（食品科学专业论文）花芸豆淀粉酶抑制剂αAI1的分离纯化及相关性质的研究.pdf

摘要 芸豆( p h a s e o l u sv u l g a r i s ) 淀粉酶抑制剂亚型l ( a a 1 1 ) 可被广泛用来辅助治 疗肥胖症与糖尿病。通过淀粉酶抑制剂合适的结构、物理化学性质、功能性可影响 腔内边缘淀粉酶的活力。最终结果是降低餐后血高血糖与胰岛素水平，增加淀粉消 化的抗性和肠内微生物的活力。然而，淀粉酶抑制剂提取物的疗效及安全性取决于 加工及提取工艺。抑制剂可被添加到食品中，用来增加糖尿病人的碳水化合物耐受 量，降低摄取的能量，从而避免出现肥胖症和提高抗性淀粉的含量。 一般的粗提工艺包括水提取，p h 分离和乙醇( 7 5 ) 沉淀，它可用来筛选抑 制剂提取合适的品种。几种芸豆中，红芸豆中淀粉酶抑制剂的活力最高，黑芸豆的 则最小。随后的粗提取物的s d s - p a g e 电泳图显示蛋白质组分的数量减少了，只 有两条主要带。1 4 2 6 克红芸豆粗提物的特异性血凝活性平均为1 4 2 2 2 2 u m g 。进 一步采用d e a e s e p h a r o s ec l 6 b 和s e p h a c r y ls 2 0 0 层析柱分离纯化。在0 0 9 原 芸豆粉( w w ) 的基础上通过电泳纯化得到的淀粉酶抑制剂检测不到血凝活性，同 时，比酶活由0 3 2 增加到8 0 7 8u m g 。n a t i v e p a g e 电泳图上只显示一条带， s d s p a g e 电泳图上在分子量1 4 4 0 0 - 2 1 0 0 0d a 区域有两条紧密结合的带。淀粉酶 抑制剂的i c 5 0 值为0 0 0 9 8m g m l ，反应1 5 - 2 0 m i n 后可达最高活力。淀粉酶抑制剂 在p h3 5 7 5 内有活力，在p h4 0 后活力显著增加，p h 5 8 达到最大。热稳定性的 最佳条件是p h5 5 ，时间1 6m i n ，温度4 7 2 3 。 花芸豆( p h a s e o l u sv u l g a r i s ) a 淀粉酶抑制剂作为糖尿病和肥胖症患者的保健品 应用时，需要具有一定的热处理。选取p h ( a ) 、温度( b ) 、时间( c ) 三因素，以淀粉 酶抑制剂的残余活力为指标，采用响应面中的b o x - b e h n k e n 设计方法，得到的结 果如下： r es i d u a li n h i b i t o r ya c t i v i t y ( ) = 0 3 9 2 7 8a 2 c 一1 11 5 3 6 7a 2 0 0 7 0 9 6 1b 2 0 2 7 0 6 1c 2 0 0 6 4 4 7 4b + 3 9 6 3 1 3a c 一8 8 7 1 2 1 1 0 3 b c + 2 3 7 6 8 4 0a + 8 2 1 3 7 4b i 2 2 7 2 0 c 一2 5 1 4 8 4 0 9 固有荧光光谱及a n s 辅助表面疏水性测定结果表明：抑制剂活力降低的同 时，其四级结构展开。高浓度盐溶离子及低浓度盐析离子可以稳定抑制剂，离子的 顺序为：c h 3 c o o c i b r i s c n ，反之亦然。d s c 图谱显示淀粉酶抑制剂的 变性温度为：8 4 1o c ( t o ) 、8 6 7 ”c ( t p ) 、8 7 6u c ( t c ) 。 关键词：花菜豆，p h a s e o l u sv u l g a r i s ，0 l 一淀粉酶抑制剂 - a 1 1 ) ，热稳定性，糖尿病， 高血糖，肥胖症，毒性，热处理，响应面法，表面疏水性，霍夫迈斯特系列盐，多 元醇，色谱。 v i a b s t r a c t a b s t r a c t t h ek i d n e yb e a n ( p h a s e o l u sv u l g a r i s ) 伍- a m y l a s ei n h i b i t o ri s o f o r ml ( a - a 1 1 ) s t a r c hb l o c k e r si sap o t e n t i a lw i d e l yu s e dr e m e d ya g a i n s to b e s i t ya n dd i a b e t e s c o n s u m p t i o no ft h ea - a m y l a s ei n h i b i t o rc a u s e sm a r g i n a li n t r a l u m i n a la a m y l a s ea c t i v i t y f a c i l i t a t e db yt h ei n h i b i t o r s a p p r o p r i a t es t r u c t u r a l ，p h y s i c o c h e m i c a la n df u n c t i o n a l p r o p e r t i e s a sar e s u l tt h e r ei sd e c r e a s e dp o s t p r a n d i a lp l a s m ah y p e r g l y c a e m i aa n di n s u l i n l e v e l s ，i n c r e a s e dr e s i s t a n c eo fs t a r c ht od i g e s t i o na n di n c r e a s e da c t i v i t yo fc o l o r e c t a l b a c t e r i a t h ee f f i c a c ya n ds a f e t yo ft h ea m y l a s ei n h i b i t o re x t r a c t s ，h o w e v e r , d e p e n do n t h ep r o c e s s i n ga n de x t r a c t i o nt e c h n i q u e su s e d n ee x t r a c t sa r ep o t e n t i a li n g r e d i e n t si n f o o d sf o ri n c r e a s e dc a r b o h y d r a t et o l e r a n c ei nd i a b e t i c s ，d e c r e a s e de n e r g yi n t a k ef o r r e d u c i n go b e s i t ya n df o ri n c r e a s e dr e s i s t a n ts t a r c h ac r u d ee x t r a c t i o np r o c e d u r ei n v o l v i n gw a t e re x t r a c t i o n , p hf r a c t i o n a t i o n , a n d a l c o h o lp r e c i p i t a t i o n ( 7 5 ) w a su s e dt os e l e c ta na p p r o p r i a t ev a r i e t yf o ri n h i b i t o r e x t r a c t i o n s p e c k l e dk i d n e yb e a n sh a dt h eh i g h e s ta - a m y l a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t yf o l l o w e d b yr e dw h i l et h eb l a c kk i d n e yb e a n sh a dt h el o w e s ti n h i b i t o r ya c t i v i t y t h er e s u l t a n t s d s p a g ep a t t e r nf o rt h ec r u d ee x t r a c ti nt h ep r e s e n tr e s e a r c hr e d u c e dt h en u m b e ro f c o m p o n e n tp r o t e i n st ot w om a j o rb a n da r e a s i tg a v e1 4 1 2 6g r a m so ft h ec r u d es p e c k l e d k i d n e yb e a np v u l g a r & a - a m y l a s ei n h i b i t o rw i t ha na v e r a g es p e c i f i ch e m a g g l u t i n a t i n g a c t i v i t yo f1 4 2 2 2 2u m gp r o t e i n f o rc h r o m a t o g r a p h i cp u r i f i c a t i o nd e a e - s e p h a r o s e c l - 6 ba n ds e p h a c r y ls - 2 0 0c h r o m a t o g r a p h yw e r eu s e d t h ei n h i b i t o rw a sp u r i f i e dt o e l e c t r o p h o r e t i cp u r i t yw i t h o u td e t e c t a b l eh e m a g g l u t i n a t i n ga c t i v i t ya t0 0 9 w wo f o r i g i n a ls e e df l o u ra n da ni n c r e a s ei ni n h i b i t o rs p e c i f i c a c t i v i t yf r o m0 3 2t 08 0 7 8 u n i t s m gp r o t e i n t h ei n h i b i t o rs h o w e dt w of u s e db r o a db a n d si nt h er e g i o n1 4 4 0 0 210 0 0 d ao ns d s - p a g ea n das i n g l eb a n do nn a t i v e p a g eg e l s t h ei n h i b i t o rh a da ni c 5 0 v a l u eo f0 0 0 9 8m g m la n dr e a c h e dm a x i m u ma c t i v i t ya f t e r15 - 2 0m i n u t e so fr e a c t i o n t h ei n h i b i t o rs h o w e da c t i v i t yi nt h er a n g e3 5 7 5w i t has h a r pi n c r e a s ei na c t i v i t ya f t e r p h 4 0t oam a x i m u ma t5 8 r n l eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rs t a b i l i t yw e r ep h5 5 ，t i m e1 6 m i n u t e s ，a n dt e m p e r a t u r e7 4 2 30 c t h es t a r c hb l o c k i n gh e a ts t a b i l i t yo fs p e c k l e dk i d n e yb e a n s ( p h a s e o l u sv u l g a r i s ) 位一 a m y l a s ei n h i b i t o r ( c 【- a ii ) f o ra p p r o p r i a t e b e f o r e - h e a t t r e a t m e n t a p p l i c a t i o n a sa n u t r a c e u t i c a la d d i t i v ea g a i n s td i a b e t e sa n do b e s i t yw a sa s s e s s e d t h ei n t e r a c t i v ee f f e c to f p h ( a ) ，t e m p e r a t u r e ( b ) a n dt i m e ( c ) o nr e s i d u a li n h i b i t o r ya c t i v i t yw a sm o d e l e du s i n g r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw i t ht h eb o x - b e h n k e nd e s i g na s ； i v a b s t r a c t r e5 i d u a li n h i b i t o r ya c t i v i t y ( ) = 0 3 9 2 7 8 a 2 c 1 1 1 5 3 6 7a 2 0 0 7 0 9 6 1b 2 0 2 7 0 6 1 c 2 0 0 6 4 4 7 4b + 3 9 6 3 1 3a c 一8 8 7 1 2 1x1 0 一b c + 2 3 7 6 8 4 0a + 8 2 1 3 7 4b 1 2 2 7 2 0c 一2 5 1 4 8 4 0 9 i n t r i n s i cf l u o r e s c e n c ea n da n s a s s i s t e ds u r f a c eh y d r o p h o b i c i t yi n d i c a t e da c t i v i t y l o s si sa c c o m p a n i e dt e r t i a r ys t r u c t u r a lu n f o l d i n g c h a o t r o p i cs a l t sa th i g h ( 1 0m ) a n d k o s m o t r o p i cs a l t sa tl o w ( o 1 - 0 0 1m ) c o n c e n t r a t i o ns t a b i l i z e dt h ei n h i b i t o ri nt h eo r d e r c h l c o o c i b r - r s c n a n dv i c e v e r s ar e s p e c t i v e l y d i f f e r e n t i a ls c a n n i n g c a l o r i m e t r ys h o w e dt h ei n h i b i t o rd e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r ea s8 4 1 ”c ，8 6 7 ”ca n d8 7 6 o cf o ro n s e t ( t o ) ，p e a k ( t l p ) ，a n de n d ( t c ) t r a n s i t i o nt e m p e r a t u r e s ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：k i d n e yb e a n s ，p h a s e o l u sv u l g a r i sq - a m y l a s ei n h i b i t o r ( o l - a j1 ) ，h e a ts t a b i l i t y ， d i a b e t e s ，h y p e r g l y c a e m i a ，o b e s i t y ，t o x i c i t y ，h e a tt r e a t m e n t , r e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y ， s u r f a c e h y d r o p h o b i c i t y ，h o f r n e i s t e r s e r i e s s a l t s ，p o l y o l s c h r o m a t o g r a p h y v 0 【a 1 1 仅叫u 2 a a i l p h a p p a a b b r e v i a t i o n su s e d a b b r e v i a t i o n su s e d p h a s e o l u sv u l g a r i sa l p h a - a m y l a s ei n h i b i t o ri s o f o r m1 p h a s e o l u sv u l g a r i sa l p h a - a m y l a s ei n h i b i t o ri s o f o r m1 a l p h a - a m y l a s ei n h i b i t o rl i k ep r o t e i n p h y t o h e m a g g l u t i n i n p o r c i n ep a n c r e a t i ca m y l a s e s d s - p a g es o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s d s c d e a e d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t e r d i e t h y l a m i n oe t h a n o l a n o v a a n a l y s i so f v a r i a n c e h a i7 t i u b m l d 5 0 s c f a a a c c d n s h e m a g g l u t i n a t i n gu n i t s t r y p s i ni n h i b i t o r yu n i t s b a s a lm e a b o l i cr a t e l e t h a ld o s e5 0 s h o r tc h a i nf a t t ya c i d s a m e r i c a na s s o c i a t i o no fa n a l y t i c a lc h e m i s t s 3 , 5 一d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d e d t ak 2 e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i dd i p o t a s s i u ms a l t ，d e h y d r a t e x i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：碰! 垒丝鱼丝! 日期：年月日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名玖左丝丝：彰k 导师堑名：主兰垒耋 日期：年月日 d e c i ，a ra t i o n i w o k a d a l a0 b i r oc u t h b e r td oh e r e b ys o l e m n l yd e c l a r et h a tt h ew o r kw h o s er e s u l t s a r er e p o r t e dh e r e i ne n t i t l e d “s t u d i e so nt h ep h a s e o l u sv u l g a r i sa l p h a - a m y l a s e i n h i b i t o rf r o ms p e c k l e dk i d n e yb e a n s ：p o t e n t i a lf o rn u t r a c e u t i c a ia p p l i c a t i o n ”w a s c a r d e do u ts o l e l yb ym eu n d e rt h eg u i d a n c ea n ds u p e r v i s i o no fp r o f j i a n g1 3 0o ft h e s t a t ek e yl a b o r a t o r yo ff o o ds c i e n c ea n dt e c h n o l o g y ，j i a n g n a nu n i v e r s i t yd u r i n gt h e a c a d e m i cp e r i o d2 0 0 6 2 0 0 9 if u r t h e rd e c l a r et h a tt h i sw o r kh a sn o tb e e ns u b m i t t e dt o a n yo t h e ru n i v e r s i t ya n d o rr e s e a r c hi n s t i t u t i o nf o rc o n s i d e r a t i o na n d o ra w a r do fa d e g r e ea n d o ra c a d e m i cq u a l i f i c a t i o n s i g n a t u r e d a t e w o k a d a l a0 b i r oc u t h b e r t 似s c c a n d i d a t e ) c e r t i f i c a t i o n t h i si st oc e r t i f yt h a tt h er e p o r tp r e s e n t e dh e r e i ne n t i t l e d “s t u d i e so nt h ep h a s e o l u s v u l g a r i sa l p h a - a m y l a s e i n h i b i t o rf r o m s p e c k l e dk i d n e yb e a n s ：p o t e n t i a l f o r n u t r a c e u t i c a la p p l i c a t i o n s u b m i t t e db yo n em r w o k a d a l ao b i r oc u t h b e r tf o rt h e r e q u i r e m e n t so ft h ea w a r do ft h ed e g r e eo fm s c i nf o o ds c i e n c ea n dt e c h n o l o g yi s b a s e do nt h er e s u r so fw o r k sc a r d e do u tb yh i mi nt h es t a t ek e yl a b o r a t o r ys c h o o lo f f o o ds c i e n c ea n dt e c h n o l o g y ，j i a n g n a nu n i v e r s i t y ，w u x i c h i n ap ru n d e rm y g u i d a n c ea n ds u p e r v i s i o nd u r i n gt h ea c a d e m i cs e a s o n2 0 0 7 2 0 0 9 ic e r t i f yf u r t h e rt h a t n e i t h e rt h er e s e a r c hr e p o r tn o ra n yp a r tt h e r e o fh a sb e e ns u b m i t t e dp r e v i o u s l yf o r c o n s i d e r a t i o na n d o ra w a r do fa n yo t h e rd e g r e e s i g n a t u r e d a t e p r o f e s s o rb oj i a n g ( s u p e r v i s o r ) i a c k n o w l e d g e m e n t s a c k n o w l e d g e m e n t s f o rm et oc o m p l e t et h e s es t u d i e ss e v e r a lp e o p l eh a v ec o n t r i b u t e ds i g n i f i c a n t l ya n d t h e r e f o r eia mg l a dt oa c k n o w l e d g et h e mh e r e ia mg r a t e f u lt ot h eg o v e r n m e n t so fu g a n d aa n dp e o p l e sr e p u b l i co fc h i n af o ro f f e r i n g m et h eo p p o r t u n i t yb ep a r to ft h i se x c h a n g ep r o g r a m ia me n t i r e l yg r a t e f u lt op r o f e s s o rb oj i a n g ，d rt a oz h a n g ，a n dd rm uw a n m e n gf o r p r o v i d i n ge n c o u r a g e m e n ta n da d v i c e i nc a r r y i n go u tt h i sr e s e a r c h a l l o wm et o s p e c i f i c a l l ye m p h a s i st h ec o n s i d e r a b l er o l ep l a y e db yd rz h a n gt a oi np r o v i d i n g g u i d a n c ed u r i n gm yr e s e a r c h ，f o rt h a ta mg r e a t l yi n d e b t e d a mm o s tg r a t e f u lt om yl a b o r a t o r yc o m r a d e se s p e c i a l l yj i aj i a n g h u a ，l i uz h u ，h u ay i n g ， c h e nc h a o ，c h e n gl i f a n g ，h u a n gw e n x i a , l iy u n g a o ，m i a om i n g ，w a n gq i n g x i n ，s u n t a o ，x i a os h u i ，z h a n gl o n g t a o ，w a n g g u eh u a ，l uz h e n r o n g ，m a y u nh o n g ，m ac h a n g ， y u a ns h i f a n g ，s h i g u ec h a n ga n do t h e r sw h op r o v i d e dm ew i t hc o n s i d e r a b l yi m m e n s e a d v i c ea n dg u i d a n c ei nt h em a n yo f t h es t a g e so f m yw o r k 1w o u l dl i k et ot h a n kt h es c h o o lo fi n t e r n a t i o n a le d u c a t i o nf o rt h ee n d u r i n ge f f o r t sm e y p u ti nt r y i n gt om a k em ys t a yi nt h eu n i v e r s i t ym o r ea c a d e m i c a l l yf r i e n d l ya n d c o n d u c i v e 1w o u l dl i k et ot h a n kf e l l o wi n t e r n a t i o n a ls t u d e n t sf o rt h ec o n d u c i v ee n v i r o n m e n tt h e y p r o v i d e dd u r i l 坞m ys t u d i e s ia mi n d e b t e dt od r a r c h i l e on 。k a a y aa n da l lt h es t a f fo fm a k e r e r eu n i v e r s i t y d e p a r t m e n to ff o o ds c i e n c ea n dt e c h n o l o g yf o ri n t r o d u c i n gm e t ot h i sw o n d e r f u lf i e l d i i i n t r o d u c t i o na n dl i t e r a t u r er e v i e w c i 御t e r1 i n t r o d u c t i o n & l i t e r a t u r er e v i e w l 1 1 i n t r o d u c t i o n ：k i d n e yb e a ns t a r c hb l o c k e r s k i d n e yb e a n s ( p h a s e o l u sv u l g a r i sl ) a l ea m o n g t h ew o r l d sg r a i nl e g u m e sm o s t u s e df o rd i r e c th u m a nc o n s u m p t i o n l t h ek i d n e yb e a n 伍一a m y l a s ei n h i b i t o ri s o f o r ml ( a - a l1 ) ，o n eo ft h e i rn o n - n u t r i t i v eb i o a c t i v ef a c t o r s 2 ，d i s c o v e r e di n1 9 4 5b yb o w m a n ，h a s b e e ne x t r a c t e da n du s e di ns e v e r a lc o m m e r c i a la n t i - o b e s i t ya n da n t i - d i a b e t e sp r o d u c t s r e f e r r e dt o 嬲s t a r c hb l o c k e r s as t a r c hb l o c k e ri sas u b s t a n c et h a ti n t e r f e r e sw i t ht h e b r e a k d o w no fc o m p l e xc a r b o h ) 7 & a t el e a d i n gt oa 。r e d u c e dd i g e s t i b i l i t yo rp r o l o n g e d d i g e s t i o ns u c ht h a te n e r g yd e r i v e df r o mt h ec a r b o h y d r a t ei s r e d u c e do rt h er a t eo fb o d y a b s o r p t i o no ft h ee n e r g yi nf o r mo fg l u c o s ei sr e d u c e d 4 i nt h e19 8 0 s ，u s eo ft h es t a r c h b l o c k e r sf r o mk i d n e yb e a n st oc e n t r e lo b e s i t ya n dd i a b e t e sw a sar e s e a r c hi s s u e ，b u ti t h a sp r e s e n t l yr e e m e r g e dw i t he f f o r t sb e i n gt a k e nf o ri t sc o n s i d e r a t i o na s g e n e r a l l y r e g a r d e da ss a f e ”d e t a i l e di n v e s t i g a t i o n sr e v e a l e dt h a tm a n yo ft h ec o m m e r c i a l l y a v a i l a b l ea m y l a s ei n h i b i t o re x t r a c t s ( s t a r c hb l o c k e r s ) f a i l e dt oi n f l u e n c es t a r c hd i g e s t i o n d u et ol o wa - 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