（农产品加工及贮藏工程专业论文）纤维素酶工程菌的构建及表达.pdf

纤维素酶工程菌的构建及表达 摘要 纤维素属于可再生自然资源，是生物界最重要的碳源物质，每年由光合作用产生的植 物干质量约2 2 0 亿吨，其中纤维素占5 0 。我国每年仅作物秸秆的纤维产量就达2 亿吨以 上。利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径之一，对解 决环境污染、食品短缺、能源危机和人类社会的可持续发展具有重大的现实意义。 绿色木霉能产生大量的胞外纤维素酶，酶系较完全，主要包括：内切葡聚糖酶、外切 葡聚糖酶和b 葡萄糖苷酶，据报道在这几种类型的酶协同作用下能对纤维素进行完全降 解，并且对结晶纤维素也有较好的酶解活性。 纤维素酶属诱导型酶类，其多个酶组分的表达调控是一个非常复杂的过程，其中外 切葡聚糖酶( c b hi i ) 具有关键的作用。当c b hi i 基因缺失时，会影响纤维素酶系其它 酶的表达，而缺失其他基因时，只单独影响自身的表达。另有研究表明c b hi i 是纤维素 酶系统中最先表达的酶，其表达产物进一步诱导其他纤维素酶基因的表达，但c b hi i 基 因的表达受葡萄糖的抑制，要提高绿色木霉的产纤维素酶能力可以通过对绿色木霉c b h i i 基因进行克隆，将其克隆到不受葡萄糖抑制的真核启动子下游，构建高效表达载体，使 c b hi i 基因不再受到培养基中葡萄糖的抑制而得到高效表达，从而促进其他纤维素酶基因 的协同表达，大幅度提高菌株在发酵过程中的产纤维素酶的能力。 本研究根据绿色木酶e d n a 序列设计合成引物，p c r 扩增c b hi i 基因序列，将完整 的目的基因与表达载体p u t 连接，转入大肠杆菌d h 5a 中，获得重组质粒p u t - c b h 。再 将p u t - c b h 重组质粒与强启动子p k ia 片段以合适的比例连接，转入大肠杆菌d h 5q 中， 获得具有p k ia 强启动子的重组表达质粒p u t - c e 。构建的重组表达质粒采用电穿孔法转 化回原宿主菌绿色木霉，得到阳性转化子。通过s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纤维素酶 基因在原宿主菌中的表达，对阳性转化子用b e na 显性标记进行初筛后进一步采用刚果 红染色法复筛，并进行液体摇瓶培养，检测发酵液酶活力以及遗传稳定性。本研究获得了 一株表达率高、酶活力强和遗传稳定的重组纤维素酶工程菌p u t - c e h 1 。实验表明纤维素 酶工程菌在5 0 、2 0 0 r p m 培养7 2 小时，总酶活达到4 5 u m l h ，c x 酶活达到1 6 0 0 u m l h ， c l 酶活达到1 6 0 u m l ( 2 4 h ) ，葡萄糖苷酶活达到1 5 u m l h 。 纤维素酶工程菌的获得，为研究绿色木霉纤维素酶基因在同源转化中的表达及工程菌 的酶学特性提供了重要的材料。通过对阳性转化子的s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测、阳 性转化子与原宿主菌发酵培养液的酶活比较和重组酶的酶学特性分析，证明了同源转化后 重组质粒正确表达了绿色木霉的纤维素酶基因，也证明了绿色木霉纤维素酶工程菌在表达 率、酶活力和遗传稳定性上对比原宿主菌都有显著提高，并且工程菌表达分泌的纤维素酶 具有相应的生物学酶活特性，为进一步研究绿色木霉基因的同源转化和对纤维素的完全降 解提供了理论依据。 关键词：绿色木霉，c b hi l 基因，纤维素酶，同源转化 c o n s t r u c t i o na n de x p r e s s i o no fc e l l u l o s ee n g i n e e r i n gb a c t e r i a a b s t r a c t r e n e w a b l er e s o u r c e ，c e l l u l o s e ，i sak i n do fc a r b o ns o u r c ei nl i v i n gn a t u r e t h ed r yw e i g e to fp l a n t sa b o u t2 2 0ah u n d r e dm i l l i o nt o na r ep r o d u c e db yp h o t o s y n t h e s i si nay e a r ，c e l l u l o s ei sa b o u t5 0 t h ef i b e ro fh a u l mi sa b o u t2ah u n d r e dm i l l i o nt o n s oi t sv e r yi m p o r t a n tt ou s ec e l l u l a s et od e c o m p o s ec e l l u l o s e e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n ，f o o ds h o r t a g e ，e n e r g yc r i s i s ，s u s t a i n a b l e d e v e l o p m e n to fh u m a ns o c i e t yc a nb es o l v e di nad a y t h ef i l a m e n t o u sf u n g u st r i c h o d e r m av i r i d ei saw e l l k n o w nc e l l u l o l y f i co r g a n i s ma n dp r o d u c e sa f a m i l yo fd i f f e r e n tc e l l u l o l y t i ce n z y m e s ，i n c l u d i n ge n d o g l u c a n a s e s ，e x o c e l l o b i o h y d r o l a s e s ，a n dp - g l u c o s i d a s e sw h i c hw e r em o s ti m p o r t a n tt ot h eb i o d e g r a d a t i o no ft h ec e l l u l o s i cb i o m a s s s o m eo ft h ec e l l u l a s e sh a v eb e e ns h o w nt oc o o p e r a t ei nt h eh y d r o l y s i so fc e l l u l o s e ，t h e ya c ti ns y n e r g y t h ec l o n i n go fc e l l u l o s eg e n e sa n dt h e i rh i g l le x p r e s s i n gi ns c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b ei so fg r e a ts i g n i f i c a n c ei n b i o d e g r a d a t i o no ft h ec e l l u l o s i cb i o m a s s ( c e l l u l o s ea n dh e m i c e l l u l o s e ) s u c h 舔a g r i c u l t u r a la n df o r e s t r yr e s i d u e s t h ec b h i i 、e g ia n db g l if r o mt v i r i d ew e r et r a n s f e r r e dt os c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ，a n dc e l l u l a s e s - p r o d u c i n gs p o m b ee n g i n e e r i n gs t r a i n sw i t hs t a b l eh e r e d i t yw e r ec o n s t r u c t e d i t sc o m p l i ct oe x p r e s sa n dc o n t r o lt h ei n d u c i n ge r z y m e so fc e l l u l a s e ，a n de x o g l u c a n a s e ( c b hi i ) i si m p o r t a n t t h ee x p r e s s i o no fc e l l u l o s ei se f f e c t e db yg e n ed e l e t i o no fc b hi i b u tg e n ed e l e t i o no fo t h e r sc a ne f f e c te x p r e s s i o no fo n e s e l f i ns t u d yc b hi ii se x p r e s s e df i r s t l yi ne e l l u l a s es y s t e m a n dt h ep r o d u c t i o nc a ni n d u c eo t h e rg e n e se x p r e s s i o n n 抢e x p r e s s i o no fc b hi i i si n h i b i t e db yg l u c o s e ，s ot h ea b i l i t yo fp r o d u c i n gc e l l u l a s ec a nb er a i s e db yg e n ec l o n i n go fc b hi i ，a n di sc l o n e d e dt ot h ed o w n s t r e a mo fe u k a r y o np r o m o t e r e x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e d ，i tc a np r o m o t ec o o r d i n a t ee x p r e s s i o no fo t h e rc e l l u l o s eg e n e sa n dt h ec a t i v i t yo fp r o d u c i n gc e l l u l a s e i nt h i ss t u d y ，p r i m e rc a nb ed e s i g n e db yc d n as e q u e n c eo ft f i c h o d e r m av i r i d e ，g e n eo r d e ro f c b hi ia m p l i f i c a t e db yp c r t h eg e n ew a sc o n j u g a t e dw i t ht h ec a r r i e ro fp u t ，a n dw a ss h i f t e di n t od h 5q ，r e c o m b i n a n tp l a s m i do fp u t c b hi so b t a i n e d r e c o m b i n a n tp l a s m i do fp u t - c b ha n df r a g m e n to fs t r o n gp r o m o t e rp k iac a nb es h if ti nd h 5a ，t h e nr e c o m b i n a n tp l a s m i do fp u t c eis o b t a i n e d b yu s i n ga c l ia n de l e c t r o t r a n s f o r m a t i o n ，t h ee x p r e s s i o np l a s m i dw e r et r a n s f o r mi n t ot i l e h o d e r m av i r i d ec e l l t h e ni tw a sq u a l i t a t i v ea s s a y e db yb e naa n dc o n g or e dm e t h o d ，t h ee n z y m ea c t i v i t yw a sa s s a y e db yf e r m e n t a t i o n h i g h ee x p r e s s i o n , e n z y m ea c t i v i t y ，g e n e t i cs t a b i l i t yc a nb eo b t a i n e d 5 0 c ，2 0 0 r p m ，c u l t u r i n g7 2 h ，m ea c t i v i t y o fe n z y m ei st h eh i g h e s tt h ee n z y m ea c t i v i t yo ft o t a le n z y m e ，c x , c i ，g l u c o s i d a s ei s4 5 u m l h ，1 6 0 0 u m l h , 1 6 0 u m l ( 2 4 h ) ，1 5 u m l h t h ec e l l u l o s ee n g i n e e r i n gb a c t e r i aw h i c hh a db e e no b t a i n e dp r o v i d st h ei m p o r t a n tm a t e r i a l i i i t ot h es t u d yo ft h ee x p r e s s i o no fa u t o g e n i ct r a n s f o r m a t i o nf o rt h et v i r i d ec e l l u l a s eg e n e sa n dt h ea n a j y so fc h a r a c t e r i s t i c so fm c o m b i n a n t f r o mt h e r e s u l t so ft h es d s - p a g e ，t h ee n z y m ea c t i v i t ya n dc h a r a c t e r i s t i co fe n z y m ef o rc o n v e r t e r , t h eq u a n t i t yo fe x p r e s s i o n ，e n z y m ea c t i v i t y ，g e n e t i cs t a b i l i t y a r eh i g h e rt h a nh o s t i tc a np r o v i dt h e o r yf o ra u t o g e n i ct r a n s f o r m a t i o no fc e l l u l o s eg e n ea n dd e g r a d a t i o no fc e l l u l o s e k e y w o r d s ：e e l l u l a s e ，t r i e h o d e r m av i r i d e ，c 阴i ig e n e ，h o m o l o g o u se x p r e s s i o n i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 姗躲歹才 期：如扩年细p 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 学位论文作者签名： 导 乃瑟 签字日期：2 册疹年多月，g 日 签字日期：翮年月，拍 吉林农业大学硕士学位论文纤维素酶工程茵的构建及表达 第一章前言 纤维素属于可再生自然资源，是生物界最重要的碳源物质，每年由光合作用产生的植 物干质量约2 2 0 亿吨，其中纤维素占5 0 。我国每年仅作物秸秆的纤维产量就达2 亿吨以 上l l j 。因此，利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素综合利用的有效途 径，对解决环境污染、食品短缺、能源危机和人类社会的可持续发展具有重大的现实意义。 1 1 纤维素及纤维素酶概述 1 1 1 纤维素的化学组成及结构 纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，是由吡喃葡萄糖以b 1 ，4 糖苷键连接成的线性 大分子聚合物，纤维二糖是其基本单元。纤维素分子表面平整，易于长向伸展，加上吡喃 葡萄糖环上的侧基，十分利于氢键的形成，使这种带环、刚性的分子链聚集在一起。纤维 素分子的大小一般由聚合度来定义，即一个分子所含的葡萄糖残基数，范围从8 0 0 0 1 0 ，0 0 0 左右1 2 。纤维素主要有结晶区和非结晶区两部分，分子链平行有序排列的为结晶区，结晶 区有氢键，所以结构稳定，微生物降解十分困难；后者纤维素结构比较疏松，很容易被微 生物降解。结晶区和非结晶区是一两相共存的体系，每个葡萄糖残基中都含有三个醇羟基， 羟基中的氢原子与相邻的氧原子间距离小于0 2 8 n m - - o 3 0 n m 时都可能形成氢键。这样， 纤维素分子链内、链间及分子链与表面水分子间，都可形成氢键。植物最初合成的纤维素 分子链是呈高度水合状态，后逐渐失水，借氢键的形成造成螺旋状。结晶区内的氢键属于 结合性强的不可逆类型。虽然氢键的键能远较糖普键低，但由于在由纤维素分子链聚集排 列形成的超分子结构中，特别是在结晶区中存在着大量的氢键，是造成纤维素具有坚韧性 和水不溶性的主要原因p j 。 纤维素占植物干重的3 5 - - - 5 0 ，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，也 是自然界中数量最大的可再生性资源。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、 粮食短缺、环境污染等问题具有重要的意义。 1 1 。2 纤维素酶( 系) 的组成 纤维素酶( c e l l u l a s e ) 是指能够水解纤维素1 3 一l ，4 d 葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二 糖和葡萄糖的一组酶的总称。早在1 9 5 0 年r e e s e 等人就提出了c i c x 概念。经过多年来的研 究，特别是近年来蛋白质分离及纯化技术的不断改进，分离得到的纤维素酶越来越多，每 种酶的作用机理也越来越明确1 4 5 】。纤维素酶主要是指三种关键酶： ( 1 ) 外切型纤维素酶，系统命名为外切b - 1 , 4 - d 葡聚糖酶，又称纤维二糖水解酶 ( e c 3 2 1 9 1 ，也称c l 酶) 。这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解b 1 , 4 糖苷键，每 吉林农业大学硕士学位论文 纤维素酶工程菌的构建及表达 回依次从纤维素分子中切下一个纤维二糖分子，所以又称纤维二糖水解酶( 简称c b r 0 。 ( 2 ) 内切型纤维素酶，系统命名为内切1 3 1 , 4 d 葡聚糖酶( e c 3 2 1 4 ，也称c x 酶或 c m c a s e ) 。这类酶是纤维素酶中最重要的酶，它作用于纤维素分子内部的非结晶区，随 机水解1 3 1 , 4 糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带有非还原末端的小分子纤维素。 ( 3 ) 纤维二糖酶，系统命名为1 3 葡萄糖苷酶( e c 2 1 2 1 ，也称c b 酶) ，这类酶将纤维 二糖水解成葡萄糖分子。 当以上三种纤维素酶的关键酶的活性比例适当时，就能协同作用完成对纤维素的降 解，但各个酶组分单独作用时效果极差。所以说纤维素酶降解纤维素时一个协同表达和作 用的过程。 1 1 3 纤维素酶的分子结构 在研究纤维素酶的一级结构和三维结构中人们发现，纤维素酶全酶分子呈蝌蚪状，是 由球状的催化结构域通过一个富含p r o 和t h r 或羟基氨基酸的连接桥( 1 i n k e r ) 和纤维素结合 吸附结构域三个部分组成【6 。 ( 1 ) 催化结构域( c d ) ，迄今为止，所有己知的纤维素酶的催化结构域根据其氨基酸序列的 相似性可以分为7 0 个家族，在同一个家族内具有相似的分子折叠模式和保守的活性位点， 其反应机制和对底物的特异性都可能相同。 ( 2 ) 纤维素结合吸附结构域( c b d ) ，c b d 通常位于纤维素酶序列的氨基端或羧基端，它通 过一段高度糖基化的l i n k e r 与c d 相连。细菌的c b d 大概有6 3 2 4 0 个氨基酸残基，而真 菌的c b d 只有3 肛4 0 个氨基酸残基。根据c b d 氨基酸序列的相似性，c b d 主要可以分 为五个家族。 ( 3 ) 连接桥( 1 i n k e r ) ，细菌纤维素酶l i n k e r 富含p r o 、t h r ，而真菌纤维素酶l i n k e r 富含g l y 、 s e r 、t h r 。l i n k e r 存在的重要性尚有争议，一般认为它可能有助于不同酶分子间形成较为 稳定的聚集体。 部分纤维素酶含2 0 - - 1 5 0 个氨基酸残基的重复序列，重复序列可能与纤维素酶复合物 中蛋白与蛋白之间的相互作用有关【引。纤维素酶结构域拆分的研究为内切酶和外切酶底物 的特异性做出了合理的解释：内切酶的活性位点位于一个开放的裂隙( c l e f t ) 中，它可与纤 维素链的任何部位结合并切断纤维素链；外切酶的活性位点位于一个长环( 1 0 0 p ) 所形成的 孔道( t u n n e l ) 里面，它只能从纤维素链的非还原末端切下纤维二糖。后来的有关研究也进一 步证实了上述分析。 1 1 4 纤维素酶( 系) 的主要性质 不同来源的纤维素酶分子特征和催化活性都不尽相同。细菌产生的纤维素酶量少，主 要是内切酶，大多数对结晶纤维素没有活性，而且不能分泌到细菌细胞外，常常聚集形成 多酶复合体【9 】。真菌能产生大量的纤维素酶，产生的酶组分全，能分泌到菌体外，一般不 聚集成多酶复合体，但可以相互发生强烈的协同作用。纤维素酶分子的大小因来源不同也 吉林农业大学硕士学位论文纤维素酶工程菌的构建及表达 有明显的差异，变化范围很广。内切型酶分子量介于2 3 1 4 6 k d a 之间，外切型酶一般为 3 8 118 k d a , 1 3 葡萄糖普酶为9 0 1 0 0 k d a ( 胞内酶) 和4 7 7 6 k d a ( 胞外酶) 。但纤维粘菌内切 型酶分子量小至6 3 k d a ，蚕豆腐皮镰饱的1 3 葡萄糖昔酶竟高达4 0 0 k d a 。多数真菌和少数 细菌的纤维素酶都受到糖基化，所含碳水化合物的比率不同在很大程度上决定了酶的多型 性，表现为分子量的差别。纤维素酶的酶活力一般都很低，因而酶生产成本高。据报导， 纤维素水解成葡萄搪所需的酶蛋白要比淀粉相应水解所需的大1 0 0 倍，这是影响纤维素酶 实际应用的重要原因之一【l o 】。 1 1 5 纤维素酶( 系) 的作用机制 纤维素酶对纤维素的降解，一般首先需要吸附到纤维素上，但并不一定是好的吸附就 有好的催化。纤维素酶的吸附不仅与酶本身性质有关，也与底物的特性密切相关。其能力 大小与酶的含糖量和疏水性均有关联。至于吸附过程是否可逆应视具体酶的种类而定。 n i d o t s k y 等发现，里氏木霉的c b hi i 和e g i i i 对纤维素的吸附是个可逆过程，而c b hi 是 个不可逆过程，同时还发现除c b hi 外，酶组分吸附与相应的水解活力之间没有线性关 系。此外，纤维素酶的吸附机制并未完全被了解，仍需做进一步研究【1 l 】。 纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样，遵循双置换机制，即作用部分的两个色氨酸参与 基质结合，而处在将被裂解的键及相邻一个非离子化的甘氨酸和一个离子化的谷氨酸残基 参与催化作用。这些残基被非极性化的侧链围绕，以促进质子转移。打断n 乙酰粘质酸- n 乙酰氨基葡萄糖键。人们用定点突变技术和酶专一性抑制剂实验证明了谷氨酸位于细菌和 真菌的c b h ，e g 和葡萄糖昔酶的催化位点，也有的纤维素酶中天冬氨酸、组氨酸和精氨 酸位于催化位点，参与催化反应。推测谷氨酸3 3 和天冬氨酸5 0 参与葡萄糖内切酶催化： 实验证明谷氨酸6 5 和天冬氨酸8 l ，9 2 可能是纤维二糖水解酶的催化残基【1 2 】。 纤维素酶降解纤维素的作用机制以协同理论最为广泛接受。1 9 5 4 年g i l l i a n 和r e e s e 首先证明纤维素酶在消化纤维素时具有协同性，他们发现纤维素复合酶对w a l s e t h 纤维素 ( 部分降解的酸化底物) 的降解程度大于单一组分酶。m a n d e l s ( 1 9 6 4 年) 和l i ( 1 9 6 5 年) 证明 内切葡聚糖苷酶和外切酶的协同作用能够影响抗性更大的底物，如棉花和微晶纤维素的水 解。此后，这种内切夕 、切酶间的协同性在很多菌种的纤维素酶系中得到证实。w h i t e 和 b r o w n ( 1 9 8 1 年) 用电子显微镜证明了内切矽h 切酶组分间在水解结晶纤维素时的协同作用。 f a t e r s t a m 等( 1 9 8 0 年) 发现两种外切酶c b hi 和c b hi i 联合降解结晶纤维素的速度是单组 分酶的两倍，对于这种外切- 夕r 切协同性( e x o e x o s y n e r i s m ) n - - j 能的解释是两种外切酶具有不 同的底物立体特异性，每一种酶都进攻底物中可能存在的两种不同类型的非还原末端中的 一种 1 3 q 5 】。当一种外切酶从某种类型的非还原末端切下一个纤维二糖单位后，暴露出另一 种类型的非还原性末端，被在邻近链上的第二种立体特异性的外切酶切下纤维二糖单位。 这种邻近链上两种酶的成功运作就可解释观察到的协同性。 纤维素酶各组分在纤维素降解过程中普遍存在协同作用。一般地，外切酶作用于不溶 吉林农业大学硕士学位论文纤维素酶工程菌的构建及表达 性纤维表面，使形成结晶结构的纤维素长分子链开裂，长链分子末端部分发生游离，从而 使纤维素分子易于水化，产生大量非还原性末端的纤维素小分子；内切酶作用于经外切酶 活化的纤维素，水解其内在的d 1 ，4 糖苷键，产生纤维二糖和纤维寡糖等短链低聚糖：p 1 ，4 糖苷酶则将短链低聚糖分解为2 个葡萄糖单位。 应该注意的是，这种协同作用不仅作用顺序不是绝对的，而且各种酶的功能也不是单 一、固定的。研究表明，e g 和c b h 都能引起纤维素的分散和脱纤维化( 沿纤维素的经度 轴方向分层，形成更薄更细的亚纤维) ，这样纤维素的结晶结构被打乱，导致变形，使纤 维素酶能深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁、腔壁和微裂隙缝的压力增大，水 分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性的微结晶，利于进一步被 降解。 1 2 产纤维素酶的微生物 自然界可产生纤维素酶的微生物主要包括真菌、细菌、放线菌，除了蜗牛、蚂蚁等少 数低等动物外，高等动物体内不产生纤维素酶；草食动物瘤胃及盲肠中微生物产生的纤维 素酶降解纤维素可为草食动物提供能量。 自然界中广泛地存在着能降解纤维素的微生物，它们种类繁多，包括细菌、放线菌和 真菌等。细菌类有红黄纤维弧菌、普通纤维弧菌等；放线菌类有链霉属、高温放线菌属和 等；真菌类有黑曲霉、血红栓菌、卧孔属、绳状青霉、里氏木霉、绿色木霉等。谢占玲等 发现对纤维素作用较强的菌株多是木霉属、曲霉属、青霉属和枝顶孢霉属的菌株。特别是 绿色木霉及其近缘的菌株，由于真菌纤维素酶产量高、活性高，故在畜牧业和饲料工业中 应用较多。随着分子生物学、遗传工程的迅猛发展，国内外均在尝试应用基因工程技术来 改造和构建高效纤维素降解菌，而且对特殊环境中的纤维素酶产生菌也发生了浓厚的兴 趣。这些菌具有独特的酶学性质，扩大了纤维素酶的应用范围。 木霉( t r i c h o d e r m as p p ) 是一类在各种气候带的土壤中能够普遍存在的一种多细胞丝 状真菌，最近的研究表明他们与其他寄生真菌一样，是无毒的植物共生生物。其中主要包 括瑞氏木霉( 碱c h o d e r m ar e e s e i ) 、绿色木霉( 瞄c h o d e r m av i r i d e ) 、康宁木霉( 强c h o d e r m a k o n i n g i i ) 和拟康氏木霉( t r i c h o d e r m ap s e u d o k o n i n i ) 等。特别是木霉属真菌能够分泌完全 的纤维素酶系，其中绿色木霉产量较高并且稳定，故而目前纤维素酶商业化生产作为主要 生产菌株【1 6 1 7 1 。 1 3 纤维素酶基因的克隆及表达概况 纤维素酶的合成一般受纤维素诱导及葡萄糖降解物的阻遏【l 引。根据这一特性，k n o w l e s 等成功从t r e e s e i 中克隆到了c b h 和e g 基因。将t r e e s e i 分别接种于含纤维素和葡萄 糖的培养基中，培养后提取m r n a ，前者富含编码纤维素酶的m r n a ，后者几乎不含纤 维素酶m r n a 。以这两种m r n a 为探针对己构建的c d n a 文库进行异性杂交，那些只能 吉林农业大学硕士学位论文纤维素酶工程菌的构建及表达 与纤维素诱导的m r n a 杂交的克隆则有可能是编码纤维素酶的e d n a 。由此最后从t r e e s e i 中分离得到了两个c b h 基因和两个e g 基。 迄今为止，人们已从4 0 多种细菌和数种真菌中克隆到了多种纤维素酶基因【l 引，有一 百多种基因可在大肠杆菌中表达，主要是内切b 1 , 4 d 葡聚糖酶和1 3 葡萄糖苷酶。大多 数克隆的纤维素酶基因能产生信号肽，从而使表达产物部分或全部转移至e c o l i 的细胞质 间隙。虽然克隆到大肠杆菌的基因，不需要载体的启动子就可表达，但表达水平很低，推 测可能是其启动子不能完全被识别的缘故。为了得到胞外分泌产物，一些纤维素酶基因己 在枯草芽抱杆菌、嗜热脂肪芽抱杆菌、乳酸发酵短杆菌和变青链霉菌中得到有效表达，在 其p h o s p h o g l y c e r o k i n a s e 的启动子下得到表达并高度糖基化，胞外分泌量约l o o m g l t 2 0 l 。 通过基因操作获得过量纤维素酶还需进一步研究，如丝状真菌t r e e s e i 等可大量合成和分 泌胞外纤维素酶，高产菌株可达4 0 9 l 的酶蛋白【2 l 】。多数菌株纤维素酶的合成既受纤维二 糖、山梨糖等的诱导，又为葡萄糖、甘油等易利用碳源的阻遏，还受菌体生长速度的影响。 随着以分子克隆为基础的基因重组技术的快速发展，通过利用分子生物学和基因工程 的方法对纤维素酶基因进行了克隆和一级结构的测定，迄今为止人们已经从多种细菌和真 菌中克隆得到了纤维素酶基因。在s w i s s p r o t 蛋白质数据库中，己有1 4 0 个内切酶， 1 9 个外切酶和1 0 2 个1 3 一葡萄糖苷酶的全序列。细菌主要产中性纤维素酶和碱性纤维素 酶。由于酶的耐热性在生产中具有实用意义，所以耐热细菌是研究的热点【冽。 从上世纪七十年代开始，纤维素酶基因克隆研究主要集中在酸性纤维素酶方面，发展 非常迅速。由于丝状真菌木霉属能产生大量的胞外纤维素酶，酶系较完全，并且对结晶纤 维素有较好的酶解活性，近十几年来对真菌木霉属纤维素酶基因做了大量的研究，其中对里 氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e o 纤维素酶基因的研究比较透彻，克隆了c b h i 、c b h i i 、e g i 、 e g i i i 、e g v 和b g l i 基因，并测定了这些基因的核苷酸序列。但对于绿色木霉的研究直到 九十年代初仅有c b h i 基因克隆的报道。王建荣、张曼夫利用里氏木霉的基因序列同源片 段做探针，构建了绿色木霉基因文库1 2 引，并克隆了c b h i 、c b h i i 基因，并对其基因结构 进行了研究。现已克隆的纤维素酶基因绝大多数都用基因原有的启动子或载体上的启动子 在大肠杆菌( e c o l i ) 中得到了表达 2 4 2 5 1 ，例如利用r t p c r 技术从里氏木霉中克隆到了 b g l i 基因的e d n a ，并使之在大肠杆菌中表达等。但在大肠杆菌中表达纤维素酶基因存 在两个主要问题：一是提取有很大困难，二是表达水平低、酶蛋白不能分泌，离工业化应 用的目标还有一定的距离，所以在纤维素酶基因的表达方面人们将目光转向了真核表达系 统【2 6 1 。 1 4 纤维素酶的应用 1 4 1 纤维素酶在食品工业中的应用 纤维素酶在食品工业应用极为广泛。在制酒行业中，进行酒精发酵时添加纤维素酶可 显著提高酒精和白酒的出酒率和原料的利用率，降低溶液的黏度，缩短发酵时间，而且酒 5 吉林农业大学硕士学位论文纤维素酶工程菌的构建及表达 的口感醇香，杂醇油含量低。将纤维素酶应用于啤酒工业的发芽生产中可增加麦粒溶解性， 加快发芽，减少糖化液中单一葡萄糖含量，改进过滤性能，有利于酒精蒸馏【2 9 3 0 l 。纤维素 酶用于固态无盐酱油发酵，能将包裹蛋白质的纤维素分解，使蛋白质呈裸露状态，便于蛋 白酶分解蛋白质，提高酱油得率，加快发酵速度，改善酱油风味和质量。在食醋酿造过程中， 将纤维素酶与糖化酶混合使用，可明显提高原料利用率和出品率1 3 。用纤维素处理豆腐渣 后接入乳酸菌进行发酵，可制得高营养、高品位的发酵饮料。纤维素酶应用于果蔬榨汁、 花粉饮料有利于细胞内物质渗出、增加出汁率约1 0 、减少压榨压力、促进汁液榨取和澄 清作用。目前有报道已经成功地将柑橘皮渣酶解制取全果饮料，其中的粗纤维有一半以上 都能降解为膳食纤维，具有很高的医疗保健价值。 1 4 2 纤维素酶在饲料工业中的应用 近年来，纤维素酶在饲料工业上的应用越来越普及。因为畜禽饲料中含有大量的纤维 素，除某些反刍动物( 绵羊等) 具有分解纤维素能力外，大部分畜禽不具此能力。另外， 纤维素酶除直接降解纤维素，还和其他酶协同作用，提高动物对饲料营养物质的分解和消 化。在实际生产中，通常将纤维素酶与半纤维素酶、果胶酶、b 葡聚糖酶等组成复合酶 添加到饲料中。目前国内外利用纤维素酶的方法有体外酶解法和体内酵解法两种，体外酶 解法是把纤维素酶和秸秆饲料拌匀，在一定温度、湿度和p h 之下堆积和密封发酵一定时间， 晾干后直接饲喂动物。例如：当用纤维素酶制剂作用裸麦、大麦、玉米时，可使糖的总糖 量明显增加。在青贮饲料中加纤维素酶使纤维素分解促进乳酸发酵，这样处理后的青贮饲 料，比对照柔软，曲香味明显提高，酸度和还原物质随纤维素减少而增加。另外加纤维素 后，由于纤维素被消化，乳酸发酵提高，贮存性能也提高。在饲料中添加纤维素酶，能有 效地提高鲤鱼和草鱼等饲料的营养物质消化率，喂幼鸡、仔猪及一般虚弱动物时，喂养效 果明显，喂蛋鸡可提高产卵量，喂乳牛时，不仅可以使体重增加，而且提高产乳量。体内 酵解法是把纤维素酶以添加剂的形式加到精料中，拌匀后饲喂动物，借助于动物消化道的 内环境发挥作用。纤维素酶是畜牧业中的一种新型饲料添加剂，能够分解结构复杂的纤维 素，生成易消化物质葡萄糖，摧毁细胞壁释放内容物，便于动物消化吸收。能够为畜禽体 内增加和补充各种消化酶，强化消化系统的酶解功能，增进食欲，促进生长发育。为了提 高饲料的消化率，在配合饲料中添加极少量纤维素酶( 一般在0 1 , - - - 0 3 ) 即可收到显著 效果【3 2 3 4 】。 1 4 3 纤维素酶在医药中的应用 中草药所含成分十分复杂，既有有效成分，又有无效成分和有毒成分。为了提高中草 药的治疗效果，就要尽最大限度提取有效成分，去除无效成分及有毒成分。因此，中草药 提取对于提高中药制剂的内在质量和临床疗效最为重要。但常用的提取方法( 如煎煮法、 回流法、浸渍法、渗滚法等) 在保留有效成分，去除无效成分方面，存在着有效成分损失 大、周期长、工序多等缺点【3 5 3 6 j 。近年来，用于中药提取方面研究较多的是纤维素酶，该 吉林农业大学硕士学位论文纤维素酶工程菌的构建及表达 方法的应用，使得中草药提取既符合传统的中医理论，又能达到提高有效成分的收率和纯 度的目的。大部分的中药材的细胞壁是由纤维素构成，植物的有效成分往往包裹在细胞壁 内，用纤维素酶酶解可以使植物细胞壁破坏，有利于有效成分的提取。如侯嵘娇等首先将 工业纤维素酶应用于中药及药渣中，使中药及药渣的纤维素酶解为葡萄糖，变渣为药，变 废为宝，这对中药制药工业是一个开源节流的创举。 纤维素酶用于以纤维素为主的中药材提取有效成分，的确能提高有效成分的收率，但 要拓宽其应用领域，还需要迸一步深入探讨酶的浓度、底物的浓度、温度、酸碱度、抑制 剂等对药物提取的影响，使该法得到更广泛的应用。 1 4 4 纤维素酶在其它方面的应用 除上述用途外，纤维素酶在环境保护和纤维素废料处理、纺织、造纸、洗涤剂、地质 钻井等方面均有很大的应用潜力。传统的棉和其他纤维的练漂是在碱性介质中进行，虽然 处理结果可以达到要求，但碱性废水治理却非常困难。b a c h 和s c h o l 两人比较了用商品化 纤维素酶和n a o h 进行煮练的不同，结果发现，碱煮练织物的比重比酶处理要高1 ；在纤 维降解程度相同情况下，纤维素酶处理后织物白度更好【37 1 。在纺织后整理工艺中，利用纤 维素酶对纤维织物进行生物处理，即酶降解整理，在使纺织物的强力下降的同时，可使织 物表面变得滑爽，织物蓬松，手感厚实、柔软，布面清晰，布料悬垂性好、吸湿性强。用 纤维素酶适当处理纸浆，能增加微细纤维的生成量和提高保水度，有可能促使某些纸张的 抗张力提高。用做洗涤剂，碱性纤维素酶可以选择性吸附在棉纤维的非结晶区，使棉纤维 膨松，水合纤维素分解胶状污垢脱落。 目前，“白色污染”倍受人们关注，作为解决“白色污染 问题有效途径之一的可降 解塑料的研究自然很受人们的重视。近年来利用米曲霉发酵生产l 乳酸，但以葡萄糖、淀 粉为原料的生产成本依然较高，限制了l 哥l 酸在可降解塑料方面的应用【3 & 3 9 】。玉米中含有 丰富的米曲霉生长所需的营养因子，直接利用玉米为原料生产l 乳酸，可以利用这些丰富 的营养因子，提高原料的利用率。先后有人用纤维素酶水解玉米芯得到了l 乳酸，并研究 确定了纤维素酶水解玉米芯的最佳条件 4 0 - 4 2 。 1 5 本研究的目的和意义 纤维素属于可再生自然资源，是生物界最重要的碳源物质，每年由光合作用产生的植 物干质量约2 2 0 亿吨，其中纤维素占5 0 。我国每年仅作物秸秆的纤维产量就达2 亿吨以 上。因此，利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径，对 解决环境污染、食品短缺、能源危机和人类社会的可持续发展具有重大的现实意义。 目前，纤维素酶已被广泛用于纺织工业、饲料工业、工业酒精制造及医药工业等领域， 我国年需求量大于2 0 0 0 0 吨，而目前国内产量不到1 5 0 0 吨，而且由于产酶菌种落后，产 率低，成本高，严重影响我国纤维素酶工业发展 4 3 - 4 5 1 。本研究采用先进的分子生物学技术， 吉林农业大学硕士学位论文 纤维素酶工程菌的构建及表达 预期成功构建出高活力纤维素酶工程菌株，达到先进水平。预期该菌产酶活力高，稳定性 好，适用于液体和固体发酵，能极大降低纤维素酶生产成本，所产纤维素酶完全适用于纺 织、饲料、酒精及医药工业m 4 8 】。 绿色木霉所产生的纤维素酶的降解作用日益受到重视，国内外对这方面的研究也日益 增多。绿色木霉所产生的纤维素酶可将废报纸中的纤维素转化为可发酵的糖，不仅减少了 环境污染，还对废报纸进行了回收利用。但其所产生的纤维酶的生物转化尚未扩展到工业 规模，原因是纤维素酶的量较低、生产成本高等。随着转基因技术的不断成熟，绿色木霉 纤维素酶基因在基因工程上的应用，逐渐引起人们的关注 4 9 。5 1 1 。 纤维素酶工程菌的选育、发酵工艺研究及纤维素酶的生产应用对纤维素资源的开发利 用有重要意义和具有广阔的开发前景【5 2 1 。 1 6 本研究的主要内容 本研究根据绿色木酶c d n a 序列设计合成引物，p c r 扩增c b hi i 基因序列，将完整 的目的基因与表达载体p u t 连接，转入大肠杆菌d h 5q 中，获得重组质粒p u t - c b h 。再 将p u t - c b h 重组质粒与强启动子p k i a 片段以合适的比例连接，转入大肠杆菌d h 5a 中， 获得具有p k ia 强启动子的重组表达质粒p u t - c e 。构建的重组表达质粒分别采用电穿孔 法转化回原宿主菌绿色木霉，得到的阳性转化子通过s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纤维 素酶基因在原宿主菌中的表达。用b e na 显性标记进行初筛后进一步采用刚果红染色法复 筛，并进行液体摇瓶培养，检测发酵液酶活力以及遗传稳定性。 1 7 目前纤维素酶研究的热点及存在的主要问题 纤维素酶在现阶段已经广泛应用于饲料、食品、洗涤、纺织等各个领域，今后必将在 应用深度和广度上还有更大的扩展。专家预测纤维素酶的研究开发是新世纪可再生性资源 利用的关键【5 3 6 5 1 。纤维素的生物转化对于解决世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题 具有重要意义。为此，人们在利用纤维素酶进行纤维素的生物转化方面进行了大量的研究。 例如，以纤维素为碳源发酵生产s c p 、葡萄糖、酒精【5 每删。但目前这些