（食品科学专业论文）甘露糖月桂酸酯的酶法选择性合成.pdf

摘要 摘要 脂肪酸糖酯( s f a e ) 是一类非离子型、可消化吸收、可生物可降解、无毒的双亲化合 物，作为表面活性剂和乳化剂而被广泛应用于食品、化妆品和医药工业中。s f a e 的理化 性质与它的组成、取代度和化学结构有着密切的关系。与传统的化学法合成s f a e 相比， 酶法具有直接利用底物及反应条件温和等优点，但同样无法回避选择性不高的问题。 本论文主要研究了甘露糖月桂酸酯的脂肪酶( n o v o z y m4 3 5 ) 区域选择性合成和物化 性质。通过甘露糖月桂酸酯间歇合成反应过程的研究，揭示了单酯及二酯的反应规律及影 响区域选择性控制合成甘露糖月桂酸酯的关键因素。根据这些影响因素，建立了不同反应 体系对单酯、二酯分别进行选择性合成，确定了合成甘露糖月桂酸单酯和二酯的工艺参数， 研究了甘露糖月桂酸酯的理化性质，包括水溶性、表面性质及m i l l a r d 反应活性。 首先，对甘露糖月桂酸酯的分析检测和分离纯化方法进行了研究。确定了甘露糖月桂 酸酯的高效液相色谱( h p l c ) 分析条件：采用w a t e r s 公司的s u n _ f i r ec 1 8 反相柱( 4 6 x1 5 0 m i l l ，2 5 岬) ，流动相采用9 5 的甲醇水( v v ) ，流速为1 0m l m i n ，进样量为5p l 。蒸 发光散射检测漂移管温度4 5o c ，喷雾管温度3 6o c ，载气为n 2 ，载气压力2 0p s i ，增益为 1 。甘露糖月桂酸酯采用硅胶层析分离：1 0 0 x 6 0 0m l n 硅胶层析柱( 硅胶6 0 1 0 0 目) ，上样 量2 0m l ，采用梯度洗脱的方法，洗脱剂依次为乙酸乙酯正己烷( 1 ：l ，v v ，4 0 0 0m 1 ) ，乙 酸乙酯正己烷( 6 ：4 ，v v ，4 0 0 0m 1 ) ，乙酸乙酯正己烷甲醇( 7 ：2 ：1 ，v ，v v ，4 0 0 0m 1 ) ，乙 酸乙酯正己烷甲醇( 4 ：2 ：4 ，v 讥，3 0 0 0m 1 ) ，2 0 0 0m l1 0 0 甲醇，流速为1 0m l m i n ，按 1 管3 0m i n ，收集洗出液，并用薄层层析t l c 跟踪洗脱产物，将比移值一致的产物合并。 再经过制备色谱进一步纯化：采用w a t e r s 公司s u n f i r ec 1 8 反相柱( 1 9 x 1 5 0r n n l ，2 5 岬) 。 流动相为9 0 的甲醇水( v v ) ，流速为8 0m l m i n ，进样量为2 0 0m ，蒸发光散射检测器 检测。纯化的产品经过红外、质谱和核磁共振分析测定，进行结构鉴定与表征。所得产物 为6 d - 甘露糖月桂酸酯、1 , 6 d io 甘露糖月桂酸酯、4 , 6 d io 甘露糖月桂酸酯及3 , 6 d i o - 甘露糖月桂酸酯。 确定了脂肪酶催化间歇合成甘露糖月桂酸单酯和二酯合理的工艺条件，单酯的合成条 件：7 5m m o l l 甘露糖、3 7 5m m o l l 月桂酸、1 5 l 脂肪酶和1 0 l3a 分子筛于5i i l l 丙 酮中5 0 振荡水浴反应7 2h ；二酯的合成条件：7 5m m o l l 甘露糖、酸糖摩尔比5 ：l 、1 5 l 脂肪酶和8 0g l 3a 分子筛于5m l 丙酮中5 0 振荡水浴反应1 2 0 h 。甘露糖月桂酸单酯和 二酯的转化率分别为3 3 和2 1 。 构建了循环流化床生物反应器( c i r c u l a t i n gf l u i d i z e db e db i o r e a c t o r , c f b b r ) 系统，对 甘露糖月桂酸酯进行连续化生产，以达到对甘露糖月桂酸单酯的选择性合成。选择性合成 甘露糖月桂酸二酯的较优条件：月桂酸丙酮溶液( 8 0m m o l l ) 饱和溶解甘露糖，进料速度 ( 1 0m l m i n ) ，加酶量( 6g ) ，床层膨胀比( 1 6 ) ，5 0 反应连续反应7 5 天，产物中只有 甘露糖月桂酸单酯生成，反应进行前五天，甘露糖月桂酸单酯转化率保持在3 0 左右，甘 露糖月桂酸单酯的平均产量为5 9 2 6 ( d l ) ；反应进行至7 5 天后转化率下降到2 5 。 江南大学博士学位论文 建立一种由乙腈和正己烷这两种不互溶的有机相组成的两相反应体系同时反应 萃取体系( s i m u l t a n e o u sr e a c t i o n e x t r a c t i o ns y s t e m ，s r e ) ，以达到对甘露糖月桂酸二酯的 选择性合成。选择性合成甘露糖月桂酸二酯的较优条件：以正己烷和乙腈组成s r e 体系， 相比为1 ：1 ，甘露糖的浓度为o 0 5m o l l ，酸醇摩尔比为4 ：1 ，脂肪酶添加量为1 5m g m l ， 分子筛添加量为6 0m m l ，5 0 振荡水浴1 5 0r p m 反应7 2h 。此时甘露糖月桂酸二酯的转 化率为5 1 ，总酯转化率为7 6 。 在2 5 时，甘露糖月桂酸单酯在水中的溶解度要明显的高于二酯；甘露糖月桂酸单 酯因取代度低于二酯，所以亲水一亲油平衡值( h l b ) 较高，表现出亲水性更强。通过对 甘露糖月桂酸单酯和二酯的临界胶束浓度( c m c ) 、最大吸附量( r m a x ) 、表面吸附分子 的最小截面积( 彳州加) 、临界堆积参数( a 甲) 、胶束自由能( a g 州) 的测定和比较，表明 甘露糖月桂酸二酯比单酯具有更强的胶团化倾向，更易聚集生成胶团。 研究了2 5 时不同浓度的甘露糖月桂酸酯的泡沫性质和乳化性质。单酯的起泡能力、 乳化能力和乳化稳定性都要好于二酯，而泡沫稳定性弱于二酯。根据不同的性质差别，将 单酯和二酯进行复配，通过单酯与二酯的相互作用，其配合物的乳化性能和起泡性能有了 很大的提高。 构建了甘露糖甘露糖月桂酸酯l 半胱氨酸m i l l a r d 反应体系，对比了不同处理时间下 不同体系的m i l l a r d 反应活性。通过顶空固相微萃取和g c m s 分析，1 , 6 d io 甘露糖月桂 酸酯由于半缩醛羟基被月桂酰基酯化，而表现出较低的m i l l a r d 反应活性。 关键词：甘露糖月桂酸酯；脂肪酶；选择性合成；循环流化床生物反应器；同时反应萃取 体系；物化性质；m i l l a r d 反应 i i a b s t r a c t a b s t r a c t s a c c h a r i d ef a t t ya c i de s t e r s ( s f a e s ) a r en o n i o n i c ，d i g e s t i b l e ，a b s o r b a b l e ，b i o d e g r a d a b l e ， a n dn o n t o x i c a m p h i p h i l i cd e r i v a t i v e s ，w h i c hh a v e b e e nw i d e l yu s e da ss u r f a c t a n t sa n d e m u l s i f i e r si nf o o d ，c o s m e t i c ，a n dp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r i e s t h ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so f s f a ed e p e n d so nt h ef a t t ya c i d ，t h es u g a rm o i e t y , t h ed e g r e eo fs u b s t i t u t i o n ，a n di t sc h e m i c a l s t r u c t u r e e n z y m e c a t a l y z e dc o n d e n s a t i o ni ss u p e r i o rt ot h ec h e m i c a ls y n t h e s i sb e c a u s eo ft h e d i r e c tu s eo fu n m o d i f i e ds u b s t r a t e s ，a n dm o d e r a t er e a c t i o nc o n d i t i o n s b u tb o t ho ft h e mh a v e l o wr e g i o s e l e c t i v i t i e si ns f a es y n t h e s i s i nt h i ss t u d y , r e g i o s e l e c t i v es y n t h e s i so fl a u r y lm a n n o s e sc a t a l y z e db yn o v o z y m4 3 5w a s a c h i e v e da n dt h ep h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e so fl a u r y lm a n n o s e sw e r es u d i e d b a s e do nt h eb a t c h r e a c t o rs t u d y , t h er e a c t i o nr u l e sa n dk e yf a c t o r si n f l u e n c i n gt h em o n o a n dd i e s t e r sr e g i o s e l e c t i v e s y n t h e s e sw e r ei n v e s t i g a t e d d i f f e r e n tr e a c t i o ns y s t e m sw e r ed e s i g n e da n db u i l tf o rt h es e l e c t i v e s y n t h e s i so fm o n o - o rd i l a u r y lm a n n o s e s ，a n dt h eo p t i m u mr e a c t i o np a r a m e t e r sf o rt h e s es y s t e m s w e r ed e t e r m i n e d t l l ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fl a u r y lm a n n o s e s ，s u c ha sw a t e rs o l u b i l i t i e s ， i n t e r f a c i a lp r o p e r t i e sa n dm i l l a r da c t i v i t i e sw e r es t u d i e d t h ec o m p o n e n t so fr e a c t i o ns o l u t i o nw e r ea n a l y z e da n ds e p a r a t e d t h er e a c t i o ns o l u t i o n w a sa n a l y z e db yh p l cu s i n gas u n f i r e c18c o l u m n ( 4 6 2 5 0m i l l ，w a t e r s ，u s a ) e l u t e dw i t h m e t h a n o l w a t e r ( 9 5 ：5 ，v v ) a t lm l m i n ，a n dd e t e c t e d b yaw a t e r s2 4 2 0e v a p o r a t i v el i g h t s c a t t e r i n gd e t e c t o r ( e l s d ) e l s dc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e da td r i f t - t u b et e m p e r a t u r e4 5o c ； s p r a y e rt e m p e r a t u r e3 6o c ；c a r r i e rg a sp r e s s u r e2 0p s i ；a n dg a i n1 t h er e a c t i o ns o l u t i o nw a s a p p l i e dt oas i l i c ag e lc o l u m n ( 10 0t o2 0 0m e s h , 10 0 x 6 0 0m m ) a n dt h e ne l u t e dw i t ht h em i x t u r e o fn - h e x a n e e t h y la c e t a t e m e t h a n o lb yal i n e a rp r o g r a m m i n g t h ee l u t i o ng r a d i e n t sw e r e n h e x a n e e t h y la c e t a t e ( 5 0 5 0 ，v v , 4 0 0 0m 1 ) ，n - h e x a n e e t h y la c e t a t e ( 4 0 6 0 ，v v , 3 0 0 0m 1 ) ， n h e x a n e e t h y la c e t a t e m e t h a n o l ( 2 0 7 0 10 ，v v , 4 0 0 0m 1 ) ，n h e x a n e e t h y la c e t a t e m e t h a n o l ( 2 0 4 0 4 0 ，v v ，3 0 0 0m 1 ) a n d10 0 m e t h a n o l ( 2 0 0 0m 1 ) t h ef l o wr a t eo ft h ee l u e n tw a s10 m l m i n ，a n dt h ee l u e n t ，1t u b e 10m i n ，w a sc o l l e c t e da n dm o n i t o r e db yt h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) f r a c t i o n sc o n t a i n i n gt h es a m ep r o d u c tw e r ec o m b i n e dt o g e t h e r t h e c o n c e n t r a t e ds o l u t i o nw a sa p p l i e dt oap r e p a r a t i v eh p l cw i t he l s da n das u n f i r e c18c o l u m n ( 5i x m ，19 x15 0r n r n ，w a t e r s ，u s a ) t o p u r i f yt h ep r o d u c t s t h em e t h a n o l w a t e re l u a n t ( 9 0 ：10 ，v v ) ， w a su s e da tt h ef l o wr a t eo f8 0m l m i n t h el o a d i n ga m o u n tw a s2 0 0 肛1 t h ep u r i f i e dp r o d u c t s w e r ei d e n t i f i e db yf t - i r ，m s ，1 hn m ra n d cn m r a n dt h e yw e r e6 一o l a u r y lm a n n o s e ( m e ) ， 3 , 6 一d i o - l a u r y lm a n n o s e ( d3 ，6 ) ，4 , 6 一d i o l a u r y lm a n n o s e ( d4 ，6 ) ，a n d1 , 6 - d i - o l a u r y lm a n n o s e ( d1 ，6 ) t h eb a t c hr e a c t o rw a su s e dt os y n t h s i z el a u r y lm a n n o s e t h eo p t i m u mp a r a m e t e r sw e r e a c h i e v e db ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s 朋1 eo p t i m u mp a r a m e t e r sf o rm o n o l a u r y lm a n n o s ew e r e i i i 江南大学博士学位论文 a sf o l l o w ：m a n n o s e ( 7 5m m o l l ) ，t h em o l a rr a t i oo fl a u r i ea c i dt om a n n o s e5 ：1 ，l i p a s e ( 15 l ) ， a n d3am o l e c u l a rs i e v e s ( 10e t l ) i n5m la c e t o n ea t5 0o cf o r7 2h ；t h eo p t i m u mp a r a m e t e r sf o r d i l a u r y lm a n n o s e s ：m a n n o s e ( 7 5m m o l l ) ，t h em o l a rr a t i oo fl a u r i ea c i dt om a n n o s e5 ：1 ，l i p a s e ( 15g l ) ，a n d3am o l e c u l a rs i e v e s ( 8 0g l ) i n5m la c e t o n ea t5 0o cf o r 12 0h h i g h e s t e q u i l i b r i u mc o n v e r s i o n sw e r e3 3 a n d21 f o rm o n o e s t e ra n dd i e s t e r s r e s p e c t i v e l y an o v e lc i r c u l a t i n gf l u i d i z e db e db i o r e a c t o r ( c f b b r ) w a se m p l o y e df o rc o n t i n u o u sa n d s e l e c t i v es y n t h e s i so fm o n l a u r y lm a n n o s e sb yl i p a s e c a t a l y z e dc o n d e n s a t i o no fd m a n n o s ea n d l a u r i ea c i d t h eh i g h e s te q u i l i b r i u mc o n v e r s i o no fm o n o e s t e r so f3 0 ( t h ea v e r a g ey i e l do f m o n o l a u r y lm a n n o s e w a s5 9 2 6g ( d l ) ) f o rf i r s t5d a y sa n d2 5 f o ra f t e r2d a y sw i t hn od i e s t e r d e t e c t e da l lt h et i m ew e r ea c h i e v e d a n dt h eo p t i m u mp a r a m e t e r sw e r ea sf o l l o w ：l a u r i ea c i d ( 8 0 m m o l l ) ，s a t u r a t e dm a n n o s e ，f e e dr a t e ( 1 0m l m i n ) ，l i p a s e ( 6g ) ，e x p a n s i o nr a t eo ft h eb e d ( 1 6 ) a t5 0o cf o r7 5d a y s an o v e lb i p h a s i cs y s t e m ，s i m u l t a n e o u sr e a c t i o n - e x t r a c t i o ns y s t e m ( s r e ) ，c o n s i s t i n go ft w o i m m i s c i b l eo r g a n i cs o l v e n t s ，a c e t o n i t r i l ea n dn - h e x a n e ，w a se m p l o y e df o rt h es e l e c t i v es y n t h e s i s o fd i l a u r y lm a n n o s e sb yl i p a s e c a t a l y z e dc o n d e n s a t i o n o fd m a n n o s ea n dl a u r i ea c i d t h e h i g h e s te q u i l i b r i u mc o n v e r s i o no fd i e s t e r so f51 a n dt h et o t a lc o n v e r s i o no fl a u r y lm a n n o s e s o f7 6 w e r ea c h i e v e da tt h en - h e x a n e a c e t o n i t r i l er a t i oo fl ：1 t h em o l a rr a t i oo fl a u r i ea c i dt o m a n n o s eo f 4 ：l ，6 0g lm o l e c u l a rs i e v e sa n d5g ll i p a s ea t5 0o ca n d1 5 0r p mf o r7 2h o u ri n1 5 m ls r e s y s t e m a t2 5 o c ，m o n o l a u r y l m a n n o s ew a s h i g h e r i nt h e s o l u b i l i t y a n dl o w e ri n h y d r o p h i l e - l i p o p h i l eb a l a n c e ( h l b ) v a l u et h a nd i l a u r y lm a n n n o s e s t h ep a r e m e t e r s ，c r i t i c a l m i c e l l ec o n c e n t r a t i o n ( c m c ) ，? c m c ，m a x i m a ls u r f a c ee x c e s s ( r m a x ) ，m i n i m u ma r e ap e rm o l e c u l e 似珊i n ) ，c r i t i c a lp a c k i n gp a r a m e t e r ( c p p ) a n dt h eg i b b sf r e ee n e r g yo fa d s o r p t i o n g m ) s h o w e d t h a td i l a u r y lm a n n o s e sw o u l df a v o rt h ef o r m a t i o no fm i c e l l e s t h ef o a m a b i l i t i e s ，f o a m s t a b i l i t i e s ，e m u l s i f y i n g a c t i v i t i e sa n de m u l s i o ns t a b i l i t i e so f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fl a u r y lm a n n o s e sa t2 5o cw e r ec o m p a r e d m o n o l a u r y lm a n n o s ew a s b e t t e ri nf o a m a b i l i t i e s ，e m u l s i f y i n ga c t i v i t i e s ，e m u l s i o ns t a b i l i t i e s t h ef o a m i n gp r o p e r t ya n d e m u l s i f y i n gp r o p e r t yw o u l db eb e t t e rw h i l em i x i n gm o n o e s t e ra n dd i e s t e rt o g e t h e r m a i l l a r dr e a c t i o na c t i v i t i e so fm a n n o s ew i t hl c y s t e i n ea n dl a u r y lm a n n o s e s 、析m l c y s t e i n ew e r ee v a l u a t e db yh e a d s p a c es o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ( h s - s p m e ) m e t h o d c o m b i n e dw i t hg c m s 1 , 6 - d i - o l a u r y lm a n n o s ee x h i b i t e dt h el o w e s tm a i l l a r dr e a c t i o na c t i v i t y , c o m p a r e dw i t h6 一o - l a u r y lm a n n o s e 3 , 6 一d i o - l a u r y lm a n n o s ea n d4 , 6 一d i o l a u r y lm a n n o s e k e y w o r d s ：l a u r y lm a n n o s e ；l i p a s e ；s e l e c t i v es y n t h e s i s ；c i r c u l a t i n gf l u i d i z e db e db i o r e a c t o r ； s i m u l t a n e o u sr e a c t i o n e x t r a c t i o ns y s t e m ；m a i l l a r dr e a c t i o n i v 缩写符号说明 s f a e c a l b h l b 值 c s t r c p f r p d r m e d 3 ，6 d 4 ，6 d1 - 6 t l c 母 e l s d c f b b r c l a u m f u t 彩 风 风 x m e c m f , c m t p p b s i 迮s y s t e m p 耽 m l a w m l m 缩写符号说明 s a c c h a r i d ef a t t ya c i de s t e r c a n d i d aa n t a r c t i c al i p a s eb h y d r o p h i l e l i p o p h i l eb a l a n c ev a l u e c o n t i n u o u ss t i r r e dt a n kr e a c t o r c o n t i n u o u sp l u gf l o wr e a c t o r p a c k e d b e dr e a c t o r m o n o l a u r y lm a n n o s e 3 , 6 - d i o - l a u r y lm a n n o s e 4 , 6 - d i - - o - l a u r y lm a r m o s e 1 , 6 - d i - o - l a u r y lm a n n o s e t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y r e t e n t i o nf a c t o r e v a p o r a t i v el i g h t s c a t t e r i n gd e t e c t o r c i r c u l m i n gf l u i d i z e db e d b i o r e a c t o r c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d f l u i d i z i n gv e l o c i t y m a x i m u mf l u i d i z a t i o nv e l o c i t y t w o p h a s ep a r t i t i o n i n gb i o r e a c t o r s i m u l t a n e o u sr e a c t i o n e x t r a c t i o ns y s t e m d i s t r i b u t i o nr a t i o m a n n o s e l a u r i ea c i d w a t e r m o n o l a u r y lm a n n o s e v 脂肪酸糖酯 南极假丝酵母脂肪酶b 亲水一亲油平衡值 连续搅拌式反应器 连续活塞流反应器 填充床反应器 6 d 甘露糖月桂酸酯 3 , 6 d io 甘露糖月桂酸酯 4 , 6 d i o - 甘露糖月桂酸酯 1 , 6 d io 甘露糖月桂酸酯 薄层层析色谱 比移值 蒸发光散射检测器 循环流化床生物反应器 共轭亚油酸 临晃最小流化速度 最大流化速度带出速度 颗粒平均直径 颗粒密度 流体密度 流体粘度 甘露糖月桂酸酯的转化率 甘露糖月桂酸酯的浓度 甘露糖添加的浓度 两相分配生物反应器 同时反应萃取体系 分配比 萃取相中物质e 的量 反应相中物质e 的量 甘露糖 月桂酸 水 甘露糖月桂酸单酯 江南大学博士学位论文 d l m d i l a u r y lm a n n o s e s k l 和k 2 k l 和k _ 2 p 1 ，p 2 及p 3 p - l ，p - 2 及 p 一3 r e a e x t d m f c m c r m a ) ( 4 研加 r y r n 久 c p p 1 ， 如 a ” 彳g m m o l s o 艟h h s s p m e r e a c t i o np h a s e e x t r a c t i o np h a s e c r i t i c a lm i c e l l ec o n c e n t r a t i o n m a x i m a ls u r f a c ee x c e s s m i n i m u ma r e ap e rm o l e c u l e c r i t i c a lp a c k i n gp a r a m e t e r t h eg i b b sf l e ee n e r g yo fa d s o r p t i o n h e a d s p a c es o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n v i 甘露糖月桂酸二酯 合成平衡常数 水解平衡常数 月桂酸、单酯及二酯在向萃取 方向的分配系数 月桂酸、单酯及二酯向反应方 向的分配系数 反应相 萃取相 n ，n 二甲基甲酰胺 临界胶束浓度 最大吸附量 表面吸附分子的最小截面积 气体常数 溶液的表面张力 绝对温度 a v o g a d r o 常数 临界堆积参数 疏水链所占的体积 疏水基团的长度 表面活性剂分子的极性基团 的截面积 疏水链中碳原子数目 胶束自由能 溶剂的摩尔浓度 顶空固相微萃取 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：盏垒立逍 日 期： 这竺2 ：( ：丝 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：叠兰望公 导师签名：姥蝎 第一章绪论 1 1 研究背景与意义 第一章绪论 生物技术早已经应用于人们的生产和生活当中，如酿酒、奶酪制作等【l j 。现代生物技 术兴起于上世纪7 0 年代，是2 1 世纪发展最快的学科，成为解决人类所面临的食品、健康、 能源、环境等问题的新手段，并将是未来经济发展的新动力，在农业、动物饲养、能源、 生物法处理环境污染、纤维和包装材料、药物和医学等领域形成了巨大的产业。预计到2 0 1 0 年，全球2 0 的化工产品来自于生物技术，同时产值可达到3 0 0 亿美元 2 1 。而工业生物技 术( 又称为白色生物技术) 是继医学生物技术( 红色生物技术) 和农业生物技术( 绿色生 物技术) 之后兴起的第三种生物技术，引起人们越来越多的关注【3 j 。 工业生物技术是以酶和微生物为催化剂进行物质转化，大规模生产人类所需的化学 品、医药、能源、材料等，是解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段。它 为医药生物技术提供下游支撑，为农业生物技术提供后加工手段。世界经合组织( o e c d ) 指出：“工业生物技术是工业可持续发展最有希望的技术 。图1 1 为工业生物技术价值 链【4 】。 区圈一困 物理化学方法 和，或酶处理 生物催化剂 ( 微) 生物 精细化工 大宗化工 图1 - 1 工业生物技术价值链 f i g 1 - 1i n d u s t r i a lb i o t e c h n o l o g yv a l u ec h a i n 截止上世纪末，全世界对以脂肪、油脂和糖类为原料生产的表面活性剂的需求量已经 超过四百万吨【5 。脂肪酸糖酯( s a c c h a r i d ef a t t ya c i de s t e r ，s f a e ) 作为其中的一类非离子 表面活性剂，凭借其生物可降解、无毒及良好的功能性质而广泛的应用于食品、化妆品及 药品行业【6 - 9 。随着s f a e 用途的不断拓广和使用范围的逐渐增大，世界上s f a e 的产量也 在不断提高，近年来，全球仅蔗糖酯和葡萄糖酯的年产量就达到了6 0 0 0 吨左右【l0 。s f a e 的合成方法主要有两种：化学法和酶法。化学法往往是在高温、有毒溶剂及碱性催化剂下 进行的f 1 1 1 5 】，这就使得产品色泽较深、产生异味或存在安全隐患，并且产品的酯化位置或 江月大学* 学位论i 者酯化度不易控制【, 6 1 ，为产品的使用带来了不便。鉴于如此多的缺点，非水相或无溶剂体 系酶法催化酯化或转酯化合成s f a e 被视为化学法的替代方法。酶法的优点很多，如无需 对底物进行修饰而直接利用底物：反应条件温和，使用较低的温度；具有较高的区域选择 性等【1 7 - 2 0 】。图i - 2 为化学法与酵法酯合成工艺的比较【“i 。 栈缆b l i ， 生物催亿 h 引味 l # & * 窿水 催m 荆# 日巧 漂自荆 【m 1 $ ，- - i l l l ! l ! ：j j = * a 口裟e * 囤1 - z 传统方法与生物催化法酯合成工艺比较 魂1 - 2 c o n v e n t i o n a lv s h o n i 删p r o d u c t i o n o f e s t e r o i b 脂肪酶( l i p a s e , e c3 ，1 13 ) 是一类在食品、医药、制革、有机合成和生物能源等领域 有着广泛用途的工业用酶。其中南极假丝酵母脂肪酶b ( c a n d i d aa n t a r c t i c al i p a s eb ， c a l b ) 的用途最为广泛，它对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。n o v o z y m4 3 5 是将c a l b 吸附固定于大孔丙烯酸树脂的固定化酶，它及母体c a l b 在酯化、水解、转酯、 以及其它类型的反应中都显示了较为出色的催化性能。在s f a e 的合成中，n o v o z y m4 3 5 也常常被用于催化酯化和转酯化反应瞄j 。c a n d i d aa n t a r c t i c al i p a s e 优先酯化六碳糖的c 6 位羟基，同时存在次级酯化位点 2 0 , 2 3 - 2 4 。因此，二酯和或更高酯化度的酯的生成就存在着 可能。但是在以前的报道中，利用n o v o z y m 4 3 5 催化酯化合成s f a e 的过程中，并未发现 二酯或更高酯化度酯的生成口5 删。然而，最近的研究却发现，在用脂肪酶催化合成s f a e 过程中发现了二酯或三酯的生成口1 ，这与以前强调的酶具有高选择性而只有单酯生成的报 道并不一致。在本文的预研工作中，也发现了二酯和三酯的生成阱- 2 9 1 。并且s f a e 的表面 性质与其结构有着极其紧密的关系 3 0 l ，所以研究酶催化s f a e 酯化过程及选择性合成s f a e 具有重要的意义。 本课题通过对n o v o z y m4 3 5 催化甘露糖与月桂酸酯化反应生成甘露糖月桂酸酯的间歇 合成反应过程的研究，特别是对单酯及二酯生成规律的研究，揭示反应规律及影响区域选 择性控带恰成甘露糖月桂酸酯的关键因素。在分离、鉴定甘露糖月桂酸革酯和二酯异构体 的基础上，明确其构效关系，建立不同反应体系对单酯、二酯分别进行选择性合成，为单 酯、二酯的选择性控制合成和食品应用提供理论依据。通过本课题的研究工作将有助于有 机相酶促合成研究方向的深入，以推动食品添加剂绿色制造的技术创新。 由血由由 第一章绪论 1 2 本课题的研究历史与现状 1 2 1s f a e 及其用途 1 2 1 1s f a e 是环境友好、用途广泛的食品添加剂 s f a e 是以碳水化合物分支为亲水基团，一个或多个脂肪酸作为疏水基团组成的酯类 化合物，是一类典型的多元醇非离子型生物表面活性剂【3 1 3 3 】。其广泛存在于自然界中，是 生物体内一类具有重要生理活性的物质，在物质的跨膜运输和能量传递过程中均发挥着重 要作用【3 引，其可以直接从生物材料中提取 3 5 - 3 6 域者以可再生的资源以清洁的方法制各。因 为它具有很高的安全性，已相继被日本、联合国粮农组织( f a 0 ) 、世界卫生组织( w h o ) 、 欧共体、美国和中国等国家和组织批准作为食品添加剂和药用辅料。1 9 6 9 年，f a o 和w h o 食品添加剂标准委员会于承认蔗糖酯是高效而安全、可无限量加入的食品添加剂。目前， 蔗糖肪酸酯已经成为世界上消费量最大的乳化剂之一，在国内乳化剂市场中占有的份额正 在以每年3 1 0 的速率增长1 3 川。 由于s f a e 具有特殊的两亲结构，其亲水一亲油平衡( h l b ) 值可通过改变糖基、脂 肪酸种类或取代度来调节，因此拥有广泛的h l b 值范围，可做水包油型( o w ) 乳化剂和 油包水型( w o ) 乳化剂 3 8 - 4 3 】。它比传统的表面活性剂拥有更强的亲水性和亲油性，在油 水体系中具有更优越的界面化学性质，达到同样的表面效果只需要较少的使用量m j 。s f a e 水溶液的温度依存性1 4 5 】和对p h 的敏感性【4 6 】较传统表面活性剂的低，使用更方便，与其他 表面活性剂并用有增效作用，而且无配伍禁忌，故用途非常广泛。 s f a e 与其它表面活性剂( 如离子型表面活性剂) 相比，除具有优良的表面活性外， 还具有良好的生物相容性、易生物降解性、无刺激和无毒性等优点，是一类环境友好的表 面活性剂【4 7 郴】。近年来的研究还发现，某些s f a e 及其衍生物除具有良好的乳化、分散性 能以外，也是一类具有重要生理活性的物质。 1 2 i 2s f a e 广泛的应用前景 目前s f a e 已广泛地应用于食品、医药、发酵、化妆品、洗涤剂、