（食品科学专业论文）蚕蛹肽的制备及其性质的研究.pdf

摘要 摘要 近年来，人们越来越重视生物活性肽的研究和开发，各种生物活性肽不断被发现和 阐明结构。蚕蛹是一种极富开发价值和经济价值的自然资源，它含有极高的动物蛋白， 蚕蛹肽是指蚕蛹蛋白经蛋白酶作用后，再经过特殊处理得到的低分子量的肽类混合物。 以蚕蛹蛋白为原料，采用酶水解方法研究了蚕蛹活性肽。通过研究n e u t r a s e ( 中性 蛋白酶) 、f l a v o r z y m e ( 复合风味酶) 、p r o t a m e x ( 复合蛋白酶) 、动物蛋白水解酶、木瓜 蛋白酶、c o f l a s e p n l ( 内外切复合酶) 、胰蛋白酶等七种蛋白酶在各自的最佳水解条件 下对蚕蛹蛋白单酶或双酶水解的效果，筛选出水解能力最强，水解混合物抗氧化活性最 强的中性蛋白酶和动物蛋白酶对蚕蛹蛋白进行水解。碍到抗氧化肽经过超滤后，应用离 子交换柱层析和分子筛柱层析，对肽进行了分离纯化，得到了具有较高活性的肽片段。 再以制备型h p l c 对此片段进一步分离纯化，并对此组分进行了氨基酸组成分析和分子 量测定。 结果表明最佳酶解条件为：温度5 0 ，p h 值7 0 ，底物浓度1 o ，动物蛋白酶加 量1 5 0 0 u g ，中性蛋白酶与动物蛋白酶酶活比为4 ：l ，水解时间3 h ，在此条件下水解度 为2 7 3 6 ，酸溶性肽得率为5 5 1 7 ，分子量分布于3 3 6 d a l 6 3 8 d a l 。在纯化的蚕蛹 肽中，主要存在一个分子量为6 3 0 的小肽，此小肽对邻苯三酚自氧化具有较强的抑制作 用，它能够清除超氧阴离子自由基；定浓度下优于v c 。 关键词：蚕蛹肽抗氧化生物活性蛋岛酶酶艇 a b s t r a c t a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，p e o p l ep a ya t t e n t i o nt ot h er e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to ft h ea c t i v ep e p t i d e o fl i v i n gb e i n g sm o r ea n dm o r e ，t h ea c t i v ep e p t i d eo fv a r i o u sk i n d so fl i v i n gb e i n g si sb e i n g f o u n da n de x p o u n d e dt h es t r u c t u r ec o n s t a n t l y ，t h ec h r y s a l i si so n ek i n do f t h ei n s e c tr e $ o n r c e ， w h i c hi ss ov a l u a b l ei ne c o n o m i c a lu s ea n dd e v e l o p m e n t t h es i l k w o r mc h r y s a l i s p e p t i d e m e a n st h a ts i l k w o r mc h r y s a l i s a l b u m e ni sa f t e rp r o t e a s ef u n c t i o n ，t h ep e p t i d cm i x t u r eo ft h e l o wm o l e c u l a rw e i e a tt h a tg e t sp r o c e s s e dw i t i ls p e c i a l m e t h o d i nt h i s p a p e r , i t i n t r o d u c e d t h eh y d r o l y s i so fc h r y s a l i s sp r o t e i n ，a n da n a l y z e dt h e h y d r o l y s i s s e v e nk i n d so fp r o t e a s e sa r es e l e c t e di nt h ee x p e r i m e n ta c c o r d i n gt ot h e i r h y d r o l y t i ca b i l i t i e s a sar e s u l tn e u t m s ea n da n i m a lp r o t e a s ea r ed e t e r m i n e dt oa p p l yt ot h e h y d r o l y s i sb yt h em e t h o do fd o u b l ee n z y m eh y d r o l y s i s t h es i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n t sa r et a k e no nt oi n v e s t i g a t et h eh y d r o l y s i sp r o c e d u r e t h ea n t i o x i d a t i o np e p t i d e w a ss e p a r a t e db ys e p h a d e x 0 2 5 g e lc h r o m a t o g r a p h y 、i o n e x c h a n g e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h ya n df u r t h e rp u r i f i e db yr e v e r s ep h a s eh p l c ，t h e nt h em o l e c u l a rw e i g h tw a s d e t e r m i n e da n dt h ea m i n oa c i dw a sa n a l y s e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tw h e ni ti s5 0 ，p hv a l u ei s7 0 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o ni s1 0 ， r a t i oo fa n i m a lp r o t e a s ee n z y m e s u b s t r a t ei s15 0 0 u g ，n e u t r a s e a n i m a lp m t e a s ei s4a n d h y d r o l y s i st i m ei s3 o h ，t h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sc a r lr e a c h2 7 3 6 ，t h ey i e l do fa c i ds o l u b l e p e p t i d ec a nr e a c h5 5 1 7 t h em o l e c u l a rw e i g h to fp o l y p e p t i d ei s a b o u t3 3 6 d a lt o 6 3 8 d a l ak i n do fp e p t i d ew i t ha n t i o x i d a t i o na c t i v i t yw a ss e p a r a t e d t h em o l e c u l a rw e i g h t w a sa b o u t6 3 0 t h es m a l lp e p t i d eh a v es t r o n g e ri n h i b i t i o no np y r o g a l l o la u t o o x i d a t i o n ，i t c a nr e m o v et h eu l t r ao x y g e na n i o nf r e er a d i c a la n ds u p e r i o rt ov cu n d e rc e r t a i nd e n s i t y k e yw o r d s ：c h r y s a iis a n t i o x i d a t i o r l8 i o a c t i v ep r o t e a s eh y d r o i y s is 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：墨耋亟自垄盥鱼丛塞：i 丝缒i 纽超 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论 文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 为) ，保密期至 年 月日为止。 学生签名：壑醴 导师签名： 盎整组 硼上年v 月g 日 第一章引言 第一章引言 蚕是天然昆虫，具有较强抵御外界环境污染能力，而蚕蛹则为昆虫食品开发提供 了丰富的原料保证。蚕蛹是蚕业加工的主要副产物之一，不仅来源丰富，而且具有较高 的营养价值。我国卫生部近期公布了蚕蛹是一种既是食品又是药品的食品新资源，用来 直接食补有益健康。 干蚕蛹的蛋白质含量高达4 5 5 0 ，它是一种全价蛋白。蚕蛹中含1 8 种氨基酸， 其中含有人体所必需的8 种氨基酸数量，其含量占氨基酸总量的4 0 以上，超过了联合 国粮农世界卫生组织( f a 0 w h 0 ) 规定的3 6 的标准。干蚕蛹油脂含量也相当丰 富，为2 5 2 9 。油脂中游离脂肪酸占8 1 0 ，其中不饱和脂肪馥占游离脂肪酸的 7 0 以上，主要是人体必需的油酸、亚油酸和亚麻酸，是人体生长和代谢所必须的要素 之一具有减轻动脉硬化，降低血液中胆固醇作用，防治动脉粥样硬化作用；油脂中还 含有约l 的不皂化物，如b 一谷甾醇、胆甾醇及菜油甾醇。干蚕蛹中还含一定数量的 微量元素，其中含量较高的有k 、n a 、c a 、m g 、p 、f e 、m n 、z n 等。另外，干蚕蛹中 还含4 左右的多糖类物质( 如粗纤维和几丁质) 以及极微量的抗菌肽、溶菌酶和激素。 另外通过药理学试验证蚕蛹实具有较高的营养作用，并有提高免疫功能、护肝和抗肿瘤 等功能。 但长期以来，国内生产的蚕蛹蛋白制品主要为蚕蛹蛋白粉。这种蛋白粉水溶性差， 且异味物质及色素的脱除不彻底，特别是经水溶胀后，异昧和色泽更为严重，极大地阻 碍其在食品工业中的应用。蚕蛹蛋自主要为球蛋白，可采用酸、碱及酶作为水解剂a 酸 水解使色氨酸全部破坏，丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸部分破坏，碱水解引起消旋作用而降 低营养价值，由于酶促反应条件温和易控制、效率高、专一性较强、副产物少等优点， 因此以酶解方式利用得最多。 以往多采用单酶水解工艺，反应条件严格，且单酶水解率不高，因此，采用双酶水 解工艺，蛋白质经水解方法处理后可得抗氧化肽，植物蛋白主要是以大豆蛋白研究较 多；动物蛋白则以鱼类蛋白进行的研究较多，如韩国的s e k w o n k 等人利用该国丰富的 鱼类资源，从鱼类加工厂的废弃鱼皮中经三步酶解制得了抗氧化肽；s u c t s u n a - k 从沙丁 鱼、k u n i o s u e t s u n a k 等人从酪蛋白、m a k a t o h a t t o r i 等人从不溶性的弹性蛋白中利用酶或 第一牵引言 h c i 水解都得到了抗氧化肽。从蚕蛹蛋白水解液中分离得到具有抗氧化作用的肽类物质 报道甚少。通过生化分离方法得到活性强的一类抗氧化肽，无疑有重要意义。为提高水 解率和降低生产成本提供理论依据，并为蚕蛹多肽的分离提纯，开发出用于病人和特殊 人群的肽类保健与功能食品打下良好基础，提高蚕蛹的附加值。 2 第二章文献综述 2 1 生物活性肽 第二章文献综述 生物活性肽是来源于细菌，真菌，动植物等，有重要生理功能的一类生物活性物质。 生物活性肽在生物体内的各种组织中广泛存在，其分子量分布从简单的二腋刘复杂的线 性或环型结构不等。生物活性肽包括生物体内天然存在的活性肽和蛋白质水解片段来源 的生物活性肽。生物体内天然存在的小肽经常通过糖基化，磷酸化或酞基化等被修饰。 因而从肽类分子结构上的多样性和复杂性不难看出生物活性肽在细胞的生理和代谢调 节中有重要的作用。从大量的文献报道中， 类寡肽，激素类寡肽，酶抑制剂类的寡肽， 2 1 1 天然存在的生物活性肽 生物活性肽可以归纳为下列几种：免疫调节 抗菌肽以及抗氧化肽等。 生物体内广泛分布着多种功能的内源性寡肽。它们在骨骼，肌肉，感觉器官，消化 系统，内分泌系统，生殖系统，免疫系统以及神经系统都广泛存在，并发挥重要的作用 ( 表2 - i ) 。 2 12 食物蛋白质降解产生的生物活性肽 2 1 2 1 食物蛋白质降解产生的肽类的营养作用 人们利用小肽混合物和蛋白质水解液代替传统的氨基酸混合物，作为营养不良和蛋 白质消化吸收异常病人的食物组成中的氮源。因为小肽有下列几个优点。 1 肽类比游离氨基酸的渗透压低，从而减少高渗带来的问题，提高食物的吸收利用 率。 2 肽类在肠道内运输要比游离氨基酸更容易，特别是二肽、三肽吸收利用更快、更 有效。 3 小肽般有更好的口感。 4 小肽( 小于8 个氨基酸残基) 的抗原性通常比蛋白质或多肽小得多。 3 第二章文献综述 表2 1内源性的生物活性肽 ! ! ! ! ! ! ：! 墅! ! g ! ! ! 竺生! ! ! ! ! ：! ! 丝! 望竺! 由于以上优点，这类易消化吸收的肽类有更高的营养价值和特殊的医疗用途，可以 作为肠道营养剂或以流质形式提供处于特殊身体状态的人，如消化功能不良的老人，消 化功能未成熟的婴幼儿，以及恢复期的病人等。 2 ，1 ，2 2 食物蛋白质降解产生的肽类的生物活。性 来源于蛋白质水解物的肽类，不仅具有更高的营养价值，近年来，人们又从多种食 物蛋白质的酶解液中分离和鉴定出多种具有生物活性的小肽片段。这些片段从两个氨基 酸残基到几十个氨基酸残基不等，但是都大量存在于相应来源的蛋白质中，因而可以在 蛋白质的体内消化吸收过程中被释放出来，直接被人体吸收利用，从而发挥其生物功能 ( 表2 - 2 ) 。 4 第二章文献综述 表2 - 2 食物蛋白中提取的生理活陛肽 t a b l e2 - - 2p h y s i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e sd e r i v e df r o mf o o dp r o t e i n s 【1 2 1 8 1 a c t i v i t y p r e c u r s o rp r o t e i n s s e q u e n c e s o p i o i da c t i v i t y l l 2 a c e i n h i b i t o t l l 3 - 1 6 】 m i l k ，f i s h ，s o ya n dc e r e a l p r o t e i n s h u m a nc a s e i n s ，t u m a , m u s c l e sp r o t e i n sa n dz e i n p r o t e i n s a n t i t h r o m b o t i c 1 2 1b o v i n em i l kp r o t e i n s a n t i h y p e r t e n s i v e 【1 8 】 b o v i n em i l kp r o t e i n s t y r l e u - l e u p h e t y r - g l y p h e l e u t y r p r o - p h e - - v a l t y r - g l u p h e l e u - p r o t y r - p r o - p h e - p r o - p r o - g l y t h r - t h r - m e t - p r o - l e u t r p a l a - v a l - p r o - t y r p r o g i n - a r g p r o - t h r - h i s i l e - l y s t r p g l y - a s p p h e - p h e - v a l a l a - p r o m e t - t y r - t y r l y s a s n - g l n s p - l y s m e t a l a - i l e - p r o - p r o l y s l y s - a s n g i n - a s p l y s a s n - o l u a s p l y s m e t a l a - l l e - p r o - p r o l y s l y s p h e p h e j v a l a l a - p r o a l a - v a l - p r o - 百，r p r o - g l u - a r g v a l - a r g - p r o m e t - t y r - t y r b o v i n e 醛1 c a s e i ”i f 4 5 一s s ) e n h a n c e m e n to f m i n e r a l ， b o v i n ec a s e i n c t s 2 一c a s e i n ( 5 5 - 5 7 ) b i o a v a i l b i l i t y 1 “ b o v i n e8 - c a s e i n ( 1 3 - 3 5 ) b a l a - h i s a n t i 。) i d a i l t | 1 61 7 】 a n i m a lm u s c l e sa n db r a i n , p - a l a - 3 - m e t h y l 。h i 8 e g gw h i t ea l b u m i n v a l - h i s - h i s v a l h i s - h j s - a l a _ a s n - g l n - a s n 5 第二章文献综述 综上所述，由于寡肽在多种代谢调节和生理过程中的非凡作用，生物活性肽的研究 成为一个快速发展的领域。新的小肽结构的阐明、肽的结构和功能关系的深入理解以及 肽合成方法的发展等，在理论研究和生产领域中无疑将引起人们的关注，掀起研究热潮。 2 2 蚕蛹蛋白质的组成与利用 2 ，2 ，1 蚕蛹蛋白质的组成 蚕蛹( s i l k w o r mc h r y s a l i s ) 为家蚕昆虫家蚕蛾( b o m b y xm o r i l ) 的蛹，自古就作为滋 补强身，和脾胃，长肌肉的食物和药物。 李时珍在本草纲目之“昆虫篇”中对蚕蛹有全面的记述，蚕蛹既是食物又是药 物，味咸辛、性平、无毒、入食可健体强身，入药可医治多病，补气养血，强腰壮肾， 健肺润肠，长食之可医治体虚力弱，肾虚诸症m 2 引。 现代的本革学著作如中药大辞典、中药志、中华药海、中药辞海 等也都将蚕蛹作为中药收录。用于小儿疳积、消渴、消瘦、心烦失眠、小儿遗尿、蛔虫 等病症。另外，民间还有以蚕蛹与冰糖蒸熟服食治疗癫痫，炒服治高血压，油炸服食治 疗鼻炎，研粉吞食治疗高血压、肝炎、肝硬化、胃痛、支气管炎【2 6 j 、肺结核、慢性肾炎 等用法【2 卅。 蚕是天然昆虫，具有较强抵御外界环境污染能力，而蚕蛹则为昆虫食品开发提供 了丰富的原料保证。我国卫生部近期公布了蚕蛹是一种既是食品又是药品的食品新资 源，用来直接食补有益健康i l ”。 干蚕蛹的蛋白质含量高达4 5 5 0 ，它是一种全价蛋白【1 9 。2 3 】。蚕蛹中含1 8 种氨 基酸其中含有人体所必需的8 种氨基酸数量，其含量占氨基酸总量的4 0 以上，超 过了联合国粮农世界卫生组织( f a o w h o ) 规定的3 6 的标准【1 9 2 12 3 1 。干蚕蛹油脂 含量也相当丰富，为2 5 2 9 【。油脂中游离脂肪酸占8 - - 1 0 ，其中不饱和脂肪 酸占游离脂肪酸的7 0 以上，主要是人体必需的油酸、亚油酸和亚麻酸，是人体生长 和代谢所必须的要素之一，具有减轻动脉硬化，降低血液中胆固醇作用，防治动脉粥样 硬化作用：油脂中还含有约1 的不皂化物，如b 一谷甾醇、胆甾醇及菜油甾醇 2 0 引”j 。 干蚕蛹中还含一定数量的微量元素，其中含量较高的有k 、n a 、c a 、m g 、p 、f e 、m n 、 z n 等。另外，干蚕蛹中还含4 左右的多糖类物质( 如粗纤维和几丁质) 以及极微量的抗 6 第二章文献综述 菌肽、溶菌酶和激素。另外通过药理学试验证蚕蛹实具有较高的营养作用，并有提高免 疫功能、护肝和抗肿瘤等功能。 按文献介绍的各成分测定方法，测定了秋蚕蛹的蛋白质含量高于春、夏蚕蛹，结果 如表2 3 。 表2 3 蚕蛹蛋白含量( ，蚕蛹蛋白质质量千蚕蛹质量) t a b l e2 3t h ep e r c e n to f c h r y s a l i sp r o t e i ni nd r yc h r y s a l i s ( ) 2 2 2 蚕蛹蛋白质的利用 目前蚕蛹综合利用开发比较成熟的技术主要包括无臭蚕蛹蛋白粉与蛹肤的生产、蚕 蛹复合氨基酸与各种单一氨基酸的生产、粗蛹油和精炼油的生产、蚕蛹甲壳素与壳聚糖 的生产等。其技术水平达到蚕蛹蛋白提取率可达7 0 以上，蛋白质含量可达9 8 ；蚕 蛹复合氨基酸提取率可达6 0 以上，单一氨基酸的提取可达9 5 ；蛹油提取率可达9 8 以上，蛹甲壳素的提取率达7 0 以上。 ( 1 ) 蚕蛹蛋白 蚕蛹含有的蛋白大多为球蛋白和清蛋白，易于消化吸收，在人体内利用率高，其中 粗蛋白含量可达7 7 ，可部分溶解于水。 蚕蛹蛋白是一种优质的纯天然全价蛋白质，除了含有6 0 以上的人体必须氨基酸 外，还富含核黄素、尼克酸、锌、铁、铜等营养要素，具有补充机体营养，促进生长发 育的作用。可广泛用于婴幼儿、孕妇、老人、久病体弱者及运动员的营养食品添加剂和 滋补剂。 ( 2 ) 蚕蛹粉及蚕蛹蛋白粉 将新鲜、清洁的蚕蛹，去除杂质，晒干或用烘干机烘干后粉碎成蚕蛹粉。这种蚕蛹 粉，可作蚕蛹食品的原料，也可作畜禽饲料添加剂。 蚕蛹经粉碎、水解、分离、水合和干燥后，可形成蛋白质粉末。其质量比蚕蛹粉优 良，用于食品原料和畜禽饲料添加剂的效果好。 ( 3 ) 工艺流程 蚕蛹蛋自粉的生产蚕蛹蛋白与蛹肤的生产工艺与生产技术有很多报道，而主要有 7 第二章文献综述 “筛分一过氧乙酸法”和稀碱抽提法。筛分一过氧乙酸法是直接将脱脂蚕蛹用微粉碎机 粉碎后，过8 0 日筛得精蚕蛹蛋白粉，按1 5 的比例加入饱和石灰水搅拌均匀，5 0 c 下 保温，再按蚕蛹粉量的1 5 倍加入3 0 的h 2 0 2 处理2 4 h ，然后调节p h 、抽滤、干燥即 得白色无臭的食用蛋白粉。稀碱抽提法是将脱脂蚕蛹粉碎后，加一定水量调和均匀后， 再按比例加入稀碱溶液f 1 15 的n a o h ) 在4 0 4 5 c 下保温抽提，然后用盐酸调节 口h 至蚕蛹蛋白的等电点4 4 5 ，使蚕蛹蛋白析出沉淀，再离心分离，水洗脱盐、脱色、 脱臭、喷雾干燥即得无臭蚕蛹蛋白粉。其生产流程如图2 - 1 所示。 脱脂蚕蛹_ 粉碎一过筛一调p h = 6 5 一抽滤_ 干燥一食用蚕蛹蛋白 加水一加碱_ 保温- 调p h = 4 - - 4 ，5 _ 脱盐一脱色_ 脱臭一干燥_ 食用蚕蛹蛋白粉 图2 1蚕蛹蛋白粉的生产工艺流程示意图 f i g 2 1t h e p r o e e d u r eo f c h r y s a l i s p r o t e i np o w d e r 22 ，3 蚕蛹肽的理化性质和生物活性 许多国家近年来开发出多种用于病人和特殊生理需要人群的肽类保健与功能食品。 蛋白水解物和由蛋白水解物制各的活性肽类食品，具有易消化、易吸收、抗过敏性、治 疗低血压和降低胆固醇等作用，故国外关于蛋白水解物和活性肽产品的开发极为活跃， 目前已有多种产品上市。特别是日本。已开发了大量的活性肽产品进行商业化销售，以 活性肽为功能因子已开发各种低抗原食品、璺儿食品、流动食品、运动食品、促钙吸收 食品、降压食品、醒酒食品等一系列的产品。活性肽和蛋白水解物类食品在西欧和美国 已有各种商品化产品，我国的活性肽和蛋白水解物的研究相对滞后，主要集中在植物蛋 白肽，乳源活性肽的研究。 蚕蛹蛋白质分子结构复杂，蛋白质分子量很大，从而使得蚕蛹蛋白质消化率和生物 效价受到影响。而采用生物技术和食品加工技术将蚕蛹酶解产生蚕蛹多肽，以克服蚕蛹 蛋白质在营养学上的弱点，使蚕蛹蛋白获得最佳的营养方式。 蚕蛹蛋白肽中的一些生理活性多肽能在人体小肠中与钙、铁等矿物质形成可溶性络 合物，具有抗蛀牙、补钙、促进钙吸收和防止钙丢失等诸多生理功能，对于我国钙缺乏 较为严重的人群来说有着重要的意义。 第= 章文献综述 内含的一些胶原多肽对机体和脏器起着支持、补强、结合以及形成界隔等作用，摄 入胶原多肽可对由于胶原物质减少而引起的疾病起改善作用；还有消化吸收率近1 0 0 、 保护胃粘膜以及抗溃疡、调节血压、抑制血压上升；促进骨骼形成以及美容作用；另外 它对关节症等胶原病具有很好的预防及治疗作用。 蚕蛹蛋白经酶解后，其酶解产物由许多多肽分子和游离氨基酸所组成，其必需氨基 酸比例平衡，含量丰富。人们一般会认为蛋白质必须通过消化道中的各种蛋白酶水解后， 最终以氨基酸的形态才能被人体吸收。但现代生物代谢实验证明并非如此，肠道吸收较 短的低肽( s h o r to l i g o p e p t i d e s ) 的速度比同一组成的氨基酸快。因为人体肠道中存在着 一个不同于氨基酸转运系统的特殊多肽转运体系，此体系能直接将小分子肽转运至小肠 粘膜上的内皮细胞内而迅速被消化吸收，吸收效果优于一般蛋白质和游离氨基酸。蚕蛹 多肽由于分子量较小，水溶性很高，具有低粘度、水溶性高、抑制蛋白质形成凝胶、较 强的吸湿性和保湿性、调整蛋白质的硬度、改善口味和易消化吸收等特点。蚕蛹多肽是 蚕蛹蛋白的最佳营养方式，具有良好的营养特性，能提供极易消化吸收的多肽化合物， 并具有体能恢复、促进发酵和营养特性。 因此，蚕蛹蛋白肽所含的二肽、三肽等低分子肽具有吸收率高、且比氨基酸消化吸 收快的特点，并有低抗原性，低渗透压，又不会引起过敏、腹泻等不良反应，特别适合 一些抵抗力差的体弱人群。具有强身健体作用；还有些生理活性肽具有镇痛、调节人 体情绪、呼吸、脉搏、体温、消化系统及内分泌等功能；还具有提高毛细血管通透性等 作用：还能促进胆固醇排泄，具有降低胆固醇的作用；机体防御功能肽、苦味肽、降血 压肽；具有降低血压的功能，对于高血压人群来说，是比较理想的食疗佳品。 因此，蚕蛹蛋白肽食品是一种多肽富集、营养互补、功效很强的少年儿童生长发育 不可缺少的营养食品，同时也是各类人群强身健体不可多得的保健佳品。 2 3 自由基理论与抗氧化肽 自由基学说是英国学者h a r m a n 于1 9 5 6 年最早提出的，该学说认为自由基攻击生物大 分子造成组织细胞损伤，是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要 起因自由基( f r e er a d i c a l ) 具有高度的化学反应活性，是人体生命活动中多种生化反应的 中间代谢产物。在正常情况下，人体内的自由基是处于不断产生与清除的动态平衡中， 但自由基产生过多或清除过慢时，它通过攻击生物大分子物质及各种细胞器，会造成机 体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤，加速机体的衰老进程并诱发各种 9 第二章文献综述 疾病。 2 3 1 自由基的产生及对机体生命活动的影响 自由基从化学结构上看是指含有未配对电子的基团、原子或分子。人体内存在的氧 自由基即活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) 包括超氧阴离子( 0 2 一) ，羟自由基( o h ) 、过氧 化氢( h 2 0 2 ) ，氢过氧基( h 0 2 ) ，烷氧基( r o ) ，烷过氧基( r o o ) ，氢过氧化物( r o o h ) 和 单线态氧( 1 0 2 ) 等。人体内亦存在n o 及其相关自由基，包括n o 、过氧化亚硝酸根( - o n 0 0 ) ， 烷基过氧化硝酸根( r o o n o ) ，n 0 2 以及o n o o h 分解产物n 0 2 + ，n 0 2 等。此外存在于体内 的非氧自由基主要有氢自由基( h ) 和有机自由基限) 等。 2 3 1 1 自由基的产生 细胞在正常的代谢过程( 如细胞内酶的催化活动、电子传递过程、细胞成分的自动 氧化以及杀死微生物的吞噬作用) 中，或者受到高能辐射，以及由于高压氧、药物( 抗癌 剂、抗菌素、杀虫荆和麻醉剂等) 、香烟烟雾和光化学空气污染物等作用，都会刺激机 体产生活性氧自由基，表2 4 t s 】概括了机体内活性氧自由基的产生途径。 表2 - 4 机体内活性氧自由基的产生途径 t a b l e2 4t h ep r o d u c t i o no f a c t i v eo x y g e nf r e er a d i c a li ne c o n o m y 物理因素 1 x - r a y 水裂解一h + o h j 0 2 一0 2 。 2 光离一r 寸0 2 一0 2 一3 光激发一- + 0 2 一0 2 。一 化学因素 1 无机的m + + 0 2 一m ”+ 0 2 一 2 有机的r h + 0 2 一r + 0 2 一+ h + + 0 2 一0 2 一+ r 生化因素 1 非酶催化 ( 正铁血红蛋白f e 2 + ) + 0 2 一( 正铁血红蛋白f e 2 + ) + 0 2 2 酶催化 ( 1 ) 膜酶：线粒体、微粒体和脂膜( 女i i n a d p h 氧化酶) ( 2 ) 可溶酶：胞外( 如血浆铜蓝蛋白酶) 胞内酶( 如黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶) 机体内自由基的产生以酶催化反应最为重要。人体细胞内所含的黄嘌呤氧化酶、髓 1 0 第= 章文献综述 过氧化物酶j i n a d p h 氧化酶等在进行酶促反应时，会诱导产生大量的自由基中间产物。 人体内内源性n o 生物合成是由氧化氮合酶催化l - 精氨酸和分子氧产生。同时n o 自由基又能与活性氧自由基反应，n o 的自由基反应见图2 2 ： 0 2 一一n 0 2 + 一n 0 2 - 0 n 0 0 一一0 n 0 0 h n o 。 n o s 一o h a r g 0 。一n o - 一0 h 图2 2 一氧化氮自由基的反应” f i g 2 - 2t h er e a c t i o no f n i t r o u so x i d ef r e er a d i c a l 2 3 1 2 自由基对生物大分子的损伤 由于自由基高度的活性与极强的氧化反应能力，能通过氧化作用来攻击所遇到的任 何分子，使机体内大分子物质产生过氧化变性，交联或断裂，从而引起细胞结构和功能 的破坏，导致机体组织损害的器官退行性变化。o h 是最活泼的自由基也是毒性最大 自由基。它可与活细胞中任何分子发生反应而造成损害，且反应极快。0 2 一的毒性是 机体发生氧中毒的主要原因，由它引起的损伤表现在使核酸断链，多糖解聚和不饱和脂 肪酸过氧化，线粒体氧化磷酸化等作用的改变。所有能产生0 2 一的生物系统都能通过 歧化反应生成h 2 0 2 ，后者能使少数酶的- - s h 氧化。在细胞内的1 - 1 2 0 2 能与f e 2 + ，c u + 离子反 应生成o h 一，或紫外线使h 2 0 2 均裂产生o h 。 自由基作用于核酸类物质会引起一系列的化学变化，诸如氨基或羟基的脱除、碱基 与核糖连接键的断裂、核糖的氧化和磷酸脂键的断裂等。o h 通过加成反应或夺氢反 应，产生新的自由基，并进一步通过连锁反应使得核酸及其组成成分出现共价键的断裂， 从而产生对核酸的损害。自由基可直接作用于蛋白质，也可通过脂类过氧化产物间接作 用于蛋白质，而使蛋白质产生破坏作用，血 i r o o 可使蛋白质分子发生交联生成变性的 高聚物，其它自由基则可使蛋白质的多肽键断裂。并使个别氨基酸发生化学变化。更严 重的是，自由基可改变酶蛋白的化学结构，导致酶生物活性的丧失。另外，醛类是自由 第二章文献练述 基作用于脂质产生的过氧化物的裂解产物，能与蛋白质的- - s h 和氨基产生交联作用。自 由基可使细胞膜寡糖链中糖分子的羟基氧化，生成不饱和的羰基或聚合成双聚物，从而 破坏细胞膜上的多糖结构，影响细胞免疫功能的发挥。 脂质中的多不饱和脂肪酸由于含有多个双键而化学性质活泼，最易受到自由基的破 坏发生过氧化反应。脂质过氧化反应是自由基连锁反应最好例子( 图2 3 ) “”。 ( c h 2 c h - c h z ) + r - - ( - c h = c h - c h ) + r h ( i ) ( c h 2 c h - c h 一) l 0 0 ( 1 i d ( h ) + ( c h = c h - c h 2 ) ( - c h = c h - c h ) + 0 2 ( c h = - c h c g - ) j o 0 ( i i ) 一( - c h = c h - c h 一) 1 0 一o h ( i v ) ( 1 i i ) + ( - c h = c h c h ) ( i i ) 图2 3 不饱和脂肪酸氢过氧化物( i v ) 形成的链式反应 f i g2 - 3t h ec h a i nr e a c t i o no f f o r mo f u n s a t u r a t i o nf a t t ya c i dh y d r o g e np e r o x i d ( i v ) r 为自由基引发剂，r 一从不饱和脂肪酸( i ) 分子中夺走氢，生成自由基( i i ) ，于是 自由基( i f ) 吸收氧以形成脂肪酸过氧化基团( i i i ) 与另一个( i ) 分子发生反应，生成又一 个自由基( i i ) 以及一个不饱和氢过氧化物( i v ) 。可见只要少数几个自由基引发剂就可导 致数以千计的分子发生自由基反应。 一个不饱和脂肪酸分子通过自由基反应形成共轭双键和丙二醛。不饱和脂肪酸的氢 过氧化物与r 发生自由基反应以夺取氢，接着产生双键重排，吸收氧，形成五元氧环， 导致键断裂反应和最终形成丙二醛。丙二醛可与具有氨基或疏基的蛋白质、磷脂酰乙醇 胺和核酸等形成希夫碱( s c h i f f b a s e ) ，导致生物分子发生交联作用。结果生成比原分子 大很多倍的聚合分子，从而使蛋白质正常结构受破坏而丧失功能，一些依赖- - n h 2 和- s h 来维持活性的酶蛋白质都会被抻制失活。而丙二醛与核酸物质钓交联，则会引起突变， 导致肿瘤的产生。 2 ，3 1 。3 自由基与疾病的关系唧i s l 第二章文献综述 1 自由基与衰老：h a r m a n 于1 9 5 6 年率先提出自由基与机体衰老和疾病有关。自由基 衰老理论的中心内容认为：衰老来自机体正常代谢过程中产生的自由基随机破坏性作用 的结果，包括生物大分子的交联聚合和脂褐素( l i p o f u s c i n ) 的累积：器官组织细胞的破坏 与减少：免疫功能的降低等。 2 自由基与癌症：研究表明，不少致癌物必须在体内经过代谢活化形成自由基并攻 击d n a 才能致癌，而许多抗癌剂也是通过自由基形式去杀死癌细胞。因此，人们谨慎的 认为自由基介入了致癌( c a r c i n o g e n e s i s ) 、促癌( p r o m o t i o n ) 和抗癌( a n t i t u m o r ) 诸过程中。 但尚不能肯定自由基在癌症的发生过程中是否起着本质的关键作用。 一个正常的细胞发生癌变必须经历诱发和促进两个阶段，这就是两步致癌学说。诱 发期的特点是阈值剂量的致癌物只需使用一次，诱发剂就能与d n a 不可逆的结合。促进 期的特点是有些物质本身不致癌，但多次作用于已诱发的细胞就会出现癌变。自由基作 用与诱发阶段关系密切，活性氧使姐妹染色体互换升高，脂质过氧化终产物丙二醛也有 致癌作用。促癌阶段也与自由基有关，促癌剂的促癌作用与其产生自由基的能力相平行， 而许多抗氧化剂则有抑制促癌作用。 3 自由基与缺血后再灌注损伤缺血是引起致死性疾病的主要原因。但缺血还不足 以导致组织损伤，而是在缺血一段时间后突然恢复供血，才导致损伤出现。缺血组织再 灌注时造成的微血管和实质器官的损伤主要是由活性氧自由基引起的。在缺血后再灌注 状态下，细胞内的氧自由基主要来自黄嗦吟氧化酶和多型核白细胞所产生的活性氧。 当然，自由基由于是机体正常代谢的产物，对维持机体正常代谢必不可少。它的主 要作用有增强自细胞的吞噬作用，提高杀菌效果，促进前列腺素的合成，参与脂肪加氧 酶产物的合成，参与胶原蛋白的合成，参与肝脏的解毒作用，参与凝血酶原的合成，参 与核糖核昔的还原等。1 2 3 2 自由基清除剂 自由基清除剂与抗氧化剂在某种程度上是同义词。自由基清除剂分酶类清除剂( 抗 氧化酶) 与非酶类清除剂两大类。酶类清除剂主要有超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶 ( c a t ) 和谷胧甘肤过氧化物酶( g s h p x ) 等。非酶类清除剂主要有维生素类( v i te 和v i tc 等) 、d 一胡萝1 - 素、金属鳌合剂、钙离子拮抗剂、黄酮类和多酚类以及抗氧化肽类( g s h 、 肌肽等) 等。 2 3 2 1 酶类抗氧化剂 1 3 第二章文献综述 s o d 能清除吐i ，同时生成h 2 0 2 。h 2 0 2 又可被c a t 清除生成h 2 0 和0 2 。除c a t ； i - g s h p x 也可清除h 2 0 2 ，g s h - p x 还可以清除脂类过氧化自由基r 0 0 与r o o h 。 2 ，3 2 2 非酶类抗氧化剂 维生素e ，为脂溶性抗氧化剂，在体内、外均有很强的抗氧化作用。维生素e 可以淬 灭1 0 2 ，又可吼与1 0 2 反应，故它是1 0 2 的有效清除剂。它还可以与0 2 - 反应，但是反应 是缓慢的。在脂类过氧化的过程中起到关键作用的r 0 0 谴 到维生素e 后，可以转变为化 学性质较不活泼的r o o h ，从而中断自由基反应。维生素c 是水溶性的抗氧化剂，它作 为电子供体，当给出一个电子后就成为半脱氢抗坏血酸自由基，再失去一个电子就成为 脱氢抗坏血酸。 b 胡萝卜素可能是单线态氧的碎灭剂，分子中有大量的共轭双键，对过氧化自由基 敏感，可以作为一种链阻断i 生氧化剂。别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶抑制剂。除抑制黄嘌呤、 次黄嘌呤氧化成尿酸产生0 2 _ 夕p ，还可以直接清除o h 及0 2 - ，其活性代谢产物氧嘌呤醇 ( o x y p u r i n 0 1 ) 对o h 更有效，并于h o c l 发生反应而连接于其上，阻止h o c i 对胰蛋白酶 抑制剂的失活作用，保护发炎组织中弹性蛋白酶的活性。金属鳌合剂去铁胺与f e ”有高 度的亲和力( k d = l o ) ，与f e 2 + 紧密结合阻止f e 2 + 参与f e n t o n 反应而减少自由基的生成。许 多中药中都含有抗氧化组分，并广泛的用于临床。主要有酚类，毗喃类，及酚酸类，黄 酮类，菇皂试类，木脂素类，单宁类，生物碱等。其它还有葡萄糖、水杨酸钠、二甲亚 砚、牛磺酸、尿酸等小分子物质。 2 3 3 抗氧化肽 抗氧化肽是指生物体内源性的或由生物体内蛋白质降解后生成的，具有抑制生物大 分子过氧化或清除体内自由基产物的寡肽。众所周知，许多氨基酸及其衍生物具有抗氧 化能力。抗氧化氨基酸主要指半胱氮酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸和 缘氩酸。氨基酸衍生物如5 一色氨酸等，都有抗氧化能力。 2 3 3 1 含巯基的肽类及衍生物 巯基化合物般均具有清除氧自由基的能力。如谷胱甘肽( g s h ) 与卡托普利 ( c a p t o p r i l ) ，能直接与自由基发生反应，减少自由基的产生。 谷胱甘肽( g s h ) 的结构为t l 一谷氨酰l 半胱氨酰一甘氨酸，分子中含有一个活泼的 1 4 第二章文献综述 疏基，易被氧化脱氨。g s h 是生理活性的形式，两分- 子g s h 失氢后转变为氧化型谷胱甘 肽( o x i d i z e df o r mg l u t a t h i o n e ，g s s 回。g s h 的活性s h 使之具有多方面的生理功能。g s h 可以清除自由基，对自由基的过氧化损伤能起到强有力的保护作用，其反应式为： r + g s h r h + g s r o o h + 2 g s h g s s c j + r o h + h 2 0 2 g s ，g s s g i - 1 2 0 2 + 2 g s h g s s g + 2 h 2 0 g s s g 由存在于肝脏和红细胞中的谷胱甘肽还原酶催化作用下，利用还原型辅酶i i 又得至u g s h ，使体内自由基的清除反应能够持续进行。g s h 对于放射线、放射性药物或 由于肿瘤药物所引起的白细胞减少等症状，能起到有效的保护作用。g s h 可阻止h 2 0 2 氧 化血红蛋白，保护疏基，防止溶血的出现，保证血红蛋白能持续发挥输氧功能等。此外， g s h 还可抑制乙醇侵害肝脏产生脂肪肝。 疏丙基甘氨酸(