（食品科学专业论文）益生菌Lcasei+Zhang固态发酵特性的研究.pdf

摘要 本课题对分离自内蒙古传统发酵酸马奶中的益生菌干酪乳杆菌z h a n g ( l c a s e i z h a n g ) 进行固态发酵。经过培养基和发酵条件的优化后，以液态发酵( 含水量9 0 ) 作比较，对基质初始含水量为5 5 的固态发酵下l c a s e iz h a n g 生长及代谢特性进 行了初步研究。所得结论如下： l c a s e iz h a n g 固态发酵培养基和发酵条件的优化结果是：每千克基料中含豆粕 3 9 0 9 、麸皮4 9 0 9 、葡萄糖2 9 9 、乳清粉5 9 9 、碳酸钙2 9 9 、硫酸铵2 9 、硫酸镁l g ，初 始含水量5 5 ( 湿基) ，发酵时间为6 0 h 。在o - - - - 6 0 h 的发酵期内，随着培养时间的 延长，l c a s e iz h a n g 活菌数逐渐增加，固态发酵条件下最高可达( 1 0 7 2 3 1 7 5 0 ) 1 0 8 c f u g ，液态发酵条件下最高达( 2 4 9 0 3 6 8 ) 1 0 8 c f u m l 。 固态发酵条件下l c a s e iz h a n g 对还原糖的利用与液态发酵有相似之处，发酵期 内的前1 2 h 是l c a s e iz h a n g 利用还原糖的高峰期。在o 0 5 的显著水平下，固态发 酵1 8 h 合成的胞外多糖量显著高于同时间液态发酵的合成量，在2 4 h 、3 6 h 、6 0 h 固态 发酵合成的胞外多糖则显著少于液态发酵的合成量，培养4 8 h 时二者差异不显著。 l c a s e iz h a n g 蛋白水解力随着菌体生物量的增加、发酵时间的延长呈上升趋势。 在6 0 h 的发酵时间范围内，l c a s e iz h a n g 蛋白水解活性在固态发酵条件下较液态发 酵条件下弱，表现为o p a 法测得液态发酵物中游离氨基氮的增加量最大可以达到 1 6 3 6 1m g l ，而固态发酵物中游离氨基氮含量均低于未发酵的对照样；并且h p l c 法分析得到，液态发酵条件下各种游离氨基酸总和显著大于固态发酵的各种游离氨基 酸总和( 尸 0 0 5 ) 。随培养时间的延长液态发酵体系中乳酸和乙酸含量逐渐增加，固 态发酵体系中二者呈不规则变化。固态发酵与液态发酵条件下l c a s e iz h a n g 细胞膜 中软脂酸( c 1 6 ：o ) 和油酸( c 1 8 ：1 ) 的含量差异不显著，而液态发酵l c a s e iz h a n g 细胞膜中亚油酸( c 1 8 ：2 ) 和亚麻酸( c 1 8 ：3 ) 的含量显著高于固态发酵( 尸 0 0 5 ) 。 固态发酵基质的烘干温度为3 5 时，l c a s e iz h a n g 的存活率较高为1 7 5 1 ， 其活菌数可达3 9 8 x1 0 毗。 关键词：益生菌l c a s e iz h a n g ；固态发酵；优化；代谢特性 s t u d yo nf e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fp r o b i o t i c l c a s e iz h a n g 。s o l i ds t a t esystemlc a s ez t m n gi no i lb t a t eb y s t e m a b s t t a c t p r o b i o t i cl a c t o b a c i l l u sc a s e iz h a n gi s o l a t e df r o mk o u m i s sw a su s e df o rs o l i ds t a t e f e r m e n t a t i o n ( s s f ) a f t e ro p t i m i z a t i o n so fs o l i dm e d i aa n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，t h e c h a r a c t e r i s t i c so fl c a s e iz h a n gi ns o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ( w a t e rc o n t e n to fm e d i a5 5 ) w e r ec o m p a r e dw i t ht h es u b m e r g e df e r m e n t a t i o n ( s m f ) ( w a t e rc o n t e n to f m e d i a9 0 ) ，n l eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ( g k gm e d i u m ) ：s o y b e a l lc a k e3 9 0 9 ，w h e a t b r a n4 9 0 9 ，g l u c o s e2 9 9 ，w h e yp o w d e r5 9 9 ，c a c 0 32 9 9 ，( n i - l ) 2 s 0 42 9 ，m g s 0 4lg ，w a t e r c o n t e n t5 5 ，i n c u b a t i o nf o r6 0 h t h el o n g e rt h e i n c u b a t i o nt i m e ，t h em o r et h ev i a b l ec o u n t o f l c a s e iz h a n g t h ev i a b l ec o u n to f ( 1 0 7 2 8 + 1 7 5 0 ) x 1 0 8 c f u ga n d ( 2 4 9 0 - a ：3 6 8 ) 10 8 c f li m lw e r eo b t a i n e dr e s p e c t i v e l ya t6 0 hi ns s fa n ds m f - t h eu t i l i z a t i o no f r e d u c i n gs u g a rw e r es i m i l a ri ns s fa n ds m f v a r i a t i o n sb e t w e e ns s fa n ds m f i nt h e p r o d u c t i v i t yo fe x o p o l y s a c c h a r i d e sw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tb e s i d e4 8 h ( p o 0 5 ) ，n l e p r o t e o l y t i ca c t i v i t yo fl c a s e iz h a n gi n c r e a s e dw h i l et h ev i a b l e c o u n ta n d i n c u b a t i o nt i m ei n c r e a s e d a n dt h ep r o t e o l y t i ca c t i v i t yw a si n f e r i o ri ns s f t h et o t a l a m o u n to f f r e ea m i n oa c i dw a sd i f f e r e n tb e t w e e ns s fa n ds m f ( p o 0 5 ) t h ey i e l d so f l a c t i ca c i da n da c e t i ca c i dc h a n g e dw i t ht i m e al o w e rc o n t e n to fl i n o l e i ca c i d ( c18 ：2 ) a n d l i n o l e n i ca c i d ( c 18 ：3 1w e r ed e t e c t e du n d e rs s fc o n d i t i o n st h a nu n d e rs m fc o n d i t i o n s ( p 0 0 5 ) t h es u r v i v a lr a t eo f l c a s e iz h a n gw a s17 51 w h e nt h ef e r m e n t a t i o ns u b s t r a t ew e r e d r i e da t3 5 c ，a n dt h ev i a b l ec o u n tw a s3 9 8 x10 s c f u g , k e yw o r d s ：p r o b i o t i cl c a s e iz h a n g ；s 0 l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n ；o p t i m i z e ；c h a r a c t e r i s t i c s o f m e t a b o l i s m d ir e c t e db y ：p r o f s u nt i a ns o n g a p p ii c a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：c u id i n gl i ( f o o d s c i e n c e ) 毋湖s c i e l 髓a n d h 酶i 咖g 浏l e 鹦i n n e r m m g o l i a a g r i e t d t u m l u n i v w s i t y h u h h o t 0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢蚵 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：盥日期：兰幽 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期问论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蘩古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的棠印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阕学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) 。采用影印、缩印或其他手段保存论文： 论文作者签名：豳 指导教师签名：纽盔堑： 日 期：主翌乏奄：丛 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 1 1 固态发酵 1 1 1 固态发酵的发展简介 固态发酵历史悠久，应用广泛，是人类利用微生物生产产品历史最悠久的技术之 一。最早的固态发酵是应用于面包和酒曲的生产。考古学者在史前2 5 0 0 年的埃及 t h e b a n 法老王坟墓内找到经发酵的面包实体，以及酒和啤酒酿造的壁图和实物。 据推测，人类在史前3 0 0 0 年已懂得使用酵母发酵技术，虽然不知原理，但已具有熟 悉经验。1 8 5 9 年，法国科学家巴斯德( l o u i sp a s t e u r ) 解开了面包发酵的谜团，发 现面包的发酵原来是由于微生物所引起的。 最早的酒是由含糖的水果、蜂蜜、兽乳等受到自然界中的微生物作用发酵而成的 自然酒。人类最早发明的人工饮料酒是游牧时代用兽乳酿造的乳酒，古称醴酪，是第 一代人工饮料酒，它不添加任何糖化发酵剂，全靠自然形成。第二代人工饮料酒是加 了糖化发酵剂一曲蘖而酿成的，又称人工发酵酒。新石器时代仰韶文化遗址出土饮酒 容器，晚期龙山文化出现酒器，殷墟中发现酿酒作坊的遗址，证明在3 0 0 0 多年前中 国的酿酒业已经相当发达，当时已发明了曲蘖，而且可以熟练地用它酿酒。曲是一种 利用固体培养物保存微生物的好方法。在干燥条件下，微生物处于休眠状态，活性容 易保持不变。这种方法的原理，一直延用到今天。曲的发明，是我国古代劳动人民的 伟大贡献，后传入西方，不仅改变了西方自古沿用麦芽糖化谷物，然后再加酵母菌发 酵成酒的方法，还奠定了酒精工业的基础。更重要的是，曲给现代发酵工业和酶制剂 工业带来了深远影响。 酱、酱油和豆腐乳也是比较古老的固态发酵产品。据载，酱和酱油早在我国的周 朝时代就已开始生产，到了春秋战国时期，已经成为人们日常生活中不可缺少的调味 品。豆腐乳的生产起源于中国，可追溯到公元2 2 0 - - 2 6 5 年三国时期的魏国。它是将 豆腐坯用真菌固态发酵后，经含盐和酒精的盐水老化而成，根据加工方法，腐乳可以 分为霉菌发酵腐乳、自然发酵腐乳、细菌发酵腐乳和酶法催熟腐乳。我国著名的农业 科学家，北魏( 6 世纪) 的贾思勰在其所著的齐民要术中对发酵食品，如酒、酱、 豉、醋、泡菜等的制造方法都有比较详细的论述口一1 。 固态发酵从传统食品和饮料酒工业发展而来。如今，它的应用已扩展到制药、酶 制剂、有机酸、堆肥处理、蘑菇培养以及其它食品和饮料的工业生产。随着现代微生 物发酵技术及数学模型研究的不断发展，固态发酵这一古老的酿造技术将发挥更大的 优越性。 1 1 2 固态发酵的内涵、特点 微生物发酵方法可分为两大类：液态发酵与固态发酵。固态发酵( s o l i ds t a t e f e r m e n t a t i o n ，s s f ) 是指在没有或几乎没有自由流动水的湿固态基质上进行的一种 2 益生菌l c a s e iz h a n g 固态发酵特性的研究 或多种微生物发酵过程。j 1 ，既包括固体底物基质固态发酵以天然基质( 麸皮、 甜菜、甘薯、豆粕等) 作为碳源和能源的发酵过程，也包括以惰性基质( 大麻纤维、 珍珠岩、p u f ( 聚氨基甲酸酯泡沫胶) 、聚合树脂、甘蔗渣、聚苯乙烯等) 作为固态支 撑物的惰性载体吸附固态发酵过程。固态基质不仅起到一个提供碳源、氮源、水分、 无机物和其它营养物的作用，同时也为微生物的生长提供了一个固定的位置，因此固 态发酵过程很类似于在自然环境中所发生的微生物反应凸。依据固态发酵过程中是 否能实现限定微生物纯种培养，分为传统固态发酵与现代固态发酵。现代固态发酵是 为了充分发挥固态发酵的优势，针对传统固态发酵存在的问题，使之适应现代生物技 术的发展而进行的，可以实现限定微生物的纯种大规模培养。 与其它培养方式相比，固态发酵具有如下优点：( 1 ) 培养基简单、来源广泛并且 价格低廉，可以利用可再生的天然生物质或工业下脚料为主要原料：( 2 ) 投资少， 能耗低；( 3 ) 基质的低含水量，可大大减少生物反应器的体积，不需要废水处理， 污染环境较少，后处理加工方便；( 4 ) 固态发酵后的物料可直接作为产物： ( 5 ) 发 酵过程一般不需要严格的无菌操作，固态发酵相对较能抵抗细菌污染阳3 ；( 6 ) 通气 一般可由气体扩散或间歇通风完成，不需要连续通风；( 7 ) 有利于微生物在接近于 自然状态下生长等 1 。 然而在固态发酵过程中，微生物代谢、生长和产物的形成都在固体介质表面，培 养基不均匀且不易搅拌，菌体的生长、对营养物质的吸收和代谢产物的分泌在各处都 是不均匀的，使得发酵参数的检测和控制都比较困难。微生物生长及代谢产生的热量 使固体培养基的温度升高，导致水分的损失，甚至杀死微生物，这是固态发酵控制的 一个难题引。 1 1 3 固态发酵的应用 随着能源危机与环境问题的日益严重，固态发酵技术以其低能耗、环境影响小和 代谢物的特异表达等优点引起人们极大的兴趣凹1 ，并在许多领域得到成功开发应用。 1 1 3 1 固态发酵在食品工业中的应用 在我国，固态发酵于古代就已被广泛用于生产酿造食品，如酒、酱油、醋等。制 曲是酱油生产中较为重要的一环，种曲的优劣，直接影响到发酵速度、酱油的品质和 产出量。传统酱油生产中种曲和成曲的制备都是在敞开的环境中进行，很容易感染杂 茵，采用现代固体发酵技术能克服上述问题。红曲是我国黄酒特有的糖化发酵剂，生 产中以大米为原料，经浸米、蒸料后拌入红曲菌种培养制成。红曲培养通常要求控制 一定的温度和湿度，采用现代固态发酵技术和设备，可以使发酵过程易控制，发酵过 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 程中化学营养物质添加方便，并可防止杂菌的污染，获得高产量和高质量的产品。 长期以来，有机酸作为食品工业中的添加剂和防腐剂，用来防止食品变质和延长 食品的保存期。与化学合成法相比，发酵得到的有机酸更适合食品、医药等部门。柠 檬酸是较常用的有机酸，我国以甘薯渣为原料固态发酵柠檬酸早在1 9 7 7 年就已投入 生产妇1 。世界上有许多国家在柠檬酸生产初期，均采用固体浅层培养法，由于一些废 渣( 苹果渣、甘蔗渣等) 的利用以及深层发酵法投资大等原因，浅层固体法生产柠檬 酸至今不衰，特别是在发展中国家玎0 1 。乳酸是一种重要的食用有机酸。人和哺乳动 物体内存在的乳酸全是l 一型的，它直接参与代谢，并且能迅速地转化成肝糖，全部 被吸收。从人体营养及代谢的角度来看，应服用l 一乳酸。世界卫生组织建议限制使 用d 一乳酸含量高的产品，尤其是生产婴幼儿营养食品应避免使用d 一或d l 一混合乳 酸，国内外对l 一乳酸的研究和生产十分重视。r p j o h n 等分别以干酪乳杆和德氏乳 杆菌为生产菌固态发酵生产l 一乳酸，结果显示，还原糖的转化率高达9 5 和9 9 ， l 一乳酸的最高产量为2 9 9 5 9 基质n “1 2 1 。 风味化合物大部分是通过化学合成或天然植物提取得到。植物是精油、香料的主 要来源，但它们受气候条件、植物疾病等自然条件的制约。生产风味化合物一个替代 路线就是用微生物合成或转化。目前己知有些微生物( 包括细菌、真菌) 具有合成不同 风味化合物的能力。用微生物液态发酵生产风味化合物产率低，不利于工业化应用， 但固态发酵拥有较大的潜力。 1 1 3 2 固态发酵在饲料工业中的应用 由于饲料用原料日益紧缺，而微生物发酵可以利用工农业生产的下脚料、废弃物 或化工副产品生产出优质高效的饲料及添加剂，因而世界各国对利用微生物开发饲料 资源极其重视。采用固态发酵工艺，可利用农副产品及其下脚料生产各种饲料添加剂， 如酶制剂、益生素、蛋白饲料等。 木质纤维农作物废渣是反刍动物膳食能量的潜在资源。这些废渣含有大量的纤维 素、半纤维素和一些木质素，但缺乏蛋白质，这就限制了它们作为动物饲料的利用率。 另外，它们在消化性和适口性方面有时也较差。为了提高其利用率，有必要改善其营 养质量，可采用物理、化学和微生物等方法实现，其中微生物固态发酵法显示了很好 的潜力。现在人们已成功地利用白腐菌把木质纤维素转化为蛋白含量较高的饲料。i a n d r e i d 用白腐真菌固态发酵木屑，纤维素酶的消化率从1 8 提高到5 3 n 副。以酿 造糟渣为原料，以霉菌和酵母菌为菌种，进行单菌种或复合菌种固态发酵，发酵产物 中粗蛋白含量较原料提高5 - - - 1 5 ，粗纤维含量降低1 0 左右，并且必须氨基酸配比 平衡更为合理n 毛5 一引。苹果渣皮是水果加工厂的下脚料，含水量高达8 0 以上，蛋 白质含量极低，难以直接作为畜禽饲料。张玉臻等研究用丝孢酵母菌固态发酵苹果渣 4 益生菌l c a s e iz h a n g 固态发酵特性的研究 皮，使其转化为富含蛋白质的畜禽饲料，以期部分或全部代替配合饲料中的鱼粉 。 以淀粉质废渣为原料固态发酵生产饲料蛋白，发酵后蛋白质含量较对照均有很大提高 【- 1 9 】 o 近年来，饲用酶制剂的研究和生产得到了飞速发展。它们在提高饲料利用率、促 进动物生长和防治疾病等方面均发挥了积极的作用，并且在很大程度上还避免了由于 添加抗生素和激素所产生的负面影响。w g r a j e k ( 1 9 8 7 ) 等人的研究结果显示，一些 酶采用固态发酵法其产率及酶组分要远远优于液态发酵乜h 豫幻硎1 。 1 1 3 3 固态发酵在资源环境中的应用 微生物在资源环境中扮演着十分重要的角色，在环境保护中做出了巨大的贡献。 微生物在资源环境保护中的应用已从自然生态系统发展到活性污泥方法处理废水，并 迸一步扩大到工农业残渣转化、固体废弃物处理及生物修复等领域。 1 生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) ：是利用微生物及其代谢过程来修复被人类长期 生活和生产所污染和破坏的局部环境，使之重现生机的过程。由于目前环境污染日益 严重，国外学者对生物修复研究相当投入。固态发酵生物技术是有毒化合物生物降解 与环境生物修复的有益手段。m a s a p h y 等汹1 研究发现，把白腐菌p e u r o t u s p u m o n a r y u s 接种到棉花或麦草混合物上可以降解阿特拉津( a t r a z i n e ，一种除草 剂) ，提出可通过微生物降解来达到生物修复的目的。 2 生物解毒：采用固态发酵对某些工农业废渣进行脱毒处理，如木薯皮、油菜籽 粉、咖啡壳、咖啡肉浆等，有些已取得成功。孙建义等利用假丝酵母进行棉籽饼脱毒 的试验，游离棉酚的降解率达9 0 以上汹3 。另有研究显示，采用固态发酵处理木薯 皮有毒化合物，发酵9 6 h 后，木薯皮的氰化氢水平剧减9 5 ，溶解性鞣酸减少约4 2 。 3 生物转化：利用固态发酵将农作物及其废渣进行生物转化，可以提高它们的营 养价值，减小对环境的污染。食用真菌( 蘑菇) 就是一个很好的例子，它具有把许多 不能食用的植物或其剩余物降解转化的能力，使之变为有食用价值的食物。据分析， 食用菌不但含有丰富的蛋白质、脂肪、糖、维生素、矿物质等营养成分，而且某些食 用菌还对动植物病毒性疾病有免疫或抑制作用，还能抑制肿瘤的发生和发展，并能溶 解定量的胆固醇，所以被称为“健康食品眦2 。 4 生物燃料：用工农业残渣进行固态发酵，生产生物燃料主要为乙醇。乙醇是产 量最大的发酵工业产品，是清洁燃料工业的代表，是可再生性能源。利用固态发酵技 术生产乙醇有许多优点，如：由于发酵过程减少用水量，而降低发酵罐体积，无废水； 降低能耗等。这是一个有潜力的生产乙醇路线，国外对其研究相当多，大多利用酵母 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 菌发酵，但也有研究用代谢葡萄糖的细菌菌株。董永胜等研究以固态基质材料发酵乙 醇，利用发酵过程中酵母菌产生的c 0 2 作为循环载气来汽提乙醇并同时回收，以及时 有效的除去产物乙醇，提高了发酵效率涵1 。 5 生物农药：白僵菌( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) 和苏云金芽孢杆菌杀虫剂( b a c i l l u s 咖u r y n g i e n s y s ，简称b t ) 是世界上研究较多、应用较广的生物农药。它们对多种害 虫都有很强的杀伤作用，但人畜无毒、无害、无副作用，不致畸、不致癌、不污染环 境，在持续长久控制害虫、保存多种生物种类、维护生态平衡方面具有不可替代的作 用，是比较理想的绿色环保型生物杀虫剂。选用苏云金芽孢杆菌、白僵菌等优良菌种， 以麸皮、稻壳等副产物为底物进行固态发酵，能以较低的成本产出高效成品粉剂，与 传统的液态发酵方法比较，投资和生产成本可减少1 3 以上n 一。 1 1 4 发展固态发酵的意义 当前，许多工农业残渣、生活垃圾已成为社会公害，对人类的生存环境均产生不利 的影响。随着人们对固态发酵机理认识的不断加深，可以利用现代固态发酵技术对这 些材料进行降解、修复，转化成对人们有益或无害的物质，既无损于自然生态系统，又 可以解决环境污染问题，减轻资源危机。因此，发展固态发酵具有极其深远的意义。 1 2 益生乳酸菌 1 2 1 乳酸菌的发展简史 乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i a ，l a b ) 是一类能在可利用的碳水化合物发酵过 程中产生大量乳酸的细菌，细胞形态有球状、类球状、短杆或杆状，多数为革兰氏阳 性，也有具阳性细胞壁型的阴性菌汹1 。 早在4 0 0 0 年前，古人就已经开始饮用酸奶。2 5 0 0 年前，佛教教典中有关于乳酸 菌分泌物的经文。公元前2 0 0 年，古印度、古埃及、古希腊人就用有益于人体的乳酸 菌制作发酵食品，因为乳酸菌在自然界分布广泛，所以当时用自然发酵奶制造游牧民 族的上等食品。过了1 2 0 0 多年，即公元1 0 0 8 年，德国建立了世界上第一个酸奶作坊。 到1 6 世纪中叶，发酵乳酪渐渐成了一些民族的传统食品。古人虽可制作出酸乳制品， 但并不认识细菌，只是靠感官和经验制作。1 6 7 7 年，列文虎克( l e e u w e n h o e k ) 发明 了显微镜，第一次看到了微生物。1 8 5 7 年巴斯德( l o u i sp a s t e u r ) 在研究乳酸发酵 过程中首次发现乳酸菌，从而阐明了乳酸发酵的原理。1 8 9 9 年蒂赛( t i s s e r ) 发现 双岐杆菌，1 9 0 0 年奥地利医生莫罗( em o r o ) 发现嗜酸乳杆菌。1 9 0 5 年梅契尼科夫 ( e l i em e t c h i n i k o f f ) 撰写的长寿说( t h ep r o l o n g a t i o no fl i f e ) 英译本出版， 文章论述了乳酸菌具有的生理功能，阐明酸奶能使人长寿的缘由。1 9 11 年，梅契尼 科夫的同事l o u d e nd u g l a s 出版长寿杆菌( b a c i l l u so fl o n gl i f e ) 一书，他把 6益生菌l c a s a iz h a n g 固态发酵特性的研究 饮用酸奶与长寿直接联系在一起，有力地支持了梅契尼科夫的论点。1 9 1 5 年，美国 d a v i e ln e w m a m 首次利用乳酸菌治疗膀胱感染，为乳酸菌在临床方面的应用奠定了基 础。2 0 世纪5 0 年代，德国人鲁希( r u s c h ) 以及我国临床医务工作者用健康人体内 的混合菌群治疗肠道疾病获得了成功。在6 0 - 8 0 年代，日本学者光冈知足对肠道菌群 作了全面的分析汹川。这些都为微生态学的建立和益生菌的开发提供了理论根据。1 9 7 4 年，p a r k e r 开始把益生菌用于饲料添加剂，随后，益生菌制品在市场上日益增多。 2 0 世纪8 0 年代，我国微生态学家康白、刘秉阳、梅汝鸿、何明清等率先在我国研制 出了人用益生菌制品、植物用益生菌制品( 增产菌) 和动物用益生菌制品。随着人们 对肠道微生物与健康关系的认识和研究不断深入，以及各相关学科的相互渗透，益生 菌越来越引发研究者的兴趣，也使得益生菌的应用越来越广。 1 2 2 益生菌的定义 益生菌( p r o b i o t i c s ) 这一名称是相对于抗生素( a n t i b i o t i c s ) 而言的专业用 语，来源于主要表达生物间共生关系的拉丁语p r o b i o s i s 一词。对益生菌最直接的理 解，即“对人和动植物机体有益的菌”。g i b s o n 等将其表述为“通过改善肠道微生物 平衡而对宿主产生有益影响的活菌食品添加物” 3 2 o 根据2 0 0 3 年欧洲食品与饲料菌 种协会对益生菌所下的定义，益生菌是指“当摄入充足的数量后，能对宿主产生一种 或多种有论证的功能性健康益处的活的微生物 0 3 1 。 目前乳酸菌中研究最多的是能够在胃肠道中存活的双歧杆菌和乳酸杆菌，其他用 作益生菌的还有链球菌、肠球菌、芽孢杆菌等。活跃于市场的部分益生菌菌株有：芬 兰v a l i o 乳业的鼠李糖乳杆菌l g g ，美国b i o g a i a 公司的露特乳杆菌1 0 6 3 ，芬兰 p r o v i v a 公司的植物乳杆菌2 9 9 v ，日本y a k u l t 公司的干酪乳杆菌s h i r o t a ，瑞士雀 巢公司的约翰逊乳杆菌l j l 和嗜酸乳杆菌l a l ，日本森永的双歧杆菌b b 5 3 6 ，丹麦 汉森的双歧杆菌b b l 2 和嗜酸乳杆菌l a 一5 等阻】。国内几个大型乳品企业主要使用的 益生菌种有：伊利的l g g ，蒙牛的b b l 2 、l a b s ，光明的a b l 0 0 等。 1 2 3 益生乳酸菌的功效 1 2 3 1 促进营养成分的分解、吸收 乳酸菌的菌体蛋白可增加蛋白质含量。乳酸菌能将食物中的大分子蛋白质，部分 降解为小分子肽和游离氨基酸，利于胃肠消化吸化。乳酸菌可分解乳糖成为葡萄糖和 半乳糖，进而进一步分解为小分子化合物，有助于儿童脑及神经系统的发育d 副。乳 酸菌在代谢过程中消耗部分维生素，有利于增加肠内维生素的稳定性。乳酸菌产生的 有机酸使钙、磷、铁等元素处于易吸收的离子状态，提高利用率。 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 1 2 3 2 抑菌抗病，健胃整肠 乳酸菌是定居在肠道中的有益菌群，通过代谢产酸、降低肠内p h 值，产生抗菌 的细菌素，能有效地抑制肠道腐败菌的繁殖，抑制有害物质的产生。乳酸菌促进消化、 吸收，有健胃的功能。乳酸菌产生的有机酸还有促进肠管蠕动、有润肠通便的功效汹 】 口 1 2 3 3 增强机体免疫功能 乳酸菌菌体抗原及代谢物通过刺激肠粘膜淋巴结，激发免疫活性细胞，产生特异 性抗体和致敏淋巴细胞，调节机体的免疫应答，防止病原菌侵入和繁殖。还可以激活 巨噬细胞，加强和促进吞噬作用啪麓1 。 1 2 3 4 维持和改善机体正常机能 由于乳酸菌抑制了腐败菌的生长繁殖，减少了有毒代谢产物的吸收，可以改善肝 功能。乳酸菌的代谢能显著减少肠管对胆固醇的吸收，同时，乳酸菌吸收部分胆固醇 并将其转变为胆酸盐排除体外，可以降低血清胆固醇，维持机体正常机能。l 圳。 1 2 3 5 抗癌功能 乳酸菌细胞壁对氨基酸加热分解物等有害物质有较高的吸附率，以减少或消除其 毒害作用，减少胃癌和肠癌的发生汹3 。 1 2 3 6 其它益生作用 乳酸菌还可提高食品的储藏性能，延长储藏时间。并可赋予发酵产品特有的风味， 酸奶就是具有良好风味的食品。 1 2 4 国内外益生菌产品概况 乳酸菌产业在全球市场的增长率超过9 汹3 。国外发酵型乳酸菌奶饮品比较发 达，目前全球最大的消费市场是日本和欧洲。日本是世界上研制开发和利用微生态制 剂较早的国家之一，就研发及应用水平而言，日本处于较领先地位，发酵乳、乳酸菌 饮料是日本很普遍的功能性食品。欧洲各国在益生菌的研究上不亚于日本人，传统的 酸奶制品最主要的是雀巢和达能公司的产品，知名的乳酸菌生产跨国公司还有： d a n i s c o ，d s m 等。美国市场上益生菌产品有两种形式：食品和膳食补充剂，含有益 生菌的食品几乎全部是奶制品；含益生菌的膳食补充剂产品品种较多，剂型有胶囊、 粉剂、口服液、片剂哺】。 我国的乳酸菌产业主要包括发酵型酸奶、乳酸菌饮料、益生菌、乳酸菌饲料、发 酵型泡菜、发酵型肉制品、医药保健品等。但国内的益生菌市场还处于起步阶段，与 8 益生菌l c a s e iz h a n g 固态发酵特性的研究 国外相比还有较大的差距。随着具有健康促进效用的其它产品的发展，人们对益生菌 的兴趣日益增长。而且，各大公司也可能扩大产品开发队伍以推出除酸奶和乳制品之 外更加多样的食品种类，如果汁、谷类、含有益生菌的奶酪产品等。人们对益生菌的 功效作用和重要性理解将会更加深刻。 1 2 5 立题目的和意义 目前，食品安全倍受重视，因为畜产品( 肉、蛋、奶) 中的抗菌素、化学药物残 留会影响人类健康。所以，人们对副作用小、效果较好的微生物制品展开研究，以代 替抗生素和化学药品。其中益生菌广为人知，它多采用液态发酵法，为了提高其活菌 数，往往施行冻干技术和微胶囊化技术，但是成本较高。固态发酵技术不仅能弥补这 一缺憾，同时还具有其它一些优势。例如，固态发酵所用培养基来源广泛，多为便宜 的天然基质或工业生产的下脚料；固态发酵可减少发酵过程中的产品损耗和伴生的废 料，降低下游的加工成本( 去除水分) 阳1 ；固态发酵后的物料可直接作为产物；基质 含水量低，减少了生物反应器的体积；环境污染较少：等等。 在饲料领域，固态发酵所用菌种涉及乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、霉菌等。而在 乳酸菌家族中，干酪乳杆菌是一种重要的有益菌。本课题所用菌株l c a s e iz h a n g 分 离自内蒙古传统发酵酸马奶中，经研究已证实该菌具有耐酸、耐胆盐和降胆固醇能力 “，并且具有一定的抑菌效果和良好的调节、增强动物免疫功能的作用 4 2 o 本文旨 在通过对益生菌厶c a s e iz h a n g 固态发酵的研究，筛选出较适宜的培养基、固态发酵 条件及烘干温度：并通过与液态发酵的比较，了解益生菌l c a s e iz h a n g 固态发酵的 特点，为实际生产奠定基础。 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1菌株来源 厶c a s e iz h a n g ：分离自内蒙古传统发酵酸马奶中，由内蒙古农业大学“乳品生 物技术与工程教育部重点实验室”保存。 2 1 2 培养基 ( 1 ) m r s 液体培养基 蛋白胨l o g 、牛肉膏l o g 、酵母粉5 9 、葡萄糖2 0 9 、吐温8 01 9 、磷酸氢二钾2 9 、 乙酸钠5 9 、柠檬酸钠2 9 、硫酸镁o 2 9 、硫酸锰0 0 5 4 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h6 5 ， 1 2 1 ，灭菌1 5 分钟。 ( 2 ) m r s 琼脂培养基 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 m r s 液体培养基中加入1 5 2 o 琼脂，1 2 1 ，灭菌1 5 分钟。 2 1 3 仪器、设备 h ia y a m ah a 一3 0 0 m i 高压灭菌锅； n s c i i a 一1 2 0 0 洁净工作台： m i r - - 2 6 2 0 恒温培养箱： h z s h 控温水浴振荡器； l 一i ib 低速大容量多管离心机： e p p e n d o r f5 8 1 0 r 台式高速冷冻离心机； u - 2 0 0 0 分光光度计： l a b c o n c o 真空冷冻干燥机； a g i l e n tl1 0 0 高效液相色谱仪； g c 一9 a 气相色谱仪( 日本岛津) ； e 1 0 0 超声波破碎仪( i e d at r a d i n gc o r p o r a t i o n ，w a t t s ：1 0 0 ，f r e q ：2 0 k h z ， v o l t s ：1 0 0 ) ： s h a r pu t 一1 2 0 4 8 超声波洗涤机； 雷磁p h s j 一3 f 型p h 计； 1 0 1 - - 3 a 鼓风干燥箱。 2 2 方法 2 2 1l c a s e iz h a n g 种子液制备 将冷冻干燥保存的c a s e iz h a n g 接种在m r s 液体培养基中，3 7 培养1 8 - 2 4 h ， 传代培养3 次，使菌株活力得到充分恢复。将培养液离心( 3 5 0 0 xg ，1 0 r a i n ) ，弃去 上清夜，用无菌生理盐水洗涤、离心收集菌体，重复三次，最后将收集到的茵体用无 菌生理盐水稀释备用( 活菌数为i o s c f u m l ) 。 2 2 2l c a s e iz h a n g 固态发酵培养基和发酵条件的优化 2 2 2 1l c a s e iz h a n g 固态发酵培养基的优化 采用九因素、四水平正交设计进行固态发酵培养基的优化，各因素及水平见表l 。 培养基于2 5 0 r a l 三角瓶中混匀，自然p h ，1 2 1 灭菌3 0 m i n ，降至室温后接入种子液 0 2 m l ，用无菌玻璃棒搅匀，置3 7 培养箱中静止培养，每隔1 2 h 摇瓶一次，使其均 匀生长。培养2 4 h 后，向每个三角瓶中加入1 0 0 m l 无菌生理盐水及无菌玻璃珠，置水 浴振荡器中1 4 0 r m i n 振荡3 0 r a i n ，使分散均匀。采用倾注平板法计数，3 7 倒置培 养4 8 h 后记录菌落总数。 10 益生菌l c a s e iz h a n g 固态发酵特性的研究 2 2 2 2 l c a s e iz h a n g 固态发酵培养基初始含水量的优化 培养基的含水量对固态发酵起着非常重要的作用。在上述优化的培养基基础上， 对4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、6 0 的初始含水量进行单因素研究，考察不同的培养 基含水量对l c a s e iz h a n g 活菌数的影响，以确定一适宜的基质初始含水量。操作方 法同2 2 2 1 。 表1固态发酵培养基的正交试验因素水平表 t a h i t if a c t o r sa n dl e v e l si no r t h o g o a a le x p c r i r 啪to f s o l i dm e d i a 因素 abcdefghi 豆粕麸皮葡萄糖乳清粉蛋白胨硫酸铵硫酸镁碳酸钙蒸馏水 承乎( g )( g )( g ) ( g ) ( g ) ( g ) ( g )( g ) ( 皿l ) 1340 20 6000 0 15 2450 31 20 0 40 0 0 40 0 0 2o 26 3560 41 80 1o 0 lo 0 0 4o 37 46 7 0 52 4 0 20 0 2 0 0 10 48 注：豆粕、麸皮均为市售，要求无霉变、无异味；浓缩乳清粉为美国进口；其它所用试剂为国产分析纯 2 2 2 3l c a s e iz h a n g 固态发酵时间的优化 以优化的培养基和初始含水量为基础，研究在1 8 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 、6 0 h 、7 2 h 不同培养时间l c a s e iz h a n g 的生长情况，确定一较佳发酵时间。操作方法同 2 2 2 1 。 2 2 3l c a s e z h a n g 在固态发酵体系中生长及代谢特性的研究 通过与液态发酵的对比，观察固态发酵条件下l c a s e iz h a n g 的生长过程和产物 生成的变化。本研究中液态发酵( s m f ) 是指培养基初始含水量为9 0 ，即固态基质 悬浮于水中；固态发酵( s s f ) 的培养基初始含水量为5 5 。 2 2 3 1l c a s e iz h a n g 的培养及发酵物的预处理 按正交优化结果配制培养基，组成见表2 ，于2 5 0 m l 三角瓶中混匀，自然p h ，1 2 1 灭菌3 0 m i n 。降至室温后分别接入l c a s e iz h a n g 种子液0 2 m l ，用无菌玻璃棒搅 拌均匀，3 7 静置培养，每隔1 2 h 摇瓶一次，使其均匀生长。在培养至1 2 h 、1 8 h 、 2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 和6 0 h 分别取出三角瓶，向固态发酵的各三角瓶中补加无菌蒸馏水 7 9 6 m l ，然后放入水浴振荡器，1 4 0 r m i n 振摇3 0 r a i n ，然后在无菌操作下用二层纱布 内蒙古农业大学硕士学位论文 过滤，除去较大颗粒 物，滤液备用。 表2 固态发酵及液态发酵的培养基组成 t a b l e2c o m p o s i t i o no f r n e d i a 豆粕麸皮 乳清粉( g )葡萄糖碳酸钙硫酸铵 硫酸镁 蒸馏水 ( g )( g )( g )( g )( g )( g )( 札) s s f450 60 30 30 0 2o 0 l1 2 5 辄f450 60 30 30 0 20 0 t9 2 1 2 2 3 2l c a s e iz h a n g 的生长动力学分析 取上述制备好的发酵滤液用灭菌生理盐水作1 0 倍递增稀释，采用倾注平板法进 行计数，3 7 倒置培养4 8 h 后记录菌落总数。 2 2 3 3 l c a s e iz h a n g 对还原糖的利用 取2 2 3 1 中发酵滤液与浓度为1 6 的三氯乙酸等体积混匀，离心( 4 5 0 0 x g ， 1 0 m i n ) ，上清液采用3 ，5 一二硝基水杨酸( d n s ) 比色法进行测定h 3 一5 1 ，经查标准 曲线得出c a s e iz h a n g 不同时间发酵物中还原糖含量，从而间接反映出还原糖被利 用情况。 2 2 3 4l c a s e iz h a n g 产胞外多糖的测定 2 2 3 4 1 多糖液的制备 ( 1 ) 除蛋白、菌体：取2 2 3 1 中发酵滤液与1 6 三氯乙酸等体积混匀，离心( 4 5 0 0 x g ，1 0 m i n ) ，弃掉沉淀。 ( 2 ) 热处理t 离心后的上清液用4 0 n a 0 h 调节p h 到6 5 7 o ，然后9 0 水浴 热处理3 0 m i n ，使残余蛋白变性、沉淀：离心( 4 5 0 0 xg ，1 0 m i n ) ，以除去残余蛋白。 ( 3 ) 乙醇沉淀：向离心后的上清液中加入三倍体积的9 5 乙醇，充分振荡，多 糖呈絮状沉淀析出，静置过夜，离心( 4 5 0 0 x g ，1 0 m i n ) 。 ( 4 ) 洗涤、溶解：离心所得沉淀用7 5 乙醇洗涤，至d n s 法检验无还原糖反应 为止，经洗涤后的沉淀用蒸馏