（食品科学专业论文）保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶合成共轭亚油酸研究.pdf

保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶合成共轭亚油酸研究 摘要 共轭亚油酸( c o n j u g a t e d el i n o l e i ea c i d ，c l a ) 是具有共轭双键的1 8 个碳 原子的不饱和脂肪酸。c l a 具有一系列的位置和几何异构体，其中c 9 ，t 1 1 c l a 和t 1 0 ，c 1 2 c l a 两种异构体被认为最具有生物活性，研究发现这两种异构体 具有抗肿瘤、抗粥样动脉硬化、减肥、免疫调节、抗糖尿病等功能。共轭亚油 酸天然存在较少，主要靠人工合成，生物法合成共轭亚油酸具有反应条件温和， 异构体成分单一的优点，可用于食品和药品的添加，而亚油酸异构酶做为合成 中的重要酶近年来成为研究的热点。 本文以保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶为研究对象，首先在产物分析鉴定的 基础上，对保加利亚乳杆菌诱导产酶条件进行了研究，其次研究酶的分离纯化 条件和酶学性质，并对酶的反应体系进行了初步研究。 气质联用色谱和液相色谱检测结果表明：保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶可 以合成c l a ，其中含有两种异构体，主要产物为c 9 ，t 11 。c l a 。 诱导产酶条件研究表明，在脱脂乳培养基中添加1 5 o ( v v ) l a 所产酶的共 轭亚油酸转化率最高；温度为3 6 ，培养3 6 h 为较适的培养条件；单独添加0 1 ( m v ) 的乳糖或0 1 ( m v ) 的氯化钠有利于诱导产酶：在培养基中直接添加l a 的效果优于培养3 至1 2 h 后再进行添加。 亚油酸异构酶的最佳提取条件为，以o 7 ( m v ) 的量添加溶菌酶( 3 0 。c ， 1 h ) ，然后在冰水浴中超声破碎( 超声3 s ，间歇4 s ，9 0 次，功率4 0 0 w ) 。粗酶 液经过4 0 , - - , 8 0 饱和度的硫酸铵进行盐析，m i l l i p o r e 超滤管进行超滤，s e p h a d e x g 1 0 0 凝胶过滤层析的步骤进行分离纯化后，酶的纯化倍数达到5 1 7 倍，比活 力为2 4 4 7 8 u r a g 。纯化后的亚油酸异构酶在s d s p a g e 电泳中只有一条条带， 达到电泳纯度，分子量为4 2 6 9 k d a 。 亚油酸异构酶的酶学特性表明：保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶的最适反应 温度为4 0 c ，在2 0 一4 0 c 范围内酶有较高的稳定性；最适反应p h 值为4 0 ， p h 值在3 0 - - - 6 0 范围内有较高的稳定性；低浓度( 0 0 1 m o l l ) 的金属离子 c a 2 + , z n 2 + ，m 9 2 + 可利于亚油酸异构酶的催化反应，其影响顺序分别为 c a 2 + z n 2 + m 9 2 + ；高浓度( 0 0 2 t o o l l ) 的s d s 有利于亚油酸异构酶的纯化反应； 以亚油酸为底物的酶促反应动力学方程得到，k i n = 3 8 7 m m o l l ， v m a x = 4 3 5 m m o l m l h 。 亚油酸异构酶反应体系初步研究表明：保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶在缓 冲液体系下c l a 转化率最高；正己烷适合为亚油酸异构酶非水体系反应的介 质；微水体系在正己烷中添加0 6 的缓冲液的反应体系亚油酸异构酶的c l a 转化率较高；在两相体系中正己烷与缓冲液的配比为6 ：4 时，亚油酸异构酶的 c l a 转化率较高；乙醇不适合做为均相体系的介质。 关键词：共轭亚油酸亚油酸异构酶保加利亚乳杆菌生物合成 l i o n l e i ca c i di s m e r a s eo fl a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u sb i o s y n t h e s i z ec o n ju g a t e dl i n o l e i ca c i d a b s t r a c t c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ( c l a ) w a sao c t a d e c a d i e n o i ca c i d ( cl8 ：2 ) c o n t a i n i n g c o n u g a t e dd o u b l eb o n d s c l ah a dat e r mo fp o s i t i o n a la n dg e o m e t r i ci s o m e r s t w o o ft h ei s o m e r s ，c i s 一9t r a n s - 11a n dt r a n s 一10e i s 一12 ，c o u l dc o n f e ran u m b e ro f b e n e f i c i a lb i o l o g i c a le f f e c t t h et w oi s o m e r s ，t h a tw e r ea t t e n e da th o m ea n da b r o a d ， s h o wt o a n t i n e o p l a s m ，a n t i - a t h e r o s c l e r o s i s ，r e d u c ef a t ，i m m u n om o d u l a t i o ， d i a b e t e sm e l l i t u se c t m e t h o do fb i o c o n v e r s i o nc a np r o d u c ep u r ec l af r o ml a w i t hs i n g l ei s o m e ra tl i g h t d u t yt e s t t h em e c h a n i s mw a st h a tt h ee x i s t e n c eo f l i n o l e a t ei s o m e r a s ee n z y m ec o n v e r tl i n o l e i ea c i dt oc l a s ot h es t u d yo fl i n o l e a t e i s o m e r a s ee n z y m eh a db e e nt h ef o c u so fc o n s i d e r a b l er e s e a r c he f f o r t si nr e c e n t y e a r s t h er e s e a r c hl a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u st oe x t r a c tl i n o l e i ca c i d i s o m e r a s e b a s i co nd e t e c t e dt h ep r o d u c to fl i n o l e i ca c i di s o m e r a s e ，p r o d u c t i o n c o n d i t i o nf o rl i n o l e i ca c i di s o m e r a s ew i t hl n c t o b a c i l l t l sd e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u sw e r ei n v e s t i g a t e d t h e ns t u d i e dp u r i f i c a t i o no fl i o n l e i ci s m e r a s e i n l a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u s ，a n d s o m eo ft h ee n z y m a t i cp r o p e r t i e p r e l i m i n a r yr e s e a r c ho nr e s p o n s es y s t e m t h r o u g hac o m b i n a t i o no ft o wd e t e c t i o nm e t h o d s o fg c m s ，a 矿- h p l c ， d e t e r m i n e dt h em a i np r o d u c to fc l aw h i c hh a dt o wi s o m e r ，a n dm a i n l yc o n t a i n e d c 9 ，t 1 1 一c l a t h ep r o d u c t i o nc o n d i t i o nf o rl i n o l e i ca c i di s o m e r a s e w i t hl a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u sw e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eh i g h e s t y i e l dw a so b t a i n e dw h e n1 5 0o fl a ( v v ) w a sa d d e d t ot h em e d i u m t h eo p t i m u m c o n d i t i o nf o rl a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u sc u l t u r ew a ss h o w na s f o l l o w s ：t e m p e r a t u r ew a s3 6 a n dt i m e w a s3 6h i n d i v i d u a l l ya d d i n g0 1 ( m v ) o fl a c t o s e ，o r0 1 ( m v ) o fn a c l w a sa d d e dt o m e d i u m ，r e s p e c t i v e l y ， l i n o l e i ca c i di s o m e r a s ew h i c hw a sf a v o rt op r o d u c i n gc l aw a so b t a i n e di ng o o d y i e l d t h er e s u l t so fl aa d d e dd i r e c t l yt om e d i u m w a sf a v o rt ot h a to fl aa d d e dt o m e d i u mw h e nb a c i l l u sh a dc u l t r u e d3h t o12h t h eo p t i m u mc o n d i t i o no fe x t r a c tw a st h a tf r i s tm i xg e n t l yw i t ho 7 ( m v ) l y s o z y m ep o w d e ra n di n c u b a t i n g f o rl ha t3 0 c ，t h ec e l l sw e r ed i s r u p t e db y s o n i c a t i o nf o r10 r a i na tp o w e r4 0 0 ww o r k i n g3 sa n dr e s t i n g4 si n0 * c t h eo p t i m u m s a t u r a t i o no fa m m o n i u ms u l p h a t ef o rl i n o l e a t ei s o m e r a s ew a s4 0 - 8 0 u s e da n 1 1 1 a m i c o nc e n t r i f u g a lf i l t e ru n i tf i t t e dw i t hac e n t r i p l u s 15m e m b r a n eo f30k d a n o m i n a l w e i g h t c u to f ff o r p r o t e i n s e p h a d e x g 一10 0 g e l f r a c t i o n a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ，a c h i e v i n ga no v e r a l lp u r i f i c a t i o no f5 17 f o l da n das p e c t i c a c t i v i t yo f2 4 4 7 8 u m g 】t h ep u r i f i e de n z y m ew a sas i n g l ed i s t i n c tp r o t e i nb a n d b ys d s p a g e ，w i t ha l le s t i m a t e dm o l e c u l a rw e i g h to fa b o u t4 2 6 9 k d a s o m eo ft h ee n z y m a t i cp r o p e r t i e sw e r et h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo fl i o n l e i c i s m e r a s ew a s4 0 ，t h ei s m e r a s ee x h i b i t e dh i g hs t a b i l i t yu n d e rt h ew a t e rb a t ho f 2 0 c - - 4 0 c t h eo p t i m u mp ho fl i o n l e i ci s m e r a s ew a s4 0 w i t h i np hv a l u e s r a n g ef r o m3 0t o6 0 ，t h ei s m e r a s ee x h i b i t e dh i g hs t a b i l i t y s a m em e t a li o n ss u c h a sc a 2 + , z n 2 + ，m 9 2 + a tl o wc o n c e n t r a t i o n ( o 0 1 m o l l ) p o f i tl i o n l e i ci s m e r a s e e f f c t w a sc a 2 + z n 2 + m e 2 + s d sa t h i g hc o n c e n t r a t i o n ( 0 0 2 m o l l ) p o f i tl i o n l e i c i s m e r a s e u s i n gl a a ss u b s t r a t e ，t h ek mo fl i o n l e i ci s m e r a s ew a s3 8 7 m m o l l ，t h e v m “w a s4 3 5 m m o l l h r e s e a r c ho nr e s p o n s es y s t e mo fl i o n l e i ci s m e r a s ei nl a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c 幻j s u b s pb u l g a r i c u s l i o n l e i ci s m e r a s ei nl a c t o b a c i l l u sd e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u s i np o t a s s i u mp h o s p h a t eb u f f e rs y s t e mw a so p t i m i z e d h e x a n ew a ss u i tt ou s ea s o r g a n i cm e d i u m a tm i c r o w a t e rm e d i u ma d d i n g0 6 p o t a s s i u mp h o s p h a t eb u f f e r p o f i t l i o n l e i ei s m e r a s e t h eb e n e f i tc o n d i t i o ni nt w o - p h a s em e d i u mo nt h e c o n v e r s i o no fc l a b yl i n o l e a t ei s o m e r a s et w o p h a s ev o l u m er a t i oo fh e x a n ea n d b u f f e rw a s6 ：4 e t h a n o lw a sh a r m f u lt ol i n o l e a t ei s o m e r a s ea n dd i d n tf i tf o ru s i n g i nh o m o g e n e o u s - p h a s em e d i u m k e yw o r d ：c o n j u g a t e d l i n o l e i e a c i d ；l i n o l e a t ei s o m e r a s e , l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u s ；b i o s y n t h e s i z e i v 插图清单 图1 1 亚油酸和两种主要共轭亚油酸结构图1 图2 1c l a 最大吸收波长扫描图1 0 图2 2c l a 标准曲线1 0 图2 3 蛋白质标准曲线1 1 图2 4 气质联用色谱检测及质谱图13 图2 5a 矿高效液相色谱检测图1 4 图2 6l a 的添加量对c l a 产率和生物量的影响1 5 图2 7 温度对c l a 产率和生物量的影响1 5 图2 8 培养时间对c l a 产率和生物量的影响1 6 图2 9 添加微量物质对c l a 产率和生物量的影响1 6 图2 1 0l a 的添加时间对c l a 产率和生物量的影响1 7 图3 1 溶菌酶的添加量对亚油酸异构酶比活力的影响2 4 图3 2 超声波破碎对亚油酸异构酶比活力的影响2 5 图3 3 保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶的s e p h a d e xg 一1 0 0 凝胶过滤层析图。2 7 图3 4 亚油酸异构酶的s d s - p a g e 图。2 8 图3 5 标准蛋白相对分子量与相对迁移率r f 的关系2 8 图3 6 温度对亚油酸异构酶活力的影响2 9 图3 7p h 对亚油酸异构酶活力的影响2 9 图3 8 亚油酸异构酶的热稳定性3 0 图3 9 亚油酸异构酶的酸碱稳定性3 0 图3 1 0 不同金属离子对亚油酸异构酶活性的影响3 1 图3 11 不同有机试剂对亚油酸异构酶活性的影响3 1 图3 1 2 亚油酸异构酶的l i n e w e a v e r - b u r k 图3 2 图4 1 有机溶剂对亚油酸异构酶转化c l a 的影响3 6 图4 2 微水含量对亚油酸异构酶转化c l a 的影响3 6 图4 - 3 两相体系中两相体积比对亚油酸异构酶转化c l a 的影响3 7 图4 4 均相体系中两相体积比对亚油酸异构酶转化c l a 的影响3 8 图4 5 四种反应体系对c l a 转化率的影响3 8 v i 表格清单 表2 1 蛋白质标准曲线绘制加样表1 l 表3 1 溶菌酶添加量对亚油酸异构酶分离纯化影响2 4 表3 2 超声波条件对亚油酸异构酶分离纯化的影响2 5 表3 3 硫酸铵分级盐析2 6 表3 4 保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶的分离纯化2 7 表4 1 有机溶剂的l o 妒( 疏水常数) 。3 6 i x 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得 佥目垦王些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签字。督睦 签字日期：2 0 1 0 年4 月2 6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金目墨王些态堂有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人 授权 金目垦王些盘堂 可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名：罢芦锰 i 签字日期：2 0 1 0 年4 月2 6 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字日期：2 0 1 0 年4 月2 6 日 电话： 邮编： 致谢 本论文是在导师王武副教授的悉心指导和耐心帮助下完成的。从论文的选 题、实验方案的设计、研究工作的开展以及论文的的审阅无不凝聚了导师的智 慧和心血。王老师在论文的研究思路和研究方法方面给予了建设性的意见，开 阔了我的研究思路。我从王老师身上看到的不仅是认真严谨的治学态度、踏实 勤奋的工作作风，更看到了王老师对工作、教育事业顽强执著的精神，积极进 取、豁达乐观的人生态度，以及待人接物的坦诚与宽容。在论文完成之际，谨 向王老师致以最衷心的感谢和祝愿! 衷心感谢食品科学与工程教研室以及实验室的各位老师，在我整个实验与 学习过程中给予的悉心帮助和无私教导。尤其感谢陈从贵教授、王泽南教授、 孙汉巨副教授、周存六副教授、陆剑锋副教授、林琳副教授、潘丽华老师、吕 顺老师、韩卓老师、操丽丽老师、方红美老师，感谢各位老师对我的帮助和指 导，在此向他们表示诚挚的感谢! 在学习期间，离不开周围许多同学们对我的帮助和支持。感谢沈君臣、杨 波、王锐、焦道龙、张伟伟、李洪波、唐晓明、宋俊骅等同学在实验期间对我 的帮助。特别感谢我的好姐妹张安、程丽梅、易守连、范婷婷、孟凡丽长期以 来对我关心和支持，使我的平淡的学习生活充满了活力和色彩。感谢已毕业的 付敏师姐，把我引到入课题，在课题开始给予我许多帮助。还要感谢我的师弟 师妹们，感谢张静、丁琦、江京、查甫本、李琪玲，以及已毕业的0 4 、0 5 级本 科生们，感谢他们对我的支持和帮助。 最后还要感谢我的父母，感谢父母对我的养育之恩，感谢他们对我默默地 支持和鼓励。 毕业论文将要完成，也标志着我在合肥工业大学学习生活将要结束。在这 七年的时光中有太多美好的回忆，将成为我一生中受之无穷的财富。感谢这七 年来所有关心和帮助过我的朋友们! 由于本人知识水平有限，难免论文中存在不妥和不足之处，敬请各位专家、 老师批评指正。 v 郑钰 2 0 l o 年4 月2 6 日 第一章前言 共轭亚油酸( c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ，简称c l a ) 是指一系列具有共轭双键的1 8 个碳原子的不饱和脂肪酸的位置异构和几何异构的总称【l 】【2 1 。共轭亚油酸的双键 在碳链上有多种排列位置的方式，一般认为c l a 有1 6 种异构体形式，共轭双 键起始于羧基端的第8 、9 、1 0 、1 1 位碳原子，其主要的位置异构体有4 种： 8 ，1 0 - c l a 、9 ，1 1 c l a 、1 0 ，1 2 c l a 和1 1 ，1 3 - c l a 。由于共轭双键两端的碳原 子都存在着顺式( e i s ) 和反式( t r a n ) 两种几何异构型，因此每种位置异构又具有4 种几何异构体。研究表明，在共轭亚油酸的多种异构体中c 9 ，t l l - c 1 8 ：2 和t 1 0 ， e 1 2 。c 1 8 ：2 最具有生理活性，是天然存在与人工合成的主要异构体，其结构如 图1 1 所示【3 1 。 薏孽亚涟酸 m 粼 瓤i l t - l & 2 ) ”涡 船酸w 弥n 一 l 嗷1 2 伊l 翰 一 ”一一、o h 图1 1 亚油酸和两种主要共轭亚油酸结构图 f i 9 1 1s t r u c t u r eo fl i n o l e i ca c i da n dt w om a i ni s o m e r so fc o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d 1 1 共轭亚油酸的生理功能 共轭亚油酸具有抗癌、抗粥样动脉硬化、减肥、增强免疫、抗糖尿病、改 善骨组织代谢等多种生理功能，而异构体以c 9 ，t 1 1 - c 1 8 ：2 和t 1 0 ，c 1 2 - c 1 8 ： 2 形式存在的共轭亚油酸生理活性最强。因此越来越多的食品、药品中添加以 共轭亚油酸使其具有一定的保健功能。 ( 1 ) 抗癌作用 在共轭亚油酸的各种异构体中，主要以c 9 ，t 1 1 一c 1 8 ：2 和t 1 0 ，c 1 2 一c 1 8 ：2 两种 形式具有抗癌功能。动物实验表明【4 】：共轭亚油酸可以减少致癌物引起的前胃 癌、乳腺癌、皮肤癌和结肠癌等癌症。用含共轭亚油酸的食物喂养老鼠可以较 好地防止肿瘤的生成。 ， 抗癌作用机理主要有以下几方面【5 】：由于共轭亚油酸对组织的抗氧化作 用使其具有了抗癌的作用；共轭亚油酸的共轭双键系统对癌细胞具有一定的 毒性，能抑制癌细胞的核酸和蛋白质的生物合成，使其无法生成而对正常细胞 产生破坏；共轭亚油酸可与鼠前胃赘瘤细胞的磷脂和人类乳房肿瘤细胞结合， 可抑制癌细胞的生长；共轭亚油酸可抑制致癌物质二甲基苯葸形成中间产物 细胞色素p 4 5 0 ，会使皮肤癌受到抑制。 ( 2 ) 抗动脉粥样硬化作用 共轭亚油酸具有抗动脉粥样硬化和预防冠心病的功能。一些研究表明【6 l ， 养喂含共轭亚油酸饲料的田鼠和兔子，其主动脉壁上的病灶会逐渐变小变薄， 血液中总胆固醇水平较低，大动脉中动脉硬化的概率小。 研究认为 7 1 ，共轭亚油酸通过活化和结合过氧化物酶体增生因子，激活受 体a ( p p a r a ) 来调节脂质代谢。而在细胞外水平上，过氧化物酶体增生因子诱 导促血清脂质减少的作用，可能是由于脂蛋白脂肪酶增加对乳糜微粒和极低密 脂蛋白颗粒中的甘三酯水解的结果。也有证据表明血浆中的甘三酯的清除过程 受到过氧化物酶体增生因子的调节作用。 ( 3 ) 减肥作用 共轭亚油酸可以诱导利用脂肪酸并导致体重下降，且不储存脂肪。共轭亚 油酸能够降低白色脂肪组织和肝中脂肪酸的增殖及三酰基甘油酯的水平。 共轭亚油酸的减肥机理可能有以下几方面【4 】：共轭亚油酸是一个很好的 过氧物酶体增殖活化受体( p p a r a ) 的催化剂和配位体，可以促进脂类代谢； 共轭亚油酸进入脂肪细胞可以使其脂质蛋白脂酶的活性下降，细胞内三酰基 甘油的浓度减少，使游离出来的脂肪酸进入脂肪组织中；共轭亚油酸可以显 著增加脂肪组织以及肌肉中的肉毒碱棕榈酰基转移酶( c t p ) 的活性，而线粒 体中脂肪酸氧化的指标可提高脂肪酸燃烧的活性。 ( 4 ) 免疫作用 共轭亚油酸的免疫作用可能与其能促进脾的白介2 2 细胞和t 细胞的繁殖 有关【引。动物营养学的研究中，在饲料中添加一定量共轭亚油酸可以有效的降 低免疫刺激导致的动物生长抑制。此外，共轭亚油酸还能够促进细胞分裂，阻 止肌肉退化，以延缓机体免疫能力衰退。 ( 5 ) 抗糖尿病作用 共轭亚油酸在动物实验中显示出很好的抗糖尿病活性【9 】。其作用机理可能 与高效胰岛素致敏剂噻唑烷基二酮类药物类似。可通过激活肝中的类固醇受体 的亚型过氧化物增殖体活化受体( p p a r a ) ，参与基因表达调控，调节血糖浓度，从 而可以改善i i 型糖尿病人对胰岛素的抗药性。 ( 6 ) 改善骨组织代谢作用 共轭亚油酸可以促进软骨组织细胞合成，促进骨组织分裂和再生及矿物质 在骨组织中的沉积：共轭亚油酸能增加大鼠骨骼形成的速率，对骨质疏松、风 湿性关节炎都有一定的缓和作用。l i 和w a t k i n s 的研究表明 1 0 1 , 在食物中补充 共轭亚油酸后，骨骼中的共轭亚油酸含量会高于其他组织中的含量，且花生四 烯酸的含量稍有下降。在颈骨及大腿骨细胞培养介质中加入共轭亚油酸，将明 显降低p g e 2 的合成，低浓度的p g e 2 可促进骨骼的形成。共轭亚油酸对骨骼形 成的促进作用可能与其对食物摄取效率及身体组成的影响相关联。 2 1 2 共轭亚油酸的检测方法 共轭亚油酸根据其特性，检测方法主要有紫外分光光度法( u v ) 、气质联用 色谱检测法( g c - m s ) 、高效液相色谱法( h p l c ) 等。这些方法各有优缺点，下面 简单的介绍三种共轭亚油酸的检测方法。 1 2 1 紫外分光光度法 紫外分光光度法是检测共轭亚油酸较为简便的方法，其原理是利用共轭亚 油酸中的共轭双键在2 3 3 n m 的波长下有较大的特征吸收峰，而作为底物的亚油 酸在该波长下不具有吸收峰，因此可以快速的测定共轭亚油酸【l l 】的含量。但是 此方法只能检测共轭亚油酸的总含量，不可以分析检测共轭亚油酸中各种异构 体的含量。 1 2 2 气质联用色谱检测法 气质联用色谱是脂肪酸检测的常见方法，它主要根据脂肪酸的极性进行分 离，具有灵敏高效的特点。气质联用色谱检测分析方法对色谱柱的要求较高， 需要强极性的毛细管柱，并且柱子的长度越长其分离效果越好【l2 1 ，如c p s i l 8 8 t m ( 1 0 0 m x o 2 5 m m x 0 2 i j m ；c h r o m p a c kl t d ) ，s p - 2 5 6 0 ( 1 0 0 m x 0 2 5 m m x 0 2 “m ； s u p e l c oi n c ，b e l l e f o n t e ，p a ) ，b p x 7 0 ( 1 2 0 m x 0 2 5 m m x o 2 5 1 x m ；s o e ) 。在气相毛细 管柱中分离共轭亚油酸几何异构体的出峰顺序依次为c t 、t c 、c c 和t t 。其中主 要的异构体出峰顺序为，c 9 ，t 1 1 - c l a 、t 8 ，e 1 0 c l a 、c 1 1 ，t 1 3 c l a 、t 1 0 ，e 1 2 c l a 、 c 9 ，c 1 1 - c l a 、t l1 , t 1 3 一c l a 。 气质联用色谱检测与气相检测的主要区别在于检测器的不同。气质联用中 的质谱检测器相对于气相中使用的f i d 检测器，具有更高的灵敏度，并且可通 过分出的每个峰的质谱来分析推测一些未知的成分。因此近年来气质联用色谱 检测以成为重要的共轭亚油酸检测方法。 共轭亚油酸在进行检测中需要将其进行甲酯化，以降低脂肪酸的挥发温度， 甲酯化的方法有酸催化、碱催化和三甲基硅重氮甲烷t m s 法【1 3 1 。不同的甲酯 化方法会影响共轭亚油酸异构体中的共轭双键位置的转移和构型的改变。研究 表明【1 4 】，共轭亚油酸在2 的h 2 s 0 4 甲醇，5 5 ，1 0 r a i n 甲酯化率最高且双键 的发生转移较少。由于在气质联用色谱检测需经过甲酯化过程，而甲酯化过程 中会影响异构体的共轭双键移位是不可避免的，会影响各种异构体的含量的测 定，故气质联用色谱检测共轭亚油酸异构体含量可能受甲酯化条件的影响。 1 2 3 高效液相色谱法 高效液相色谱常常应用于有机物的分析，但使用一般的色谱柱来分析异构 体组成复杂的共轭亚油酸十分困难，而利用银离子能与碳碳双键的兀电子作用， 形成可逆的强极性复合物的特性，使用银离子高效液相色谱法a g + - h p l c 能较好 的分析c l a 异构体【1 8 】【1 9 1 。在分析过程中需要若干根串联的银离子柱可以显著 提高c l a 位置和几何异构体的分离效果，随着串联色谱柱的增加( 从一根到六 根) ，其分离效果逐步提高。e u l i t z 用3 根串联的a g n 0 3 ( 4 6 m mi d x 2 5 0 m m ，粒 度5 9 m ) 柱子，除了不能将1 0 c ，1 2 t c l a 和1 0 t ，1 2 c c l a 以及8 c ，1 0 t c l a 和 9 t ，l l c c l a 分开，其余各种异构体均能分开【2 0 】。几何异构体按t , t 、e t 、c ，c 的先 后次序洗脱，在每一组几何异构体中，位置异构体按1 1 ，1 3 、1 0 ，1 2 、9 ，1 1 、8 ，1 0 的 先后次序洗脱。8 ，1 0 和9 ，1 1 c l a ，c ，t 比t , c 先洗脱出来，而1 1 ，1 3 c l a 正好相反。 但由于银离子柱的造价较高且使用寿命有限，依靠增加柱子的数量来提高分离 效果的手段，在一般实验条件下并不可行。 1 3 共轭亚油酸的合成 天然的具有活性的共轭亚油酸主要存在于瘤胃动物的肉和乳脂里，含量甚 微，难以富集，且异构体成分复杂难以纯化。因此共轭亚油酸的获得基本靠人 工合成，合成的主要方法有化学合成和生物合成两种。 1 3 1 化学合成法 常见的化学合成共轭亚油酸的方法有异构化法、脱水法、溴化脱溴化氢法 等，得到的多是共轭亚油酸异构体的混合物，通过采用低温重结晶、液相色谱 法等才能对粗产物加以分离1 2 2 1 。但是化学合成得到的产物是一系列c l a 几何 异构体的混合物，除含c 9 ，t 1 1 - c l a 和t l o ，c 1 2 c l a 外，还有一些环化等副产物 存在，分离提纯非常困难。此外，化学合成会产生t , t 异构体，研究发现这类异 构体对人体有害，但在化学合成中很难避免其生成。 1 3 2 生物合成法 由于化学合成法具有以上一些弊病，影响了共轭亚油酸在医药和食品中的 应用。而微生物酶催化转化法所需的反应条件较为温和、生成的共轭亚油酸异 构体较为单一，逐渐得到人们的重视，目前己发现多种微生物可以将亚油酸转 化为共轭亚油酸。 合成共轭亚油酸机理是由于亚油酸对微生物的生长具有一定的抑制作用， 革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对亚油酸更为敏感，亚油酸使微生物细胞质质膜 的渗透性发生改变抑制了细胞生长，因此认为微生物细胞产生亚油酸异构酶可 将亚油酸转化为共轭亚油酸，则是细胞反抗抑制的一种表现。而这些微生物能 够将亚油酸转化为共轭亚油酸是由于该微生物能在细胞内生成亚油酸异构酶， 是转化亚油酸的特异性酶。 亚油酸异构酶可来源于多种微生物如乳酸杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、丙酸杆菌 属( p r o p i o n i b a c t e r i u m ) 、真杆菌属( e u b a c t e r i u m ) 、丁酸弧菌属( b u t y r i v i b r i o ) 等。 其乳酸杆菌属、真杆菌属、丁酸弧菌属中具有能产生c 9 ，t 1 1 - c l a 的亚油酸异构 酶，丙酸杆菌属还同时具有能产生t l o , e 1 2 一c l a 的亚油酸异构酶【2 3 1 。l i nt y 【2 副 等在脱脂乳培养基中加入l m g m l 和5 m g m l 的亚油酸，分别接入嗜酸乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s ) 、德氏乳杆菌乳酸亚种( l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i i 4 s p 1 a c t i c u m ) 、德氏乳杆菌保加利亚亚种( l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i i s p b u l g a r i c u s ) 、 嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 、乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i s ) 菌种进 行培养，发现嗜酸乳杆菌形成的共轭亚油酸量最多。张中义【3 1 儿3 2 】从酸菜汁中分 离筛选到一株产共轭亚油酸能力较高的乳酸菌，经鉴定为植物乳杆 l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ，微氧条件可提高c l a 的产量，催化亚油酸l a 生成c l a ，生 成的c l a 产物为c 9 ，t l l t 9 ，c 1 1 c l a 和t 1 0 ，c 1 2 c l a 异构体的混合物。曹健【2 6 】等研 究表明，嗜酸乳杆菌产酶的最佳培养条件为：脱脂乳培养基，并添加1 乳糖和 1 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，接种量1 ( 5 x 1 0 8 个m l ) ，培养温度3 7 ，培养时间为3 6 h ，此外 添加0 1 l a 、i n a c l ，以及卵磷脂、低分子量乳清蛋白等能促进亚油酸异构 酶的合成。 德氏乳杆菌保加利亚亚种( l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i i s p b u l g a r i c u s 简称保加 利亚乳杆菌) 为革兰氏阳性菌，属于乳酸杆菌属。多种研究表明【2 引，保加利亚 乳杆菌可将亚油酸转化为共轭亚油酸，可作为亚油酸异构酶的产生菌株从中提 取亚油酸异构酶。寇秀颖【2 9 】【3 0 】以保加利亚乳杆菌l d b 2 为研究对象进行发酵培 养，测试了接种量、底物浓度、金属离子以及培养时间等，对菌株产共轭亚油 酸产量的影响，表明保加利亚乳杆菌可转化l a 合成共轭亚油酸。而张浩【36 j 等人 则对保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶进行研究，研究了亚油酸异构酶的提取和性 质。其中通过单因素和正交试验得出保加利亚乳杆菌最佳破碎条件，并通过硫 酸铵盐析、超滤、凝胶过滤层析等步骤进行分离纯化得酶的纯化倍数2 3 o o ，测 得分子量约为3 0 k d ，文章对保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶的部分酶学性质进行 了研究，结果表明该酶能专一地转化为共轭亚油酸。 1 4 研究意义与内容 1 4 1 研究意义 基于对共轭亚油酸生理活性的认识，共轭亚油酸已越来越多的应用于功能 性食品、保健品及药品等领域。作为功能性食品的添加剂，可以人为地在某些 人类经常使用的食物中添加一定量的共轭亚油酸，以弥补人体摄入共轭亚油酸 的不足，增强人体的免疫力。在保健品的应用中，共轭亚油酸作为动物的次生 代谢产物是天然的，可定量的经常性食用，对人体有益无害。在药用领域，尽 管其作用机理还不十分明确，也未实现临床的实验，但其抗癌和抗粥样动脉硬 化的作用正促使更多的研究者加入探索的行列，有理由相信高纯度的共轭亚油 酸活性异构体将来可能会应用于临床治疗和康复。 目前，商品化的共轭亚油酸主要是通过化学法制备所得，利用该法制备的 共轭亚油酸主要存在以下缺点：产物是多种异构体的混合物，高温反应产生有毒 物质反式脂肪酸，有机溶剂残留等。而生物法制备c l a ，具有高度专一性，产 物主要为活性异构体c 9 ，t 1 1 c l a ，可很好的应用于食品和医药领域。亚油酸异 5 构酶作为生物转化共轭亚油酸的关键酶，今年来成为研究的热点，国内外的科 学家对亚油酸异构酶做了大量的研究工作。 1 4 2 研究内容 本文以具有合成共轭亚油酸能力的德氏乳杆菌保加利亚亚种( l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u s1 1 4 8 0 ) 为研究对象，进行以下几个方面的研究： 鉴定保加利亚乳杆菌亚油酸异构酶的合成产物； 研究保加利亚乳杆菌诱导产酶条件； 研究亚油酸异构酶分离纯化技术及其酶学特性； 初步研究亚油酸异构酶的反应体系。 6 第二章保加利亚乳杆菌诱导产亚油酸异构酶条件研究 本章首先通过气质联用色谱、高效液相色谱检测保加利亚乳