（食品科学专业论文）抑扩展青霉芽孢杆菌的筛选鉴定及抑菌物质研究.pdf

摘要 使用对峙培养法从土壤、昆虫等样品中分离筛选到3 l 株对扩展青霉具有不同程度抑制作用 的芽孢杆菌，通过表型、全细胞蛋白s d s - p a g e 、1 6 sr d n a 序列测定方法对其进行鉴定，h 1 9 5 等6 个菌株为地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) ，h 1 l 为短小芽孢杆菌( b p u m i l u s ) 、h 1 6 1 为 枯革芽孢杆菌僻s u b a l 括) 、h t l 6 为多粘类芽孢杆菌( p a e n i b a c i l l u s p o l y m y x a ) ，h t ll 等2 2 个菌株为 同一个种并位于枯草芽孢杆菌所在进化分枝中，未能准确鉴定。 测量了3 1 个菌株在不同温度下的抑菌能力，所有菌株的抑菌能力与温度正相关，h t l 6 菌株 在较低温度( 1 5 、2 5 c ) 下抑菌能力最高，h t l 6 和枯草芽孢杆菌进化分枝中某些菌株在较高温度 ( 3 7 ( 2 ) 下具有很好的抑菌能力；地衣芽孢杆菌的菌株在较低温度下无抑菌能力，较高温度下抑 菌能力较弱，短小芽孢杆菌h 1 1 的抑菌能力较弱但随温度变化较小。在2 0 c 下，多粘类芽孢杆 菌和枯草芽孢杆菌进化分枝中菌株对扩展青霉菌丝生长抑制率为1 0 9 - 4 2 2 ，其中h 1 3 7 菌株 抑制率最高。在苹果汁平板上，包括h t l 6 、h 1 3 7 菌株在内的某些菌株无抑苗能力，培养基成分 对菌株抑菌能力有很大影响。 对多粘类芽孢杆菌h t l 6 产抑菌蛋白的条件、性质进行了初步研究，h t l 6 产抑菌蛋白需要 真菌中某些成分的诱导，茯苓菌核是较好的诱导物质，茯苓粉培养基中加入葡萄糖、硫酸铵降低 了发酵液抑菌活性，对茯苓粉浓度、氮源浓度、发酵时问作了初步研究。h t l 6 菌株在茯苓粉培 养基中产生的抑菌蛋白具有极好热稳定性，1 2 1 处理1 5 r a i n 活性不变；p h 3 0 - 9 0 下活性不变， p i l l 0 2 时活性全部丧失：蛋白酶处理后抑菌能力有一定r 降但无显著差异。利用热处理除去大量 杂蛋白后使用1 0 k d 超滤管纯化该蛋白，t r i c i n e - s d s - p a g e 显示分子量约为4 5 k d 。 关键词：扩展青霉，芽孢杆菌，多粘类芽孢杆菌，鉴定，抑菌能力，抑菌蛋自 a b s t r a c t 3 1s t r i p so fs p o i f 0 袖gb a c t e r i aw e r es c r e e n e db yd u a l - c u l t u r ef r o me n v i r o n m e n t a ls a m p l e s ( s o i l ，i n s e c t s ) a l ls t r a i n sh a dd i f f e r e n t i n h i b i t o ra c t i v i t yt op e n i c i l l i u me t c p a m m ，ap a t h o g e nt o p o s t h a r v tf r u i t b yp h 饥o t y p i cc h a r a c t e r i s t i c s ，c e l lp r o t e i ns d s - p a g ea n d 1 6 sr d n a q 1 1 a n a l y s i s ，s i xs t r a i n s ，i n c l u d i n gh 1 9 5 ，w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u sl i c h e n 扣r m i s ，s t r a i nh l lw a si d e n t i f i e d a sb p u m i l u s s i i 试i ih 1 6 1w a si d e n t i f i e da sb s u b t i l i s ，2 2s t r a i n s ，i n c l u d i n gh t l1 ，w e f eb e l o n gt oo n e s s i e l es p e c i e si nb s u b t i l i sg r o u pc l a d e ，b u te x a c ts p e d 嘴w a su t l l m o w n s t r a i nh t l 6w a si d e n t i f i e da s p a e n i b a c i l l u s p o l y m y x a t h ei n h i b i t o ra c t i v i t yo fa l ls t r a i n sw a st e s t e di nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r eb ym e a s u r i n gd i a m c t 目o f i n h i b i t o rz o n ei nd u a l - c u l t u r ep l a t e i ts h o w e dt h a tap o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ei n h i b i t o ra c t i v i t y a n dt h et c m p e r a t m e p p o y m y x ah t l 6s u i nh a dt h es t r o n g e s ti n h i b i t o ra c t i v i t ya t1 5 ca n d2 5 s t l _ a i nh t l 6a n d8 0 l n es t r a i n si nb s u b t i l i sg r o u pc l a d eh a ds t r o n gi n h i b i t o ra c t i v i t ya t3 7 s t r a i n si n b 1 i c h e n i f o r m i sm ti n h i b i tp e a p a n s u ma t1 5 a n d2 5 。b u taw e a ki n h i b i t o ra c t i v i t yw a 8o b s e l 3 t c d a t3 t c t h ei n h i b i t o ra c t i v i t yo fb p u m i l u sh 1 lw a sw e a kb u tk e p ti nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e t h e i n h i b i t o rr a t et op e a p a w u mh y p h a eg r o w t hm a d eb ys t r a i n si nb s u b t i f i sg r o u pc l a d ea n dp p o t y m y x a c h a n g e df r o m1 0 9 t o4 2 2 i na p p l e j n i c em e d i u mp l a t e ，s o l n es t r a i n s ，i n c l u d i n gh t l 6a n dh 1 3 7 ， c a n ti n h i b i tp e x p a n s u m ，i tm e a n t , f o rs o m es t r a i n s ，t h ei n h i b i t o ra c t i v i t yw a sa f f e c t e db ym e d i u m c o m p o n e n t t h ec o n d i t i o n sw q g q t es t u d i e df o rr p o l y m y x ah t l 6t op l - o d u o ea n t i f u n g a lp r o t e i n t h ep r o t e i nw a s i n d u c e db ys o m ec o m p o n e n ti nf u g a lc e l l i tw a sf o u n dt h a tp o r i ac o c 0 5s e l a r o t i u m ( p c s ) w a 8ag o o d i n d u c t i v em a t e r i a l t h ep r o d u c t i o no f a n t i f u n g a lp r o t e i ni np c sm e d i u mw a sd e p r e s s e db yg l u c o s ea n d a m m o n i u m s u l p h a t e ae l e m e n t a r yo p t i m i z a t i o nw a ss u t d i e d ，i n c l u d i n gt h ec o n c e n t r a t i o no f p o r i ac o c o s s c l e r o t i u ma n dn i t r o g e ns o u r c e , t h ec u l t u r et i m e t h ea n t i f u n g a lp r o t e i nw 船h e a ts t a b l ea n dr e a n a i n l a c t i v ea f t e rs t e r i l i z a t i o na t1 2 1 f o r1 5 m i n t h ea n t i f a n g a la c t i v i t yr e m a i n e ds t a b l eo v e i ab r o a dp h r a n g e ( 3 0 - 9 0 ) ，b u tl o s tc o m p l e t e l yi np h 1 0 2 i ta l s os h o w e da s t a b i l i t ya f t e ra c a l m a n t sw i t h p r o t e o l y s i s ( g r l z y l n e s t h ep r o t e i nw a sp u r i f i e da i d e rh e a t i n gp r o c e s sa n du l t r a - f i l t r a t i o nw i ma l o k d c u t - w e i g h t t h em o l e c u l a rw e i g h to f t h ep r o t e i nw a s 4 5k di nt r i c i n e - s d s - p a g e k e yw o r d s ：p e n i c i l l i u me x p a n s u m ，b a c i l l u s ，p a e n i b a c i l l u s ，i d e n t i f i c a t i o n ，i n h i b i t o ra c t i v i t y a n t i f a n g a lp r o t e i n n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：秀型蠹褥 时间： 年月同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密盼学位论文在解密后应遵守此协议) 燃薹，鬻 剔磁轹舻 时问： 序，月 日 时间加年g 月f 阳 1 1 青霉对采后水果的危害 第一章绪论 据统计，在运输和储藏期间水果的腐烂损失率在发达国家为1 5 - 2 5 ，发展中国家高达5 0 。 水果的平均含水量约8 5 ，碳水化合物平均含量约1 3 ，蛋白质、脂肪、灰分的平均含量分别为 0 9 、0 5 、o 5 ，就营养成分而言，水果可为细菌和真菌的生长提供条件，但水果的p h 低于 大多数细菌能够生长的p h 值，因此水果的腐烂主要由真菌引起。真菌侵染水果后遥过碳水化合 物代谢消耗有机酸使水果的p h 上升，为进步的细菌腐烂创造条件，因此对水果腐烂的控制主 要在于控制真菌( 徐岩，2 0 0 i ) 。 造成水果腐烂的真菌主要包括青霉、曲霉、疫霉、腐霉、轮枝孢、刺盘孢、镰刀霉、葡萄孢 霉、丝核菌、核盘菌类等。青霉( p e n i c i l l i u m ) 是在我国造成苹果腐烂的主要真菌之一，包括橘青霉 僻c i r t r i m u m ) 、扩展青霉僻e x p a l l s ) 、鲜绿青霉妒v i r i d i c a t u m ) 、圆弧青霉僻c y c l o p i u m ) 、 细小青莓僻p a t u l u m ) 等。 除导致经济损失外某些青霉菌株还会产生真菌毒素，严重危害人体健康。青霉能够产生的 主要真菌毒索包括以下几种： 展青霉素：也称棒曲霉紊，化学结构见图1 1 。主要由扩展青霉产生，草酸青霉、棒曲霉、 丝衣霉等也能够产生。展青霉素在酸性环境中非常稳定，巴氏消毒时8 0 不能破坏，8 5 c 只能破 坏少量毒素但在碱性环境中不稳定。采用皮下注射时，老鼠的l d 5 0 为1 5 2 0 m g k g ，并可诱发 皮一f 肿瘤的产生：口服l d 5 0 为5 0 m g k g ，发生心肌和肝脏变性。我国国家标准g b l 4 9 7 4 - - 2 0 0 3 规定苹果、山楂食品中展青霉素含量不能超过5 0 p g k g 。由于扩展青霉是苹果储藏期的主要腐败 茁，当原料中含有这种腐烂苹果时产品中就可能含有展青霉素。1 9 7 3 年f d a 检测了1 3 6 份果汁 样品，其中3 7 含有展青霉素，含量为4 0 4 4 0 g l ，平均为6 9 p g l 。真菌产毒的最适温度在最 适生长温度以下，因此水果的低温储藏环境有利于毒素产生；利用气调可部分抑制腐败真菌的生 长并抑制青霉、曲霉的产毒。但不能抑制丝农霉产毒( 蔡静平，2 0 0 3 ) 。 橘霉素：化学结构见图1 2 。可由橘青霉、扩展青霉、鲜绿青霉、点青霉等产生。在长波紫 外线下呈柠檬黄色荧光。已发现橘霉素对动物肾脏有明显毒性，并已被认为具有致癌性。 赭曲霉素：也称棕曲霉素，化学结构见图1 3 。由棕曲霉、鲜绿青霉、圆弧青霉、产黄青霉 等产生。至少包括7 种结构相似的次级代谢产物，在紫外线下呈微绿色至蓝色荧光。其中赭曲霉 素a 是已知的毒性最强的物质之一，可诱发动物的肝肾损伤并有致癌性。老鼠口服的l d 5 0 为 2 0 2 2 m g k g ，5 9 发生肝细胞瘤，全部发生肾囊腺瘤，2 9 发生肾细胞瘤。赭曲霉素具有耐热性， 食物煮沸后仅能破坏2 0 的毒素。 青霉酸：化学结构见图1 4 。多种青霉和曲霉均可产生，圆弧青霉产青霉酸能力最强。老鼠 的皮下注射l d 5 0 为1 0 0 3 0 0 m g k g ，具有致癌性。 控制水果在采后和储藏期间由真菌导致的腐败，不仅能够产生巨大的经济效益，而且对于提 高食品安全水平也具有重要的意义。 图11 展青霉素 f i g1 1p a t u l i n h 图12 橘霉囊 f i g1 2c i m n i n c l 图13 赫曲霉素 f i g1 3o c h r a t o x i n 1 2 生物防治在果蔬采后防腐中的研究现状 岫：一l 已 图14 青霉酸 f i g1 4p e u i c i l l i c a c i d 抗真菌剂是防治水果采后真菌腐败的主要手段之一，但随着人们对健康的关注程度提高、使 用抗真菌剂导致的环境问题以及抗药菌株的出现，其使用范嗣和效果逐渐减小，寻找替代方法是 十分必要的。 生物控制，也称生物防治，是利用生物间的相互作用，包括寄生、捕食、拮抗、竞争等，达 到控制有害生物的目的。拮抗是指指某种生物产生的代谢产物可抑制它种生物的生长发育甚至将 后者杀死，有时因某种生物的生长而引起的其它条件的改变( 例如缺氧、p h 改变等) ，从而抑制其 他生物的现象也称拮抗。竞争是指两个种群因需要相同的生长基质或其它环境因子，致使增长率 和种群密度受到限制时发生的相互作用，其结果对两种种群都是不利的。寄生是指一个种群从另 一个种群的细胞或组织中获得营养，而对后者产生不利影响。捕食是一种种群被另一种种群完全 吞食以获得营养。生物控制中使用的微生物称为生防微生物，也称生防作用物c o i o c o n t r o la g e n t s ， b c a s ) 。在水果采后病害的生物控制中，生防微生物无论是单独使用还是与抗真菌剂联合使用均 表现出相当效果，被认为是最有前景的方法之一。 一个有效的生防微生物应具有以卜特点：疾病控制效果好，应达到9 5 以上；可应用于多种 水果的防腐抗菌谱广泛，对多种水果腐败真菌有效：在低使用浓度或剂量下即可发挥效果；可 长期发挥效果；其安全性有保证，不能产生对人体有害的物质；对水果无致病性；环境友好：适 应水果储藏条件，包括低温、气调等；兼容目前使用的抗真菌剂；遗传稳定；营养要求简单，可 使用低廉材料进行发酵生产；抗逆性强。易于加工和储藏( s p a d a r o ，2 0 0 4 ) 。 目前国内外研究和使用的果蔬采后生防微生物主要包括芽孢杆菌和酵母两类。 2 协 纵 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 2 1 生防微生物的作用机制 目前对生防微生物的机制研究仍不充分，己知的机制包括以下几种： 产生抗菌物质：据报道效果较好的生防微生物均产生对病原真菌具有毒性的物质，认为该机 制是产生拮抗效果的主要原因。 营养和位点竞争：某些腐败真菌侵染水果时，孢子的萌发需要某些营养物质或特异物质的诱 导，孢子萌发后形成侵染垫或附着胞需要直接接触水果表面。生防微生物对营养物质和位点的竞 争性利用阻止了腐败真菌孢子的萌发、菌丝生长和侵染。 寄生：寄生于腐败真菌的生防微生物主要是真菌，包括木霉和多种酵母，已报道菌株均能产 生胞外细胞壁物质降解酶，包括几丁质酶、葡聚糖酶等。 诱导植物抗病性：非痛原菌诱导的植物抗性( n o n p a t h o g e n - m e d i a t e di n d u c e ds y s t e m i cr e s i s t a n c e ， i s r ) 和病原菌诱导的植物抗性( p a t h o g e n i n d u c e ds y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e ，s a r ) 具有相同的表型 特征，包括感染处周围组织木质化和产生抗生素类物质，从而阻止病原菌的蔓延。 1 2 2 芽孢杆菌作为果蔬采后生防微生物的研究 1 2 2 1 抗菌物质产生的拮抗作用 抗菌物质产生的拮抗作用：芽孢杆菌产生的抗真菌物质从合成途径分为非核糖体途径和核糖 体途径。 非核糖体途径产生的抗真菌物质包括脂肽类、多肽类、其他类物质。 a 脂肽类：具有表面活性剂性质，脂肪酸与若干个氨基酸形成环状内酯，疏水的脂肪酸链 和氨基酸作用于细胞膜，扰乱膜结构，导致膜上离子通道的形成，产生拮抗效果( h e e r k l o t z ，2 0 0 1 ) 。 脂肽由非核糖体肽合成酶( n o n - r i b o s o m a lp e p f i d es y n t h e t a s e s 。n r i s s ) 合成。多个n r p s 分子线 性排列在一起以合成特定氨基酸顺序的肽。一个完整的n r p s s 分子包含3 个结构域。腺苷酰化 结构域( a - d o m a i n ) 识别井通过腺苷酰化激活特定氨基酸，形成氨基酰a m p 。硫酯形成结构域 ( t - d o m a i n ) ，也称肽酰基载体蛋白( p 印d d y lc a r d e rp r o t e i n ，p c p ) ，与脂肪酸合成、聚酮合成中的酰 基载体蛋白具有同源性。p c p 中含有4 - 磷酸泛酰巯基乙胺( p - p a n o ，通过硫酯键结合氨基酰，p - p a n t 结合在一个s e r 残基上，是在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶( p h o s p h o p a n t e t h e i n y lt r a n s f e r a s e ，p p t a s e s ) 催化下将c o a 中的p - p a n t 转移到s e r 残基上。聚合域( c d o m a i n ) 催化肽键的形成，接受上一个 n r p s 分子中t - d o m a i n 携带的酰基并与自身a d o m a i n 形成的氨基酰- a m p 形成肽键，延长的肽 链被转移到自身的t - d o m a i n 上。c d o m a i n 不仅接受上一个n r p s 携带的酰基，也可接受c o a 携 带的酰基，例如脂酰基。某些n r p s 分子中含有差向异构化结构域，将l 氨基酸转变为d 氨基 酸。在n r p s 多酶体系末端的n r p s 分子还含有一个硫酯酶结构域，负责将合成的肽从p c p 上释 放下来( r e l a t e r ，1 9 9 9 ) 。 目前己报道的能够产生脂肽的种包括b a c i l l u ss u b t i l i s 、b c e r e u s 、丑l i c h e n f o r m i s 、且 a m y l o l i q u e f a c i e n s 、b p u m i l i s 等，对某些芽孢杆菌菌株基因组所作分析表明n r p s 基因在b a c i l l u s 属中厂- 泛存在，但只有部分菌株具有p p t a s e s 基因，缺乏p p t a s e s 基因将导致p c p 中的s e x 残基 3 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 无法与p - p a n t 连接，失去携带氨基酰的功能，也就无法合成肽类。 筛选具有脂肽合成能力菌株往往通过指示菌拮抗法筛选，准确率不高，k o l u s h e v a ( 2 0 0 0 ) 报道 了一种快速筛选作用于细胞膜的抗菌肽的方法：磷脂与多聚乙二炔脂类( p d a ) 形成的颗粒，磷脂 形成外膜，p d a 为内含物。作用与膜的物质与磷脂相互作用导致膜结构扰乱，导致磷脂中脂肪酸 碳链的扭曲，进而导致p d a 分子的重排，产生蓝一红颜色变化。该方法灵敏度高并可定量检测， 不仅能用于靶点为细胞膜的抗菌肽检测，还可用于多种膜相关研究中，具有广阔应用前景。 芽孢杆菌产生的脂肽主要包括3 类：s u r f a c t i n 、i t u r i n 、f e n g y e i n 。 s u r f a c t i n 类：结构为一个c 1 2 - 1 7 脂肪酸通过b 羟基和羧基与7 肽l - g l n g l u 、l l a u 、d - l c u 、 l v a l 、l - a s p a s h 、d - l e u 、l - l c u i l c v a l 形成内酯，氨基酸构型为l l d l l d l 。主要包括s u r f a c t i n ( 表 面活性素) 、e s p e r i n 、l i c h e n y s i n 。广泛研究的是s u r f a c t i n ，由b s u t b i l i s 、8 p u m i l i s 产生，氨基酸 顺序为g h 、l e u 、l e u 、v a l 、a s p 、l e u 、l e u ，由于具有良好的表面活性剂性质，目前已进行工 业发酵生产。l i c h e n y s i n ( y a k i m o v ，1 9 9 9 ) 由丑l i c h e n i f o r m i s 产生，氮基酸顺序为g h 、l e u 、l e u 、 v a l 、a s n 、l e u 、l i e 。s u r f a c f i n 类脂肤的的合成酶系包括3 个蛋白，以s u r f a c l i n 为例，其合成酶 系为s r f a - a 、s r f a - b 、s f f a - c ，分别由3 、3 、1 个n r p s 分子组成，负责3 、3 、1 个氨基酸的装 配( 吴清平，1 9 9 8 ) 。 i t u r i n 类：由b 一氨基c 5 脂肪酸通过b 一氨基和羧基与7 肽l - a s h a s p 、d - t y r 、d a s n a s p 、 l - g i n s e t p r o 、l - p r o o l u g l n 、d a s h s e t p r o 、l s e r a s n f f h r 形成内酯，氨基酸构型为l d d l l d l ， a s x - t 弭a 是其特征序列，包括i t u r i n 、b a c i l l o m y c i n 、m y c o s u b t i l i n 等。i t u r i n 类的合成酶系包 括4 个酶，第一个为丙二酰- c o a 醮基转移酶：第二个酶包含酰基一c o a 连接酶、a c p 、b 一酮酰 基合成酶、氨基酸转移酶和1 个n ip s 分子，负责b 氨基_ 月日肪酸和1 个氨基酸的装配；第3 个 酶含有4 个n r p s 分子，装配4 个氨基酸；第4 个蛋白包括2 个n r p s 亚基，装配2 个氨基酸。 m y c o s u b t i l i n 的氨基酸顺序为a s a 、t y r 、a s n 、g h 、p r o 、s c r 、a s n ，b a c i l l o m y c i nd 的氨基酸顺 序为a s h 、t y r 、a s n 、p r o 、g h 、s e t 、t h r ，i t u r i n a 的氨基酸顺序为a s n 、t y r 、a s n 、g i n 、p r o 、 a s n 、s e r ( m o y n e ，2 0 0 4 ；h i r a d a t e ，2 0 0 2 ；c h o , 2 0 0 3 ) a f e n g y c i n 类：包括丑s u b t i l i s 产生的f e n g y c i n 、且c m m 产生的p l i p a s t a t i n ，由1 0 个氨基酸 组成，其氨基酸序列为l - g i u 、d o m 、l - t y r 、d a l l o - t h r 、l - g l u 、d a l a v a l 、l - p r o 、l - o h 、 d l - t y r 、l - i l e ，由第3 个氧基酸l t y r 和最后个l - i l e 与c 1 6 _ 1 9 3 一羟基脂肪酸形成内酯，p l i p a s t a t i n 与f c n g y c i n 仅为t y r 构型不同，对丝状真菌具有高抑制性并能够抑制磷脂酶a 2 活性。f e n g y e i n 的合成需要f e n c 、f e n d 、f c n e 、f c n a 、f e n b 五个酶，分别负责2 、2 、2 、3 、1 个氨蒸酸的装 配( v o l p o n ，2 0 0 0 ；l i n ，1 9 9 9 ) 。k i m 等( 2 0 0 4 ) 报道了具有相似结构的脂肽，由l - g i u 、d o m 、l - t y r 、 d - a l l o - t h r 、d - a l a 、d v a ! 、l - p r o 、l 1 l e 按3 ：1 ：2 ：l ：1 ：2 ：1 ：1 组成。 b 多肽类：芽孢杆菌产生的抗真菌多肽包括环状、线状、分支环状3 类。这类物质主要作 用于细菌并多作为饲料添加剂、药品使用，在植物病害的生物控制中少见( 陈中义，2 0 0 3 ) 。 环状结构最为常见，例如短杆菌肽s ( g r a m i c i d i ns ) 、短杆菌酪肽( t y r o c i d i h e ) 为b r e v i b a c i l l u s b r e v i a 产生的环十肽：m y c o b a c i l l i n 是b s u b t i l i s 产生的环十三肽。裴炎等( 1 9 9 9 ) 报道b c e r e u ss - 1 菌株产生一种环状多肽a p s 一1 ，由g i l a 、a s p 、t y r 、s c r 、t h r 、p r o 、l e u 、h e 、v a l 和一种异常氨 基酸组成。刘颖等( 1 9 9 9 ) 报道b ，s u b t i l i st g - 2 6 产生一种抗真菌小肽l p 1 ，经m a l d i t o f 质谱鉴 定，分子量为1 0 5 7 3 ，等电聚焦测得其p i 为4 7 5 。l p 1 对温度有较高的稳定性，1 0 0 ( 2 保温3 0 r a i n ，仍 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 i 一 能保持7 5 的活性。抑菌谱表明，该抗菌肽对多种植物病原真菌有很强的抑制作用，l p - l 可造成绿 色木霉菌丝生长形态异常：菌丝端部膨大，菌丝扭曲，分支加剧，菌丝内细胞质分布不均匀，发生凝聚。 茚三酮反应以及测序结果均证实其为环肽。何青芳等( 2 0 0 2 ) 报道b s u b t i l i sa 3 0 菌株产生一种对多 种植物病原真菌有强烈抑制作用的物质，该物质分子量1 4 7 6 d a ，茚三酮反应阴性说明无自由n 端，酸水解后茚三酮反应和双缩脲反应呈阳性，故推测为一种环肽。 线状多肽包括短杆蕴肽a ( g r a m i e i d i na ) 和伊短菌素( e d e i n e ) 。短杆菌肽a 由1 5 个氨基酸组成 的线性肽，其中8 个是l 氨基酸7 个是d 一氨基酸，它具有疏水的侧链，两个分子在一起形成跨膜的 离子通道。伊短菌素由5 个氨基酸和亚精胺组成，其中两个氨基酸为非蛋白氨基酸。这两种线状 多肽均由b r e v i b a c i l l u sb r e v i s 产生。 分支环状多肽包括：多粘菌素( p o l y m y x i n ) ，包括5 种成分，由1 0 个氨基酸和脂肪酸组成， 第4 个氨基酸和c 端氮基酸形成7 肽环。枯草杆菌素( b a c t r a c i n ) 目h1 2 个氨基酸组成，7 个氨基酸 成环，5 个为线状。o e t a p e p t i n 包括4 种成分，为8 肽，含与多粘菌素相似的7 肽环，线状部分 只有一个氨基酸。 c 其他类物质 z w i t t e r m i c i na 是线状聚酰胺类物质，在且c e r e u s 群中广泛存在。对细菌和真菌具有广谱抑 菌活性，对疫霉、腐霉属病原菌活性极强。 芽孢杆菌溶素( b a c i l y s i n ) 是由置s u b t i l i s 产生的2 肽，由l - a i a 和一个稀有氨基酸l 抗荚膜菌 素( l - a n t i e a p s i n ) 组成，由氨基酸连接酶或b a c i l y s i n 合成酶在a t p 和m 9 2 + 存在下合成。 a n o x y b a c i l l i n 是且c e r e u s 产生的，由一个脂肪族氨基酸和甲基偶氮氧侧链组成，具有广谱抗 真菌活性，机理为在转录水平抑制真菌硫吸收有关酶的合成，是发现的第一个真菌转录特异的抗 生素。 多烯类物质对细菌、真菌具有抗性，已报道的有b a c i l l a e n e 、d i f f i c i d i n 、o x y d i f f i c i d i n 等，高 学义等( 2 0 0 3 ) 报道b s u b t i l i sb 2 可以产生一种多烯类物质，可以抑制真菌孢子的萌发。谢海平等 f 2 0 0 3 ) 从香港清水湾海域中分离到一株能产生抗酵母样真菌和革兰氏阳性菌抗生素的b s u b a l s b s - i ，对b s 1 产生抗生素条件的研究表明，b s 1 在多种培养基中生长迅速，但只在p d b ( 马铃薯葡 萄糖液体) 中产生抗真菌活性物质。活性物质租提液具有良好的耐热性和酸碱耐受性，1 2 1 加热 1 5 r a i n 及在p h 2 和p h l 0 处理2 4 h 仍有相当高的活性。用吸附、萃取、离子交换层析和r p h p l c 等技术对此菌的抗菌代谢产物进行纯化，结果发现b s - i 在p d b 培养基中发酵时至少产生3 种亲水 性的抗真菌活性化台物，三者在c 1 8 反相层析柱上的保留时间差别不大，对h p l c 纯化后的其中一 种化合物结构的初步分析表明该化合物含有共轭双键但无任何氨基酸残基，推测也可能是多烯类 物质。 田黎等( 2 0 0 3 ) 从海洋生境中分离筛选获得1 株芽孢杆菌b - 9 9 8 7 菌株，其分泌到胞外的代谢产 物对植物病原真菌有显著的抑制作用，其中对茄交链孢菌、大丽轮枝菌、黄枝孢菌、立枯丝核菌 主要造成真菌孢子或菌丝末端膨大成球状，继而胞壁崩解，原生质外泄：对尖孢镰刀菌和莴苣霜霉 菌的抑制作用则表现为孢子萌发率降低和芽管长度明显变短。该抑菌物质经乙醚萃取，硅胶g 薄 层层析纯化，官能团显色反应初步推断为酚类化台物。 由核糖体途径产生的抗真菌物质主要是细胞壁多糖降解酶类，包括几丁质酶和葡聚糖酶，蛋 5 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 白酶、脂肪酶对真菌细胞壁降解具有协同作用。芽孢杆菌产生的几丁质酶包括内切酶和外切酶， 内切酶产生寡聚几丁质多糖，外切酶产生几丁质单糖。葡聚糖酶包括外切的b 一1 , 3 葡聚糖酶、1 3 一l 葡聚糖酶、b l , 6 - 葡聚糖酶和内切的8 - l 3 - 葡聚糖酶、b - i 夺葡聚糖酶。 p 妒甙2 0 0 4 ) 等在寻找对引起西瓜炭疽病的c o l l e t o t r i c h u ml a g e n a r i u m 的生防微生物时从土 壤中分离出一株丑a m y l o l i q u e f a c i e n sm e t 0 9 0 8 ，单独培养时发酵液无抗菌性，只有与病原菌共同 培养时发酵液才具有抗菌性，纯化后得到一个分子量约4 0 k d a 的蛋白，用胶体几丁质、壳聚糖、 纤维素、b 1 , 3 葡聚糖作为底物测试发现该蛋白具有b 1 , 3 葡聚糖酶活性。该蛋自在3 0 7 0 c f 活性不变但在1 0 0 ( 2 下处理2 0 m i n 后活性减少5 0 。用激光共聚焦扫描显微镜观察菌丝形态发现 该酶作用于细胞壁，导致茵丝膨大并断裂。 w a n g 等( 2 0 0 2 ) 从土壤中分离到两株可以以儿丁质为唯一碳源生长的b s u b a l 扫菌株，在含有 几丁质或海洋甲壳动物外壳的培养基中可以产生一种对f u s a r i u ma x y s p o r u m 具有毒性的物质，并 表现出几丁质酶活性。该物质对p h 不敏感，在p m 、p h l l 时活性均在5 0 以上；对热稳定，1 0 0 处理3 0 m i a 活性不变：5 0 浓度的发酵液对f o x y s p o r u m 的抑制率达到8 5 。 h e l i s t o 等( 2 0 0 1 耀道b a c i l l u ss p x - b 是一株对多株植物病原真菌具有抗性的芽孢杆菌，能够 产生儿丁质酶、壳聚糖酶、p 一1 , 3 葡聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶。采用均质处理的m a c r o l e p i o t a p r o c e r a 萤丝体可以有效诱导以上酶类的产生，效果优于胶体几丁质和部分纯化的p o l y p o r u s $ q u a m o s u $ 菌丝体细胞壁。采用b i o - r a d 的m i n i p r o t e a ni ie l e e t r o p h o m s i sc e l l 系统对几种酶类进行了纯化， 几丁质酶纯化3 6 倍、壳聚糖酶纯化6 9 倍、1 3 1 , 3 葡聚糖酶纯化1 5 倍、脂肪酶纯化4 4 倍，儿丁 质酶有2 个分子量为4 6 k d a 和3 5 k d a 的亚基组成，壳聚糖酶和脂肪酶分子量分别为2 7 k d a 和 6 2 k d a ，均由一个亚基组成。 陈红等( 2 0 0 2 ) 利用纹枯病菌细胞壁培养基富集产生几丁质酶的菌株，从1 6 6 株几丁质酶产生 菌中分离得到一株高产菌x 2 - 2 3 ，鉴定为圆孢芽孢杆菌伪g l o b 缸p o r u s ) 是一种新的几丁质酶产生 菌。丑g l o b i s p o r u sx 2 - 2 3 对所有的指示菌如水稻纹桔病、稻瘟病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、油 菜菌核病以及水稻白叶枯病等多种病原菌均具强烈的拮抗作用。当且g o b i s p o r u sx 2 2 3 加入上述 病原真菌的液体培养基中时，由光学显微镜和电子显微镜观察发现病原真菌苗丝发生扭曲、变形、 菌丝细胞壁肿胀裂解、细胞质聚集、原生质体外溢或裸薅等异常现象。该菌发酵液中几丁质酶活 性达2 5 ，5 u m l 。 c h e n 等( 2 0 0 4 ) 报道来自b c i r c u l a n sw l - 1 2 的几r 质酶基因c 徂，约2 4 k b ，通过穿梭载体 p h y 3 0 0 p l k 转移到一株广谱抗真菌的b s u b t i l i sf 2 9 3 中，该基因得到表达并在上清液中检测出 几丁质酶活性，其抗菌能力得到显著提高。 1 2 2 2 位点占据 位点占据需要菌株具有在植物体表面和f q 部定植的能力，对此已有少数报道。r e v a 等( 2 0 0 4 ) 对从植物组织和土壤中分离出的1 7 株芽孢杆菌进行鉴定，5 株为b s u b a l i ss u b s p s u b a l m ，3 株为 且s u b d l i ss u b s p s p i z i z e n i ，2 株为b m o j a v e n s i s ，7 株与且a m y l o l k l u 咖c i e n s 相似但有所不同。采 用扫描电镜研究了这些菌株在植物根部定植能力，用种植试验研究了对植物的保护效果，并与菌 株在平板上产生的抑菌圈大小进行了比较，发现菌株对植物的保护效果与根部定植能力正相关但 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 与在平板上抑菌能力无相关性，说明平板法不能完全反应菌株的实际应用价值，植物活体保护试 验是必需的。 b a c o n 等( 2 0 0 2 ) 对1 3 株丑m o j a v e n s 缸利用础一突变株在植物体内的运动研究了它们在植物体 内的定檀能力，结果显示这1 3 株b m o j a v e n s i s 均具有定植能力，可以成为植物内生菌，并表现 出对f u s a r i u mm o n i l i f o r m e 的抗性，在平板培养中有l o 株能够抑制e m o n i l i f o r m e 的生长，并对植 物生长具有促进作用。另外1 4 株芽孢杆菌中s u b t i l i s 、丑a t r o p h a e u s 、丑l i c h e n i f o r m i s 、丑 a m y l o l i q u e f a c i e n s 、p a e n i b a c i l l u sl e n t i m o r b u s 、户p o p p i l l i a e ) 只有5 株能够定植。认为且m o j a v e n s i s 可能是一个定植能力较强的种，而植物内生菌是获得该种的一个较好来源。 c h e n 等( 1 9 9 5 ) 报道：对2 4 4 株棉花内生菌的鉴定表明，伯克霍尔德菌属( b u r k h o l d e r i a ) 、芽孢 杆菌属( b a c i l l u s ) 、假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 是主要的棉花内生菌，所占比例分别为2 6 2 、1 8 1 、 1 6 8 。对一株内生菌且p u m i l u sj m 1 1 2 9 的研究表明，该菌株对镰刀霉导致的枯萎病有较好的控 制效果，发病严重程度为1 7 5 、2 4 2 、o 8 3 。对照为2 5 0 、3 4 2 、2 0 0 。该菌株在植物体内定植后 可以生长繁殖，活菌数有一定上升。 1 2 _ 2 3 诱导植物抗病性 o n g e n a 等( 2 0 0 5 ) 报道丑s u b t i l i sm 4 和病原菌c o h e t o t r t k h u ml a g e n a