（食品科学专业论文）激烈热球菌胞外α淀粉酶的体外定向进化.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名： 导师签名： 王桶时间：加7 年多月，弓日 鹂阃：沙。年厶只7 p 。 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名互佝 导师签名： 时间：如7 r 年月店日 时间加叼 每乙bl e 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 q 一淀粉酶，按酶委会( e n z y m ec o m m i s s i o n ) 的标准为e c 3 2 1 1 ，是指一类作 用于淀粉分子，从分子内部切开a l ，4 键，生成糊精和还原糖的水解酶，产物的末端 葡萄糖残基c l 碳原子为a 一构型，故称a 一淀粉酶。目前淀粉糖生产工业主要应用的 是耐高温d 一淀粉酶，多为b l a ( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sa 锄y l a s e ) ，但b l a 最适p h 值( 6 0 ) 较高，需要添加c a 。近年研究发现p f a ( p y r o c o c c u sf u r i o s u s e x t r a c e l l u l a rd - - - a m y l a s e ) 活性不依赖于c 矿，具有极大的工业应用潜力。本文以 激烈热球菌胞外一淀粉酶( p f a ) 为研究对象，用易错p c r 的方法构建p f a 基因随机 突变文库，库容量约为1 0 0 0 0 ，在9 6 孔板中，以3 ，5 一二硝基水杨酸为显色剂，测定 不同p h 值条件下的酶活力，肉眼直接观察显色结果，筛选得到一株突变体( m u t a ) ，经 过测序和序列比对发现全序列4 3 5 个氨基酸中，只有一个氨基酸发生改变，即第3 l 位 由精氨酸变为甘氨酸，该位点位于酶分子结构域a 的第一个a 一螺旋中，三维结构模拟 显示酶分子表面极性发生明显改变。突变体最适p h 降低约0 5 个单位，比酶活提高5 倍以上。本实验为从分子结构上阐释p f a 的嗜酸机理提供部分理论研究基础，突变体的 酶学性质更接近工业应用的需要，提高了p f a 的工业应用潜力。 关键词：p f a ；易错p c r ；三维结构 a b s t r a c t a b s t r a c t a - a m y l a s e s ( e c3 2 1 1 、c o m p r i s eag r o u po fe n d o - a c t i n ge n z y m e st h a th y d r o l y z es t a r c h b yc l e a v i n ga - 1 ，4 - g l u e o s i d i cl i n k a g e sa tr a n d o m t h eh y d r o l y z a t eo fs t a r c ha r ed e x t r i n ea n d d e o x y g h c o s e t h ea - a m y l a s ef r o m b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i si st h em o s ti m p o r t a n tc o m m e r c i a l e n z y m e s ，h a v i n gw i d ea p p l i c a t i o n si ns t a r c h - p r o c e s s i n g h o w e v e r , i th a sa no p t i m a la c t i v i t ya t p h6 0a n dr e q u i r e sa d d i t i o n a lc a z + f o r i t st h e r m o s t a b i l i t y r e c e n t l y e x t r a c e l l u l a ra - a m y l a s e f r o mp y r o c o c c u sf u r i o s u s ( p f a ) w a sr e p o r t e dt h a ti th a sg r e a tp o t e n t i a lo fi n d u s t r i a l e x p l o i t a t i o n w eu s e de r r o r - p r o n ep c r t or a n d o m l yi n t r o d u c em u t a t i o n st ot h eg e n ec o d i n g f o rt h ep f a ，a n dt h el i b r a r yo fm u t a t i o nh a sa b o u t1 0 0 0 0c l o n e s w eu s ed i n i t r o s a l i c y l i ca c i d t od e t e c ta m y l a s ea c t i v i t ya td i f f e r e n tp hv a l u e si nt h e9 6 w e l lp l a t e t h em u t a n tr 3 1 g ( m u t a ) h a s o n l y o n e c h a n g e o f a m i n oa c i d ，w h i c h i s l o c a t e d i n t h e f a s t a - - h e l i x o f d o m a i n a , a n d i t w a sf o u n dao b v i o u sd i f f e r e n c ef r o mp f ai ns u r f a c ep o l a r i t yo f m u t a t i v el o c a t i o n t h e m u t a t i o nh a sa l lo p t i m a l a c t i v i t ya tp h5 0 ，c o r r e s p o n d i n gt oa s h i f to f0 5p hu n i tc o m p a r e dt o t h ew i l dt y p ea n dt h es p e c i f i ca c t i v a yi n c r e a s e da tl e a s t5 - f o l d t h i se x p e r i m e n th a v e p a r t l y e x p l a i n e dt h ep f a sm e c h a n i s mo fh i g ha c t i v i t ya ta c i d i cp h s p e c i f i ct h ep r o p e r t yo f m u t a t i o ni sm o r ec l o s et ot h en e e df o ri n d u s t r i a la p p l i c a t i o n s k e yw o r d s ：p f a ；e r r o r p r o n ep c r ；t h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r e 2 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 分子体外定向进化的研究方法 赢嚣薹一) 一避差姜撩季蓁。i 夏蹙犍文聋 t 伊一l o 强董j 擘 o 墨 l 伊1 0 砷窦爱庳 l 。，1 驴突安库l 二r 芑 i a 图1 定向进化原理 f i g u r e1 p r i n c i p l eo f d i r e c t e de v o l u t i o n 1 1 1构建突变文库的常用策略 1 1 1 1 易错p c r ( o r r o r p r o n ep c r ) 易错p c r 是最早出现的一种突变文库构建方法，它于1 9 9 3 年由a r n o l d 研究组首次 提出( c h e nk ，a r n o i df i l ，1 9 9 3 ) 。其原理是从单一基因出发，改变p c r 反应的条件，例如 增加反应体系中m 9 2 + 的浓度以稳定非互补的碱基对；加入m n “以降低聚合酶对模板的特 异性；以及调整4 种d n t p 的浓度以促进错误掺入；使用低保真度的d n a 聚合酶等，使 基因在扩增反应过程中产生一定程度的碱基突变。这些突变有可能导致其编码的蛋白质 在功能性质上发生变化，从而期望从中筛选出目的蛋白。易错p c r 的关键在于通过调整 反应体系中各物质的浓度来控制碱基的突变率。当突变率过高时，有害突变太多，容易 丧失酶自身的催化活性，而且有利突变与不利突变组合在一起，也会掩盖有利突变；当 突变率过低时，野生型的背景太高，突变文库的多样性不足，增加筛选的工作量。一般 认为每1 0 0 0 个碱基有1 5 5 个碱基发生替换是合适的( h a r a y a m as ，1 9 9 8 ) ，即突变率 在0 2 左右。z h a o 等对枯草杆菌蛋白酶易错p c r 文库的调查发现，6 5 的活性克隆相当 于0 2 的突变率，通过活性克隆的比例来检查碱基的突变率是简单实用的方法( z h a o h ，m o o r ej c ，1 9 9 8 ) 。易错p c r 也存在一些局限性，它一般适用于1 5 0 0 b p 以下的基因片段； 由于该方法的遗传突变只发生在单一分子中，如果两个有利突变分别存在于两个序列 中，易错p c r 不能将他们组合在一起，通常是将一次易错p c r 产生的含有突变的基因作 为下一次易错p c r 的模板，进行反复随机突变，由此发展出了连续易错p c r ( s e q u e n t i a l e r r o r - p r o n ep c r ) 。该方法可使少量有利突变累积，但较为费时费力，为了能快速积累 有利突变，产生了d n a 重排技术。 1 1 1 2d n a 重排( d n as h u f f | i n g ) 1 9 9 4 年s t e m m e r 等人首次成功应用d n a 重排的方法( s t e m m e rw p ，1 9 9 4 ) 。该方法的 基本原理如图2 所示。首先从一组含有各种突变的文库出发，用d n a s ei 进行消化，获 得大量分子大小在2 0 - - - 5 0 0 b p 之间的随机片段，这些随机片段带有有利或有害突变。由 于这些片段间存在互补序列，在无外加引物的情况下可以互为引物和模扳进行随机扩 增，此时有可能将原来分别存在于多个序列上的有利突变组合到一个序列上，然后再加 入两端引物进行全长目的片段的扩增。d n a 重排常与易错p c r 结合使用，首先用易错p c r 的方法产生一系列含各种突变的基因文库，再用d n a 重排技术将这些文库中的各种突变 进行再组合，从而提高了获得优化蛋白的可能性。当d n a 重排的方法应用于进化上相关 4 沈阳农业大学硕士学位论文 的一系列基因时，称为d n a 家族重排( f a m i l ys h u f f l i n g ) ( s t e m e r w p c ，s o o n g 眦，1 9 9 9 ) 。 近年，在f a m i l ys h u f f l i n g 的基础上又出现了两种改进技术( k i k u c h i 虬o h n i s h i k ，1 9 9 9 ) ，如图3 所示，第一种是将用于随机切割靶基因的d n a s ei 换成限制性内切酶； 第二种是首先将靶基因单链化，再用d n a s ei 切割。实验证明这两种改进技术都有助于 提高改组基因的多样性。 l 辩错f c r 两i 蔓要1 。- 一一- 。一一一 l 一- - h 一- - - 一一一 l 一- i p - 一一 l _-忡“q-一 _ l 片段霪新装怒l 薹瑟l ；燎琏正向突蹙l 图2d m 重排原理 f i g u r e 2 p i j h c i p l co f d n a s h u f f l i n g 前言 陬f 澈 = 兰- ： _ - l l 拶臻粥 = = = = = = = = = = = = = 銮 ；簿链纯敝键撬内l ；习酶涟纯 ：= ：i = ：= l ，；段他= 苎 - - ： l 龙辨镶o l 物鼢 l 褥域i 张 = = = 篡：= = = 嚣篇= 垂 鳓l 旗嘲露 a 图33 种d n a 重捧方法 f i g u r e3 t h r m e t h o r d so f f a m i l ys h u f f l i n g 与单一的易错p c r 相比，d n a 重排有许多优点：( 1 ) 对靶序列的长度没有要求，可达几 十k b ；( 2 ) 可以实现靶序列各大片段之间的交换，为研究蛋白质的功能区提供了基础； ( 3 ) 能够在短时间内实现多种有利突变的重新组合，从而提高获得目的基因的可能性。 s t e m m e r 等运用d n as h u f f l i n g 技术对b 一内酰胺酶定向进化，经多轮重组和筛选，最 终获得了一个能够使宿主细胞对头孢类抗生素抗性与原家族父本相比分别提高2 7 0 倍和 5 4 0 倍的进化酶。 1 1 1 3 交错延伸法( s t a g g e r e de x t e n s i o np r o c e s s ，s t e p ) 1 9 9 8 年，出现了一种新的重组策略一交错延伸法( z h a oh u i m i n ，g i v e rl ，1 9 9 9 ) ，其基 本原理如图4 所示，首先用易错p c r 等方法产生一系列含点突变的基因，以这些片段为 模板进行p c r ，将常规的退火与延伸合并为一步，缩短反应时间在这种条件下不能合成 全长的基因片段，而只能产生非常短的新生链，经下一轮热变性后，新生短链又与其他 含不同点突变的模板退火延伸，如此反复，最终获得含有各种模板序列的全长片段。z h a o 等利用易错p c r 和交错延伸重组相结合的方法，将枯草杆菌蛋白酶e 在6 5 的半衰期 延长了5 0 倍( z h a oh ，g i v e rl ，1 9 9 8 ) 。b u l t e r 等用上述方法将一种含酮多酚氧化酶的总 活力提高1 6 0 倍。 6 沈阳农业大学硕士学位论文 1 个弓i 锈和2 个 i _ _ l _ _ _ _ _ 奢 奉援檄愆失 i 虬r 主= = = = = = 援片段 i 霸簦上疆辔骧睡靛片段 c = 盅- 群j 墨孑2 2 2 2 2 2 2 0 = 詈2 2 2 2 = = = i 维续怒姊靖l 夏至 l 垒麓因k 魔 炳入外擞弓f 物 扩堪套长片段 圈4 交错延伸法 f i 剑4 s t a g g e r e df t c m i o op r o c e s s 1 1 1 4 随机引物体外重组( r a n d o m - p r i m i n gi nv i t r or e c o m b i n a t i o n ，r p r ) 1 9 9 8 年，a n o r l d 首次提出随机引物体外重组( s h a oz ，z h a oh ，t 9 9 8 ) ，该方法是用一 套随机序列引物与模板的不同部位互补延伸，产生大量d n a ，j 0 片段。由于碱基的错误掺 入和错误引导，这些小片段中含有少量点突变，并且相互间包含同源序列。去除模板后， 这些小片段互为引物进行扩增，直至产生全长基因片段，如图5 所示。 图5 随机引物体外重组 f i g u r e 5 r m d p r i m i n gi nv i t r or e c o m b i n a t i o n 该方法类似于d n a 重排，但与d n a 重排相比有许多优点，例如r p r 可利用单链d n a 为模 7 前言 板，因此可以直接进化m r n a 或c d n a ；r p r 的随机片段不是由亲本d n a 切割获得，亲本 i ) n a 的制备量比d n a 重排少l o _ - 2 0 倍；在d n a 重排方法中，随机片段重新组装前需要彻 底去除d n a s ei ，r p r 则无需此步骤，使基因的组装更简便易行；合成的随机引物长度 相同，无序列倾向性，可以保证亲本d n a 中每个键击都有相同的突变频率( s h a oz h i x i n ， z h a oh u i m i n ，1 9 9 8 ) 。 1 1 1 5随机片段交换法( r a n d o mi n s e r t i o n a i - d e i e t i o n a is t r a n d e x c h a n g e m u t a g e n e s i s r a i s e ) 2 0 0 6 年，r y o t a 等在d n as h u f f l i n g 原理的基础上，发展出一种新的突变文库构建 方法一随机片段交换法( f u j i ir ，k i t a o k am ，2 0 0 6 ) 。该方法主要由三个步骤组成，即基 因破碎；添加随机短序列；重新组装。基本过程如图6 所示，首先常规p c r 扩增待突变 基因，接着用d n a s ei 消化，获得一系列大小在1 0 0 3 0 0 b p 之间的d n a 碎片，然后在末 端脱氧转移酶( t d t ) 的作用下，d n a 碎片的3 末端被随意加上一个至几个碱基，随机 碱基的个数可由d n t p 浓度和碎片浓度的比例来调节，一般d n t p 的浓度调整到碎片浓度 溆i 消化 觋驰口尾 自躬l 物扩增 厂丁 随机片主；：三纛i 墨譬。：盖：；赢基咎缺随机片段抽 和碱毖咎缺碱基咎缺 疆帆片段删障和喊蒌馨侵 l 。 全长基因 图6 随机片段交换法 f i g u r e 6 r a n d o a ll n s c n i o n a l d c l e t i o n a ls t r a n de x c h a n g em u t a g c n e s i s 的1 0 倍，这样可以在每个碎片的37 端增加约5 个碱基的长度。此步需要用无校正活 沈阳农业大学硕士学位论文 性的d n a 聚合酶催化，如d e e pv e n t ( e x o 一) d n ap o l y m e r a s e 随后这些带3 尾巴的短 片段互为引物进行p c r 重新组装，这时在随机加尾处可产生三种类型的序列变化，即 随机片段插入和碱基替换、碱基替换、随机片段删除和碱基替换。最后加入两端引物扩 增出全长基因。该方法除了在自身引物p c r 步骤之前的加尾一步，其余均与d n a s h u f f l i n g 类似，但与d n as h u f f l i n g 相比，它无需从一组含点突变的基因或基因家族 出发，可直接以单个基因为父本，而且它产生的突变强度大于d n as h u f f l i n g ，除包含 点突变、区域交换外，还可产生随机序列的插入或删除等，从而提高突变文库的多样性。 除以上介绍的方法外，近来又出现了一些新的策略，如临时模板随机嵌合生长 ( r a n d o mc h i m e r a g e n e s i s o nt r a n s i e n tt e m p l a t e s ，r a c h i t t ) 、外显子洗牌( e x o n s h u f f l i n g ) 和酵母增强组合文库( c o m b i n a t o r a ll i b r a r i e se n h a n c e db yr e c o m b i n a t i o n i ny e a s t ，c l k r y ) 等。随着人们对酶分子定向进化要求的不断提高，进化方法也在不 断的发展和完善之中。 1 1 。2 筛选策略 筛选策略受酶进化方向、进化程度等因素影响灵活多变，针对性强。合理的筛选方 法能大大节约劳动强度和劳动时间，它己逐渐成为关系定向进化成功与否的关键因素。 各种筛选方法共同的宗旨就是高灵敏度和高通量。根据基于的原理不同，目前常用的筛 选方法可归为三种：平板筛选；基于荧光或显色反应；表面展示技术。其中平板筛选方 法最为简便，它是在固体平板培养基中加入底物，根据宿主菌表达的突变酶作用于底物 形成透明圈或其他特征进行筛选，或是利用有关的缺陷株作为宿主菌，直接将突变体与 宿主菌的生长联系起来。但平板筛选只局限于某些突变方向的筛选，例如提高酶活、改 变作用底物等，对于改变最适p h 和最适温度等突变方向，还是需要以可测定的酶促反 应结果来筛选，即基于荧光或显色反应的方法。它是根据酶作用底物后可产生荧光基团 伙可以显色的产物，通过测定荧光信号或在特定波长下的吸收值，来筛选突变体。目前， 这种方法广泛结合9 6 孔板、机械手臂、酶标仪等设备以提高自动化程度和工作效率。 近年来，各种表面展示技术呈现出强大的发展势头，已经报道的方法有噬菌体表面展示 技术、核糖体和m r n a 展示技术、细菌细胞表面展示技术、酵母表面展示技术等。它们 的相同点是利用载体表达外源蛋白( 即突变酶) ，表达后酶和基因并不分开，再根据酶 和底物或酶作用底物形成的产物和其他亲和底物基团的亲和吸附作用筛选突变体，区别 9 时所用的载体不同。它们所遇到的问题是当酶的催化活性并不与吸附作用紧密联系时， 亲和层析难以达到目的。 体外区室化( i nv i t r oc o m p a r t m e n t a l i z a t i o n ，i v c ) 是最近开发的一种表面展示 技术( s t e 蛐e r w p 1 9 9 4 ) ，如图7 所示，它是将突变基因库的水溶液和转录翻译系统混入 ( 或均质化) 到一个油一表面活性剂体系，产生油包水型乳浊液，突变基因和表达系统 被包含在这种乳浊液的小液滴中，表达的蛋白和催化活性不能离开小液滴，这样使基因 和表型联系起来，进行大量基因文库的筛选。这种方法除了可以针对改变地物特异性的 筛选外，还可以针对那些酶与底物结合力不强的筛选，即在小液滴中，底物经酶作用转 变成产物，但底物或产物并不与酶牢固结合，这时亲和层析难以达到目的，而i v c 可以 解决这个问题，底物或产物虽与酶分开，但仍留在酶所在的小液滴中。 筛选方法总的发展趋势是在高灵敏度和高通量的基础上向高效率、自动化的方向发 展。 1 1 3 应用 圈7 体外区室化原理 f i g u r e7 p d n c i p l eo f v i c 1 9 6 7 年s p i e g e l m a n 等最先提出分子水平上的体外定向进化思想。在随后的近4 0 年中，通过各国生物和其他各界科学家的不懈努力，已经这一思想转变为现实，并逐渐 形成一种后应用技术融入到人类生产的各个领域。定向进化技术由于其强大的功能和广 泛的适用性已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止，已有许多学者运用这项技 术成功地改造了各种各样的酶，并且其数量和形式仍在迅速增加。 1 0 皂鼍 a 沈阳农业大学硕士学位论文 例如z h a o 等利用易错p c r 和交错延伸重组相结合的方法，将枯草杆菌蛋白酶e 在 6 5 2 2 的半衰期延长了5 0 倍( k i k u c h i 虬o h n i s h ik ，1 9 9 9 ) 。2 0 0 2 年，j i n f e n gn i 等用易 错p c r 和d n as h u f f l i n g 相结合的方法成功改变b a c i l l u ss p t e l 2 4 的过氧化氢酶的底 物特异性，突变株经测序发现产生三个位点的碱基改变，r 4 7 h 、r 3 5 6 c 、d 3 7 4 n ，从而导 致过氧化氢酶活性减弱而过氧化物酶活性增强。2 0 0 5 年，l i uz q 等将d 内酯水解酶基 因经三轮易错p c r 和一轮d n as h u f f li n g ，获得突变体m u te 一8 6 l ( k i k u c h il i o t m i s h i l 【，2 0 0 0 ) ，该突变体含有三个点突变，a 3 5 2 c 、g 7 2 1 a ，以及在1 0 3 8 处有一同义突变，突 变体的酶活力比野生型提高5 5 倍。s t e m m e r 等( c r a m e r ea ，r a i l l a r ds ，1 9 9 8 ) 运用d n a s h u f f l i n g 技术对b 一内酰胺酶定向进化，经多轮重组和筛选，最终获得了一个能够使 宿主细胞对头孢类抗生素抗性与原家族父本相比分别提高2 7 0 倍和5 4 0 倍的进化酶。 h i k a r u 等研究联苯过氧化物酶( z h a o h u i m i n , o i v e r l ，1 9 9 8 ) ，它的作用底物是聚乙烯联苯， 该酶的大亚基b p ha 1 对底物特异性起重要作用，以b p ha 1 基因为父本，运用r p r 方法， 经过两轮重组和筛选，获得一株作用底物更加宽泛的突变体，它不仅作用于聚乙烯联苯， 也作用于d i b e n z o f u r a n 、d i b e n z o p d i o x i n 、d i b e n - z o t h i o p h e n e 、a n df l u o r i n e ，这 些混合物几乎不能被野生型联苯过氧化物酶作用。2 0 0 6 年，r y o t a 等用r a i s e 方法成功 改良b 一内酰胺酶的底物特异性。h e l e nm 0 h a r e ( b l u s t e rt ，a l c a l d e i ，2 0 0 3 ) 等研究 相同底物不同产物的羟基苯乙醇酸合酶( h m a s ) 和羟基苯丙酮酸过氧化物酶( h p p d ) 的 作用机理时，对h p p d 基因突变库进行筛选，依赖是微孔板和分光光度计。在微孔板中， t h n s 作用底物羟基苯丙酮( h p p ) 生成苯乙醇酸( h m a ) ，h m a 在经羟基苯乙醇酸氧化酶 作用生成甲基苯甲醛，在3 3 0 n m 处测定吸收值；而h p p d 作用h p p 生成尿黑酸( h g a ) ， h g a 再经尿黑酸过氧化物酶生成乙酰乙酸，在3 1 8 n m 处测定吸收值。用这种方法筛选到 产物由h g a 变成h 姒的突变体。 1 9 6 7 年s p i e g e l m a n 等人最先提出在分子水平上体外定向进化生物分子的思想。在 随后的近4 0 年中，经过各国生物和其他各界科学家的不懈努力，它已从一种理论转变 为现实，并逐渐形成一种后应用技术融入到人类生产的各个领域。实践证明，酶的体外 定向进化是改造酶分子切实有效的方法，它是人们在基因水平改造自然的强大工具。自 1 9 9 3 年第一次成功运用易错p c r 以来，在短短的十几年中，各种进化方法层出不穷，这 不仅反映了定向进化思想巨大的发展潜力和空间，也反映了人们对进化酶类及其它蛋白 的迫切需要。近年来，不断有新的蛋白获得结晶，人们对各种酶和其他蛋白质微观结构 的了解增多，这也帮助定向进化由完全的随机突变向着有的放矢的定点突变发展，当对 酶的分子结构和催化机理有一定的了解，但还不足以支持定点突变时，饱和突变是一个 不错的方法，即酶分子中某个或某几个氨基酸被其他氨基酸随机替换。分子体外定向进 化技术的发明和发展将为人类带来巨大的福音，但同时，该技术也可能创造出危害人类 和自然平衡的物质，因此，必须在保证安全性的基础上进行研究和应用。 1 2 耐高温a 一淀粉酶的分子结构和催化机理 a 一淀粉酶( d - - a m y l a s e ) 广泛地存在于动植物和微生物中，它是一种内切葡萄 糖苷酶，按酶委会( e n z y m ec o m m i s s i o n ) 的标准为e c 3 2 1 1 ，是指一类作用于淀粉 分子，从分子内部切开a l ，4 键，生成糊精和还原糖的水解酶，产物的末端葡萄糖残 基c l 碳原子为q 一构型，故称d 一淀粉酶。 d 一淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一，在味精、饴糖、葡萄糖、酒精、啤酒、 乳酸、柠檬酸等工业中发挥者巨大作用。当今广泛使用的酶制剂始于1 9 0 6 年人类发现 了用于液化淀粉生产乙醇的细菌淀粉酶，首先应用于工业的a 一淀粉酶是来自于真菌 的。但是，由于一些细菌一淀粉酶具有耐高温、耐酸、耐碱等特性，更符合工业生产 中的各种极端条件，因此，目前在需高温的发酵等工业中使用的最为广泛的是细菌d 一 淀粉酶，尤其是来自杆菌( 如解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌) 的耐高温n 一淀粉酶已 占据相当大的市场。 1 2 1 耐高温口一淀粉酶的种类 耐高温a 一淀粉酶按来源分为古菌a 一淀粉酶和真细菌q 一淀粉酶：他们的最适作 用温度在6 0 。c 以上。一般古菌来源的a 一淀粉酶较真细菌能够耐受更高的温度。许多古 菌能够在各种极端的条件下生存，如高温、高渗、强酸强碱等，维持他们生命活动的很 多蛋白质也是适应其生存环境的，因此，耐高温a 一淀粉酶也有很多是来自古菌的。表 1 列举出部分耐高温a 一淀粉酶的性质： 1 。2 2 耐高温一淀粉酶的分子结构 根据x 一射线衍射等技术得知的或由基因序列推算出的耐高温a 一淀粉酶的分子量 大多在4 0 - _ 6 0 k d 之间，有的以单体形式存在，有的以二聚体存在。通过对已知结构的 沈阳农业大学硕士学位论文 细菌a 一淀粉酶的氨基酸序列比对发现，他们都含有四个保守区。 裹1 耐高温a 一淀粉酶举倒 t a b l e1e r n p l ee f t h o l e a _ a m y i a s c 大部分细菌a 淀粉酶都需要有c a 2 + 的存在才能发挥催化活性，而本实验研究的 来自于古细菌p y r o c o c c u sf u r i o s u s 的嗜热a 一淀粉酶( p f a ) 则无需另外添加钙离 子。它们的二级结构是常见的a 一螺旋、b 一折叠、b 转角以及一些无规则卷曲等， 这些二级结构元件排列堆积成有催化活性的三级结构。虽然各种来源不同的a 一淀粉 酶的一级结构不同，有的完全一致的氨基酸不足3 0 ( 如p f a 与b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s 的一致性为2 9 ) ( l i n d e na ，m a y a n s0 ，2 0 0 3 ) ，但它们的三级结构却极 其相似，这也表明三级结构是催化活性的关键因素。这些三级结构都显示出一个共同 的特点，即由三个结构域组成，以淀粉工业中常用的b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sd a m y l a s e ( b l a ) 为例，如图8 ( m a c h i u sm ，d e c l e r c kn ，1 9 9 8 ) ，结构域a 是由8 个d 一螺旋和8 个b 折叠交替组成的a b 桶状结构，形成q 淀粉酶的中部，约包含 2 8 0 个氨基酸残基，这是一个较为刚性的区域，维持酶的基本构象。结构域b 位于结 构域a 的第三个a 一螺旋和第三个一折叠之间，它的二级结构主要是一个或几个b 层。这种结构能产生较大的柔性，推测它可能与底物特异性结合有关，结构域b 所包 含的残基数因不同来源的n 一淀粉酶有较大差异，如b l a 约包含1 0 0 个，p f a 含5 8 个，但它们的三级结构都是b 层和松弛的无规则卷曲。n 一淀粉酶的催化活性口袋位 于结构域a 和b 之间，在n 9 桶状结构的底部，这与其它拥有这种结构域的酶的活 性中心位置相似。已知结构的a 一淀粉酶在结构域a 和b 之间都有一个或几个钙离子 及其他金属离子结合位点，推测它可能与稳定酶的结构有关。结构域c 构成q 一淀粉 酶的碳端，由反平行e 层组成，构成希腊钥匙型结构，它包含的氨基酸少，距离活性 位点远，缺乏柔性，目前它的功能尚不清楚。 图8a 一淀粉酶三个结构域 f i g u r e8 0 t h r e cd o m a i n so f a y l a ” 将一级结构和三级结构的特点对映起来研究，一级结构显示出的4 个保守区分别位 于结构域a 的第3 个、第4 个、第5 个b 折叠以及第7 个b 一折叠和第7 个a 一螺旋 之间，这些保守区构成催化活性中心和对活性起调节作用。保守区i 位于第3 个b 一折 叠的碳端，包括3 个保守的氨基酸：a s p l 0 0 、a s n l 0 4 、h i s l 0 5 ，保守区i i 位于第4 个b 折叠，包括两个保守的氨基酸：a s p 2 3 1 、a r 9 2 2 9 ，保守区位于第5 个b 一折叠的碳 端，只有一个完全保守的氨基酸g l u 2 6 1 ，保守区位于第7 个h 一折叠和第7 个a 一螺 旋的连接处，这一区域完全保守的氨基酸是a s p 3 2 8 ，而3 2 7 位经常是h i s 。 随着d 一淀粉酶微观知识的不断丰富，我们可以了解酶催化的作用机理，包括其活性位点、作 用方式、构象变化等，这些都是酶促反应宏观现象的基础。 1 2 3a 一淀粉酶的催化机理 目前公认的a 一淀粉酶的催化机理如图9 所示( n i e l s e nj e ，b o r c h e r tt v ，2 0 0 2 ) ，催 化中心位于b 桶状结构的底部，g l u 2 6 1 和a s p 2 3 1 是起催化作用的两个重要残基。 1 4 沈阳农业大学硕士学位论文 图9d 一淀粉酶的催化机理 y i g u r e 9 c a t a l y t i c m 蛔n j 墨m o 缸- 舡时l a 辩 整个催化过程可分三步：第一步，淀粉链中的糖苷氧被质子供体g l u 2 6 1 质子化， 第二步亲核基团a s p 2 3 1 亲核攻击葡萄糖残基的c 1 ，糖苷键断裂，葡萄糖残基与a s p 2 3 1 形成酯键，同时去质子化状态的g 1 u 2 6 1 夺取一个水分子h ，产生一个o i l - ，第三步o h - 攻击葡萄糖残基的c 1 ，使酯键断裂，g l u 2 6 1 和a s p 2 3 1 重新恢复初始状态。在已知结构 的q 淀粉酶中，在n b 桶状结构的底部，都含有g l u 和a s p 两个残基，它们的相对 位置相似，并且所有d 一淀粉酶的整体三维结构都很相似，因此，它们的催化反应机理 应该是相同或相近的。以对a 一淀粉酶分子结构和催化机理的研究为基础，通过各种手 段改善酶的催化反应特异性，使其更适合于在工业生产中应用是近年来新兴的发展趋 势。当传统的从环境中筛选和重组表达不能满足工业生产需要时，基因水平上的改造便 成为许多科学家关注的热点。 1 2 4d 一淀粉酶定向进化的研究进展 目前应用得最广泛的基因水平上的突变主要有两种，随机突变和定点突变，有时也 将两种方法结合使用。随机突变采用首先构建突变文库，然后根据研究酶的特点设计高 通量的筛选方法。它的优点是不必明确知道酶的三维结构，催化机理等。定点突变需要 对酶的结构机理有较明确的认识，它更适用于研究单个或多个位点对酶分子的影响。将 这些方法应用于n 一淀粉酶的研究已有一定进展。目前有关突变的研究大多针对于 b l a ，如t a k a s e 研究发现a s n 3 2 6 l y s a s p 能够显著改变b l a 的p h 特性( k t a k a s e ，1 9 9 3 ) 。 n i e l s e nje 等对b l a 进行定点突变，发现g l n 2 6 4 s e r 和a s n l 9 0 p h e 能提高b l a 的热稳 定性。s h a wa 等( s h a wa ，b o t tr ，1 9 9 9 ) 通过随机突变，得到m e t l 5 t h r 能增强b l a 的稳 定性，在此突变的基础上，在进行随机突变，发现m e t l 5 t h r 和a s n l 8 8 s e r 使b l a 热稳 定性提高两倍。但目前就氨基酸突变如何导致酶宏观性质的改变的解释说法不一，还有 待进一步研究。 1 2 5a 一淀粉酶的工业应用 耐高温a 一淀粉酶以其优良的性能广泛的应用于柠檬酸、乳酸发酵、啤酒、酒精、 味精、淀粉糖等工业领域，例如，淀粉糖的生产工艺如图1 0 所示， 回瓢巫单墅攀( i 遘_ p h 4 蔓- - , 4 5 ) 圃匝口爿匦巫卜 墅卜_ _ _ 圃 ll 圈圈 图1 0 淀粉括生产工艺 f i g l i r o l o p r o c e s s o f s t c h 目前淀粉糖的生产需进行两次p h 值的调节，生淀粉糊化后的p h 值在4 5 左右，此时加 碱增加p h ，使其达到a 一淀粉酶的最适p h ，在高温条件下使长链淀粉转变成寡糖，如 糊精等，随后，需加酸降低p h ，使其达到糖化酶的最适p h ，寡糖最后转变为单糖。在 整个过程中，两次p h 值的调节主要是由于d 一淀粉酶的最适p h 较高，目前我国淀粉糖 工业广泛应用的d 一淀粉酶的性质如表2 所示。 表2 工业用。一淀粉酶的性质 t a b l e 2c h a r a c t e r o f i n d u s ”i a l a - - a m y l a s e 若获得适于工业应用的最适p h 4 5 的a 一淀粉酶，则不需两次p h 调节，从而简化 工艺流程，降低成本，以及改善产品质量。 为了使酶的性能更符合生产的需要，许多研究者对其进行了深入的研究，从诱变育 种( 如紫外、亚硝基胍、甲基磺酸乙酯) 到构建基因工程菌，再到基因突变技术，耐高 温a 一淀粉酶的性能得到了巨大的改善。 目前耐高温。一淀粉酶的研究已经深入到基因体外定向进化和定点突变阶段，这主 1 6 沈阳农业大学硕士学位论文 要是基于有关耐高温a 一淀粉酶微观分子结构和催化机理研究的积累。a 一淀粉酶是食 品工业中用量最大的酶类之一，也是生物技术应用于食品工业的典例，生物技术与食品 工业的紧密结合，将是食品工业未来发展不可抵挡的趋势。 1 3p f a 的研究进展 h y p e r t h e r m o p h i l i ca r c h e o np y r o c o c c u s f u r i o s u s 最初于1 9 8 6 年由f i a l a 和s t e t t e r 从 意大利v u l c a n o 岛附近的高温泥土中分离得到，它是一种严格厌氧的海洋型异养生物， 最适生长温度1 0 0 ( 2 。在它的胞内胞外均检测到a 一淀粉酶活性并同样具有耐高温的特 点。 1 9 9 3 年，k e n n e t h 等将p f u r i o s u s 胞内q 一淀粉酶进行了纯化，测定其最适作用 温度在1 0 0 c ，活性范围4 0 1 2 0 ，最适作用p h 值在6 0 左右，活性不依赖于c 矿。 1 9 9 7 年，j o u g a n s e n 和d o n g 几乎同时报道了p f a 的基因序列，并在大肠杆菌和枯 草杆菌中进行表达，测定p f a 的分子量为4 5 0 0 0 d a ，重组p f a 为二聚体。最适作用温度 1 0 0 ，最适p h 值4 5 - - 6 0 ，其活性不依赖于c a 2 + 。 2 0 0 2 年，s a v c h e n k o 等对p f a 的嗜热机理进行研究。通过与其它嗜热a 一淀粉酶氨 基酸序列比对发现，p f a 含有较多的半胱氨酸残基( 即c y s l 5 2 、c y s l 5 3 、c y s l 6 5 、c y s l 8 7 、 c y s 4 3 0 ) ，将这些半胱氨酸残基逐一进行点突变显示，如图1 1 所示，1 6 5 位的半胱氨酸 残基对酶的热稳定性有重要影响，定点突变研究结果如图所示，图中黑色表示酶分子未 经热处理的相对活力，白色表示酶分子经1 0 0 4 c 保温1 5 m i n 后的相对没活。横坐标代表 5 个c y s 突变情况，1 6 5 位为c y s 的突变体均保持较高酶活。 1 7 霪 b 釉 毒驰 墨柏 乏 o 8 8 g gg 巧霭石韪乙 器翟器鞑器8 麓鬟墨罄 ( jt j t 0 仍ou 键哦谚甜 圈1 1 定点突变结果 f i g u m l lr e s u l to f s i w - m m a g c n e s i s 2 0 0 3 年，a n n iu n d e n 等研究p f a 的晶体结构显示在活性位点附近的c a 2 + 和z n 2 + 与酶分子结合得非常牢固，与c a 2 + 相互作用的残基是a s n l 0 9 ，a s p l 5 4 ，g l y l 5 7 , a s p l 6 4 , g l y 2 0 2 ，与z n 2 + 相互作用的残基是h i s l 4 6 ，h i s l