（食品科学专业论文）秸秆固态发酵酒精动力学研究.pdf

摘要 秸秆固态发酵生产酒精是解决秸秆生物转化酒精的 r 效途径。本文探讨了秸秆态发酵 过程参数的测定方法，对秸秆固态发酵过程进行动力学建模，井求解动力学参数，最扁在两 种类型的固态生物反应器进行了初步放大研究。 比较了麦角固醇法、氨基葡糖法、千重损失法、菌体呼吸强度法，试验显示麦角闹醇法 相对于培养时间稳定，测定方法简单、快捷，可以作为秸秆固态发酵过程的生物麓测定方法。 将秸轩固态发酵酒精工艺路线分解为纤维素酶曲制各和同步糖化酒精发酵两个关键过 程，分别对上述过程进行动力学分析，在试验基础上提出建模假设并建立了动力学模型。 用经改进的基本遗传算法( m s g a ) 辨识动力学参数结果显示所建立的动力学模型能较 好地描述和预测秸秆固态发酵生产酒精的过程；遗传算法所得模型值与试验值拟台结果优r 传统的l e v e n b e 曙m a r q u a r d t 算法，其目标函数值由5 0 2 3 6 下降到4 4 6 8 0 ，且求解步骤人火 简化。 在转轴搅拌式和转鼓式生物反应器上，对底物湿度、搅拌频率和时间、通气速率等控制 参数进行了优化，确定了发酵工艺条件。结果显示转鼓式反应器内的发酵效果优于转轴搅拌 式，达到0 3 1 2 9 干菌体和1 7 0 uf p a 酶活幢培养基干重，洒精产率达到o 0 7 4 d g 培养基干重， 各参数均优于摇瓶发酵，说明固态生物反应器放大取得匙好效果。 关键词：秸秆酒精 固态发酵遗传算法 生物反应器 a b s t r a c t t h eb i o c o n v e r s i o no fb i o m a s s ( c o r ns t a r ka n ds t r a w ) i n t oe t h a n o lh a sb e e ns c e na st h ei n o s t p r o m i s i n ga l t e r n a t i v eb i o e n e r g ys o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o nt op r o d u c ee t h a n o lb yc o r n s t a l ki sa r l e f l i ：c t i v ea p p r o a c ht os o l v et h ep r o b l e m t h ea r t i c l ed i s c u s s e dd i f l f b r e n tm e t h o d st od e t e r m i n et 1 1 e p r o c e s sp a r a m e t e r sf i r s f l y t h e nk i n e t i cm o d e l sw e r es e tu pa n dt h em o d i f i e ds i m p l eg e n e t i c a l g o r i t h m sw a sa p p l i e dt od e t e r m i n e t h ek i n e t i cp a r a m e t e r s a tl a s t t h eb i o p r o c e s sw a ss c a l e du p i nt w o t y p e so f b i o r e a c t o r a f t e r c o m p a r i n gt h ee r g o s t e r o l m e t h o d ，n gm e t h o da n d d r y n l a s sl o s sm e t h o d ，t h e e r g o s t e r o lm e t h o dw a sc h o s e na st h eb e s ta p p r o a c ht om e a s u r et h eb i o m a s si n t h es o l i d s t a t e s u b s t r a t eb e c a u s eo fi t ss i m p l i c i t y ，e f f i c i e n c ya n d s t a b i l i t yd u r i n g c u l t u r ep r o c e s s e s t h ep r o c e s so ft h es o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o nw a sc a r e f u l l y a n a l y z e da n dt w ok e yp r o c e s s e s ( c e l l u l a s ep r e p a r a t i o na n d s i m u l t a n e o u ss a c c h a r i f i c a t i o n e t h a n o l f e r m e n t a t i o n ) h a v eb e e n s e p a r a t e df o rf u r t h e rs t u d y t h em o d e l i n ga s s u m p t i o n sw e r eb r o u g h tf o r w a r da n dk i n e t i cm o d e l w a ss e tu po nt h eb a s i so f e x p e r i m e n t sv a l i d a t i o n t h e nam o d i f i e ds i m p l eg e n e t i ca l g o r i t h m s ，w h i c hw a sr e a l i z a t i o nb ) ，m a t l a bg a t o o l b o x ，w a sa p p l i e dt od e t e r m i n et h ek i n e t i cp a r a m e t e r s t h ep a r a m e t e r sg a i n e db ym s g aw e r e c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a ll e v e n b e r g - m a r q u a r d tm e t h o da n d1 e s u l t ss h o w e dt h a tt h em s g a w a sm o r ee f f i c i e n ta n de x a c tt h a nt h et r a d i t i o n a lo n ew i t ht h eo b j e c t i v ef u n c t i o nv a l u er e d u c e d f r o m5 0 2 3 6t o4 4 68 0m e a n t i m e ，t h es o l v es t e p sw e r ed e c r e a s e dr e m a r k a b l e l y a tl a s t ，t h e b i o p r o c e s sw a ss c a l e du pi n o n er o t a t e - d r u mb i o r e a c t o ra n do n er e v o l v e - s h a f t b i o r e a c t o r t h ec o n t r o lp a r a m e t e r ss u c ha ss u b s t r a t eh u m i d i t y , s t i r r i n gt i m e f r e q u e n c y a n df l o w r a t ew e r eo p t i m i z e d r e s u l t ss h o w e d t h a tt h ef e r m e n t a t i o ne f l b c ti nr o t a t e - d r u mb i o r e a c t o r e x c e l l e dt h er e v o l v e s h a f to n ew i t h0 3 1 2 9d r yb i o m a s s ，1 7 0uf p ae n z y m ea c t i v i t i e sa n d00 7 4 9 e t h a n o l p r o d u c t i o np e rgd r y s u b s t r a t e ，w h i c hs h o w e das u c c e s s f u ls c a l e 。u p f r o mf l a s k st o b l o r e a c t o l k e y w o r d s ：c o r ns t a l k ，e t h a n o l ，s o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n ， g e n e t i c a l g o r i t h m s ，b j o r e a c t o r - i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：时间：2 矿护年月2 矿日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容a ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 乃悭 时间：口，；年月p 日 时间：严多年厂月弘曰 动力学参数 综合( f p a ) 酶活力 初始酶活力 c 。和c x 酶活力 b 葡萄糖苷酶活力 失活速率常数 t 时刻的菌体量( j 1o o m l ) 抑制常数 米氏常数m o l l 维持常数 群体大小 生存期望数目 酶活力( ) 起始酶活力( ) 初始交叉率 初始突变率 最大产物量 动力学参数( h 。) 主要符号表 s 基质浓度( g g 干重) s 、 纤维一糖浓度 s纤维素浓度 s 葡萄糖浓度 t最大遗传代数 x 菌体量( 1o o m l ) x o初始菌体量( l o o m l ) x 。最大菌体量( g i o o m i ) y 。菌体量对底物消耗的得率系数 y p s产酶活力对底物消耗的得率系数 a 生长相关产物生成系数( g 产= 物g 生物量) i v b生长无关产物生成系数( 无困次) ul l i 事l i n g ( h i ) 。 最大比生长速率( h 。) 占编码精度 “参数取值范围 b 、 ， ， m j m 州 啪e厶b k q k 弧m h ，h m 叭只嘟 ；呈望窑兰：i 堡圭兰垒鎏圣 玺三耋堑篁 第一章绪论 1 1 研究的目的、意义及进展 1 ，1 1 秸秆转化生物质酒精 世界面临着三大问题：粮食、环境和能源。 我国是农业大国，每年约产生农作物秸秆八亿吨，但目前被利用的仅占1 5 ，绝大部分农作 物秸秆被直接焚烧，既造成严重的环境污染，又产生了惊人的资源浪费。 秸秆燃料酒精和联产饲料系统工程是利用秸秆、柴草等生物质材料，经秸秆固态发酵转化为 酒精和大量廉价高效固态酒糟饲料，并通过部分取代汽油为汽车等提供洁净的动力资源是二十 一世纪“绿色农业”、“生态农业”的方向，符合可持续发展战略。秸秆是一种可再生的自然能源 资源不会给环境带来危害，是可以“合理永续利用的自然资源”，不仅能缓解商品能源的短缺 和提供高效饲料，而且有利于农业科技的全面推行和再生物质的综合利用，对农村经济可持续发 展和生态环境的保护起到积极的作用。 国际上对发酵酒精的研究多是以将其作为清洁液体燃料。替代或部分替代汽油，作为汽车燃 料为目标的，主要集中在再生资源利用、提高发酵强度和节约能源三大方面。据预测，到2 0 5 0 年前后。世界将面临能源的枯竭。发酵酒精和甲醇将是最现实的液体燃料替代用品。现今，巴西 年产发酵酒精量已达1 2 0 万吨，美国超过2 0 0 万吨，几乎全部或大部分用作制备汽油醇。我国也 已开始对使用玉米等农产品生产汽油醇项目的研究“1 。 目前，欧盟、美国等在生物质能利用领域已取得了重大进展，如微生物纤维素酶的生产效率 显著提高( 生产率已达1 0 0 i u t l h 以上) ，多种新的原料预处理实用技术已被开发，纤维索酶解率 可达9 0 以上，纤维素生产酒精或丙酮丁醇等的中试已扩大至数十立方米发酵罐的小型生产规模 等【3 | 。但由于缺少适宜的菌种和工艺。尤其是高温细菌发酵菌种和技术，缺少对多碳源高温联合 发酵动力学的探讨以及有效的新型反应器的研究，生物质能源还缺乏一定的市场竞争力，其应用 还受到一定的限制。 由美国能源部和农业部共同提案的生物质研发法案( b i o m a s s r e s e a r c ha n d d e v e l o p m e n t a c t o f2 0 0 0 ) i ：强在2 0 0 0 年通过了美国政府的立法。旨在1 0 年内从技术上解 决生物质能源的工业化瓶颈，政策上支持以生物酒精为主的生物质能源消费量翻三番，同时投入 巨额资金到科研机构、生产企业进行技术开发。我国对生物质能源研究的投入力度也逐年增加， 近年的“8 6 3 计划”和国家自然科学基金均对与生物质能源相关的研究作了重点资助。 我国年产酒精4 0 07 i 呲g 上，主要以薯干、玉米、木薯和糖蜜为原料。在能源日趋短缺的今 天，开发燃料酒精等石油替代品，特别是研究开发利用植物纤维替代粮食生产燃料酒精，最终实 现由“黑色能源”向“绿色能源”的转化，对发展再生能源、缓解能源危机有重要的战略意义”。 妻垦釜些銮兰2 老主兰篓兰 叁三塞堑丝 1 1 2 固态发酵及其动力学研究 固态发酵( s o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ，s s f ) 指在没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的 水不溶性基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程。由于其具有能耗低、产品分离 成本低、废液少、不存在二次污染等，s s f 在农副产品的综合利用、生物农药及酶制剂生产等方 面具有广泛的应用。特别是用于发酵酒精的生产上，在国内外已日益引起了人们的重视，现代技 术支持下的高效率连续化固态反应器发酵技术可实现无污染、连续化、规模化的酒精生产，并实 现酒精和酒糟饲料的自动分离，可以从根本上解决液态发酵带来的“三废”等环保问题1 6 。s s f 不同于深层液体发酵，其反应基质是以固体状态存在。反应体系内的传递过程极其复杂，既包括 气一固、气一液之间的传递，又有液一固之间的传递；反应过程也不同于化学反应中的气固反应， 合适的菌体生长环境，如p h 、湿含量、温度、供氧等是s s f 过程中菌体生长代谢所必需的j 。s s f 的这些特点决定了其反应器的独特性质，使得操作过程的自动化程度较低p i 。 近年来，固态发酵动力学的研究成为生物反应工程领域的研究热点。由于固态发酵水分活度 低，发酵过程中菌体生长、营养物质的传输及代谢物的分泌等均匀性差，给固态发酵的参数检测 及控制带来困难，其动力学研究与液态发酵相比还很不成熟。学者们就影响固态发酵的各种因素 研究了其动力学性质，包括水分活度、p h 值、发酵时间以及介质传热、菌体生物量等。其中， t a r a g a n o ( 1 9 9 9 ) 等研究了利用黑曲霉固态发酵生产果胶酶的水分活度、p h 与发酵时间的相互关 系由d o e h l e r t 设计方法应用响应面分析法得出了二次多项式回归模型，提出了为防止热量转移 过程中尤其在通风条件下水分的蒸发损失应采取的相应措施：如调整发酵介质的松软性、孔隙率 等，在配料中补加持水性较强的介质等1 7 j ；m i t c h e l l ( 2 0 0 0 ) 等就菌体的生长量研究建立了数学模型 1 8 1 ：s a n g s u r a s a k ( 1 9 9 8 ) ，m i t c h e l l ，k r i e g e f f 2 0 0 0 ) 等提出了微生物在一些生物反应器如转鼓式发酵 器及填充床反应器中的细胞生长动力学模型 9 , 1 0 1 ；o o i j k a a s ( 1 9 9 8 ) 等利用呼吸测定及各种代表性细 胞成分分析方法对在不同培养基及培养条件下固态发酵的菌体生物量的测定进行了研究”1 1 o 我国 的研究者也针对特定的固态发酵过程提出了动力学模型，戚以政、张国英( 1 9 9 4 ) 等在对柠檬酸固 态发酵研究的基础上提出了对m o n o d 方程的修正形式，在一定程度上反映了温度、湿度、p h 值 和底物颗粒度对反应速率的影响【”】；吴绵斌，夏黎明等( 1 9 9 9 ) 研究了培养条件对玉米渣皮在盘式 固态发酵反应器中用a s p e r g i l l u sn i g e rb 1 1 和c a n d i d a u t i l i sa t c c 9 25 6 共培养生产细胞蛋白的影 响，通过单因素实验得到了培养时间、培养温度、通风量、料层厚度的最优参数”。 从查得的文献情况来看，目前对固态发酵动力学的研究多集中于通过实验采集大量数据，利 用试验设计、曲线回归等数学方法对试验数据进行数学关联，据此得到实验条件的优化。这些研 究研究还停留在经验和半经验式的建模方法上，所建立模型的精度不高，局限性也较大，对生产 和放大缺乏实际的指导意义。这主要是因为； 固态发酵本身的特殊性和复杂性使人们对固态发酵过程中各种生化反应的机理缺乏了解。 如本课题所研究的秸秆固态发酵生产酒精为例，霉菌和酵母在固态底料上的共生生长是个非常 复杂的过程，目前尚没有较好的数学模型能够加以解释；固态发酵不同于深层液态发酵，底物 和反应物在固态发酵反应器中不能达到液态发酵状态下完全的混合，这种不均一性给生物反应过 程的研究带来很多困难，许多能够较好的描述液态发酵的动力学模型在固态发酵情况下不适台； 2 耋垦垒些奎兰璧去兰篁鎏圣 叁三耋竺篁 底物和反应物混合的不均一性使固态发酵过程中的传热传质不能像在液态发酵时可以忽略，传 递因素的进入使固态发酵动力学模型的建立和数值解析存在很大困难。 尽管存在许多的困难，人们期待对固态发酵过程进行更理性的研究和分析，试图建立结构化 的( 机理) 模型来阐述这个复杂的问题。w b a r m i g e r 等提出的a r m i g e r h u m p h r a y ( 卜t l 模型) 模 型是目前较为成功的纤维素水解模型，运用此模型可以根据不同反应条件和假设对菌体在纤维素 为主要成分的底物上生长的过程做出简化【l “。吴绵斌( 1 9 9 6 ) 将a - h 模型应用于双菌种( 霉菌和酵 母) 固态发酵玉米皮渣，对反应过程做出如下简化：将反应归结在两类酶( 纤维素酶和淀粉酶酶) 的作用，并做出如下假设：两类酶只受还原糖的反馈抑制，细胞生长动力学符合m o n o d 方程，酶 的生成只与霉菌生长相关，玉米皮渣颗粒为球型，淀粉降解符合米氏方程，还原糖为菌体的限制 性底物，其它基质的影响不考虑等，如此建立了双菌种共生的数学模型，并利用p o w e u 法对模 型( 微分方程组) 进行计算机非线性寻优得到了模型在不同条件下的计算值。通过实验值与模型计 算值的比较，认为两者具有较好的相关性”。 1 1 3 固态生物反应器 生物反应器是生物反应过程的关键设备，是为特定的细胞或酶提供适宜生长环境或进行特定 生化反应的装置。其结构、操作方式和操作条件与产品的质量、产量和能耗有密切的关系。 从远古时代人们用来酿造的桶和罐，一直到现代制药、食品、环保工业的大型自动化的生产 设备，生物反应器随着科学技术的发展不断吸收各学科最新的技术成果，特别是近年来涌现出很 多的新型生物反应器。人们从不同角度对生物反应器进行了分类：根据所使用生物催化剂的不同 分为酶催化反应器和细胞催化反应器；根据反应器操作方式的差别分为间歇式、半连续半间歇和 连续操作式反应器；根据反应器的结构分为釜式、管式、塔式、膜式反应器；根据反应器所需能 量的输入方式分为机械搅拌式、泵流式和气升式反应器。 细胞酶空气 能量 原料 图1 - 1 一般生物反应过程示意图 f i g 1 - 1g e n e r a lb i o r e a c t i o np r o c e s s b k 1 0 n s a f l e 在其研究中归纳出九种不同形式的s s f 工业规模固态反应器：转鼓式、木盒式、 加盖盘式、垂直培养盒式、倾斜接种盒式、浅盘式、传送带式、圆柱式、混合型等”1 ：k e a i d o u 等人则提出了十种不同形式的s s f 反应器”1 。如果将这些种类繁杂的s s f 反应器按基质的运动 形式来分，则可分为两类：静态固体发酵反应器，包括浅盘式和塔柱式反应器；动态固体发酵反 应器，包括带机械搅拌式的简、柱式反应器、转鼓式反应器及搅拌器运动的盘式反应器m 1 。 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 i m3 1 1 1 静态固体发酵反应器内发酵基质在发酵过程中基本处于静止的状态。其结构简单、操作方便、 易于灭菌和放大。但由于发酵基质的相对静止，给热量、氧气和其它营养物质的传递带来了一定 的困难，容易导致基质内部温度、湿度、p h 值和菌体生长状态的不均匀。 动态固体发酵反应器内的物料处于间断或连续的运动状态，由于发酵基质在不断的运动，强 化了传热和传质：同时设备结构紧凑自动化程度相对较高。但是，由于机械部件多、结构复杂， 给灭菌消毒带来了一定的困难；在生产过程中消耗能量过大。同时，持续的发酵物料的运动有可 能破坏菌丝体，影响菌体的生长与代谢。由于实验室规模的发酵过程，搅拌所起的作用( 如促进 物料传递、使发酵基质内部参数均匀) 不一定十分显著，因此这种设备的放大是个显著问题。 综上所述，不同类型的反应器各具特点，有着不同的适用范围，实际工作中反应器的选型和 设计需要结合接种技术、灭菌方式、发酵基质的特性、供气手段、参数的测量和控制、取样分析 技术、结构和操作方面的因素，综合加以权衡。近期报道的固态发酵反应器有；盒式、管道 式、滚筒式( 韩北忠，1 9 9 9 ，s t u a r t ，1 9 9 9 ，h a r d i n ，2 0 0 0 ) 2 0 2 1 ，2 2 】和浅盘式( e r r i d d e r ，19 9 8 ) 刚。 也有利用发酵池( 周晓云等，j 9 9 8 ) 进行生产的报道“。 由于固态发酵过程中热量的聚集容易，造成局部温度升高，且反应器搅拌和散热不方便，物 料分布不均一，使传热传质成为影响固态发酵效果的重要原因，是建立模型时必须考虑的重要因 素。通常采用定时搅拌和通风的方式来消除传热传质不均的影响。有学者认为，体积氧传递系数 ，a 是反映反应器中气体( 氧气) 传递效果的重要参数，人们可以通过检测和控制k ( l ) a 来保证反 应器良好状态；但也有学者持不同看法，j t h i b a u l t ( 2 0 0 0 ) 等对k ( l ) a 作了重新评估，认为在圃态 发酵情况下必须对k ( l ) a 值进行重新定义和认识”q ；d m s m a r t ( 1 9 9 9 ) 等也对转鼓式反应器内的 传递现象做了研究，描述了操作参数对传递现象的影响“”。 生物反应器的基本设计内容包括以下几个方面：l 选择合适的反应器类型，根据反应过程和 物料的特性和生产工艺特征确定反应器的操作方式、结构类型、传递和流动方式：2 确定最佳的 操作条件及控制方式，如温度、压力、p h 、通气量、物料流量等：3 计算所需的反应器体积。设 计各种结构参数“。 由于生物反应过程的复杂性，例如生物反应本身机理难以精确表述，实际的生物反应过程往 往是多种底物、多种产物、多个生物体同时生长，并存在各种抑制的极为复杂的反应过程，同时 生物反应器的传热、传质以及结构参数的差别造成反应条件的不均一性等各方面的( 包括物理的、 化学的、生物的和工程的) 因素使得生物反应器的选型、设计、放大和控制具有很大的难度“。 咀前，人们无法找到较为精确的对生物反应过程的数学描述，研究工作很大程度上是依靠经 验( 感觉) ，进行无数学模型的工艺开发，并通过不断的实验摸索逐渐进行改进。使得实验成本高、 花费时间长、精确性不高，且研究的通用性差，还要承担不成功造成的损失。鉴于此，为了使实 验室的研究成果尽快的放大到工业生产规模，利用生物技术更好的造福人类，更加理性的考察生 物反应过程，反应器的设计及动力学的研究成为研究的重点和热点。 生物反应器动力学研究的最终目的是建立表述生物反应过程的数学模型，并用它来指导生物 反应器设计和放大。在动力学研究中建立模型的方法有三种2 8 1 ：一种是从反应过程的机理出发经 耋里垒些查兰璧圭兰堡篁兰 堑三塞堑篁 过推导得到数学模型，称为机理模型或结构模型；另一种是纯经验模型，是在完全不了解过程机 理的情况下，仅根据一定条件下的实验数据进行数学关联得到的模型；第三种是半经验模型，是 在对过程机理有一定了解的基础上结合实验数据得到的数学模型。由于前面所述的生物反应过程 的极其复杂性，目前生物反应器的动力学研究多是采用半经验模型。建立数学模型的重要研究方 法是数量化和简化，对生物反应过程建立模型时并不要求无所不包的把各种因素都考虑和罗列进 去，而且由于很多因素没有很好的数量化方法或检测方法，所以必须对反应过程进行台理和巧妙 的简化，最终得到可行的、能较好描述过程机理的数学模型。 1 1 4 遗传算法在动力学模型求解和发酵过程优化中的应用 遗传算法是模拟生物在自然环境中的遗传和进化过程而形成的一种自适应全局优化概率 搜索算法。它最早由美国m i c h i g a n 大学的h o l l a n d 教授于2 0 世纪6 0 年代提出，7 0 年代d el o n g 基于遗传算法的思想在计算机上进行了大量的纯数值函数优化计算实验，在上述工作的基础 上，8 0 年代由g o l d b e r g 进行归纳总结形成了遗传算法的基本框架2 ”。 遗传算法与其他一些优化算法相比，主要有以下特点：( 1 ) 决策变量的编码作为运算对象；( 2 ) 直接以目标函数值作为搜索信息：( 3 ) 同时使用多个搜索点的搜索信息；( 4 ) 使用概率搜索技术。遗 传算法提供了一种求解复杂系统优化问题的通用框架，它不依赖于问题的具体领域，对问题的种 类有很强的鲁棒性，所以广泛应用函数优化、组合优化、生产调度问题、自动控制、机器人学和 图像识别等领域p 。 用遗传算法来构造求解的基本步骤有； 第一步：确定决策变量及其各种约束条件，即确定出个体的表现型x 和问题的解空问。 第二步：建立优化模型，即确定出目标函数的类型( 是求目标函数的最大值还是求目标函数的 最小值? ) ，晟终确定数学描述形式或量化方法。 第三步：确定表示可行解的染色体编码方法，也即确定个体基因型x 及遗传算法的搜索空间。 第四步：确定解码方法，即确定出由个体基因型x 到个体表现型x 的对应关系或转换方法。 第五步：确定个体适应度的量化评价方法，即确定由目标函数值，( x ) 到个体适应度f ( x ) 的转 换规则。 第六步：设计遗传算子，即确定选择运算、交叉运算、变异运算等遗传算子的具体操作方法： 第七步：确定遗传算法的有关运行参数，即确定出遗传算法的m 、t 、p 。、p 。等参数。 由上述构造步骤可以看出，可行解的编码方法、遗传算子的设计是构造遗传算法时需要考虑 的两个主要问题，也是设计遗传算法时的两个关键步骤。对不同的优化问题需要使用不同的编码 方法和不同操作的遗传算子，它们与所求解的具体问题密切相关，因而对所求解问题的理解程度 是遗传算法应用成功与否的关键”。 呈里查些奎兰塑圭兰堡篁兰 篓= 塞堑鎏 圉卜2 退传算法的主要构造过程示意圈 f i g 1 - 2t h em a i nc o n s t r u c t i o np r o c e d u r eo f g e n e t i ca l g o r i t h m s 由于发酵动力学模型参数的求解可以看作是函数优化的过程，而遗传算法自身的特点决 定了它在非线性函数系统优化方面的优势，已经有遗传算法在发酵动力学模型参数求解和发 酵过程优化方面的报道。陈宏文等( 2 0 0 0 ) 遗传算法应用于求解赖氨酸分批发酵动力学模型参 数，表明用遗传算法可有效地解决赖氨酸分批发酵动力学模型这类复杂的非线性函数的参数 估算问题，并将估算结果与p o w e l l 方法作了比较【3 “。颜学峰( 2 0 0 2 ) 等为了准确地估计反应 动力学参数。提出一种混沌遗传算法( c g a ) ，与传统的遗传算法相比较，c g a 的在线和离线性 能都有较大的改进。将c g a 应用于2 氯苯酚在超临界水中氧化反应动力学参数的估算，获得 了满意的结果”i 。郑启富等( 2 0 0 3 ) 针对简单遗传算法( s g a ) 存在早熟、寻优效率偏低等缺点， 提出了一种改进的遗传算法，并将它用于上海天厨味精厂1 5 0 1 发酵罐发酵动力学模型参数的 估计，取得了满意的效果”。 固态发酵动力学建模面对的是比液态发酵更为复杂的过程，通常建立的固态发酵动力学模型 是一个复杂的微分方程组，同时也是商度非线性的系统。由此可以认为采取遗传算法对固态发酵 动力学参数辨识将会有很好的应用前景，但目前还末见有此类的研究报道。 1 2 存在的问题 综上所述，对于本课题所讨论的霉菌和酵母双菌种固态发酵秸秆生产酒精过程尚没有较好的 室里垒些查兰堡圭兰堡篁奎 篁= 耋堑鎏 反应机理的解释，为了对秸秆固态发酵生产酒精的生物过程更加深入的理解，有必要在前人相关 工作的基础上结合本课题的特点提出合理的反应机理模型，籍此得到能反映发酵过程的限制性步 骤和易于检测和控制的关键参数；对于固态发酵反应器内传热和传质的研究目前只是处在初步探 讨阶段，很少有将传热传质和反应机理结合的成功的动力学模型，多数研究是撇开实际生物反应 过程的冷模实验研究，这方面的研究需要进一步深入。 1 3 研究的基础和内容 项目名称 科学与技术问题 研究方法 研究内容 研究目标 睹秆固态发酵酒精的动力学研究 上 f 高效菌种的选育及工程生产菌构划恨应动力学模型建立i iil 微生物及生物学研到阳胞反应动力学研列陶态反应器动力学研， jl i 1 秸秆预处理； 2 高活性纤维素和半纤维索分解菌的筛选与高温酒精酵母的构建： 3 秸秆固态发酵酒精动力学的研究； 4 秸秆连续化固态发酵酒精反应器动力学与控制软件及其设备研究： 5 秸秆固态发酵酒精工艺优化及酒糟饲料效价研究； 6 秸秆固态发酵酒精中试研究。 l 1 高效( 半) 纤维素菌与高温酒精酵母混合同步发酵菌种； 2 固态发酵酒精联产酒糟饲料新工艺，实现环保高效工程化 处理农产品废弃物的新技术。 图1 - 3 秸秆固态发酵酒精课题的研究路线 f i gl3r e s e a r c hr o u t eo fb i o c o n v e r s l o nc o r ns t a l kt o e t h a n o lb ys o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o i 2 本课题所进行的研究是国家自然科学基金项目秸秆固态发酵酒精动力学研究的一部分， 项目编号2 9 9 7 6 0 4 5 ，其研究路线如图1 3 所示【3 。课题组的前期工作已经研究了秸秆的预处理方 法、产纤维素酶高产菌株的筛选、耐高温酵母工程菌的构建，并进一步提出同步固态发酵工艺流 程，该工艺可有效的消除反应过程的抑制作用，提高酶曲的利用率和酒精得率，并大大的缩短反 应时间。通过研究秸秆同步固态发酵生产酒精的工艺条件，得到在每1 0 9 秸秆，添加2 0 9 培养8 4 h 时的纤维素酶曲，加水比1 ：3 ，接种酵母5 ，厌氧发酵2 4 h 后得到酒精7 2 ( 以秸秆干重计) ”“。 摇瓶试验存在着很多的限制，如厌氧发酵过程中无法搅拌、产生的酒精不能及时吸收( 酒精 浓度达到一定程度，就会对酵母的生长发酵起到抑制作用) 等，本实验一方面旨在通过反应器的 室里至些奎兰塑圭兰堡耋兰 量：茎堑篁 设计优化，得到更高的酒精产率；另一方面，通过对秸秆固态发酵生产酒精的动力学研究，建丑 动力学模型，理性的描述、深入的理解秸秆生物酒精的转化过程，为反应过程的优化和控制以及 反应器的设计放大提供依据，最终为秸秆固态发酵生产酒精工业化做出探索。 课题的主要研究内容有： 1 秸秆固态发酵过程参数的测定； 2 摇瓶中纤维素酶曲制各过程的动力学建模； 3 摇瓶中秸秆同步糖化酒精发酵的动力学建模； 4 基于遗传算法的动力学参数辩识； 5 反应器内发酵条件的优化； 6 转轴搅拌式、滚筒式反应器并发酵效果的比较。 8 - ；! ：垦奎些! ! 兰堡圭茎堡篁兰 釜三耋 童垒垦童垒璧翌堑垫堡耋垫! ! 塞 2 1 引言 第二章秸秆固态发酵酒精过程参数测定 与液态发酵相比，固态发酵具有产量较高、后处理简单、对环境污染小、产品更安全等优点。 但也存在参数测定困难、发酵过程不易控制、发酵基质不均匀等缺点”j 。本课题所研究的秸秆崮 态发酵过程是一个双菌种、多酶系、混合底物的复杂体系，要达到对秸秆固态发酵过程的有效地 监钡4 控制，有必要寻找对其过程参数测定的合理和简便的方法。 生物量是表征微生物生长状况的一项基本参数。生物反应过程的终产物有生物体和生物代谢 产物。生物体是产品多少的量度，而生物量与代谢产物之间通常有相应的比例关系。可以借助于 生物量的测定来了解最佳的产物量及生物体生长达到的最优状态。对于固态发酵而言，微生物不 易从底物中分离，尤其是真菌菌丝可以深入到培养基内部，紧密缠在一起。生物量很难直接测定。 目前，固态发酵菌体生长( 即生物量) 的测定方法国内报道较少，国外多采用下述方法：( 1 ) 直接从 圊态培养基中分离测定，如除去基质、直接计数等；( 2 ) 通过检测代谢活动推断生物量，如测定 0 2 和c 0 2 的代谢量、胞外酶量、a t p 等；( 3 ) 测出生物体中某些特殊物质( 如蛋白质、总糖、核酸、 氨基葡糖、麦角固醇等) 的含量推测生物量；( 4 ) 利用与菌体生长有关的某些现象( 如压降、底物减 重等1 估测生物量。然而，这些测定方法均有一定的局限性，如产生单位菌体量所需的o 。量或排 放的c 0 2 量会随菌龄变化，细胞的特殊生物组分含量会因不同菌种、培养条件和培养时间而不同， 检测时间长、过程繁复会影响测定的精确性等，很难判定哪种检测方法最好w 。 氨基葡糖( 几丁质) 是真菌细胞壁的主要成分，由n 乙酰n g 通过d 一1 ，4 糖苷键结合成的直链 高分子聚合物。研究表明，氨基葡糖( n c - ) 的含量可以反映真苗的菌体量，可用化学方法测得。 因此，氨基葡糖分析法成为目前固态发酵菌体生物量测定较常用的方法。可用在葡糖蛋白质含有 氨基葡糖的复杂农作物培养基上生长的菌体，但底物中氨基葡糖的含量必须是不变的。二十世纪 六十年代，日本微生物学家就利用该法监控米曲固态发酵过程中黄曲霉的生长，黄曲霉菌体中氨 基葡糖的含量大约为i1 4 mg g ( 干物质) 【3 l ；a r i m a 和u o z u m i 研究了液态培养的米曲霉菌丝体中 氨基葡糖含量变化范围是6 7 m g g 于菌丝至1 2 6 m g g 千菌丝 a l ；n i s h i o 利用氨基葡糖法检测麦麸上 的黑曲霉生物量【s 1 ，菌体的氨基葡糖含量测得为5 0 m g g 干菌体，该值保持不变，直到发酵中后期 开始上升；n i s h i o 同时也研究了t a r a l o m y e e s s p 固态发酵过程，涮得在对数生长期氨基葡糖的含 量为7 7 m g g 千菌体，几乎不变，据此可推测麦麸中菌体增长量【6 】td e s g r a n g e s 等人发现固态发酵 b e v p r i a b a s s i a n 口在菌体对数生长氨基葡糖含量恒定，但会随培养基的不同而改变 7 1 ；d u r a n d 等 人对2 2 个菌株进行分析，建立了每个菌种氨基葡糖含量与菌体千重间的关系式，并通过实验证 明，该关系式可适用于几种不同的培养基【8 1 。因此，建立氨基葡糖与菌体干重间的准确关系是使 用氨基葡糖法检测菌体量的关键，但同时应考虑菌丝中氨基葡糖的比例随菌龄和环境的变化a 麦角固醇是存在于生物膜中的甾类化合物，专一性很强，就生物量的测定丽言，比氨基葡糖 更具代表性，该方法最早被用于监视谷物发霉状况。m a t e h a m 等人利用a g a r i v u s b i s p o r u s 对比氨 皇里垒些奎兰罂圭兰墨鎏兰 塑三耋 垫墼墅童丝墼塑堑苎堡耋墼翌塞 基葡糖和麦角固醇对菌体生长情况的鉴定能力，得到了固态发酵的氨基葡糖和麦角崮醇与菌体间 的线性关系1 9 1 ：n o u t 等人证明，r h i z o p u s o l i g o s p o r u s 的麦角固醇含量因培养条件不同可从2 m g 干菌体变化至2 4 m g g 干菌体，并受通气量、生长阶段及底物含量的影响”。麦角固醇的测定比 氨基葡糖的测定更便捷，测定时先用甲醇萃取，再进行甾类的皂化，然后即可用分光光度计或高 压液相色谱定量分析。此法为低菌体含量的测定提供了一个更灵敏的方法1 1 ”，但应注意底物组成 ( 脱脂含量) 对生物中麦角固醇的含量有较大的影响，而菌体寿命和生长温度对其影响则较小。 好氧发酵时，由于生物体代谢吸收0 2 放出c 0 2 ，营养不断被消耗，底物总重也在逐渐减少， 因此可以用底物干重损失来衡量菌体的生长代谢。t e r e b i z n i k 建立了固态发酵中木霉菌体生物量 的变化趋势与底物干重损失的关系。认为在对数生长期底物干重损失能很好的描述木霉的生长代 谢【”1 ：路秀玲等研究了红曲霉固态发酵过程生物量的测定方法，结果表明底物干重减重与菌体量 存在一定的正向函数关系，通过测定底物减重可以推断出红曲霉生长代谢状况f ”7 。 氧气的消耗量( 摄氧率，o c r ) 及二氧化碳的排放量( 呼吸强度。c p r ) 与生物体生长息息相关， 可用于推断菌体的生长状况及其产物代谢的含量。已有一些关于应用二氧化碳排放量来推测固态 发酵的菌体生长情况的报道，例如：c a r r i z a l e z 用n a o h 吸收排放的气体，通过电导仪显示n a o h 浓度的下降计算二氧化碳的产生速率，进而得到麦麸上生长的黑曲霉的比生长速率“4 j ； n a r a h a a a r a 研究了大米培养的米曲霉q c 0 2 ( 二氧化碳比释放速率) 与i l ( 比生长速率) 之间存在线性 关系，二氧化碳的释放速率可用红外线二氧化碳分析仪进行测定i 】“；o k a z a k i 和s u g a m a 在一个 封闭的瓦氏呼吸器中用大米培养米曲霉，呼吸作用产生的二氧化碳被n a o h 吸收。由于氧气被消 耗，压力下降，通过电解氧发生器的显示值，可以连续的检测出耗氧量，进而表征出细胞的生物 量。 在上述固态发酵检测生物体含量的测定方法中，测耗氧量和二氧化碳排放量的方法能实现在 线检测，可能是最有效的方法，而其它方法均不具有普遍适应性，某一固态发酵的具体检测方法 需要根据便捷、耗费低、准确三原则进行选择”】。 本章研究即针对秸秆固态发酵过程的特点，研究了生物量、二氧化碳的排放量( c p r ) 、等关 键过程参数测定的方法，找出合理、简便、有效的监测手段，为后面的动力学建模做好试验基础。 2 2 实验材料与方法 2 2 1 菌种和发酵原料 实验室前期工作筛选的耐温酿酒酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v 括i a ec b 2 和康氏术霉t r i c h o d e r m a k o n i n g i it r 6 a 秸秆粉：取自中国农业大学非常规饲料研究所，经秸秆揉切机粗粉碎，再用9 f o - 2 0 粉碎机 粉碎，并经蒸汽爆破预处理。 2 2 2 试剂 1 0 中国农业大学硕士学位论文第二章 秸秆固态发酵酒精过程参数测定 丙酮分析纯 北京化工厂 葸酮分析纯北京化工厂 冰乙酸分析纯北京化工厂 乙酸钠分析纯北京化工厂 硝酸分析纯北京化工厂 浓硫酸分析纯北京奥利化学试剂厂 亚甲基蓝 分析纯北京奥利化学试剂厂 浓盐酸分析纯北京化工厂 定性滤纸 中速新华滤纸厂 酚酞分析纯北京化工厂 葡萄糖 分析纯北京化工厂 甲苯分析纯北京奥利化学试剂厂 氢氧化钾 分析纯北京奥利化学试剂厂 氨基葡糖标准品 分析纯s i g m a 公司 无水乙醇分析纯 北京奥利化学试剂厂 正庚烷 分析纯北京化工厂 麦角固醇标准品分析纯s i g m a 公司 3 ，5 一二硝基水杨酸 分析纯北京奥利化学试剂厂 2 2 3 实验仪器 9 f 0 2 0 粉碎机 i t z q - - - c 空气浴振荡器 m j x 一1 5 0i i 型霉菌培养箱 灭菌锅 1 0 0 w 电炉 7 2 2 s 分光光度计 $ 5 2 型紫外分光光度计 恒温水浴锅 t g l 一1 6 c 离心机 c f 长风水浴锅 y p l 2 0 0 电子天平 c s l 0 1 一l a b 电热干燥箱 北京燕京牧机公司二厂 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 广东医疗器械厂 上海博讯实业有限公司 上海申航五金电器厂 上海精密科学仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 北京市长风仪器仪表公司 上海安亭科学仪器厂 北京