（食品科学专业论文）戊糖乳杆菌WH1221产细菌素的条件优化及其抑菌特性研究.pdf

摘要 本试验以分离自内蒙古传统乳制品中的戊糖乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p e n t o s u s ) w h l 2 2 1 为研究对象，对其产细菌素的培养条件、培养基成分和生物学特 性进行了分析，并对该细菌素进行了初步的分离纯化和在不同食品中抑菌作用的研 究。主要研究结论如下： ( 1 ) l p e n t o s u sw h l 2 2 。l 产细菌素最佳培养条件和培养基成分的优化：采用 响应面法确定了l p e n t o s u sw h l 2 2 1 产细菌素最佳培养基成分和培养条件为大豆 蛋白胨1 0g l ，牛肉膏5g l ，酵母粉5g l ，葡萄糖3 0g l ，柠檬酸钠6g l ，磷酸 氢二钾6 叽，乙酸钠1 5g l ，t w e e n8 02g l ，硫酸镁1 l ，硫酸锰5 0m g l ，硫 酸亚铁5 0m g l ，起始p h 值7 0 ，1 的接种量，3 7 静置培养4 8 h 。此条件下该细 菌素粗提液的效价值为4 9 3 9 0 m l 。 ( 2 ) 细菌素粗提液的生物学特性：l p e n t o s u sw h l 2 2 1 的细菌素粗提液在p h 3 0 - 6 0 范围内具有抑菌活性，其中在p h3 0 - - 5 0 范围内活性最强，而在中性及碱 性条件下则失去活性。该粗提液经过不同温度、时间的加热和冷冻冷藏处理后，其 抑菌活性均显示出了较强的稳定性。抑菌谱较广，不仅对革兰氏阳性菌有抑菌作用， 而且对革兰氏阴性茵也有抑菌作用，但是对酵母菌无抑菌作用。 ( 3 ) 细菌素的纯化：l p e n t o s u sw h l 2 2 1 的细菌素粗提液经过超滤后，分子 量为3 k d a m 5 k d a 的组分抑菌活性最强。该组分经过s e p h a d e xg 2 5 凝胶过滤层 析，出现两个洗脱峰，对这两个洗脱峰的收集液进行测定，只有第二个峰的收集液 有抑菌活性，说明该细菌素的主要抑菌活性物质的分子量在3 l a 5 k d a ) 及超滤液i ( m 5 k d a ) ，然后将超滤液i ( m 5 k d a ) 再经3 k d a 超滤柱超滤得浓缩液i i ( 3 k d a m 5 k d a ) 及超滤液i i ( m 3 k d a ) 。进水压力始终保持0 1 m p a ，所得超滤 液、浓缩液经旋转蒸发浓缩并冻干后，配成1 0 0 m g m l 的溶液，分别对其进行抑菌试 验，并测定肽含量。 2 2 8 4 超滤液的凝胶柱分离 2 2 8 4 1 s e p h a d e xg - 2 5 的前处理 将1 3 0 9s e p h a d e xg 2 5 干胶j j n 入至u 6 0 0 m l 蒸馏水中，加热2 h ，待充分溶胀后，将 凝胶匀浆悬浮，倾去上清中的细小颗粒。真空脱气后装柱( 柱规格为2 6 c r u x l 0 0 c m ) 。 2 2 8 4 2 装柱 向层析柱注入部分洗脱液，使层析柱底部死空间内的空气排空，再关闭层析柱 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 3 出水口，向柱内加入约1 3 柱容积的洗脱液，将凝胶匀浆通过内壁一侧或玻璃棒引 流倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉积约2 - - - 3 c m 后打开柱的出口使水流出，流速 一般为3 - - 6 m l 1 0 m i n ，同时不断缓慢加入凝胶悬液，待沉集的凝胶上升到离柱的顶 端约2 c m 处时停止装排，关闭出水口。然后在凝胶表面放一片滤纸，防止加样时凝 胶被冲起，待凝胶完全沉淀后，接上洗脱液和蠕动泵，检查密闭性，用3 - - 5 倍柱床 体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。 2 2 8 4 3 层析样品的制备 将分子量在3 k d a m 5 k d a 的超滤组分配成肽含量5 m g m l i 拘溶液，置- 于4 o c 冰箱，备用。 2 2 8 4 4 加样 加样前先将层析柱上口打开，使床面上的洗脱液靠重力作用自然下降，当床面 刚好暴露时关闭出水口，用加样器轻轻将i m l 样品溶液缓慢加到凝胶床面上，避免 破坏床面的平整，然后打开出水口使样品溶液流入柱内，当样品溶液流至与胶面相 切时，关闭出水口。用少量洗脱液冲洗层析柱上端，打开出水口使洗脱液也进入床 面。最后加入3 - - 4 m l 洗脱液于凝胶上，关闭上口，连接洗脱液贮瓶、蠕动泵、核酸 蛋白检测仪、分部收集器，即可进行洗脱。 2 2 8 4 5 洗脱与收集 打开上、下出水口，以蒸馏水作为洗脱液，洗脱流速为0 3 m l m i n 。h d 2 型核 酸蛋白检测仪在2 2 0 n m 处测定各管收集液的吸光值，经层析谱采集分析仪记录后输 入计算机绘制洗脱曲线。将各个洗脱峰对应的收集液经旋转蒸发浓缩后，置于4 c 冰 箱，备用。 2 2 8 4 6 抑菌活性的检测 将层析所得的各个洗脱峰的洗脱液收集并经旋转蒸发浓缩后，以丑c e r e u s 为指 示菌，测定其抑菌活性及肽含量。 2 2 9 三p e n t o s u sw i l l 2 2 1 细菌素在食品中的抑菌作用 2 2 9 1 细菌素的制备 将l p e n t o s u sw h l 2 2 1 的细菌素经凝胶过滤层析后有抑菌活性的组分浓缩并 冻干，再配成效价值为2 x 1 0 4i u m l 的细菌素溶液，置于4 0 ，备用。 2 2 9 2 细菌素在鲜奶中的抑菌作用 1 4 戊糖乳杆菌_ r l - 1 1 2 - 2 - 1 产细菌素的条件优化及其抑菌特性研究 将刚挤出的新鲜牛奶分成若干份，分别向其中添加5 0i u m l 、1 0 0i u m l 、1 5 0 i u m l 按照方法2 2 9 1 制备好的l p e n t o s u sw h l 2 2 1 的细菌素和5 0i u m l 的 n i s i n ，2 2 培养，于0 一3 6 h 内取样，测定其细菌总数、酸度和p h 值，以不添加细 菌素的新鲜牛奶作为空白对照。 2 2 9 3 细菌素对番茄汁中且c e r e u s 的抑菌作用 将新鲜番茄烫漂后去皮、榨汁、过滤，制成3 0 的番茄汁，并分成若干份，经 巴氏杀菌加入5 0 c f u m l 的丑c e r e u s 后，再分别添加5 0 i u m l 、1 0 0i u m l 、1 5 0i u m l 按照方法2 2 9 1 制备好的三p e n t o s u sw h l 2 - 2 - 1 的细菌素和5 0i u m l 的n i s i n ，于 3 0 培养，隔天取样，测定其活菌数，以不添加细菌素的番茄汁作为空白对照。 2 2 9 4 细菌素对番茄汁中大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 ( e s c h e r i c h i ac o l i0 1 5 7 ：h 7 ) 的抑菌 作用 将3 0 的番茄汁分成若干份，经巴氏杀菌后加入5 0 c f u m l 的e c o l i0 1 5 7 ：h 7 ， 再分别添加5 0 m l 、1 0 0i u m l 、1 5 0i u m l 按照方法2 2 9 1 制备好的上p e n t o s u s w h l 2 2 1 的细菌素和5 0 i u m l 的n i s i n ，于3 0 培养，隔天取样，测定其活菌数， 以不添加细菌素的番茄汁作为空白对照。 2 2 9 5 细菌素对调配型酸乳饮料中e c o l i0 1 5 7 ：h 7 的抑菌作用 原料乳中加入糖、稳定剂，混合均匀，用食品级乳酸调p h 值至4 0 左右，均质 后经巴氏杀菌得到调配型酸乳饮料。 将调配型酸乳饮料分成若干份，并加入5 0 c f u m l 的e c o l i0 1 5 7 ：h 7 ，再分别添 加5 0i u m l 、1 0 0i u m l 、1 5 0i u m l 按照方法2 2 9 1 制备好的三p e n t o s u sw h l 2 2 1 的细菌素和5 0i u m l 的n i s i n ，于3 0 c 培养，隔天取样，测定其活菌数，以不添加 细菌素的调配型酸乳饮料作为空白对照。 3 结果与分析 3 1 三p e n t o s u sw h l 2 2 1 生长曲线和抑菌活性曲线的绘制 三p e n t o s u sw h l 2 2 1 在起始p h 值6 5 的m r s 培养基中3 7 c 培养的生长f h j 线 见图2 ，抑菌活性和p h 值变化曲线见图3 。 由图2 和图3 可知，三p e n t o s u sw h l 2 2 1 生长迅速，4 h 进入对数生长期，1 2 h 到达稳定期，2 0 h 后开始进入衰亡期。目前，细菌素的多少和抑菌活性强弱通常是 通过抑菌圈的直径进行衡量嘲j 。由抑菌活性变化曲线和酸性对照可以看出， p e n t o s u sw h l 2 2 1 在4 h 1 2 h 内对指示菌产生的抑制作用不是由细菌素引起的，而 是微生物发酵产生的酸性物质作用的结果。细菌素则是从1 2 h 开始产生，到达2 4 h 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 5 后增长速度减慢，4 8 h 时达到最大值，抑菌圈直径可达2 0 3 8 士0 6 1 r a m ，酸性对照为 1 4 8 9 士0 4 7 m m 。由此可见，该细菌素是在稳定期开始产生的，这与t o d o r o v 嗽3 报道 的“多数的细菌素是在对数生长期末期或者稳定期开始合成”相符。 星 矗 臣 理 录 1 0 9 5 9 8 5 8 7 5 7 6 5 6 5 5 5 + 活菌数的对数+ 0 d 6 0 0 048 2 5 。 2 0 1 5 1 0 5 o 1 62 02 43 24 04 8 时间( h ) 图2 工p e n t o s u sw h l 2 - 2 - 1 生长曲线 f i g u r e2g r o w t hc u r 、eo fl p e n t o s u sw h l 2 - 2 1 + g ! 1 1 2 2 1 + 酸性对照+ p h 值 9 8 7 6 5g 4 吕 3 2 1 0 17 0481 21 62 02 43 24 04 8 时间( h ) 图3 l p e n t o s u sw h l 2 - 2 - 1 抑菌活性和p h 值变化曲线 f i g u r e3 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n dp hc h a n g e so f l p e n t o s u sw h l 2 - 2 1 6 5 4 型 3 墨 2 1 o 3 2l p e n t o s u sw h l 2 2 1 产细菌素最佳培养条件的优化 3 2 1 培养时间对细菌素产量的影响 培养时间对细菌素产量的影响如图4 所示。由图4 可以看出，不同的培养时间 ，l昌j-o【暴涟俺* 16戊话乳杆菌州1 2 - 2 1 产细菌素的条件优化及其抑菌特性研究 细菌素的产量不同，虽然1 2 h 时细菌素已经开始产生，但在3 6 h 开始趋于稳定，4 8 h 达到最大，抑菌圈直径为2 10 3 0 5 3 m m ，酸性对照为1 51 8 03 6 r n m 。但是随着培 养时间的延长，细菌素的产量明显下降，这可能是由于长时间的培养，使细菌素吸 附到菌体细胞上导致其抑菌活性下降。所以，上p e n t o s u sw h l 2 2 1 产细菌素最 佳时间为4 8 h 。 口w h l 22 一l 酸性对照 曲陪_ h 舟怕 1 22 4 3 64 86 0 培养时间( h ) 田4 培养时问对菌素产量的影 f i g u r e4 e f f e c lo f c o l t u l l m e i op r o d u c t i o no f b a c t e h o c i n 322 培养温度对细菌素产量的影响 培养温度对细菌素产量的影响如图5 所示 2 5 ：2 0 占 g 1 5 盏1 0 疆 晕5 0 口州l2 2 1 酸性对 馕1 i 培养温度( ) 目5 镕养a 度对菌素产量的影响 f i g e5 e f f e c to f c u l 【u m t e m p e r a t u r e f op r o d u c t i o no f b a c t e f i o c i n lv硭删匣通章 -。 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 7 由图5 可以看出，不同的培养温度对细菌素的产量有较大影响。1 5 时，细菌 素产量很少，2 5 c 时，细菌素的产量明显增高，3 7 c 时产量最大，抑菌圈直径可达 2 1 5 7 04 9 r a m ，酸性对照为】52 7 i 05 3 m m ，而4 5 时，没有细菌素的产生这是 由于p e n t o s u s w h l 2 2 一l 在4 5 生长受到限制，进而影响到细菌素的产生。这充 分说明细菌素的产生是与细菌的生长状况是密切相关的“”，故选择3 7 ( 2 为 p e m o s u s w h l 2 2 1 产细菌素的最佳培养温度。 3 23 起始p h 值对细菌素产量的影响 培养基的起始p h 值对细菌素产量的影响如图6 所示 2 5 2 0 i ：1 5 酋 匡1 0 芒 ；5 45 6 口h 值7 8 9 图6 起始9 h 值对亲产量的髟目 f i g u r e6e f f e c io f h t op r o d u c t i o no f b a c l e r i o c i n 由图6 可以看出，在p h 值为7 时细菌素的产量最大。其抑菌圈直径可达 2 24 6 ：l 02 3 n u n ，酸性对照为1 49 2 工o2 5 m m ，偏酸