（食品科学专业论文）火棘多糖的初步研究.pdf

火棘多糖的初步研究 杨锋 v -6 1 0 1 8 6 摘要火棘( p y r a c a n t h af o r t u n e a n a ( m a x i m ) l i ) ，又叫赤阳子、救军粮， 主要分布于我国东南和西南部。其果实、叶和根都可药用，果实具有健脾消积、 活血止血等功能。同时也可食用，酸甜适口、香气浓郁，含有丰富的营养物质。 因此作为药食两用的火棘具有很大的开发价值。 为了进一步开发火棘野生资源，本论文对秦巴山区产火棘果实中水溶性多糖 的提取、分离纯化、理化性质、生物活性、膳食纤维的制各及特性等方面进行了 较为深入的研究，取得了如下的研究结果。 火棘水溶性多糖的最佳提取工艺为：9 0 水，提取9 小时，料液比为l ：l o ； 在此条件下火棘多糖的提取率约为3 5 ；超声波处理可使火棘多糖的得率提高3 0 以上。 采用d p p h 分光光度法对火棘粗多糖进行体外抗氧化试验，结果表明火棘粗 多糖具有明显的清除d p p h 作用，s c s 。为1 8 7 m g m l 。 经试验。蛋白酶- s e v a g 法具有较好的脱蛋白效果；l s a 一8 大孔吸附树脂可以 用于火棘粗多糖的脱色；再经d e 一5 2 和s e p h a d e xg 一2 0 0 柱层析分离得到p p - a 2 、 p p - a 3 、p p - b 2 三种多糖组分。 气相色谱、红外光谱、理化特性分析结果表明p p - a 2 和p p - b 2 是同一物质， 主要由阿拉伯糖和鼠李糖组成，其中还含有少量的果糖、半乳糖和甘露糖，阿拉 伯糖：鼠李糖：果糖：半乳糖：甘露糖= 5 0 5 ：4 5 1 ：3 3 7 ：1 8 8 ：1 ，经s e p h a d e xg - 2 0 0 柱层析测定其分子最为3 0 ，0 0 0 d a l ，不同的是p p b 2 中含有少量多酚类色素物质。 p p - a 3 是一种糖蛋白，分子量为2 1 0 ，0 0 0 d a l ，主要由阿拉伯糖组成，其中含有少 量的葡萄糖和果糖，阿拉伯糖：葡萄糖：果糖= 1 6 2 ：l ：1 5 9 ，其中氨基酸总含量为 0 5 ( 半胱氨酸未检出) 。 火棘多糖作为膳食纤维类功能性食品添加剂，具有较好的膨胀力、持水力及 阳离子交换能力，同时具有较好的清除自由基能力，其作为面条改良剂时的最适 使用量为3 左右。 关键词火棘多糖理化性质膳食纤维 t h e p r e l i m i n a r ys t u d y o n p o l y s a c c h a r i d e f r o m p y r a c a n t h a f o r t u n e a n a y a n gf e n g a b s t r a c t p y r a c a n t h a f o r t u n e a n a ( m a x i m l i ，w h i c h w a sa l s on a m e d c h i y a n g z i a n d j i l q u n l i a n g , i sm a i n l yd i s t r i b u t e di nt h es o u t h e a s ta n d s o u t h w e s to fc h i n a i t sf r u i t 1 e a fa n dr e o ta l lc o u l db eu s e da sm e d i c i n ei nc h i n af u r t h e r m o r e ，i t sf r u i tw a se d i b l e ， w h i c hc o n t a i n e da b u n d a n tn u t r i m e n t s op y r a c a n t h a f o r t u n e a n a ( m a x i m ) l if r u i th a d g r e a te x p l o i t a t i o nv a l u e i no r d o rt ou l t e r i o r l y e x p l o i tp y r a c a n t h af o r t u n e a n a ( m a x i m ) l ir e s o u r c e t h e a u t h o rc o n d u c t e das e r i e so f s t u d y o nt h e w a t e r - s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e f r o m p y r a c a n t h a f o r t u n e a n a a n da c h i e y e dt h ef o l l o w i n gr e s u l t s t h eo p t i m a le x t r a c t i o n t e c h n o l o g y o fp y r a c a n t h af o r t u n e a n a p o t y s a c c h a r i d e s w e r e9 0 ，9 h ，1 0 ：i ( w w ) o fw a t e rt oi t sf r u i t e x t r a c t i o nr a t i oo ff i l ep o l y s a c c h a r i d e s w a sa b o u t3 5 、i t l iu l t r a s o n i c e x t r a c t i o nr a t i oc a nb ei n c r e a s e dm o r et h 眦3 0 t h r o u g h a n t i o x i d a n ti nv i oe x p e r i m e n t b yd p p h s p e c t r o p h o t o p h y , i ts h o w e d t h a t p y r a c a n t h af o r t u n e a n ac r u d ep o l y s a c c h a r i d ec o u l dr e m o v ed p p h a n di t se f f e c tw a s v e r yp r o m i n e n ta n ds c 5 0w a s1 8 7 m g m l s o m ee x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a tt h ep r o t e i nc o u l db ea l m e s tc l e a r l yr e m o v e df r o m p y r a c a n t h af o r t u n e a n ac r u d ep o l y s a c c h a r i d eb yp r o t e i n - e n z y m e - s e v a ga n dd e c o l o r c o u l db ea c h i e v e db yl s a - 8b i gs i z e a d s o r p t i o nr e s i n t h e ni s o l a t e db yd e - 5 2a n d s e p h a d e xg - 2 0 0g e lf i l t r a t i o n ，t h r e eg l y c o c o n j u g a t e sp p - a 2 ，p p - a 3a n dp p - b 2w e r e a t t a i n e d g a s c h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i s ，i n f r a r e ds p e c t r aa n a l y s i sa n dp h y s i c a la n dc h e m i c a l c h a r a c t e r ss h o w e dt 1 1 a tp p - a 2a n dp p - b 2w e r et h es a m e m a t e r i a l s t h e ym a i n l y c o n t a l n e d r h a m n o s e ，a r a b i n o s e ，f r u c t o s e ，g a l a c t o s e a n dm a n n o s ei nar a t i oo f 5 0 5 ：4 5 l ：3 3 7 ：1 1 8 ：1 s e p h a d e x g - 2 0 0 g e l f i l t r a t i o n a n a l y s i s s h o w e dt h a tt h e i r m o l e c u l a rw e i g h tw a s3 0 ，0 0 0 d a l d i f f e r e n tt op p 抛，p p - b 2c o n t a i n e dal i t t l ep i g m e n t p p a 3w a sak i n do f g l y c o p r o t e i n ，i tw a sc o m p o s e do fa r a h i n o s e ，g l u c o s ea n df r u c t o s e i nar a t i oo f l 6 2 ：1 ：1 5 9 a n ds o m ea m i n oa c i d s w h o s e t o t a l c o n t e n t w a s0 5 i na m i n o a c i d ，e y s t e i n ew a s n o td e t e c t e do u t t h em o l e c u l a r w e i g h t o f p p a 3w a s2 1 0 0 0 0 d a l a sd i e t a r yf i b e rf u n c t i o n a lf o o da d d i t i v i e s ，p y r a c a n t h a f o r t u n e a n ap o l y s a c c h a r i d e h a sg o o de x p a n s i b i l i t y , a b i l i t yt ok e e pw a t e ra n da b i l i t yt oe x c h a n g ew i t hp o s i t i v ei o n f u r t h e r m o r e i tc a l ls c a v e n g ef r e er a d i c a l w h e ni ti su s e da sm e l i o r a t i v ea d d i t i v ei n n o o d l e t h ed o s a g eo f p y r a c a n t h a f o r t u n e a m ：p o l y s a e c h a r i d ei sa b o u t3 k e y w e r d s p y r a c a n t h a f o r t u n e a n a ( m a x j m ) l ip o l y s a c c h a r i d e p h y s i c a la n dc h e m i c a le h a r a c t o rd i e t a r yf i b e r 第一章绪论 1 多糖的研究进展 多糖作为来自高等植物、动物细胞膜、微生物细胞壁中的天然大分子物质，是 构成生命的四大基本物质之一，同维持生命功能密切相关。由于过去人们对多糖 认识的简单化，只认为糖类是一种能源和细胞内支撑物，再加上多糖自身结构的 复杂性，使得多糖研究远远落后于蛋白质和核酸的飞跃发展。近二十年来，随着 分子生物学的发展、科学技术的进步，人们逐渐认识到糖及其复合物分子参与了 生命现象中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能，因此，多糖的研究成 为目前生命科学中研究最活跃的领域之一。本章就近年来国内外对多糖的提取、 分离纯化、结构分析、生物功能及其多糖在食品领域中的应用进行概述。 1 1 多糖的提取 多糖主要是从自然界中的植物、动物或微生物中提取分离得到的。由于多糖 是极性强的大分子化合物，提取时一般先将原料脱脂、脱色，然后用进行提取， 提取物浓缩后加沉淀剂离心沉淀得粗多糖。目前常用的提取方法有：热水浸提法、 酸浸提法、碱浸提法等。 热水浸提法【1 1 是多糖提取的传统方法，用水作为溶剂浸取多糖，温度一般控制 在5 0 9 0 左右，在恒温水浴上回流浸提2 4 h 过滤后得滤液和滤渣。再用水在 相同条件下将滤渣反复浸取3 5 次，最后合并滤液，浓缩除去绝大部分水，然后 边搅拌边加体积相当于余下溶液2 5 倍的9 5 乙醇，多糖里絮状沉淀析出，离 心分离( 3 0 0 0 6 0 0 0 d m i n ) 2 0 m i n 左右，用适量丙酮或乙醚洗涤脱水，然后进行真 空干燥或直接冷冻干燥即得到粗多糖。 酸浸提法【2 j 一般采用稀酸，提取时间宣短，温度不超过5 0 ，以防止糖苷键 断裂。碱浸提法1 2 堞采用o i m o l l n a o h 来提取，为防止多糖降解，常通以氮气或 加入硼氢化钠、硼氢化钾来处理。稀酸稀碱提取液应迅速中和、浓缩、透析、醇 析而获得多糖沉淀。 1 2 多糖的分离纯化 1 2 i 脱除蛋白质 由于原料组成中均含有一定量的蛋白质，因此在多糖的提取工艺中，脱除蛋 白质是一个重要的环节。常用的方法有：s c r a g 法，三氯乙酸法，三氟三氯乙烷法。 s e v a g 法1 3 j 是用氯仿：戊醇= 5 ：l 或4 ：l 的二元溶剂体系与粗多糖混合，剧 烈振摇2 0 3 0 m i n ，蛋白质与氯仿一戊醇生成凝胶物而分离，分去水层和溶剂层交 界处的变性蛋白质即得到较高纯度的多糖。此法在避免多糖降解方面有较好的效 果，但效率低，如能配合酶法【4 】，s e v a g 法脱除蛋白质效果会更好，而且可以减少 有机试剂的消耗量和多糖的损失。 三氯乙酸法d 2 3 是在多糖溶液中滴加3 - 3 0 - - 氯乙酸，直至溶液不再继续混 浊为止，在5 1 0 c 放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白的多糖溶液。此法的不足 是会引起某些多糖的降解。 三氟三氯乙烷法【1 2 l 是按多糖溶液：三氟三氯乙烷= 1 ：1 的比例加入，在低温 下搅拌约1 0 r a i n ，离心得上层水层，水层继续用上述方法处理几次即得。此法效率 高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。 1 2 2 脱色 对于植物来源的多糖，可能会含有酚类化合物而颜色较深，对于从动物和微 生物等中提取的多糖也会带有不同深浅的颜色【i i ，对多糖进行脱色处理可使多糖的 应用范围更加广泛。一般情况下，可以用活性炭处理脱色，但活性炭会吸附多糖， 造成多糖损失。d e a e 一纤维索是目前最常用的脱色方法，通过离子交换柱不仅达 到脱色目的，而且可以进行多糖的分离。另外还可进行氧化脱色【5 1 ，其方法为：调 整p h 8 0 左右，在5 0 以下滴加i - 1 2 0 2 至浅黄色，保温2 h 即可。 1 2 3 多糖的分级纯化 多糖经过除蛋白和脱色等初步纯化后还要将多糖混合物中的目的单一组分分 离出来，即多糖的分级纯化。根据多糖的性质，分级纯化方法可分为下列几种： ( 1 ) 分步沉淀法：根据不同多糖在不同浓度的低级醇或低级酮中具有不同的 溶解度，逐次按比例由小到大加入这些醇或酮以分步沉淀。 ( 2 ) 盐析法；根据不同多糖在不同盐浓度中具有不同溶解度的性质，加入不 同盐析剂使不同多糖逐步析出，常用的盐析剂有n a c i 、k c i 、( n h 4 ) 2 s 0 4 等，其中 以( n i - 1 4 ) 2 s 0 4 效果最佳。 ( 3 ) 金属络合法：有的多糖能与c u 2 + 、b a 2 + 、c a 2 + 、p b 2 + 形成络合物而沉淀。 得到的络合物沉淀经水充分洗涤后用无机酸乙醇液或硫化氢处理，即得到游离的 多糖。 ( 4 ) 季铵盐沉淀法：根据长链季铵盐能与酸性多糖形成不溶性多糖化合物的 特性，以分离酸性和中性多糖。常用的季铵盐是十六烷基三甲基铵的溴化物 ( c 1 怂) 及其碱( c 1 a 一0 h ) 和十六烷基吡啶( c p c ) 。实验时应严格控制多糖 混合物的p r i 值小于9 且无硼砂存在，否则中性多糖也会沉淀出来。通常c t a b 或 c p c 水溶液的浓度为l 1 0 ( w ) ，在搅拌下滴加于0 1 l ( w v ) 的多 糖溶液中，这时酸性多糖即能从中性多糖中沉淀出来。根据形成的沉淀能溶于不 同的盐溶液、酸溶液和有机溶剂中的性质，使多糖游离出来。 ( 5 ) 柱层析1 3 , 6 1 ：柱层析法是多糖分级纯化最常用的方法。柱层析法可分为两 类，一类是凝胶柱层析，常用的凝胶介质有葡聚糖( s e p h a d e x ) 凝胶、琼脂糖( a g r o s e ) 凝胶及s e p h a c r y l 等，洗脱液为各种浓度的盐溶液及缓冲液，其离子强度不应低于 o 0 2 m o l l ，通过凝胶柱层析多糖可分为不同分子大小的糖；另一类是离子交换层 析，这种分级适合于分离各种酸性、中性和粘性多糖，常用的交换介质有d e a e 纤维素、d e s e p h a d e x 、c m s e p h a d e x 、s e - s e p h a d e x 等。在p h 6 ，0 时，酸性多糖 能吸附于交换介质上，中性多糖不能吸附，然后用p h 相同但离子强度不同的缓冲 溶液将酸性强弱不同的酸性多糖分别洗脱下来，但如果柱为碱性，则中性多糖也 能吸附。但中性多糖不能与硼砂形成络合物，所以可将柱处理成硼砂型的，用不 同浓度的硼砂溶液洗脱，也能将不同的中性多糖分离开来。检测手段一般沿用苯 酚一硫酸法，也常用l k b 柱层析系统，用比旋光度、示差折光及紫外检测器，各 组分的峰位自动记录，分离效果好且方便。 ( 6 ) 其他方法：粗多糖的分级纯化方法还有冻融分级、超滤、区带电泳、亲 和层析和超速离心等方法。 1 2 4 纯度鉴定1 7 l 经分离纯化的多糖还需进行纯度鉴定。多糖的纯度只代表相似链长的多糖分 子的平均分布，通常所说的多糖纯品实际上是一定分子质量范围的多糖的均一组 分。目前纯度鉴定常用的方法有：( 1 ) h p l c 法鉴定为单一对称峰。( 2 ) 毛细管电泳 只出现单一对称峰。( 3 ) 凝胶柱层析洗脱图呈现单一对称峰。( 4 ) 纸层析法呈单一集 中斑点。其中前两种方法较常用，多糖的纯度鉴定要用两种不同的方法才能证明 其均一性。 1 3 多糖的结构研究 多糖的结构研究，如果是均多糖，需测定单糖间连接位置、糖苷键类型以及 有无分支和分支点的位置、分支链的长短及糖苷键的构型等。杂多糖则还要测定 单糖组分、组成糖基间的比例以及不同单糖间的连接。 、 现已建立的分析方法有化学法，如甲基化分析、高碘酸氧化、s m i t h 降解、乙 3 酰解、三氧化铬氧化等；物理方法，包括红外光谱、核磁共振波谱、质谱等；生 物学法，主要是酶解分析。而随着现代分析技术的发展，新技术的引入使得糖链 的结构分析工作已不再象以前那样令人生畏，但与蛋白质、核酸的一级结构常规 技术相比，尤其是对一些从细胞膜上获取的极微量的糖链的分析，仍然是一项难 度很大的工作。 1 3 1 化学方法 1 3 1 1 甲基化分析 甲基化分析是测定糖链结构的一种经典方法，用于测定糖链糖基间的连接方 式。先将多糖的全部自由羟基通过甲基化反应转变成稳定性很强的甲醚，然后酸 水解，得到部分甲基化的单糖，再将它们转变为相应的糖醇乙酸酯，这样除了形 成糖环的那个羟基和异头碳外，其余位置的乙酰基就标出了糖链连接的位点。甲 基化分析中关键的一步在于糖环上的羟基必须全部甲基化。目前常用的甲基化方 法有： ( 1 ) h a k o m o r i 法隅l ，l ：以二甲基亚砜为溶剂，甲基亚磺酰负离子为强碱，碘 甲烷为甲基供体，在氮气保护和无水条件下进行甲基化。其过程如下：将已充分 干燥的多糖样品溶于己用分子筛干燥的二甲基贬砜中，在搅拌下滴加甲基亚磺酰 负离子试剂使多糖充分解离，在低温下慢速滴加碘甲烷，反应一段时间后，用氮 气流吹去未反应的碘甲烷，透析，冷冻干燥即得到甲基化多糖。此法需要样品量 少，甲基化易于完全，反应在非水条件下进行，糖较少发生降解，是目煎使用最 为普遍的甲基化法。 ( 2 ) p u r d i e 法i lo j ：将部分甲基化的多糖溶于碘甲烷中，加少量甲醇促溶，在 搅拌下，分数次加入氧化银，回流数小时，过滤，滤液蒸干后即得全甲基化多糖。 此法用碘甲烷作为糖甲基化反应的溶剂和甲基化供体，但由于多数糖不溶于碘甲 烷，所以该方法主要用于对部分甲基化的单糖进行全部甲基化。 ( 3 ) h a w o r t h 法1 1 1 l ：在低温下。用2 0 3 0 的n a o h 使羟基解离，同时也 作为溶剂。因为在强碱溶液中，多糖容易降解，所以要在充氮的条件下操作，n a o h 的加入要慢，最后滴加硫酸二甲酯进行甲基化，这样的过程通常要重复5 6 次， 后几次反应温度可升至4 0 5 0 c ，反应液中要加入四氯化碳或丙酮等有机溶剂， 以利于部分甲基化多糖的溶解。该方法甲基化效果不好，而且反应时间长，在使 用h a w o r t h 法数次后，通常要用p u r d i e 法才能完全甲基化。 1 3 。1 2 高碘酸氧化 4 高碘酸氧化是一种选择性的氧化降解反应，作用于糖分子连二或连三羟基处 而生成相应的甲醛、甲酸。从高碘酸的定量消耗与甲醛、甲酸的生成，可以判定 糖苷键的位置、直链多糖的缔合度、支链多糖的分支数目等。反应必须在控制条 件下进行( 暗处，4 2 0 。c ，最小量的高碘酸试剂，保持p h 3 6 ) ，否则可能有副反 应如超氧化等产生。 1 3 l3s m i t h 降解 s m i t h 降解是将高碘酸氧化产物进行水解还原。多糖间以不同的位置缩合，糖 基中的连二或连三羟基被高碘酸修饰后，产生非环状半缩醛它较糖苷键易水解， 从水解产物的检识来判断糖苷键的位置。除1 3 连接外其它类型的糖苷键被高碘 酸氧化与水解后而生成不同的醛，将氧化后的产物经硼氢化钠( 或钾) 还原，水 解产物用p c 或g l c 鉴定。 1 3 1 4 乙酰解 多糖经过乙酰解反应，可以生成乙酰化单糖和乙酰化寡糖，反应产物也可用 纸层析、薄层层析、气相层析鉴别。1 ，6 一糖苷键在乙酰解中优先断裂。此特点 有利于糖链结构的研究。 1 3 1 5 酸解 用酸水解多糖可根据需要控制条件进行。如酸的浓度、温度、时间等，用硫 酸1 3 m o l l ，8 0 1 0 0 ，3 8 h 封管可以完全水解多糖。部分水解的多糖可用 于分级与鉴定所生成的寡糖，也可以提供异头物构型与顺序的信息。多糖中如有 对酸较不稳定的甙键，控制酸的部分水解更有意义。 酸水解产物可用纸层析、薄层层析、气相层析等鉴定。纸层析展开剂常用正 丁醇：乙酸：水( 4 ：l ：5 ) 、正丁醇：吡啶：水( 6 ；4 ：3 ) ，显色剂常用苯二甲 酸一苯胺或硝酸银一氨水。薄层层析所用的展开剂和显色剂可与纸层析的相同， 也可用醋酸乙酯：醋酸：甲酸：水( 1 8 ：3 ：l ：4 ) 和醋酸乙酯：吡啶：水( 1 0 ： 4 ：3 ) 作展开剂，p 一茴香胺试剂、萘间苯二酚试剂与联苯试剂作显色剂。某些单 糖在纸层析和薄层层析上分离不易判断时也可采用某些单糖的特殊检验方法，例 如鼠李糖用巯基乙酸方法，半乳糖用半胱氨酸硫酸方法。 1 3 2 物理方法 l ，3 2 1 气相色谱法 气相色谱法作为常规的糖类分析方法，需要样品量少( 微克) ，又灵敏可靠， 可用于糖类的定性分析( 计算相对保留时间) 及定量测定( 计算峰面积的积分值) 。 与质谱联用，分析的灵敏度可进一步增高。多糖可以通过酸水解或甲醇解( 用盐 酸一甲醇) 成单糖或单糖甙，然后采用三甲基硅烷基化或乙酸乙酰化衍生化，即 可进样分析。 1 3 2 2 红外光谱法 红外光谱在多糖结构分析方面主要用于确定糖苷键构型及其他常规官能团。 五十年代，曾对糖类的红外光谱进行过广泛的研究，如不同糖的鉴别、取代基的 识别等等，而近十年来，糖的红外研究有了很大发展，可根据特异的红外吸收峰 来鉴定糖链中的一些特殊功能团。例如，8 9 0 c m l 是b 一毗喃糖苷键的特征峰， 8 4 0 c m “是一毗喃糖苷键的特征峰，8 1 0 c m 、8 7 0 c m 1 是甘露糖的特征吸收峰。 因此从红外光谱图就可以识别吡喃糖和呋喃糖，确定多糖中各种吡喃糖的糖苷键 构型，定量分析取代多糖。另外从红外光谱l 1 0 0 7 0 0 c m l 区域间的吸收峰还可以 识别糖苷键的构型和糖环部分的大小。毗哺糖苷键在l 1 0 0 l o l o c m 1 间有三个强 吸收峰，而呋喃糖苷键在相应区域只出现两个峰。 1 3 2 3 核磁共振( n h 虹i ) | 3 , 1 4 1 n m r 技术是7 0 年代才引入到多糖结构的研究中来的，开始并不是获得多糖 结构信息的最有利工具，但随着n f v l r 技术的发展和高磁场n i v i r 仪的出现。所得 到的n m r 谱质量越来越高，使原来在低磁场n m r 仪上不能分辨的信号得以分开， 可以获得更多的结构信息，从而在糖类结构的光谱解析中逐渐起着决定性作用。 尤其是8 0 年代发展起来的2 d n l v i r 技术，可以使多糖的h 和c n m r 谱得到归属， 使确定多糖的全结构成为可能。另一方面，就多糖分子本身来说，也使n m r 技术 在其结构研究中得到很好应用，这是由于多糖的基本结构通常是由若干个单糖组 成的重复单元构成的，使得分子量太于l o 万的多糖分子在h - m r 谱中出现的共振 信号要比分子量小于1 万的蛋白质分子少的多，与蛋白质分子不同。多糖分子没 有折叠成固定的构象，而是由于糖苷键的旋转，在定程度上具有柔韧性，正是 这种分子内的运动使高分子量的多糖的n h 偶谱具有较小的线宽，因而能得到分辨 率比蛋白质分子高的谱图。 与用于糖类化合物结构研究的经典方法相比，高磁场n l v i r 方法能产生较完全 和详细的结构信息。经典的分析方法如糖组分分析、甲基化分析、高碘酸氧化以 及部分酸水解等，对于寡糖和简单的多糖结构还可阐述，但对于复杂的糖类，这 些方法往往使人感到力不从心，要得到其全结构是十分困难的。而n i v i k 技术可在 有或没有背景知识的情况下获得糖类化合物最完全的结构信息及其在溶液中或固 态的行为，同时应用n n t r 技术还可以通过计算机把样品的h 和c n m r 谱数据与 数据库信息进行比较来确定糖类化合物结构，从而取代耗时又耗样的传统分析方 法。当然对于一个全新多糖的研究，n m r 方法通常还需与其他方法一起使用。此 外，在n m r 实验中，所用的样品可以很容易地通过除去溶剂而回收。 糖类化合物的n m r 谱参照标准通常是四甲基硅烷，测定的溶剂多是中性或碱 性重水，但在非质子溶剂如氘代二甲基亚砜、氘代吡啶中，糖类化合物也可以获 得分辨率较好的谱图。 1 3 2 4 质谱 质谱对糖类化合物的分析开始于6 0 年代，由于最初不能直接测定热不稳定的、 不易挥发和极性强的生物大分子，所以糖化合物需进行衍生化。多糖样品全甲基 化后。水解得到部分甲基化的单糖混合物，用硼氢化钠还原，再乙酰化得到部分 甲基化链状多羟基醇的乙酰衍生物，应用气质联用测定混合物，可了解单糖组成 及大致的分支情况l l ”。在糖类结构研究的众多分析方法中，质谱被认为是很有前 途的手段之一。目前常用的质谱方法有： ( 1 ) 快速原子轰击电离质谱( f a b - - m s ) ：8 0 年代出现的f a b m s 使得高 极性，难挥发而且热不稳定的糖及其缀合物的直接分析成为可能【l “。其原理为： 一束高能粒子，如氢、氤原子，射向存在于液态基质中的样品分子而得到样品离 子，这样可以得到提供分子量信息的准分子离子峰和提供化合物结构信息的碎片 峰。测定寡糖样品时，f a b - - m s 的典型灵敏度为i n m o l ，u l 基质，少于核磁所需 样品的百分之一。p e t e r 1 7 i 等测定了含有2 5 个糖残基的天然及衍生物的糖磷脂的序 列。r e i n h o l d i 8 d 9 1 等分析了全甲基化和全乙酰化的寡糖和糖肽。这些化合物分子量 在5 0 0 0 1 5 0 0 0 间。 ( 2 ) 电喷雾电离质谱( e s i m s ) ：它是将溶液中分子转变成气相离子的非 常有效的手段。这样产生的分子离子往往带有多个电荷。这些离子是靠吸附或失 去若干个氢形成的，所以在正离子或负离子谱上会观测到( m + n h ) ”或 ( m - - n i l ) ”的峰，因此e s i - - m s 可以测定的分子质量范围便大大扩展。人们还 发现由e s i 产生的离子的碎片化反应会因异构体的不同而有所差异，所以糖链及 其缀合物于过碘酸氧化、还原、甲基化前后用e s i - - c i d ( 有效碰撞解离) 联用技 术可获得不同的碎片离子，由此能够获知p m o l 级的糖链及其缀合物的分子质量、 序列、分支和连接信息忙o ，2 u 。c a r o z z o l 2 2 l 等用负离子e s i - - m s 识别了毗喃葡萄糖的 7 1 位与葡萄糖的c 一2 ，c 一3 以及c 一6 连接形成的不同二糖。y o s h i m i t 2 3 1 等用h p l c 和e s i - - m s 对不同阶段小鼠脑中n 一连接寡糖成分变化的检测为研究n - - 连接寡 糖对中枢神经系统发展所起的作用提供重要线索。大多数的多电荷离子可以被中 性靶气体有效地碰撞解离，是e s i - - m s 最引人注目的发展，是阐明结构的一种必 不可少的技术，而且可以区分自然界存在的同分异构体【2 4 1 。 ( 3 ) 基体辅助激光解吸电离质谱( m a l d i - - m s ) ：这种离子化方式电离出的 离子常用飞行时间( t o f ) 检测器来检测，所以m a i d i 常与t o f 连在一起称为 基体辅助的激光解吸飞行时间质谱仪。它也是一种软电离方式，产生的分子离子 稳定，不易裂解，适用于测定大分子质量的生物样品。并且m a l d i 方式不受样品 中所含添加剂、缓冲液或盐类的影响，其灵敏度也是各类电离方式中最高的1 2 ”。 1 9 9 1 年s t a h l l 2 6 l 报道了用m a id i m s 精确的测定了n g 量级的葡聚糖，相对分子 量为7 0 0 0 。当然这种方式也有其不足之处，如分辨率较低、结构信息有限、基体 的选择仍是凭经验等。 1 3 3 生物学方法( 酶法) 过去糖类结构的酶学方法通常采用的是一些外切糖苷酶对糖链进行顺序消化 以推测其化学结构i ”1 。由于酶解的高度专一性和放射性标记的引入使得这种方法 非常有效并广为采用。但这种方法的缺陷在于酶解结束后需要很多次的进行分离 和确定产物的流体动力学体积。试剂阵列分析方法社8 i 就是针对此问题应运而生的。 它将酶解方法的操作简化为只要将纯化的糖样品等分成几个试样，再将每个试样 与其中精确设定的外切糖苷酶混合保温酶解，直至所有酶都无法断裂的连接点， 称为终点片断。通过省去其中一种或数种不同的外切糖苷酶所得的酶混合物在酶 解糖链就会得到不同的终点片断。又因为放射性标记在糖链的还原端，所以检测 时只有终点片断具有放射活性，而反应产物中释放的单糖则没有响应合并每次 酶水解的产物再对产物库进行一次凝胶渗透色谱分离，把分离图谱与计算机数据 库中的糖链模拟分离图谱进行对照即可确定样品是何种糖链。根据这一原理，商 品化的糖序列仪也己被生产出来。但由于糖蛋白上。一连接糖链的高度复杂性和许 多连接特异性的糖苷酶无法获得，因而这一方法目前只适用于结构规律较明确的n 一糖链。 1 4 多糖的生物活性 多糖是生物体内普遍存在的一类生物大分子，具有许多重要的生物功能。各 国学者从各种生物体内提取研究了大量活性多糖，发现多糖具有促进机体免疫功 能、抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤和抗辐射等一系列作用，在临床上己用于治 疗肝炎、爱滋病、癌症和许多其它疾病“”。 1 4 1 多糖的免疫调节作用 多糖的免疫调节作用是其最重要的作用主要通过以下几个途径实现。”：促进 细胞因子的生成；激活m 巾、n k 细胞和t 、b 淋巴细胞；激活补体系统；促进抗体产 生等。 l4 1 1 对细胞因子的影响 研究表明，多糖能影响体内循环血液中细胞因子的含量，如d o n z i s 1 报道，给 小鼠口服可溶性酵母多糖能提高其血浆中i l - i 含量。皮下、静脉和肌肉注射葡聚 糖均可使小鼠血浆和脾脏中i l - i 和i l - 2 水平升高m 1 。多糖也能影响体外培养的 淋巴细胞细胞因子的分泌。燕麦葡聚糖可促进体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞i l i 的分泌，同时还能促进脾脏淋巴细胞i l 一2 、i f n y 和i l 一4 的分泌。”。王玲。” 报道枸杞多糖低浓度时对i l - 2 和i l - 3 的产生及其受体表达有明显促进作用，高 浓度时则呈不同程度的抑制效应。 多糖还可增强细胞因子的作用，如李金锋。”等研究发现猪苓多糖和香菇多糖 在一定浓度范围内与r i l 一2 合用能增 j b l a k 细胞活性，降低r i l 一2 用量。 i 4 i 2 激活潮状内皮系统 生物体中的网状内皮系统具有吞噬、排除老化细胞和异物及病原体的作用， 常用碳廓清法测定其活性。从三七根中分离提取的多糖可显著地增强网状内皮系 统在碳廓清实验中的活性，并增加小鼠、绵羊红细胞抗体的生成，恢复由环磷酰 胺导致的抑制而延迟的过敏反应。此外，如云芝多糖、猪苓多糖、杜仲多糖和竹 节人参多糖以及虫草多糖都能激活网状内皮系统。“。 1 4 1 3 对孙体的作用 许多多糖有激活补体的作用。补体蛋白上存在的识别点可识别多糖的结构。 实验表明m ：激活补体活性多糖大多为酸性杂多糖，其酸性部分主要是半乳糖醛 酸和葡萄糖醛酸如从当归、艾叶、柴胡等植物中提取的多糖都是酸性杂多糖。 同时，多糖分子中的游离羟基对活性也很重要，y a m a d a b 发现将车前子多糖过氧 化后，其活性下降甚至消失，但当氧化物还原成多羟基后又显示出活性，而将该 多糖去除乙酰基后，激活补体能力大大提高。 1 4 1 4 对t 、b 淋巴细胞的作用 多糖能促进淋巴细胞转化和增殖，如白术多糖在一定的浓度范围内能单独激活 或协同c o n a p h a 促进正常小鼠淋巴细胞转化并能明显提高i l - 2 分泌的水平，且对 氢化可的松造成的免疫抑制小鼠淋巴细胞的增殖功能有恢复作用呻1 。女贞子多糖 在一定浓度范围内能协同c o n a 促进小鼠脾t 淋巴细胞诱生i l 一2 “0 1 。k i m “”报道蘑菇 多糖能促进体外t 2 淋巴细胞的转化率，并增强n k 、m o 细胞活性。林志彬1 等报道， 灵芝多糖可通过间接激活淋巴细胞中d n a 多聚酶而促进d n a 合成及t 细胞增殖，促进 i l 一2 的产生，从而影响t 细胞亚群的数量和功能。杨晓林等人的研究结果表明褐 藻糖胶是小鼠b 细胞的有丝分裂原，具有多克隆激活b 细胞增殖的作用，另外耿长 山“”报道黄芪多糖对小鼠免疫功能增强作用主要是通过激活t 细胞功能而发挥作 用的。 1 4 1 5 激活巨噬细胞 由于巨噬细胞在抵御各种感染和抗肿瘤方面具有主要作用，因而激活巨噬细 胞可提高机体抗病菌和抗肿瘤的能力“。s t i m p e lm “”发现紫松果菊多糖有很强 的激活巨噬细胞功能，被激活的巨噬细胞对肿瘤显示很强的胞外细胞毒性，且这 种活化作用由紫松果菊多糖单独产生，不依赖其它淋巴细胞，活化的巨噬细胞i l 一 1 合成和分泌增加。李祖伦“”等研究了川牛膝多糖对实验小鼠r e s 吞噬功能、p f c 反应能力、nk 细胞杀伤活性的影响，结果表明，川牛膝多糖能增强小鼠r e c 吞噬 功能及p f c 反应能力，提高腿细胞杀伤活性，但对小鼠淋巴细胞转化率无显著影响。 1 4 2 多糖的抗肿瘤活性 多糖的抗肿瘤作用机理有两种，一种是具有细胞毒性的多糖直接杀死了肿瘤 细胞，另一种是多糖作为生物免疫反应调节剂，通过增强机体的免疫功能而间接 抑制或杀死肿瘤细胞。 张小梅“钉报道黄芪多糖能通过调节整体细胞免疫功能来增强i l - 2 l a k 的抗 肿瘤作用，也能通过促进抗癌细胞索的分泌、i l - 2 r 受体的表达、l a k 前体细胞的 增生而达到抗肿瘤作用。宁安红呻1 等人的实验结果表明灵芝多糖能显著延长s ，髑、 u 。荷瘤小鼠的生存期，但是在体外实验中灵芝多糖对肿瘤细胞无直接杀伤作用， 说明灵芝多糖的抗肿瘤作用可能是通过调节机体的免疫系统来实现的。陈留勇m 1 等从黄桃果肉中提取出两种水溶性多糖h t p l 和h t p 2 ，通过对小鼠的抗癌实验表明 h t p i 及h t p 2 各分别为1 0 0 m g k g 、2 0 0 m g k g 剂量，i p xl o q d 方案，对小鼠l e w i s 肺 癌足趾皮下接种的抑瘤率分别为5 4 6 9 、4 3 4 4 及4 7 0 8 、4 4 4 8 。对荷l e w i s 肺 癌小鼠的n l ( 及淋巴细胞转化的活性，h t p i 和i i t p 2 两个剂量组成均有较明显的促 进和提高。崔文”们等研究了马齿苋多糖的抗肿瘤活性，结果表明马齿苋多糖可使 小鼠t 淋巴细胞数量增加，体外对肝癌细胞s m m c 7 7 2 1 的增殖具有一定的抑制作用， 体内可使小鼠s 1 8 0 腹水瘤分裂指数显著下降，并能明显抑制小鼠s 1 8 0 移植性实体 瘤生长。 1 4 3 多糖的抗氧化活性 大量研究表明多糖对物理的、化学的及生物来源的多种活性氧( r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s 。r o s ) 具有清除作用。能减少脂质过氧化产物丙二醛( 肋a ) 的生 成量。提高超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 活性等，在中 药药理中发挥重要作用n “。 何书英“钉等研究了山药水溶性多糖的体外抗氧化作用，结果表明该多糖能明 显降低维生索c n d p h 及f e ”一半胱氨酸诱发的微粒体过氧化脂质的含量，并对黄 嘌呤一黄嘌岭氧化酶体系产生的超氧自由基及f e n t o n 反应体系产生的羟自由基有 清除作用。张振涛m 1 等通过采用荧光法及分光光度法测定m d 含量的方法研究了茜 草多糖的抗氧化作用，结果表明茜草多糖对小鼠肝匀浆在3 7 生成e ) a 含量的抑制 率为6 4 1 ，对邻苯三酚产生的氧自由基有显著的抑制作用( p 时间 料液比；表2 的方差分析结果可见，温度对提取率的影响高度显著，其次 是时间、料液比。最优水平组合为a 3 t 3 c 2 ，即在9 0 c ，提取9 小时，料液比为1 ：1 0 。 在此条件下火棘多糖的提取率约为3 5 。 3 2 火棘多糖的超声提取 3 2 1 超声频率对火棘多糖提取率的影响 样品脱脂后加水l o 倍，分别在超声频率为5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 k h z 的作用下 提取2 0 r a i n ，结果见图5 。由图5 可知，随着超声频率的增加，火棘多糖提取率提 高；超声频率超过1 5 0 k h z 时，多糖提取率增加缓慢。 棠 褂 蹲 瞰 5 01 0 01 5 02 0 0 j 群她) 3 2 2 超声处理时间对火棘多糖提取率的影响 样品脱脂后加水1 0 倍，在超声频率为1 5 0 k h z 的作用下提取5 、1 0 、1 5 、2 0 、 2 5 m i n ，结果见图6 。由图6 可见，随着时间延长，多糖提取率增加；超声连续处 理2 0 m i n 后，多糖提取率增加趋于平缓。 1 01 52 02 5 时问“i n ) 图6 超声处理时间对多糖提取率的影响 3 3 火棘多糖清除d p p h 的能力 将经过2 0 h 2 0 , 脱色、冷冻干燥的火棘粗多糖配成不同浓度的溶液，进行清除 d p p h 试验，结果见图7 。由图7 可见，多糖浓度越大( 即剂量越大) ，对d p p h 的 清除作用越强；当浓度为5 m g m l 时，对d p p h 的清除率为8 3 ，浓度为l o m g m l 时，清除率为8 5 7 ；火棘多糖浓度超过5 m g m l 时，清除自由基作用的增加趋于 平缓。其s c 。为1 8 7 m g m l 。 邑 * 逝 壤 024681 0 浓度( - - l ) 图7 浓度对火棘多糖清除d p p h 的影响 4 讨论 4 ，1 多糖含量韵测定方法 多糖含量的测定普遍采用硫酸一苯酚法，然而影响该法测定准确性和精确性的 因素很多，为了准确地选择火棘多糖的提取工艺，我们对硫酸一苯酚法进行了改善， 确定了糖溶液加重0 5 m l ，5 苯酚溶液0 3 m l ，混匀后快速加浓h 2 s o , 2 o m l ，迅速 振摇混匀，煮沸2 0 分钟的反应操作规程，所测褥的a 。具有很好的重现性，并获 5 4 3 2 l 0 ) 瞽群糍 言伯拍帅加。 得了相关系数r - - o 9 9 8 3 的标准曲线。 4 2 火棘多糖