（食品科学专业论文）植物乳杆菌ZS2058生物转化法制备共轭亚油酸的研究.pdf

摘要 摘要 共轭皿油酸( c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ，c l a ) 是亚油酸( l i n o l e i ca c i d ，l a ) 衍生 的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有很多营养和保健功能，如抗癌、抗动 脉粥样硬化和延缓机体免疫力衰退、减肥等。在共轭亚油酸的各种立体异构体中由， l l 1 8 ：2 被认为最具生物活性。乳酸菌生物转化共轭亚油酸是当前生物法转化共轭亚油酸研究的热点， 为共轭亚油酸的合成提供了另一种有效的途径。 本文主要通过比较不同反应体系中植物乳杆菌z s 2 0 5 8 生物转化c l a 的转化率，确定最适 合的反应体系为静息态细胞在磷酸盐缓冲溶液中生物转化c l a 。通过正交实验确定了最适合 的反应条件为：底物浓度为3 m g m l ，细胞浓度为4 1 0 ”c f u m l ，反应温度：3 7 。c ，p h 6 0 ， 转化时间2 4 h 。在此反应条件下，c l a 转化率为3 1 7 6 。通过g c 法和g c m s 法检测，发现 反应过程中主要产生两个产物：c l a 和羟基脂肪酸h y 。产物c 【。a 中c 9 ，t l 卜c l a 占9 6 6 0 ， t l o ，c 1 2 一c l a 占2 4 0 ，还有少量其他异构体，说明亚油酸异构酶有高度的专一性。 根据植物乳杆菌z s 2 0 5 8 生物转化c l a 的反应进程曲线以及转化机理探索实验可知， ，以卜c l a 是生物转化过程的反应中间体，其可能的反应机理是：第一步，l a 在亚浊酸异构 酶的作用下异构化为c l a ：第二步，幽，t l 卜c l a 在水合酶的作用下进一步转化为羟基脂肪酸 h y 。 本文采用超声波破碎细胞获取亚油酸异构酶粗酶，最佳的破碎条件为：破碎功率3 2 0 w ， 破碎工作时间为7 5 m i n ，菌悬液浓度1 1 2 5 9 5 0 m l ，提取p h 7 0 ，添加0 2 m o l l n a c l 溶液。 并研究了亚油酸异构酶酶反应的最适条件为：p h 7 5 ，温度3 7 。c ，l a 浓度0 8 m g m l ，酶液体 积3 m l 以磷酸钠一柠檬酸缓冲溶液为反应介质，c a ”，螯合剂i ，1 0 一菲哕啉和e g t a 对l i 粗酶 没有明显的影响。酶液在4 。c ，p h 7 5 的磷酸钠一柠檬酸缓冲溶液中有较好的稳定性，酶波中 添加2 0 甘油和0 2 m o l l n a c l 溶液有助于提高亚油酸异构酶的稳定性。 对亚油酸异构酶的分布进行了研究，通过改变离心速度，对收集到的不同部位进行酶活 检测发现，酶活在菌体碎片，可溶蛋白和细胞膜中的分布比例分别为：2 6 5 3 ，3 0 。8 0 和 4 2 6 7 。同时，粗酶液经过0 7 t r i t o n x 一1 0 0 提取5 h 后，酶活能够提高3 4 7 倍。由此可 以知道亚油酸异构酶是一种膜结合酶，并且在菌体培养过程中添加l a 能诱导其产生。 关键词：植物乳杆菌，共轭亚油酸，亚油酸异构酶，生物转化，静息细胞，超声波破碎 a b s t r a c t a b s t t a c t c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ( c l a ) i sa m i x t u r eo fp o s i t i o n a la n dg e o m e t r i ci s o m e r so fl i n o l e i c a c i d ( c 1 82 ，c i s 9 ，c i s 一1 2o c t a d e c a d i e n o i c ) c l ah a sp o t e n t i a lh e a l t ho rn u t r i t i o n a le f f e c t s ，i n c l u d i n g a n t i c a r c e n o g e n i ca c t i v i t y , a n t i a t h e r o g e n i ca c t i v i t y , a n dt h ea b i l i t yt or e d u c et h ec a t a b o l i ce f f e c t so f i m m l l n es t i m u l a t i o na n dt or e d u c e b o d yf a t o f t h ei n d i v i d u a li s o m e r so fc l a ，c i s 一9 ， t y a ? l s l l o c t a d e c a d i e n o i ca c i dh a sb e e ni m p l i c a t e da st h em o s tb i o l o g i c a l l ya c t i v e t h es t u d yo f c l ab i o c o n v e r s i o nb yl a c t i ca c i db a c t e r i ai sv a l u a b l ea n dh a sb e e nt h ef o c u so fc o n s i d e r a b l e r e s e a r c he f f o r t si nr e c e n ty e a r s b i o c o n v e r s i o no fc l ab yr e s t i n gc e l l so fl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mz s 2 0 5 8i np o t a s s i u m p h o s p h a t eb u f f e rs y s t e mw a so p t i m i z e db yc o m p a r i n gw i t ht h eo t h e rr e a c t i o ns y s t e ma c c o r d i n gt o t h ec o n v e r s i o nr a t i oo fc l a 31 7 6 c l aw a so b t a i n e du n d e rt h er e a c t i o nc o n d i t i o na sf o l l o w s ： 3 m g m ll as o l u t i o n ，4 xl o c f u m lc e l lm a s s ，o p t i m a lt e m p e r a t u r e 3 7 。ca n dt h eo p t i m a lp h v a l u e 60 t w om a i np r o d u c t sw e r ed e t e c t e db yg a sc h r o m a t o g r a p h ya n dm a s ss p e c t r o s c o p y t h e ya r e c i s 9 ，t r a n s l l - c l aa n dh y d r o x y - o c t a d e c a e n o i ca c i d i nt o t a lc l a ，9 6 6 0 w a sc 9 ，t l l c l a ，2 4 w a st 1 0 , c 1 2 一c l a i no u r e x p e r i m e n t s ，c 9 ，t l1 - c l a r o s ei nc o n c e n t r a t i o n ，b u tl a t e rd e c r e a s e d ，w h i l e h y d r o x y - o c t a d e c a e n o i ca c i da c c u m u l a t e d t h i ss u g g e s t st h a tc 9 n 1 一c l am a yb es u b j e c tt of u r t h e r m e t a b o l i s m ，p o s s i b l yb yah y d r a t a s e c 9 ，f l1 c l aw a si d e n t i f i e da st h es u b s t r a t ef o rh y d r a t a s e u l t r a s o n i cw a v ew a su s e di nt h i sp a p e rt od i s r u p tt h ec e i l so f l a c t o b a c i u u sp l a n t a r u mz s 2 0 5 8 s oa st oe x t r a c tl i n o l e a t ei s o m e r a s e i s e m e r a s ee x t r a c t i o n ，s o l u b i l i z a t i o na n d s t a b i l i t y w e r e s i g n i f i c a n t l yi m p r o v e db yo p t i m i z i n gb u f f e rc o m p o s i t i o n ，p h ，t e m p e r a t u r e ，a n da d d i t i o no fn a c l a n dt r i t o n x 一1 0 0 n os i g n i f i c a n te f f e c tw a so b s e r v e dw i t hc a l c i u m i s o m e r a s ea c t i v i t yw a sn o t i n h i b i t e d b y t h ec h e l a t o r s e g t a o r l ，1 0 一p h e n a n t h r o l i n e w e r ee x a m i n e d h i g hi s o m e r a s ea c t i v i t yw a so b s e r v e di nm e m b r a n ep e l l e t ，w h i c hs u g g e s t st h a ti s o m e r a s ew a s am e m b r a n eb o u n de n z y m e ，w h i c hc a l lb ei n d u c e db yl a d u r i n gi n c u b a t i o n k e yw o r d s ：c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ，l a c t o b a c i l t u sp l a n t a r u m ，l i n o l e a t ei s o m e r a s e ，r e s t i n g c e l l s ，u l t r a s o n i cd i s r u p t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：艇匾芝签名：型垒旦红芝日期：旆弓月知日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：组逐楚导师签名： 税物 日期：p 寸年弓月知日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 共轭亚油酸( c l ) 概况及其生理功能 1 1 1 共轭亚油酸 共轭亚油酸( c o n j u g a t e d l i n o l e i c a c i d ，c l a ) “1 可以看成由必需脂肪酸亚油酸( 1 i n o l e i c a c i d ，l a ) 衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。这些位置异构体包括一7 ， - 9 ：8 ，- 1 0 ：a 一9 ，一1 l ：a 1 0 ，a 一1 2 ：一1 1 ，一1 3 和- 1 2 ，- 1 4 十八碳二烯 酸，其中每个双键可以以顺式( c i s 一) 或反式( r a n s 一) 构型存在。这样c l a 的立体异构体 就多达十几种甚至更多。其中c 9 ，t i l 1 8 ：2 和i t 0 ，c i 2 - 1 8 ：2 两种异构体被认为最具生物活性， 特别是西，t 1 1 - 1 8 ：2 ，见图1 - 1 。这是因为c 9 ，t l l 一1 8 ：2 是唯一能被动物细胞吸收进入其磷脂 层的共轭亚油酸异构体嘲，同时观f 1 1 - 1 8 ：2 也是在人们的日常食物中含量最高的共轭亚油酸 异构体。而t l o ，c 1 2 - 1 8 ：2 在改善人体的身体组成哪，减肥等m 方面具有明显的效果。 o 图卜1 亚泊酸和两种主要共轭亚油酸图 f t g1 - ! s 牡u c t u r eo f l i n o l e i ca c i da n d w o om a i ni s o m e r so f c o n j u g a m dl i n o l e i ca c i d 天然的c l a 主要是存在于反刍动物牛和羊等的肉和奶中，每克乳脂中含量从2 m g 至2 5 m g 不等，且c l a 的含量随奶牛的年龄增长而增加8 1 。特别是具有生物活性的c 9 ，t l l 异构体在食 品中的含量很少。自然界中c l a 的含量并不是很高，所以c l a 不可能从天然植物的种子油中 大量获得。因此，主要通过人工合成大量c l a 。通常以亚油酸或富含亚油酸的植物油为底物， 通过碱催化”1 的异构化反应可合成c l a ，或者以酸为催化剂的油酸烯丙醇脱水法合成c l a ，这 些合成方法得到的c l a 是多种异构体的混合物。最新改进的人工合成方法主要是微生物发酵 法生成共扼亚油酸，许多微生物在代谢过程中都会产生c l a ，但是工业上使用最多的是乳酸菌 【8 】。 江南大学硕士学位论文 1 1 2g l a 的主要生理功能 共轭亚油酸是一种非常令人感兴趣的营养添加剂已大量用于农业和食品工业。活性共 轭亚油酸在生理功能方面具有独特营养性，共轭亚油酸是一种很强的抗癌物质，具有抗动脉粥 样化形成、抗糖尿病、增强免疫力、参与脂肪代谢并减少脂肪在体内的积累而增加瘦肉量、 影响骨骼形成、促生长因子作用、及抗氧化作用等生理功能。以下简述共轭亚油酸的几种主 要的生理功能。 1 1 2 1 抗肿瘤作用 近年来，c l a 以其显著的生物学活性成为学者们关注的焦点，尤其是显著的抗肿瘤作用 为防治癌症提供了新的思路。c l a 抑制肿瘤细胞发生、发展的作用已经得到证实，但其作用 机制尚有不同论点。经归纳总结，目前有以下几种可能的抑制机制：1 ) c l a 通过诱导脂质过 氧化产物的形成抑制肿瘤发生。研究证实c l a 能促进脂质过氧化，通过脂质过氧化产物对肿 瘤细胞的毒性而发挥抗肿瘤作用。哈尔滨医科大学c l a 课题组洲和s c h o n b e r g 和k r o k a n ”1 证 实了这一观点。2 ) c l a 通过脂类代谢抑制肿瘤的形成。这主要通过两个途径实现，一是调节 类二十碳烷酸的生成：类二十碳烷酸代谢途径与癌症、动脉粥样硬化、肥胖等疾病的发生有 关；二是c l a 通过调节p p a r 的表达影响脂类代谢：c l a 不仅可以影响p p a ry 反应基因的表达， 而且可以诱导p p a r y 基因本身的表达嘲，研究证实p p a r y 的活化剂能预防乳腺癌、结肠癌和 前列腺癌的发生。3 ) c l a 抑制肿瘤细胞的增殖。体内实验发现，c l a 抑制乳腺末端滤泡 ( t e r m i n a le n db u b s ，t e b s ) 的增值嘲。4 ) c l a 诱导肿瘤细胞凋亡。体内实验表明，膳食 c l a 主要促进乳腺、结肠嘲、前胃洲等多种组织中的肿瘤细胞凋亡来抑制癌症的发生。 1 1 2 2 抗动脉粥样化形成 血液中l i ) l 一胆固醇浓度高是动脉硬化的主要病因。l e e 等( 1 9 9 4 ) 研究发现，c l a 能降低 动脉粥样硬化，减少动脉粥样硬化模型动物的主动脉中脂肪条纹形成。在防止动脉粥样硬化 过程中，c l a 可能起到有益作用。l e e 等( 1 9 9 4 ) 和n i c o k l 等( 1 9 9 3 ) 研究表明，饲喂c l a 饲料的田鼠和兔子主动脉壁上的病灶逐渐变小变薄。另据报道，c l a 能够阻止脂肪和血小板 在粥状病交的动脉壁上沉积，这可能是c l a 抗粥状动脉硬化的主要原因。r o b e r tn l c o w s i 研 究表明减少血小板在动脉壁上沉积，c l a 的作用是l a 的5 倍。另外，c l a 也能降低血液中胆 固醇的含量。c l a 可抑制酰基辅酶a 胆固醇酰基转移酶的活性，这种酶可能与胆固醇的吸收 有关。 1 1 2 3 减肥作用 1 9 9 2 年c h i n 等报道了c l a 能降低脂肪含量并增加肌肉质量，后来在人及鼠类、鸡等动 物中都观察到膳食中补充c l a 能达到减肥的目的。c l a 的减肥作用可能有几个机制( 1 ) 通过 2 苎二兰箜堡 调节脂类代谢及能量代谢减少脂肪的积累。”；( 2 ) c l a 通过抑制增殖及诱导脂肪细胞的凋亡 实现其减肥作用；( 3 ) l e p t i n 可能介导c l a 减少身体脂肪的作用嗍。在人及鼠中都观察到 c l a 能迅速降低血液中的l e p t i n 水平，可能是c l a 的抗肥胖机制之一。 1 1 3e t a 的主要检测方法 目前共轭亚油酸( c l a ) 的分析方法主要采用g c 法【”和a g l i p l c “”法，其中g c 分析 法是脂肪酸的常规分析方法，主要根据脂肪酸碳链的长短和不饱和度进行分离。g c 法也是目 前应用最广的分析共轭亚油酸异构体的方法，但用该法分析c l a 异构体对色谱柱的要求很高， 普通的用于分析脂肪酸的色谱柱不能有效地分离各异构体。目前，a g - h p l c 分析法越来越广 泛的用于分析不饱和脂肪酸，主要是由于不饱和脂肪酸中的两个双键作为电子供体，a g + 作为 电子受体形成稳定的络合物a g + ( c 扎) 。络合物存在一对孤对电子，体现为一个双键，根据该 双键位置和几何结构进行分离用该法分析c l a 对液相色谱设备的要求很高，而且a g - h p l c 柱的价格非常昂贵。 紫外光谱仪器价格便宜，操作简便，是有机化合物分析中的重要工具。c l a 中存在的共 轭双键在2 3 4r i m 波长下有特殊吸收，而l a 在该波长下没有吸收【5 1 。因此，能快速检测c i a ， 但是该法不能鉴别各异构体，仅适合分析c l a 总量。 在本实验中，将采用g c 法和紫外分光光度法两种方法来检测c l a ，在前期研究c l a 转化 机理阶段将采用g c 法，在后期研究亚油酸异构酶酶学特性阶段，由于工作量较大将采用紫外 分光光度法进行分析。 1 2 生物转化法制备0 l a 微生物生物转化法是利用微生物中特定的酶将人工合成的非天然化合物进行生物转化， 转化液经分离纯化可得到所需要产品的过程。1 9 8 4 年，k i e s l i c hw i a l c o l m d l i l l y “给生物 转化下了一个比较明确的定义：“s e l e c t i v ee n z y m em o d i f i c a t i o n so fd e f i n e dp u r e c o m p o u n d si n t od e f i n e df i n a lp r o d u c t s 。”即：选择特定的酶修饰特定的化合物以获得目 的产物。生物转化法与直接发酵法生产的本质相同，皆属酶催化的反应，但前者为单酶或多 酶的高密度转化，而后者为多酶低密度转化，此外。生物转化至少有一种产物与反应物在结 构上相似，由于生物转化过程实际利用的是具有活性的酶，因此催化的反应具有重要的特征： 反应的专一性，立体选择性和光学立题选择性。 目前共轭亚油酸合成的方法主要有化学法和生物法两种伽，其中共轭亚油酸的化学合成 法主要有碱性异构化法，油酸烯丙醇脱水法和蓖麻油合成法等由于化学法合成共轭亚油酸 具有转化率高、产量高的特点，目前工业上应用较多但是，由于化学法生产c l a 的工艺环 境污染较大，副产物多，所得产品中c 9 ， 1 1 一c l a 含量低，而且两者不易分离，使得该法的应 用越来越受到限制。生物法合成c l a 反应条件温和，异构体组成较单一，与天然食物中得到 的c l a 组成相似，其主要异构体是c 9 ，t l l - c l a ，其它异构体含量少，而且生物法转化共轭亚 江南大学硕士学位论文 油酸产品的安全性较高。因此，对其研究比较重视。 1 2 1 生物酶异构化法的菌种 很多微生物都可以作为生产c l a 的菌种。已经研究发现的主要集中在瘤胃菌、乳酸菌、 丙酸菌等，详见表卜1 。 表1 - 1 产生c l a 的菌种 t a b l e l 1c l a s s i f i c a t i o no f d i f f e r e n tb a c t e r i at h a tp r o d u c ec l a 1 2 2 生物转化c l a 的机理探索 生物合成共轭亚油酸的方法主要是利用瘤胃细菌如溶纤维丁酸弧菌( b u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n s ) 嘲、乳酸菌如( l a c t o b a c i j u sa c i d o p h i l d 踟；l a c t o c o c c u sl a c t y ，”、 b i f j d o b a c t e r i d “，如t d 如c j j 坩印a n t a r u 矗捌等) 来生物合成共轭亚油酸。据报道，共轭 亚油酸的生物合成途径主要有两种，第一种是亚油酸异构酶先作用于亚油酸使之发生异构化， 生成c l a ，接着氢化酶作用于c l a 使之最终氢化为硬脂酸，这种途径( 图卜1 ) 。”常见于瘤 胃细菌生物转化c l a 的过程1 ；第二种是亚油酸不是从非共轭双键经一步异构化而成为共轭 双键，而是涉及到中间产物羟基脂肪酸的合成，然后迸一步脱水形成c l a ，这种途径( 图卜2 ) 则常见于乳酸菌生物转化c l a 的过程。由于溶纤维丁酸弧菌( 励t y r i v s b r i of i b r i s o l v e n s ) 等瘤胃细菌严格厌氧而不能应用于工业生产c l a ，而乳酸菌一般是兼性厌氧菌，容易培养。 而且乳酸菌具有比瘤胃细菌更强的生物转化共轭亚油酸的能力。因此，近年来关于利用乳酸 菌来生物合成共轭亚油酸的研究得到了科学家们的广泛关注。 ， 此外，还有一种说法认为乳酸菌中也存在亚油酸异构酶，能将亚油酸或具有类似结构的 其他游离脂肪酸异构化为c l a 。亚油酸异构酶( l i n o l e a t ei s o m e r a s e ，简称l i ) 是一种将亚 4 墨= 兰堕丝 油酸催化异构化形成c 9 。t l l - c l a 的异构酶，可来源于多种细菌和真菌。l a c t o b a c i l l u s 、 c 1 0 s t r i d i u m 、f r o p i o n i b a c t e r y u m ，b u t y r i 订b r i o ，点u b a c t e r i u m ，f u s o c i l l u s ，p e d i o c o c c u s a e r o c o c c u s 等微生物都有l i 活性恤”1 ，另外，c o a k l e y 等。”从b i f i d o b a c t e r i u m 中也筛选到 具有亚油酸异构酶活性的菌株。亚油酸异构酶具有较强的生物转化c l a 的能力，因此研究利 用亚油酸异构酶生物催化合成c l a 具有很大的优势和发展前景。 a c - 9 。c - 1 2 , c - 1 5c i 。3c - 9 ，o 1 2c l s - 2 c - 6 ，c - 9 ，c - 1 2c i l 。 t - l o ，o - 1 2 ，c - 1 5c l s ：3 t - l o ，c - 1 2c t s ：2 ( c l a ) c - 6 , t - l o ，c - 1 2 ，c l l 3 l fl f l f c - 6 , t - l oc 1 ”竺二- t - l oc l l l 二= “，t - t oc l = ：2 图1 2 瘤胃细菌( 溶纤丁酸弧菌) 生物转化c l a 的主要途径，a c 9 ，t l i - c l a 的合成途径；b t l o ，c 1 2 - c l a 的合成途径 5 江南大学硕士学位论文 f i g 1 2p r e d o m i n a n tp a t h w a y so f b i o h y d r o g e n a t i o no f d i e t a r yl i n o l e i ca n dl i n o l a n i ca c i d si nt h em m e n u 粼灏| c 瓣g馨瓣鞫 勃一一萄蜀试 嘲莲一j 二每。，一。蠢、竺鬈， 。蝴6h l c u 髓矗2 麓一嬲、的暑。、裂 图卜3 乳酸菌( 嗜酸乳杆菌a k u i l 3 7 ) 生物转化c l a 的可能途径 f i g 1 3p r o p o s e dp a t h yo f l i n o l e i ca c i di s o m e r i z a t i o nt oc l ab yl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u a 1 2 3 生物转化c l 的国内外研究状况 早在二十世纪二三十年代，在反刍动物的肉制品及其乳制品中发现了c i a 反刍动物 体内的c l a 是通过微生物将其生活环境中的l a 等底物通过生物氢化完成的，c l a 是生物氢化 过程中由亚油酸异构酶异构化而得到的中间异构体，1 9 6 7 年k e p l e r 等人h 1 1 从溶纤维丁酸弧 菌( b u t y r i v i b r i oh b r i s o l v e n s ) 中成功分离并纯化出亚油酸异构酶，这是人们首次从微生 物细胞内分离出亚油酸异构酶。但是由于溶纤维丁酸弧菌( b u t y r i v i b r i of i b r i s o l v o n s ) 严 格厌氧，在实验室中都很难培养不适合进行工业化生产。 c l a 具有显著的生理功能和应用价值，从而吸引了广大科学家的兴趣，并对其进行了深 入的研究。主要研究了c l a 各异构体的生理功能；c l a 的制备方法，包括化学法和生物法； 由于化学法合成共轭亚油酸具有转化率高、产量高的特点，目前工业上应用较多但是，化 学法的缺点是产品中各种异构体并存，无选择性。生物法合成c l a 的转化率相对于化学合成 法较低，但是由于生物法合成共轭亚油酸具有特异性，产物中的c 9 ，t l 卜1 8 ：2 含量高，其它 异构体含量少，而且生物法转化共轭亚油酸产品的安全性较高。因此，近年来关于利用微生 物，尤其是亚油酸异构酶合成c l a 的研究成了国际相关领域研究的前沿热点。除了早先在反 刍动物体内的瘤胃细菌中发现亚油酸异构酶，科学家们还致力于在其他微生物中发现能转化 c l a 的生物酶。1 9 9 9 年美国科学家p a r i z a 报道了一株乳酸杆菌( l a c t o b a c i l l u sr e u t e r i ) 具有一种细胞膜结合酶，它能以游离的亚油酸为原料合成c l a 。2 0 0 1 年日本的科学家o g a w a 等啪1 报道了嗜酸乳酸杆菌a k u1 1 3 7 以l a 为原料转化为c l a 的过程不是从非共轭双键经一 步异构化而成为共轭双键，而是涉及到中间产物羟基脂肪酸的合成，这是首次揭示l a 到c l a 的转化机制。2 0 0 2 年美国c o r n e l l 大学科学家l i u 等人伽以葵花子油为底物筛选出一株可以 转化亚油酸为共轭亚油酸的乳酸乳球菌，该结果表明乳酸菌不仅可以将游离的亚油酸也可以 将甘油三酯形式的亚油酸转化成共轭亚油酸。2 0 0 2 年r a i n i o 等人研究了丙酸菌休止细胞的 6 第一苹绪论 c l a 形成动力学，在实验中发现丙酸菌细胞在转化l a 为c l a 的过程初期，体系中的l a 以恒 定的速率进入细胞内部，通过亚油酸异构酶的催化作用丙酸菌细胞内的共轭亚油酸含量随时 间而增加。在此过程中，丙酸菌细胞没有受体内l a 和c l a 的增加而失活。进入c l a 转化的中 期，体系中l a 转移入细胞的速率减少，c l a 的合成量继续增加，丙酸菌细胞开始慢慢失活， 当每克细胞所含的c l a 达到3 1 r a g 时，丙酸菌细胞转化c l a 作用完全中止。2 0 0 3 至2 0 0 6 年间， 日本科学家o g a w a 6 删等继续研究生物转化c l a ，研究发现植物乳杆菌a k u1 0 0 9 a ，植物乳杆 菌j c m1 5 5 1 能转化蓖麻油酸和蓖麻油为c l a ，各菌种对c l a 的转化率有较大的差异，而且产 物c l a 中各异构体的比例也不尽相同，并揭示了植物乳杆菌转化蓖麻油酸为c l a 的转化途径有 两条：一是蓖麻油酸在1 2 脱水酶作用下形成亚油酸，继而形成羟基脂肪酸，最后形成c l a ， 这一途径中主要产生国，t l i - c l a 和t 1 0 ，c 1 2 一c l a 两种异构体；二是蓖麻油酸在1 1 脱水酶 作用下直接形成c 9 ，t l i - c l a 。2 0 0 6 年美国科学家s u s a n 嗍等通过d e a e ，聚焦色谱和凝胶色谱 方法，从梭状芽孢杆菌上分离到膜结合的亚油酸异构酶。目前，已有一部分科学家着手从分 子生物学角度对亚油酸异构酶进行更加深入的研究。r o s s o n 研究小组对l a c t o b a c i l l u s r e u t e r ip y r 8 和p - r o p i o n i b a c t e r i u mh c n s s 的亚油酸异构酶基因进行了克隆和测序，分别在 大肠杆菌中得以表达，并检测到重组酶的活性；随后，e l l e n t m 从i 墨? o p i n i b a c t e r i u ma c n e s 克隆得到的亚油酸异构酶基因，从而构建花椰菜花叶病毒质粒感染烟草植物，并在该烟草的 种子中检测到c l a 生成。 国内对生物转化c l a 的研究起步较晚，2 0 0 3 年台湾大学l i n 教授等人通过溶菌酶、超 声波破壁和硫酸铵沉淀等方法首次从乳酸菌( 嗜酸乳杆菌，l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s c c r c l 4 0 7 9 ) 中提取出乳酸菌亚油酸异构酶的粗酶液。但是对乳酸菌来源的亚油酸异构酶的进 一步研究还没有相关的报道。2 0 0 4 年，张中义洲等筛选了一株具有转化c l a 能力的植物乳杆 菌，同年，本实验室周凌华删也筛选到一株具有转化c l a 能力的植物乳杆菌z s 2 0 5 8 。2 0 0 4 年 至2 0 0 6 年柴秋儿“”等对植物乳杆菌转化c l a 的特性进行了研究。2 0 0 5 年，苗士达咖1 等通过 硫酸铵沉淀，阴离子交换和凝胶过滤，首次从植物乳杆菌l 一2 9 分离到了亚油酸异构酶。2 0 0 6 年，张艳禾等删从l ，r e u t e r ip y r 8 中克隆出与c l a 生物合成相关的基因一亚油酸异构酶基 因，通过同源重组整合到毕赤酵母细胞中，构建了工程菌株g s l l 5 p p i c 9 k - l i ，成功表达了 亚油酸异构酶，对表达产物进行生物活性测定，通过气相分析，证明所获得序列的编码产物 具有亚油酸异构酶活性。这是首次将厶r e u t e r ip y r 8 亚油酸异构酶基因在毕赤酵母株获得 表达，为酶异构法生成c l a 提供了新的途径，同时为构建高产c i a 基因工程菌株和大规模应 用在食品工业生产中奠定基础。 1 3 立题意义 基于对c l a 生理活性的认识，c l a 己经或将被应用于药品、保健品、功能食品和食品防 腐剂等领域。首先是可能被用作药品。尽管其作用机理尚不清楚，也还未进行临床实验，但 其神奇的抗癌作用和减肥作用正促使更多的研究者加入探索的行列，有理由相信高纯度的活 性异构体将来可能会应用于临床治疗与康复。其次是作为保健品c l a 作为动物的次生代谢 垩童奎堂堡主兰丝堡壅 物，是天然的，不存在所谓的同源性问题。原则上讲不存在使用上限，经常食用，对身体有 益无害。再者是作为制造功能性食品的配料，可以人为地在某些人们经常使用的食品比如牛 奶中添加一定剂量的c l a ( 建议按人体正常摄入食物总重的l 5 ) ，这样可以弥补人体 摄入c l a 的不足，增强人类抵抗许多疾病的能力。 目前，商品化的共轭亚油酸主要是通过化学法制备所得，利用该法制备的共轭亚油酸主 要存在以下缺点：产物是多种异构体的混合物，高温反应产生有毒物质反式脂肪酸，有机溶剂 残留等。而生物法制备c l a ，具有高度专一性，产物主要为活性异构体c 9 ，f l l c l ，并且没 有有机溶剂残留等问题，特别是利用乳酸菌制备c l a 反应条件温和，易于操作和控制，因此 国内外研究者投入了大量精力研究利用乳酸菌制备c l a 。 。 尽管国内外科学家对乳酸菌生物转化共轭亚油酸进行了大量的研究，也筛选出一些具有 共轭亚油酸合成能力的乳酸菌，并对乳酸菌生物转化共轭亚油酸的机理进行了探讨，如提出 亚油酸异构酶是乳酸菌合成共轭亚油酸的关键酶等，并从乳酸菌细胞内提取出了亚油酸异构 酶的粗酶液。但是，生物法转化c l a 的转化率较化学法低，并且对乳酸菌亚油酸异构酶的产 生机理、亚油酸异构酶的酶学性质和亚油酸异构酶在反应体系中的催化动力学等都还没有进 行更深入的研究。而生物转化c l a 的关键就是菌体细胞中l a 异构酶活性以及发酵条件的优化， 研究开发便宜、容易培养和可以食用的产l a 异构酶的微生物是实现c l a 工业化生产的前提， 所以，筛选、改良高活性产l a 异构酶的微生物菌株以及优化发酵条件是当前生物转化c l a 的 重要内容和研究热点。 本实验室已经筛选到一株具有转化c l a 能力的植物乳杆菌z s 2 0 5 8 ，并对其在s k m 体系中 的转化条件进行了初步探讨，在此基础上，本文立足于对植物乳杆菌z s 2 0 5 8 休止细胞生物 转化c l a 的机理进行探讨，对亚油酸异构酶的定位，酶学性质及在反应体系中催化合成共轭 亚油酸的关键因素等进行更深入的研究，为利用酶工程技术合成共轭亚油酸提供必要的理论 依据和指导。 1 4 主要研究内容 本文的主要研究内容是通过比较不同反应体系中z s 2 0 5 8 生物转化c l a 的转化率，确定 最适合的反应体系以及反应机理；研究亚油酸异构酶的定位以及粗酶液的提取，并对其酶学 性质进行研究。具体内容分四部分： 1 植物乳杆菌z s 2 0 5 8 生物转化c l a 的反应体系的确定和反应机理的探讨 2 植物乳杆菌z s 2 0 5 8 生物转化c l a 的最适反应条件的确定 3 超声波破碎提取亚油酸异构酶粗酶和亚油酸异构酶的定位 4 亚油酸异构酶粗酶酶学性质的研究 第二章植物乳杆菌z s 2 0 5 8 生物催化共轭亚油酸反应机理的初步研究 第二章植物乳杆菌z s 2 0 5 8 生物催化共轭亚油酸反应机理的初步研究 2 1 引言 共轭亚油酸( c l a ) ，特别是c 9 ，t 1 1 - c l a 因其具有显著的生理功能而倍受关注。目前，共 轭亚油酸的工业化生产主要通过化学合成的方法，但是，化学法存在着许多缺点，其中最主 要的是产品中各种异构体并存，无选择性；而利用生物合成法制备共轭亚油酸恰恰可以克服 这一缺点。 研究表明，共轭亚油酸的生物合成途径主要有两种，一种是亚油酸异构酶先作用于亚油 酸使之发生异构化，生成c l a ，接着氢化酶作用于c i a 使之最终氢化为硬脂酸，这种途径常见 于瘤胃细菌生物转化c l a 的过程伽；另一种是亚油酸不是从非共轭双键经一步异构化而成为 共轭双键，而是涉及到中间产物羟基脂肪酸的合成，然后进一步脱水形成c l a ，这种途径则 常见于乳酸菌生物转化c l a 的过程。第一种途径必须在严格厌氧条件下才能发生，因为瘤 胃细菌都是严格厌氧菌。对于更多的乳酸菌中也存在着亚油酸异构酶，这种酶在有氧存在的 情况下，也可以继续将亚油酸转化为共轭亚油酸，因此深入研究乳酸菌及其亚油酸异构酶来 催化合成共轭亚油酸，已成为国际上普遍的研究趋势。 本章对实验室保藏的植物乳杆菌z s 2 0 5 8 在不同反应体系中生物转化c l a 的能力及其完整 细胞在缓冲液中生物转化c l a 的反应途径进行了初步的研究。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料 2 2 1 1 菌种 植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) z s 2 0 5 8 ，本实验室从自制泡菜中分离筛选所得嘲。 2 2 1 2 培养基 均采用m r s 培养基。 2 2 1 3 主要试剂 亚油酸 共轭亚油酸 9 9 9 9 美国s i g i l a 公司 美国s i g i a 公司 ， 9 江南大学硕士学位论文 红花籽油 葡萄塘 蛋白胨 酵母浸膏 牛肉浸膏 柠檬酸氢二铵 磷酸氢二钾 无水乙酸钠 硫酸锰 硫酸镁 吐温一8 0 甲醇 n a o h 盐酸 硫酸 乙醚 尿素 三氯甲烷 二氯甲烷 2 一氨基一2 一甲基丙醇 三氟化硼乙醚 n a c l 正己烷 2 2 1 4 主要仪器 仪器名称 超净工作台 p h 计 移液枪 离心机 冷冻离心机 恒温水浴锅 电子天平 微型漩涡混合仪 循环水真空泵 旋转蒸发器 东海粮油集团有限公司 上海来泽精细化学品厂 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国上海兴塔美兴化工厂 中国上海兴塔美兴化工厂 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 f l u k ac h e m i ea g ，c h - 9 4 7 0b u c h s 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 型号 s w - c j - 1 f d 3 2 0 - s u n i v e r s a l 3 2 r e l - 2 0 4 s h z - 3 r e - 8 5 z 生产厂家 苏州安泰空气技术有限公司 m e t l l e r - t o l e d o 公司 e p p e n d o r f 公司 上海安亭科学仪器厂 德国h e t t i c h 公司 上海精宏实验设备有限公司 m 聊l 职一t o l e d 0 公司 上海沪西分析仪器厂 河南省巩义市英峪华中仪器厂 上海青浦沪西仪器厂 l o 觚眼隙腿觚脓从从从胍从胍从觚觚胍熊从 觚觚胍 第二章植物乳杆菌z s 2 0 5 8 生物催化共轭亚油酸反应机理的初步研究 回转式恒温调速摇床h y g i i 上海新星自动化控制设备成套厂 气相色谱仪a g i l e n t 6 8 9 0美国安捷伦公司 色谱柱 s 卜2 3 8 0 s u p e l c o 公司 气相色谱一质谱连用仪g e - 2 0 0 0 t r a c e 美国f i n n i g a n 公司 色谱柱 b p x - 7 0 s g e法国v i l l e n u v es a i n tg e o r g e s 隔水式电热恒温培养箱p y x - d h s南京实验仪器厂 立式压力蒸汽灭菌器 i s b 5 0 l上海华线医用核子仪器有限公司 其他为实验室常用仪器设备 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 菌种的培养 从斜面上挑取少量植物乳杆菌( l a c t o b a c l l l u sp l a z t a r u