准品又难以购得，因此选用比色法。 表1 - 2 不同检测方法的相互比较 检测方法优点缺点 1 5 本课题研究的目的和意义 我国是世界上大蒜重要的生产国与出口国，据不完全统计，我国大蒜常年的 1 2 种植面积为3 0 0 - 4 0 0 万亩，总产量为4