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浙江工商人学硕l 学位论文 逆流色谱法分离油菜籽中的硫代葡萄糖苷 摘要 硫代葡萄糖苷( 简称硫苷) 是广泛存在于十字花科植物中的含硫 次生代谢产物。此类化合物及其降解产物具有广泛的生物活性，不仅 可以抑致细菌和微生物的生长，还具有很好的抗癌活性。因此，对硫 苷的分离提纯及其结构鉴定在食品科学、生物医学等方面有着重要的 实践意义。逆流色谱是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱技 术，它可以实现连续高效的分离和制备。本论文应用逆流色谱技术分 离油菜籽中的硫代葡萄糖苷，为硫代葡萄糖苷的分离制备打下技术基 础。 本研究对逆流色谱分离油菜籽中的硫代葡萄糖苷的溶剂系统进 行了研究，找到了合适的溶剂系统正丁醇乙腈1 0 硫酸铵溶液( 1 ： 0 5 ：2 2 ) 。采用柱容积2 0 0m l 的h s c c c d 2 0 0 型高速逆流色谱仪分 离4 0 0 r a g 油菜籽粗提物，得到1 3 6 r a g a 2 组分( 主要为烯丁基硫苷， 下同) 和4 7 。2 r a gb 组分( 主要为2 - 羟基3 烯丁基硫苷，下同) ，分 离时间8 5 小时。采用柱容积3 4 0 0m l 的s r c c c d 3 4 0 0 型低速逆流 色谱仪分离7 9 油菜籽粗提物，得到8 6 3 m ga 2 组分和5 2 1 4 m gb 组 分，分离时间2 2 个小时。本实验还研究了流动相流速、色谱柱转速、 进样量等参数对固定相的保留率及分离效果的影响，优化了分离条 件。逆流色谱分离获得的硫代葡萄糖苷组分，经制备高效液相色谱等 浙江工商人学颈士学位论文 进一步纯化得到三种硫代葡萄糖苷单体：( 1 ) e 一( n ) 烯丁基硫苷( 2 ) z ( n ) 烯丁基硫菅( 3 ) 2 一羟基一3 一烯丁基硫苷。它们的结构经e s i m s 和1 h n m r 、1 3 c n m r 进行了鉴定。 o h 2 羟基3 烯丁基硫苷 应用柱容积1 2 0 0m l 的h s c c c d 1 2 0 0 型高速逆流色谱仪对高速 逆流色谱仪分离油菜籽硫代葡萄糖苷进行了放大实验，3 9 油菜籽粗 提物，经2 3 个小时分离，得到3 6 4 5 m g b 组分。应用柱容积2 2 l 的s r c c c d 2 2 l 型低速逆流色谱仪对低速逆流色谱仪分离油菜籽硫 一 西 一 一 一 。嘶一q 嘶 匆聃一匆洲一命 浙江t 商大学硕士学位论文 代葡萄糖苷进行了放大实验，5 0 9 油菜籽粗提物经6 5 小时分离，得 到3 3 7 9b 组分。高速逆流色谱被放大到g 级规模；低速逆流色谱被 放大到1 0 9 级规模。 关键词：硫代葡萄糖苷，逆流色谱，油菜籽，分离 i l l 浙江工商人学 鳓l ：学位论文 s e p a rp m o no fg l u c o s i n o l a t e sf r o mr a p e s e e d b yc o u n t e r c i 瓜re n tc h r o ( r 0 g r a p h y a b s t r a c t g l u c o s i n o l a t e sa r ea n i o n i c ，h y d r o p h i l i cp l a n ts e c o n d a r ym e t a b o l i t e s w h i c ha l eo fp a r t i c u l a ri n t e r e s td u et ot h e i rr o l ei nt h ep r e v e n t i o no f c a n c e ra n do t h e rc h r o n i ca n dd e g e n e r a t i v ed i s e a s e s t h e r e f o r e ，i tw a s v e r yi m p o r t a n tt os e p a r a t ea n di d e n t i f yg l u c o s i n o l a t e sf r o mc r u c i f e r o u s p l a n t s ，w h i c hw o u l db eb e n e f i tt ot h ed e v e l o p m e n to fp r o d u c t si n v o l v i n g g l u c o s i n o l a t e s c o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ( c c c ) i sal i q u i d l i q u i d p a r t i t i o nc h r o m a t o g r a p h yt h a tn os o l i dm a t r i xi sr e q u i r e d ，a n dc a nr e a c h h i g l ie f f i c i e n ts e p a r a t i o na n dr e c o v e r y i nt h ep r e s e n ts t u d y , t w ok i n do f c c c ，h i g h s p e e dc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ( h s c c c ) a n ds l o w r o t a r yc o t m t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ( s r c c c ) w e r ea p p l i e dt os e p a r a t e g l u c o s i n o l a t e si nt h er a p e s e e de x t r a c t ac c cs o l v e n t s y s t e mc o m p o s e do fb u t a n o l a c e t o n i t r i l e - 10 a m m i a o n i as u l f a t e ( 1 ：0 5 ：2 2 ) w a sf o u n da sa ne x c e l l e n ts o l v e n ts y s t e m t o s e p a r a t et h eg l u c o s i n o l a t e s i nt h ec r u d ee x t r a c tf r o mr a p e s e e d u s i n gh s c c c d 2 0 0w i t ha2 0 0m lc o l u m n 4 0 0 m gc r u d ee x t r a c tf r o m 浙江工商人学硕1 - 学位论文 m p e s e e d w a s s e p a r a t e d t o y i e l d 1 3 6 m g a 2 ( z 一( n ) 一3 一b u t e n y l g l u c o s i n o l a t e ) a n d 4 7 2 m g b ( 2 - h y d r o x y - 3 - b u t e n y l g l u c o s i n o l a t e ) i n8 5h o u r s u s i n gs r c c c d 3 4 0 0 w i t ha3 4 0 0m lc o l u m n ，7 9c r u d ee x t r a c tf r o mr a p e s e e dw a ss e p a r a t et o y i e l d8 6 3 m ga 2a n d5 2 1 4 m gb i n2 2h o u r s t h ep a r a m e t e r si n f l u e n c i n g t h ec c cs e p a r a t i o nw e r es t u d i e dt oo p t i m u mt h es e p a r a t i o nc o n d i t i o n s t h eg l u c o s i n o l a t ec o m p o n e n t sf r o mc c cs e p a r a t i o n sw e r ep u r i f i e db y p r e p a r a t i v e i - i p l ct o y i e l d t h r e e g l u c o s i n o l a t e m o n o m e r s ： e f n ) 一3 - b u t e n y l g l u c o s i n o l a t e ， z 一( n ) 一3 - b u t e n y l g l u c o s i n o l a t e a n d 园o h o o o h f v 浙江t 商人学硕i ：学位论文 匆o h 一心i s o - 2 - h y d r o x y - 3 - b u t e n y l g l u c o s i n o l a t e t h es c a l e - u p so fc c cw e r es t u d i e d u s i n gh s c c c d 1 2 0 0w i t h 1 2 0 0m lc o l u m n ，3 6 5 4 m gbc o u l db eo b t a i n e df r o mt h es a m p l eo f7 9 c r u d ee x t r a c ti n2 3h o u r s u s i n gs r c c c - 2 2 lw i t h2 2lc o l u m n ，3 3 7 9b c o u l db eo b t a i n e df r o m5 0 9c r u d ee x t r a c ti n6 2h o u r s t h es e p a r a t i o n s w e r es c a l e du pt og r a m sw i t hh s c c ca n d1 0g r a m sw i t hs r c c c ， k e y w o r d s ： g l u c o s i n o l a t e s ， c o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y , r a p e s e e d ，s e p a r a t i o n v i 浙江工商大学碗t 学位论文 符号说明 6 c i c u 1 3 c n m r e 1 m s f a b m s h 。n m r h p l c h s c c c m j k m z p t f e r f s r c c c t l c u v 化学位移 溶质在固定相中的质量浓度 溶质在流动相中的质量浓度 核磁共振碳谱 电子轰击质谱 快原子轰击质谱 核磁共振氢谱 高效液相色谱 高速逆流色谱 红外光谱 偶合常数 分配系数 质荷比 聚四氟乙烯 比移值 低速逆流色谱 簿层色谱( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ) 紫外光谱 6 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 签名： 珈磊 日期：河7 年月嬲曰 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文 的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：莶篁左导师签名： 日期：3 6 4 浙江工商人学颂十学位论文 第一章文献综述 第一节硫代葡萄糖苷的研究概况 硫代葡萄糖苷( g l u c o s i n o l a t c s ，简称硫苷1 是一类化合物的总称，它广泛存在 于十字花科植物的根、茎、叶、果实及种子中，至今已发现1 2 0 多种【】硫苷本 身是一稳定豹化合物，但在芥子酶( m y r o s i n a s e s ) 存在的条件下以及没有芥子酶存 在而在高温高压下都会发生降解反应，生成异硫代氰酸酯( i t c ) 、硫代氰酸酯、 嗯唑烷硫酮( o z d 及腈类等降解产物【2 一l 。硫苷及其降解产物异硫代氰酸酯具有 活跃的生物化学特性，尤其是抗癌活性已受到越来越多国内外学者的关注，并碍 到了广泛的认同，因此对其深入研究富有重大的意义。 一、硫代葡萄糖苷的结构及其分类 对硫苷的研究已经2 0 0 多年，1 9 世纪末，g a d a m c l _ 【4 1 最早提出了硫苷的结构， 他认为侧链r 基团直接连在n 原子，结果这种结构不能很好地解释硫苷的许多 特性。直到1 9 5 6 年，e t t l i n g e r 和l u n d e e n l 5 6 j 才。用x - 射线衍射的方法证明了硫苷 的结构如图1 - 1 所示。在超过3 0 0 0 种的十字花科植物中的硫代葡萄糖苷都具有 相似的化学结构。基本结构包含一个伊d 含硫葡萄糖，一个磺酸赫醛肟基团和一 个来源于氨基酸的侧链【3 。后来w a s e r 和m a r s h 3 1 又对硫苷的结构作了深入的 解释，认为双键c 原子、o 原子、n 原子、s 原子以及r 基团中的与双键c 原 子相连的c 原子共同处在同一平面上，并且c = n 上的立体异构为z 式。由于众 多硫苷具有相同的母核结构，差别仅在于r 基团的不同上，因此可根据r 基团 的不同对硫苷进行分类：脂肪族硫苷( 第一类) 、芳香族硫苷( 第二类) 和吲哚型硫 苷( 第三类) 。表一列出了几种常见的硫苷。 图1 - 1 硫代葡萄糖营的结构 f i g 1 - 1c h e m i c a ls t n l c t u r co f g l u c o s i n o l a t c s k 匆州 浙江工商大学硕j ：学位论文 第 一 类 c h t c h ，= c h c h 2 一 c h 2 = c h c 1 2 一c i l 2 一 c h f c h c h 2 一c h 2 一c 地一 c h f c h c l ( 伽) 一c h 2 一 c h ，= h c m c h ( 叫) c 1 2 一 c h 。一s c i i z c h 2 一c l 2 一 c t b 一( c 1 2 ) z c o 一( c t h ) 。一 a b o 一一( c | k ) o c m s c h 2 一c k 一 甲基硫代葡萄糖苷 烯丙基硫代葡萄糖苷 烯丁基磷玳葡萄糖苷 烯戊基硫代葡萄糖苷 二羟基，3 一烯丁基硫苷 2 羟基4 烯戊基硫苷 3 甲硫基丙基硫苷 4 羰基庚基硫苷 3 甲酯基丙基硫苷 2 甲硫基乙基硫苷 g l u c o c a p p a r i n s i n i g r i n g l u c o n a p i n g l u c o b r a s - s i c a n a p i n p r o g o i l r i n g l u c o n a p o l o i f c r i n g l u c o i b c x v a i n g l u c o c a p a n g u l i n g l u c o e r y p e s t r l n g l u c o v i o r v l i n c h 3 一s c i ：c h c h 2 一c i l 2 4 - 甲硫基3 丁烯基硫苷d e h v d r o e r u c i n 二、硫代葡萄糖苷的分布 硫代葡萄糖苷作为植物重要的次生代谢产物广泛存在于各种植物中，但以十 字花科植物中的含量最高，种类也最全。所有的十字花科植物都能够合成硫代葡 萄糖剖9 1 。硫苷在一些十字花科植物中含量大约占干重的1 ，在某些植物种子 中可达1 0 。但是，硫苷在植物中的含量变化很大，不同品种、同一品种的不同 生长阶段以及同一植株的不同部位含量都存在差别【i o j ，如g l u c o r a p h a n i n e 在西兰 花嫩芽中的含量是成熟植株或花的1 0 一1 0 0 倍。在十字花科植物中芸苔属植物是 主要的食用蔬菜，包括花椰菜、西兰花、芥菜、甘蓝、芜菁等。硫苷在芸苔属蔬 菜中的含量般在5 0 2 0 0 0 嵋值，西兰花、花椰菜、甘蓝均含有5 - - 6 种以上的 2 浙江_ t 商大学硕十学位论文 硫苷【1 1 】。除了十字花科植物外，至少还有5 0 0 种非十字花科双子叶植物含有己 发现的1 2 0 种硫苷的一种或几种。r o d m a n l l 2 1 曾列出了各种类型硫苷在各含硫苷 植物中的分布，如表2 所示。从表中可以看出芸苔属植物中含有硫苷的种类最多 最全，其它属植物中只含有少量的一种或几种硫苷。目前我国大面积种植的含硫 苷植物主要是各种芸苔属蔬菜，这也是我国居民摄取硫苷的主要来源【1 1 】。 表1 - 2 含硫营的植物种属以及所含硫苷的种类比较 t a b l e1 - 2t h eg l u c o s i n o l a t et y p e si nt h ep l a n tg e n e r a 硫苷类型根据r 摹团分类：a ，r = c i g s ( c h z ) n 、o h s o ( c b 2 ) r l 、c h 3 s m ( c h z ) n ；b ，r = 直链饱和烷烃类：c ， r = 支链饱和烷烃类：d r - 末端双键烷烃类或末端) 义键醇类：e ，r = 直链或支链饱和醇类；f ，r = 直链 酮类；g ，r = 芳香类；h ，r - 苯甲酸酯类；i ，r = 吲哚类；j ，r = 多葡萄糖苷类或其它。 三、硫代葡萄糖苷的分析方法 硫代葡萄糖苷的分析方法可分为：硫苷总量的测定和单种硫苷的分析。 l 一) 硫苷总量的测定 对于硫苷总量的测定方法，早在1 9 8 3 年m c c n - e g o r t l 3 1 就提出了6 种方法。在 这6 种方法中有5 种是通过测定硫苷的水解产物或是水解产物的衍生物间接测定 硫苷含量，第6 种方法是通过测定硫苷三甲基硅烷衍生物来测定硫苷。现在测定 硫苷总量的方法已经很多，但其实都是这两种方法的演化、发展。在前一种方法 中，水解反应的程度以及水解副产物的含量与酶的活性、水解时间、p h 值的大 小都有直接关系，水解条件不易控制，因此测定结果往往不是很准确；相比之下 后一种方法则不受上述条件的限制，测量结果相对准确。国内也报道了不少硫苷 总量的测定方法。戈兰英【1 4 1 报道了用麝香香酚分光光度法测定油菜籽中硫苷的 含量，但此方法对玻璃器皿的清洁度要求特别严格。1 9 8 3 年吴谋成i l5 】等发展了 氯化钯法，在实验中加入分散剂羧甲基纤维素钠，改进了显色反应条件，使该方 3 浙江工商大学硕上学位论文 法称为快速、简便的定量分析方法，但由于没有考虑硫苷分量之间的摩尔吸光系 数的差异，测试结果可靠性较低。佘珠花【1 6 l 等用硫脲紫外法测定了菜籽饼粕中 的硫苷，并提出了改进意见，但操作要求严格。严远型1 刀等讨论了a a 3 5 s 0 4 同位 素稀释分析法高精密分析菜籽硫苷总量，这种方法可实现准确定量测定，但分析 过程复杂，且需使用同位素，需在同位素实验室操作，分析成本较高。相比以上 几种方法，近红外漫反射光谱分析技术( n i r s ) 具有明显的优势，快速、简便、 样品用量小、无药品污染、准确度高f 1 8 】等特点决定了它在硫苷分析中越来越受 青睐。 l 二) 单种硫苷分析方法 对单种硫苷的分析方法可分为三个阶段：纸色谱和薄层色谱法、气相色谱法、 液相色谱法。 最初，硫营的分离主要采用纸色谱和薄层色谱的方法。1 9 6 9 年d a n i e l a k t l 9 】 等利用薄层色谱法对1 5 1 种十字花科植物中的硫苷进行了分离，但只能将少数几 种硫苷分离，分离效果不理想。后来气相色谱逐渐发展，y o u n g s l 2 0 】等首先提出 了用气相色谱分离检测硫苷。在实验中，先将硫苷酶解得到异硫氰酸酯，再用气 相色谱对水解产物进行分离检测。硫苷的一种定性方法是通过与标准样品保留时 间的比较得以实现，另外还可以用g s m s 【2 l 】对硫苷水解产物进行分析从而确定 硫苷的分子结构。硫苷的定量则是以异硫氰酸酯为标准物质，利用外标法或内标 法进行。后又有人利用三甲基硅烷柱前衍生的方法得到易挥发的硫苷衍生物，再 用气相色谱分析【2 2 捌。应用气相色谱法可以分离检测多种硫苷但不能用来分析吲 哚型硫苷，因为吲哚硫苷降解产生的异硫氰酸酯很不稳定，无法检测；吲哚硫苷 在低温下衍生化作用不完全，高温又容易使吲哚硫苷分解，故柱前衍生化气相色 谱法也不适宜于吲哚硫苷的分析。另外，甲基硫氧基烷基硫苷在柱前衍生时得到 多种衍生物，也不利于硫苷的分析。 h p l c 法是国际标准化组织( i s o ) 提出的测定硫苷的两种官方方法之一。1 9 8 0 年f e n w i c k 2 们等首先报道了反相高效液相色谱法分离硫苷。这种方法首先要求首 先对硫苷进行脱硫酸盐化处理，使硫酸根被o h 取代，然后再用高效液相对其进 行分离分析。应用此方法可以分析比较复杂的硫苷组成体系，而且可以直接和质 谱联用鉴定硫苷的结构。但这种方法也有缺点，如硫苷的预处理耗时长、定量困 4 浙江工商大学硕士学位论文 难，更重要的是去硫作用容易使硫苷分子的生物活性消失，不能实现对完整硫苷 的分离分析。反相离子对色谱用于带电荷物质的分离是一种比较理想的方法， n u c h a n a r tr a n g k a d i l o k l 2 5 l 等以四甲基溴化铵为离子对试剂利用反相离子对色谱 成功地实现了对芸苔属粗提样品中硫苷的分离；w e s t 2 6 等利用甲醇、水和醋酸 按组成的流动相体系，在反相c 1 8 柱上成功分离了极性和非极性的硫苷。我国 的学者在这方面也做了大量研究。何洪巨【2 7 1 等以甲醇、醋酸铵组成的流动相体 系，以梯度洗脱的方式成功分离鉴定了芥蓝中的硫代葡萄糖苷。后又以 h p l c e s i m s 研究了标准硫苷的m s m s 负离子质谱，解决了目前硫营标准样品 不好购买，应用h p l c 无法鉴定的问题。袁丽风【2 8 】等以挥发性的三乙胺作为离 子对试剂，利用电喷雾接口将反相离子对色谱与质谱联用，很好地分离了菜籽中 硫苷类物质，并成功鉴定了油菜籽中的多种硫苷。王志刚【2 9 】等对硫苷反相色谱 分离保留机理进行了量子化学研究，发现硫苷与固定相相互作用体系的总能量、 分子偶极距以及流动相氢键作用三个因素与保留率具有一定的相关性。 四、硫代葡萄糖苷的抗癌活- 眭 硫代葡萄糖昔的生物活性中最引人注目的是其抗癌活性，而这种抗癌活性是 通过其降解产物异硫代氰酸盐表现出来的。对此类物质的抗癌活性的报道已有很 多。z h a n g 和t a l a l 捌报道了某些硫苷降解产物可以有效预防肺癌、结肠癌、 肝癌及胃癌的发生；n a s u - u z z i 3 1 】等指出丙烯基异硫代氰酸酯能够抑制癌细胞的形 成；m a n s 【3 2 】等提出2 丙烯基异硫代氰酸酯可以刺激相酶( e c 2 5 1 1 8 ) 而使体 内的致癌基因失去作用；w a t t e n b e r g l 3 3 】等发现丁基i t c ( b i t c ) 和戊基i t c ( p i t c ) 可以抑制苯并芘及二甲基蒽等致癌物质诱发的胃癌和肺肿瘤的发生；n e s t l e 蚓等 指出s u l p h o r a p h a n e 能有效抑制小鼠乳腺肿瘤的扩散。另外还有许多报道对此类 物质的抗癌活性进行了研究| 3 5 3 8 】。可见此类物质的抗癌活性已得到世界范围内学 者的认同，并受到了广泛关注。 i t c 能够防治多种癌症的发生是因为它们能够有效地防止饮食中的多种致 癌物如多环芳烃( p a h s ) 、杂环胺( h a s ) 和亚硝胺所引起的d n a 损伤。其机制包 括两个方面的内容【3 9 】：抑制i 相还原酶的活性和诱导相酶的产生。通过抑制i 相还原酶的活性可以阻断致癌物的代谢活化，避免了对d n a 链的损伤。通过诱 导相酶的产生可以增加相酶在机体内的浓度，从而更有效地催化有毒物转 浙江工商大学硕士学位论文 化为亲水物质以从机体内排出。萝卜硫素( 4 甲基氧丁基硫苷的降解产物) 是迄今 为止发现的最强烈的i l 相酶诱导剂，它能使致癌基因失去作用。i 相酶和i i 相酶 都属于生化转移酶，最重要的i 相还原酶是细胞色素p 4 5 0 ，典型的相酶有谷 胱甘肽s 转移酶( g s t ) 、u d p 葡萄糖醛酸基转移酶【“6 1 。另外，高剂量的i t c 也 具有基因毒性，可能引起哺乳动物细胞姐妹染色体交换和染色体失常 4 0 l ，从而 引起突变和致癌，应该引起关注。 硫代葡糖糖苷广泛存在于十字花科植物中，是一种价值很高的资源。对其结 构、分布、降解特性、测定方法及生物活性的深入了解将会对其深入开发产生积 极的意义。 第二节逆流色谱技术概述 一、引言 逆流色谱( c o u n t e r e u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，简称c c c ) 是由美国国立卫生院的 y o i c h i mi t o 博士开发的一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术，它可 以实现连续高效的分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数【4 “4 2 1 。与高效 液相色谱( h p l c ) 不同的是，它不使用固相载体作固定相，克服了固相载体带来 的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点1 4 3 - 4 5 】。c c c 应用的是动态液液分 配原理，使具有不同分配比的样品在处于动态平衡的两相中不同分配从而得以分 离。如今，此项技术已被广泛应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有 机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域。 二、c c c 工作原理 h s c c c 是利用了一种特殊的流体力学现象，使两种互不相溶的溶剂相在螺 旋管中单向分布瓠4 刀。h s c c c 工作时，固定相受重力和螺旋管阿基米德螺线 运动所产生的离心力的综合作用，促使固定相移向螺旋管的入端，从而固定相得 以保留m4 8 1 。同时两相溶剂在螺旋管中充分混合，溶质在两相溶剂中得以分配 平衡，样品就会随着流动相穿过两相对流的整个管柱空间，进而依据样品中各组 分在两相中分配系数的不同而实现分离。 6 浙江工商大学硕l ：学位论文 c c c 基木原理与逆流分溶法相似，在分离过程中，各个组分在两相间不断 进行动态分配并达到瞬间平衡，它就象把通常的溶剂萃取过程成千上万次连续进 行。在多次连续的液液萃取过程中，由于物质各组分在两相问分配系数的不同， 随着流动相的流动，物质最终达到分离。组分的分离依赖于组分在两相间分配系 数k 的大小f 4 l ，4 9 s o ，k = c i ，c i i 其中，c i 为某组分在固定相中的质量浓度；c 为该组分在流动相中的质量浓度。当k = 0 时，说明样品完全分配在流动相中， 随着流动相流出，在固定相中没有保留；当k 接近l 时，若柱内固定相与流动 相体积相当，则组分在两相中等量分配。k 值越大，组分的保留时间越长；k 值 越小，组分的保留时间越短。理想的k 值应该在0 6 7 1 5 之问o “。 三、逆流色谱技术优点 l 、不需要固态载体，排除了固态载体对样品组分的吸附、沾染，使其变性、 失活等不良影响。所以，能避免不可逆吸附造成的溶质色谱峰拖尾现象，能实现 很高的回收率，特别适用于分离极性物质和生物活性物质。 2 、逆流色谱不用填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流穿透过程。 所以，能节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗，运行使用的后续投入较低，非常适用 于制备。 3 、对于样品预处理的要求较低，一般粗提物可以直接进样。另外，对溶剂 要求低，无须使用高纯度的色谱溶剂。 4 、应用广泛，进样量大，特别适用于制各级分离。 5 、设备简单，维修方便，易于操作。 四、逆流色谱溶剂系统的选择 根据色谱理论，样品分离的必要条件是合适的分配系数【5 2 。”。溶剂体系的 选择对于h s c c c 十分关键。目前溶剂体系的选择和优化一般根据实验积累的经 验，而没有更充分的理论依据，但具有实用价值。 通常来说，两相溶剂系统应满足以下要求1 5 4 - 5 7 】； 幻溶剂系统不会造成样品的分解或变性。 b ) 为了保证固定相保留率合适( 不低于5 0 ) ，溶剂系统的分层时间小于 3 0 s 。 7 浙江工商丈学硕上学位论文 c ) 样品中各组分在溶剂系统中有合适的分配系数，一般认为分配系数在0 2 5 的范围内是较为合适的，分离因子最好大于1 5 。 m 上下相的体积比例合适，以免浪费溶荆。 e ) 尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理。 i t o 根据在螺旋管中行星运动的溶剂流体力学特性将溶剂分为疏水性、中等 疏水性和亲水性体系。在实际操作中，应当是根据实际情况，参照相关文献专著， 分析总结，从需分离的物质的类别出发，多次实验去寻找合适的溶剂系统。在这 个过程中既要改变各组分的比例，又要改变各组分的组成，然后测定各组分的分 配系数及分离因子，最终确定合适的溶剂系统。 五、逆流色谱技术研究新进展 一) 与质谱联用 液质联用技术已经是很成熟的技术，h s c c c 与质谱( m s ) 联用技术就是在 此基础上发展起来的。1 9 9 1 年，o k a 5 8 】解决了h s c c c 与电子电离质谱( e i m s ) ， 化学电离质谱( c i m s ) ，快速原子轰击质谱( f a b m s ) ，热喷雾质谱( t s p m s ) 联 用的根本问题即接口问题，设计了t 型连接器，发现联用并不影响色谱的分离 和质谱的分析，从而为h s c c c 的应用提供了一种新型多维分离分析方法。1 9 9 8 年，r i n e h a r t 5 9 1 等首次报道了h s c c c 与电喷雾质谱( e s i m s ) 联用技术，并评价 了色谱分离和质谱分析的表现，认为制备型逆流色谱更适合于天然产物的分离分 析，分析型则耗时很短，并且对复杂样品有更高的溶解能力。e s i m s 作为一种 分析检测器，可连续检测且有很高的灵敏度。由于t s p ，e i ，c i 的离子化过 程经常导致热不稳定物质分解，而e s i m s 利用软电离技术可解决此问题，且检 测限较低，所以，e s i m s 的适用性更强。 总之，逆流色谱和质谱联用技术把逆流色谱分离的多样性与质谱的高灵敏度 检测和结构分析特性很好地结合在一起，广泛地应用于天然产物，药物，蛋白质 及其他生化物质的分离分析，具有广阔的前景。 ( 二) p h 区带逆流色谱和离子对逆流色谱 p h 区带逆流色谱( p n z o n e r e f i n i n gc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ) 最早是由 y i t o i 删等人在用h s c c c 分离溴乙酰三碘甲腺氨酸时偶然发现溴乙酸可以使其 8 浙江工商大学硕t 学位论文 峰形变得尖锐【朋1 ，进而对三种d n p 氨基酸混合物进行分离和研究而发展起来 的基于h s c c c 的新技术，是分离制备离子化合物有效方法。它利用取代色谱特 点，例如由一系列高浓度的溶质区带组成，样品在区带之间的界面富集。区带的 p h 由被分析物的p k a 和其在两相中的分配系数决定。这种技术需要一对溶剂， 有机酸或碱在有机相中，无机反离子在水相中，而不论何种溶剂作流动相或固定 相。例如在有机固定相加入三氟乙酸( 1 1 f a ) ，流动相中加入氨水。流动相以一定 的流速穿过固定相，由于酸碱反应，最后两相达到平衡，以有机酸在固定相和流 动相的浓度比标度分配系数。溶质的分配系数与标度值的差异决定了出峰时间， 从而实现分离。 离子对逆流色谱( i o n - p a i r i n gc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ) 是p h 区带逆流色 谱技术的一个新分支，它需在固定相中加入配位体，提高固定相的保留率【6 2 】。 最常用的配位体d e h p a 已广泛用于分离稀有元素，儿茶酚胺或多肽。 这两种技术为分离同系物，结构相似的化合物提供有效途径。 第三节选题背景及意义 癌症是危及人类生命的最严重的疾病之一，据世界卫生组织初步统计，全世 界每年约有1 0 0 0 万人被确诊为癌症患者，死于癌症者约5 0 0 万人。肿瘤已成为 我国居民死亡的第二位因素。研究和控制肿瘤是当今生命科学领域的重大的课 题。医学界和营养界越来越多的人认识到，在癌症的预防和治疗问题上，应将预 防工作列为首位。世界上存在很多天然防癌抗癌物质，其中很多是食品。目前国 际上对从植物中分离出来的硫代葡萄糖苷类物质及其降解产物异硫代氰酸盐物 质的防癌和抗癌的研究非常热门，越来越受到人们的关注。 近年来对硫苷的研究不断深化，其研究也越来越热，很重要的一个原因是 g l s 本身及其降解产物异硫代氰酸盐的抗癌活性。其抗癌方面的研究在前面已 有叙述，并且这种活性己得到世界范围内学者的认同，因此若能将其成功应用于 临床治疗以及营养保健品的开发，将会对人类攻克癌症顽疾、延长人类寿命以及 改善生活水平产生积极而深远的影响。另外，对资源的充分利用也有重要意义。 9 浙江工商大学硕e 学位论文 第四节研究目标及思路 无论是对硫苷类物质进行深入研究开发还是将来的工业化生产，对其进行提 取分离是首要的工作，但是现在对其进行制备型分离未见报道。本研究的目标是 开辟一条应用逆流色谱技术对硫苷实现制备型分离的新路子，以促进对硫苷和异 硫氰酸盐的深入研究，并希望能为将来的工业化生产打下基础。 本课题的研究思路包含下面的内容： ( 1 ) 总硫代葡萄糖苷物质高效提取技术研究。 为了保证硫苷不被酶解，必须首先使酶失活，采用高温钝化的方法，效果理 想。然后采用沸腾甲醇对原料进行浸提，对原料连续进行3 次浸提，可以达到使 其中的硫苷大部分溶出的i i l 的。 对甲醇提取物进行脱脂处理。将浓缩得到的膏状提取物以适量水溶解，再以 适量乙酸乙酯对其进行脱脂处理，连续三次。 水相的处理。先旋转蒸发至含水量较少时，再对其进行冷冻干燥，即得粗样 品。 乙酸乙酯相处理。浓缩至膏状，放入冰箱保存，以备后续处理。 ( 2 ) 硫代葡萄糖苷单种物质的连续、快速、高效分离提纯技术研究。 以逆流色谱技术为主，柱层析技术为辅研究分离单种硫代葡萄糖苷物质的技 术条件。 对逆流色谱分离进行放大，以实现较大规模的制备分离。 对逆流色谱技术来说，关键在于溶剂系统的选择。查阅资料，不断试验，选 定以正丁醇，乙腈，盐溶液为系统组分，试验不同的比例及盐溶液的有关参数， 找到对硫苷分离较为合适的系统。 辅以柱层析及其高效制备液相对其进行纯化。 1 0 浙江工商大学顾上学位论文 第二章硫代葡萄糖苷的逆流色谱( c c c ) 分离 第一节材料与方法 一、材料 ( 一) 仪器 1 、半制备型高速逆流色谱仪( h s c c c - d 2 0 0 ) ：柱容积2 0 0 m l ，浙江工商大学 食品与生物工程研究所制。 2 、小型低速逆流色谱仪s r c c c d 3 4 0 0 ，柱容积3 4 0 0 m l ，浙江工商大学食 品与生物工程研究所制。 3 、高效液相色谱仪( s h i m a d z u ，j a p a n ) ：y m co d s 柱，1 5 0 x 4 6 m m i d 和w a t e r ss u g a r - d ，2 5 0 x 4 6 m mi d 。 4 、恒流泵：w e l l c h r o mp r e p a r a t i v eh p l cp u m pk 一1 8 0 0 ( k n a u e r 德国) 。 5 、旋转蒸发仪：e y e l ar o t a r ye v a p o r a t o rn - 1 0 0 0 ，e y e l aw a t e rb a t h s b 2 0 0 0 ( 上海爱朗仪器有限公司) 。 6 、真空泵：s h z d 循环水式真空泵( 河南巩义市英峪豫华仪器厂) 。 7 、低温冷却液循环泵：d l s b 系列型低温冷却液循环泵( 郑州长城科工贸有 限公司) 。 8 、冷冻干燥机：f d 1 a - 5 5 真空冷冻干燥机( 北京博医康技术公司) 。 9 、部分收集器：b s z 1 0 0 自动部分收集器( 上海沪西分析仪器厂) ，b f i c h i f r a c t i o nc o l l e c t i o nb 6 8 4 ( b o c h i ，s w i t z e r l a n d ) 。 1 0 、超声波清洗器：k q 8 0 t d b 型超声波清洗器，昆山舒美超声仪器有限公 司。 1 1 、核磁共振氢谱：( h - n m r ) ：b r u k c ra v a n c ed m x 5 0 0 超导n m r 仪。 1 2 、核磁共振碳谱：( c ”- n m a ) ：b r u k c ra v a n c ed m x5 0 0 超导n m r 仪。 1 3 、电喷雾质谱( e s i m s ) ：b r u k c re s q u i r e3 0 0 0 。 1 4 、硅胶板：t l ca h n n i n i u ms h e e t s2 0 x 2 0 0 ns i l i c ag e l6 0f 2 5 4 ( m e r c k 德国) 。 1 5 、电子天平：a y l 2 0 型( s h i m a d z u ，j a p a n ) 。 浙江1 = 商大学硕上学位论文 1 6 、其它仪器：量筒0 0 0 n 时、5 0 0 m l 、1 0 0 0 m l 、2 0 0 0 m 1 ) 、分液漏斗0 0 0 0 m l 、 2 0 0 0 m 1 ) 、圆底烧瓶、溶剂过滤器( 1 0 0 0 m 1 ) 、烧杯、玻璃棒、铁架台、冷凝管、 电炉、铁桶、烘箱等。 ( 二) 试剂 甲醇，乙醇，乙腈，丙醇，氯仿，正丁醇，异丁醇，硫酸铵均为分析纯，购 自华东医药股份有限公司。 柱填料：硅胶，1 0 0 - 2 0 0 目，青岛海洋化工厂生产。 h p l c 流动相：水为二重蒸馏水；甲醇乙腈为色谱纯；四甲基溴化铵，氯化 钾为分析纯。 显色剂：1 0 硫酸乙醇溶液。 二、方法 ( 一) 硫代葡萄糖苷的粗提取 称取高油6 0 5 油菜籽( 浙江省上虞市舜达种子有限公司) 2 k g ，置于烘箱中 1 1 0 干燥4 小时，使内源芥子酶钝化，再将干燥的油菜籽于粉碎机中粉碎。将 经钝化和粉碎处理得到的油菜籽粉末用甲醇在沸腾状态下浸提2 次，每次用甲醇 6 0 0 0 m l ，浸提时间2 小时。将两次得到的浸提液混合，4 0 下减压浓缩至膏状， 然后将浸膏分散在3 0 0 0 m l 去离子水中，再用等体积的乙酸乙酯分配萃取2 次。 分别将水相和乙酸乙酯相减压浓缩并冷冻干燥，得到水相粗提物1 5 2 9 ，即为油 菜籽粗提物；乙酸乙酯相冷冻储藏。由于高速逆流色谱对样品前处理要求较低， 故粗提物可直接进行h s c c c 分离。硫代葡萄糖苷的粗提物提取过程如下图2 - 1 所示。 1 2 浙江工商人学硕上学位论文 芥子酶 图2 - 1 油菜籽中硫代葡萄糖苷粗提取流程图 f i g 2 - it h ef l o wo f e x t r a c t i n gg l u c o s i n o l a t e sf i r mr a p e s e e d 浙江t 商大学硕士学位论文 ( 二) 溶剂系统的选择 硫代葡萄糖苷是一类水溶性化合物，它们的物理化学特性受离子化的含硫侧 链的影响。2 0 0 1 年，a n d r e a sd e g e n h a r d t t 6 3 1 等用h s c c c 成功分离了水溶性的色 素类物质，甜菜红色素、甜菜苷及异甜菜苷等。他们应用的是一个高含盐的高极 性溶剂系统。基于这种状况并通过广泛阅读文献和多次试验，最后我们将溶剂系 统的组成选定为：乙醇，乙腈，丙醇，正丁醇，异丁醇，硫酸铵溶液。在试验过 程中，首先是t l c 分析初选，通过t l c 分析测定被分离组分在溶剂系统的上相 和下相的溶解分配情况，再通过小型的逆流色谱仪试验以验证其可行性，最终选 定合适的溶剂系统。 t l c 分析方法如下： 取少量硫代葡萄糖苷粗提物于2 m l 瓶中，用甲醇溶解，对其进行t l c 分析 以确定该样品主要含有几种成分，并选择合适的t l c 展开剂。然后取少量样品 分6 份于4 m l 样品瓶中，样品瓶的编号为l 一6 。按表2 1 所示在各瓶中加入相 应的溶剂系统，充分振摇待样品完全溶解后静置分层，然后分别取上相和下相进 行t l c 分析。因为t l c 板上某斑点所代表的物质的浓度与该斑点颜色的深浅呈 正相关，故可以通过t l c 分析判定各物质在某一溶剂系统中分配情况，从而可 以粗略选择出较为合适的溶剂系统。