（食品科学专业论文）磷酸寡糖全酶法制备工艺的研究.pdf

， 一 心 l i l l ll ii i i iii i ii i i i1 11 y 17 3 5 2 0 6 摘要 磷酸寡糖( p h o s p h o r y lo l i g o s a c c h a r i d e s ，p o s ) 指麦芽低聚糖中的葡萄糖残基与 磷酸根通过共价键连接的一种新型功能性低聚糖，由麦芽三糖至麦芽六糖组分组成。 作为一种天然、安全的新型功能性低聚糖，磷酸寡糖除具备一般低聚糖的理化特性外， 还具有促进体内钙、铁等矿物质吸收和溶解、抗龋齿、抗淀粉老化、水果和切花保鲜 等独特的功能特性，可广泛应用于食品、保健、医药、饲料添加剂等行业。尤其值得 注意的是磷酸寡糖的补钙补铁功能。钙铁都是人体内丰富的矿物质，对人体的作用不 言而喻，而今缺钙缺铁现状严重，一般的补钙补铁产品效果欠佳。磷酸寡糖在弱碱性 条件下，能与钙、铁等矿物质形成可溶性复合物，使得钙、铁离子在肠道内保持较高 的浓度，从而促进人体的吸收，是一种很好的新型补钙补铁制剂。因此，研发制备磷 酸寡糖，具有重要的现实意义。本文对全酶法制备磷酸寡糖的工艺进行了优化研究， 具体研究内容如下： 1 对目前国内外已有的磷酸寡糖的构成、功能特性研究及相关糖类的制备、分 离检测方法展开综述；分析比较了磷酸寡糖与相关产品的补钙补铁及抗龋齿、抗淀粉 老化功效；磷酸寡糖制备工艺中涉及到的结合磷含量的测定方法、液化工艺、低聚糖 的分离检测方法等。 2 以市场随机购买韵蓰粉及淀粉磷酸酯为原料，通过分光光度法及感应耦合等 离子体原子发射光谱( i c p a e s ) 法对其中的总磷含量及结合磷含量进行了测定分析。 分光光度法的测定波长为8 2 5 n m ，且较i c p a e s 法更适于淀粉磷酸酯中磷含量的测 定。市售马铃薯淀粉的平均结合磷含量为4 4 0 p p m ，而市售淀粉磷酸酯的结合磷含量 均较低，不适于磷酸寡糖的制备研究。 3 采用全酶促反应机制结合低压喷射液化技术制各磷酸寡糖前体低d e 值麦 芽低聚糖浆。工艺流程中考虑p h 、酶用量、糖化时间、糖化温度对d e 值的影响作 用。通过响应面分析法( r s m ) 优化出制备d e 值为3 5 的低聚糖浆的最佳酶解条件 为：淀粉乳浓度1 5 0 a 6 、p h 值5 9 、耐高温a 淀粉酶用量3 5u g ，真菌酶用量2 3 u g 、普鲁兰酶用量1 0u g 、糖化温度6 0 、糖化时间1 4 8r a i n 。通过高效阴离子 交换色谱( h p a e c p a d ) 定性分析，确定麦芽低聚糖浆的主要组分麦芽二糖、麦芽 三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖及麦芽七糖。 ， e 匀 i 一 j 4 通过柱层析方法对磷酸寡糖进行分离纯化。采用c h i t o p e a r lb c w - 2 5 0 1 阴离子 交换树脂为填料，o 0 2 m o l l 乙酸乙酸钠缓冲液( p h = 4 5 ) 洗脱中性糖，含有 0 1 m o l l n a c l 乙酸乙酸钠缓冲液( p h = 4 5 ) 洗脱磷酸寡糖。s e p h e d e xg 1 0 柱层析脱 盐，以水为流动相，脱盐效果较好。以结合磷含量为指标，磷酸寡糖的柱层析分离纯 化得率为7 6 9 7 。 5 以h p a e c p a d 法对磷酸寡糖进行组分分析。相对于中性糖，磷酸寡糖的出 峰时间向后延迟。对比脱磷后的磷酸寡糖与麦芽低聚糖标准品的保留时间，确定其主 要组分为麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖。红外光谱溴化钾压 片表明：样品在1 0 8 0 e m - l 处有p o c 基团的伸缩振动吸收峰，9 2 8 e m - 1 处有五价 磷的p o 伸展振动。进一步确定磷酸寡糖为结合有磷酸基团的麦芽低聚糖混合物。以 总糖含量为指标，计算出磷酸寡糖的最终得率为0 7 1 。 关键词：磷酸寡糖；低d e 值；分离纯化；结构分析；工艺优化； i i a b s t r a c t p h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e s ( p o s ) ，an e wf u n c t i o n a lo l i g o s a c c h a r i d e ，w e r e c o m p o s e do fm a l t o t r i o s e ，m a l t o t e t r a o s e ，m a l t o p e n t a o s e ，m a l t o h e x a o s ea n dm a l t o h e p t a o s e ， w i t h i nc o v a l e n t l y - b o u n dp h o s p h a t eg r o u p sl i n k e dt ot h eg l u c o s er e s i d u e s a san e w , n a t u r a l a n ds e c u r i t yf u n c t i o n a lo l i g o s a c c h a r i d e ，p o sh a dt h ee f f e c t so fp r o m o t i n gt h ea b s o r p t i o no f a l k a l i n ee a r t hm e t a ls u c ha sc a l c i u mo ri r o ni nal i v i n gb o d y , p r e v e n t i n gc a r i o u st e e t h ， s u p p r e s s i n gr e t r o g r a d a t i o no fs t a r c h ，p r e s e r v i n gt h ep l a n t s o rf r u i t s l o n g e ra n ds oo n a c c o r d i n g l y , p o sc a l lb ew i d e l yu s e di nf o o d ，h e a l t hc a r e ，m e d i c i n e ，f e e da d d i t i v e s ，e t c c o n s i d e r a b l ea t t e n t i o nh a sb e e nf o c u s e do nt h ec a p a b i l i t yo fp r o m o t i n gt h ea b s o r p t i o no f c a l c i u ma n di r o n a s a b u n d a n t l ym i n e r a l s ，t h e e f f e c t so fc a l c i u ma n di r o nw e r e c o n s p i c u o u si n t h e l i v i n gb o d y a tp r e s e n t ，s i t u a t i o n so fr e d u c e dc a l c i u ma n di r o n a b s o r p t i o nw e r es e r i o u s ，a n dg e n e r a li n h i b i t i o n sw e r el e s se f f e c t i v e h o w e v e r , p o sh a dt h e a b i l i t y t of o r mas o l u b l ec o m p l e x 诵t l lm i n e r a l s ( s u c ha sc a l c i u m ，i r o n ) a n dh a da n i n h i b i t o r ye f f e c to nt h ef o r m a t i o no fm i n e r a l p h o s p h a t ep r e c i p i t a t e s ，t om a i n t a i nah i g h c o n c e n t r a t i o no fs o l u b l em i n e r a l s ，t h u sp r o m o t e dt h ea b s o r p t i o no fm i n e r a l sa l k a l i n ee a r t h m e t a li nh u m a nb o d y a san e wi n h i b i t o r , t h e p r e p a r a t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d o l i g o s a c c h a r i d e sh a si m p o r t a n tp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e t h et a s ko ft h i sp a p e rw a st o o p t i m i z et h ee n z y m a t i cp r e p a r a t i o no fp h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a r i d e so nt h eb a s i so f p r e v i o u sr e s e a r c h e s 1 t h es t r u c t u r e sa n df u n c t i o n so fp o s ，m e t h o d so fp r e p a r i n ga n di s o l a t i n g o l i g o s a c c h a r i d e sw e r er e v i e w e db yr e a d i n ga n dc o n s u l t i n gl o t s o fp r e v i o u sp a p e r s c o m p a r i n ge f f e c t so fp o sa n dh o m o g e n e o u sp r o d u c t s ，s u c h 邪p r o m o t i n gt h ea b s o r p t i o no f m i n e r a l s ，p r e v e n t i n g c a r i o u s t e e t h , s u p p r e s s i n gr e t r o g r a d a t i o no fs t a r c h b e s i d e s ，t h e d i f f e r e n tm e a s u r e m e n t so fp h o s p h o r u s ，l i q u e f a c t i o nm e t h o d o l o g ya n da n a l y t i c a lm e t h o d s w e r ea l s oc o m p a r e d 2 t h et o t a lp h o s p h o r u sa n db i n d i n g - p h o s p h o r u so fc o m m e r c i a ls t a r c ha n dp h o s p h a t e s t a r c hw e r em e a s u r e db ys p e c t r o p h o t o m e t r ya n di n d u c t i v e l yc o u p l e dp l a s m ae m i s s i o n s p e c t r o m e t r y ( i c p - a e s ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts p e c t r o p h o t o m e t r yi sm o r es u i t a b l ef o r t h ea n a l y s i so fp h o s p h o r u si ns t a r c ht h a ni c p - a e s ，a n dt h ew a v e l e n g t hw a s8 2 5 n m t h e b i n d i n g - p h o s p h r u so fc o m m e r c i a lp o t a t os t a r c hw a s4 4 0 p p m f u r t h e r m o r e ，c o m m e r c i a l p h o s p h a t es t a r c hw a sn o ts u i t a b l ef o rt h ep r e p a r a t i o no fp h o s p h o r y lo l i g o s a c c h a r i d e s w h i c hh a dal o wb i n d i n g p h o s p h o r u sc o n t e n t 3 t h ep o sp r e c u r s o r - m a l t o o l i g o s a c c h a r i d e s 谢t ll o wd e x t r o s ee q u i v a l e n t ( d e ) w e r e i i i p r e p p e db ye n z y m a t i cm e t h o d o l o g ya n dj e tl i q u e f a c t i o n o p t i m i z a t i o no fh y d r o l y s i s c o n d i t i o n sw a si n v e s t i g a t e db yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) ，a n de f f e c t so fp h ， f u n g a la m y l a s e ，s a c c h a r i f i c a t i o nt e m p e r a t u r ea n d t i m ew e r ea l lt e s t e d t h eo p t i m a ld eo f 3 5w a sa p p e a r e da tt h ef o l l o wc o n d i t i o n s ：s t a r c hc o n c e n t r a t i o na t15o b d ，p ha t5 9 ， t h e r m o s t a b l ea - a m y l a s ea t3 5 u g ，劬g a la m y l a s ea t2 3 u g ，p u l l u l a n a s ea t 1 0 u g ， s a c c h a r i f i c a t i o nt e m p e r a t u r ea t6 0 * ( 2a n dt i m ea t1 4 8 r a i n , r e s p e c t i v e l y 1 1 1 eh y d r o l y t ew e r e a n a l y z e db yh p a e c p a d n er e s u l t ss h o w e dt h a tm a l t o s e ，m a l t o t r i o s e ，m a l t o t e t r a o s e ， m a l t o p e n t a o s e ，m a l t o h e x a o s ea n dm a l t o h e p t a o s e a sw e r et h em a i nc o m p o n e n t s 4 s e p a r e t i o na n dp r e p a r e t i o no fp o sw e r ed o n eb yc h i t o p e a r lb c w - 2 5 0 1c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y n e u t r a ls u g a r sw e r ew a s h e do u t 、) l ，i t l la2 0 m ma c e t a t eb u f f e r ( p h4 5 ) ， a n d p h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a f i d e sw e r ee l u t e db yt h es a m eb u f f e rc o n t a i n i n g0 im n a c i t h e n ，p o sw e r ea p p l i e dt oas e p h a d e xg 一10c o l u m nt or e m o v et h es a l t s 1 1 1 ey i e l dr a t eo f c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw a s7 6 9 7 5 。f r a c t i o n so fp o sw e r ea b t a i n c db yh p a e c p a d r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t r e t e n t i o nt i m eo fp o sw a sl o n g e rt h a nn e u t r a ls u g a r s c o m p a r i n gt h er e t e n t i o nt i m eo f d e p h o s p h a r y l a t e do l i g o s s a c h a r i d e s w i t ha u t h e t i c m a l t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，f o u n d e dt h a t m a l t o t r i o s e ，m a l t o t e t r a o s e ，m a l t o p c n t a o s c ，m a i t o h e x a o s ea n dm m t o h e p t a o s e a sw e r et h e m a i nc o m p o n e n t s i n f r a r e dc h r o m a t o g r a p h ys h o w e dt h a ts t r e t c h i n gv i b r a t i o na b s o r p t i o n p e a k so fp o ca n dp oa p p e a r e di n10 8 0 c m - 1a n d9 2 8c m ln e a r b y t h e r e b y , i tp r e d i c t e d t h a tp o sw e r ec a r b o h y d r a t e sc o m b i n e dw i t hp h o s p h a t eg r o u p s t h ey i e l dr a t eo fp o sw a s 0 71 ，t ot h et o t a ls u g a rc o n t e n to fi n d i c a t o r s k e y w o r d s ：p h o s p h o r y l a t e do l i g o s a c c h a f i d e s ，l o wd e x t r o s ee q u i v a l e n t ，s e p a r e t i o na n d p r e p a r e t i o n ，s t r u c t u r ea n a l y s i s ，o p t i m i z a t i o n i v 产 ， ， ， ， 目录 中文摘要i a b s t r a c t i i i e lj 录、， 1 文献综述1 1 1 前言1 1 2 磷酸寡糖概述1 1 2 1 磷酸寡糖的组成与结构1 1 2 2 磷酸寡糖的功能特性。2 1 3 磷酸寡糖的制备工艺研究4 1 3 1 磷含量的分析研究4 1 3 2 低d e 值麦芽低聚糖浆的制备研究5 1 3 3 磷酸寡糖的分离纯化6 1 3 4 低聚糖的分析检测方法6 1 4 研究展望7 2 弓i 言9 2 1 课题研究意义9 2 2 研究内容9 3 材料与方法1 l 3 1 材料、仪器和试剂l l 3 1 1 材料1 l 3 1 2 主要仪器及设备1 l 3 1 3 主要试剂1 2 3 2 淀粉原料的筛选1 2 3 2 1 淀粉水分含量测定方法1 2 3 2 2 总磷含量的测定1 3 3 2 3 游离磷含量的测定1 4 3 2 4 结合磷含量的测定1 4 3 3 低d e 值麦芽低聚糖浆的优化工艺研究1 4 3 3 1d e 值测定方法1 4 3 3 2 总糖含量的测定方法1 5 3 3 3 喷射液化制备低d e 值的麦芽低聚糖浆15 3 3 4h p a e c p a d 法分析麦芽低聚糖浆的组分1 6 v 3 4 磷酸寡糖的分离纯化研究1 7 3 4 1c h i t o p e a r lb c w - 2 5 0 1 阴离子交换树脂的结构及交换原理1 7 3 4 2 层析柱的制备与上样1 8 3 4 3 中性糖的洗脱1 8 3 4 4 洗脱液浓度的选择1 8 3 4 5 磷酸寡糖的脱盐处理1 8 3 5 磷酸寡糖的组分分析方法1 9 3 5 1 磷酸寡糖的脱磷处理1 9 3 5 2 高效阴离子交换色谱( h p a e c p ! a d ) 定性分析磷酸寡糖1 9 3 6 磷酸寡糖的结构分析方法2 0 3 6 1 磷酸寡糖的冷冻干燥2 0 3 6 2 红外光谱分析。2 0 3 7 磷酸寡糖得率的计算方法。2 0 4 结果与分析2 l 4 1 淀粉原料的筛选2 l 4 1 1 分光光度法吸收波长的选择2 l 4 1 2 磷标准曲线的绘制2 l 4 1 3 精密度及回收率实验2 2 4 1 4 不同样品中结合磷含量的分析研究2 2 4 2 磷酸寡糖前体低d e 值麦芽低聚糖浆制备工艺的优化2 3 4 2 1 还原糖标准曲线的绘制( d n s 法) 2 3 4 2 2 总糖标准曲线的绘制2 4 4 2 3 酶解条件单因素实验分析2 4 4 2 4 酶解生产低d e 值麦芽低聚糖的响应面试验分析2 7 4 2 5 低d e 值麦芽低聚糖浆组分的分析3 l 4 3 磷酸寡糖的分离纯化3 2 4 3 1 洗脱液浓度的选择3 2 4 3 2 不同浓度洗脱液各项指标分析。3 2 4 4 磷酸寡糖的组分分析。3 3 4 5 磷酸寡糖的结构分析。3 5 4 6 磷酸寡糖得率的计算3 6 5 讨论3 7 6 主要结论。3 8 参考文献3 9 v l 致谢 作者简介 硕士期间发表的论文。 本科和硕士期间获得奖励 v l i 1 文献综述 1 1 前言 寡糖又称低聚糖( o l i g o s a c c h a r i d e s ) 的概念，是b h e l g e r i c h 等于1 9 3 0 年首先提出的 【1 1 。它们通常指由2 1 0 个单糖通过糖苷键连接形成的具有直链或支链的低度聚合糖 类，一般以还原端的糖命名，如麦芽寡糖、寡果糖、寡木糖、纤维寡糖等【2 1 。根据寡 糖的生物学功能可将其分为功能性寡糖和普通寡糖两大类。普通低聚糖包括蔗糖、麦 芽糖、麦芽三糖、乳糖等，它们可被机体消化吸收产生能量【3 】。而功能性寡糖通常不 被胃酸及人体酶所水解，不能被人体肠道所利用。与一般的低聚糖相比，功能性低聚 糖具有如促进双歧杆菌增殖、抑制体内毒素生成，调节肠胃功能、抗衰老、防止胆固 醇积累、降低血压等独特的生理功能，是功能性食品开发和研究的重点【4 羽。 功能性低聚糖在世界上的发展非常迅速，日本、美国、欧洲一些国家为全球主要 的生产国，同时也是主要的消费市场。日本的功能性低聚糖开发较早，品种也最多， 低聚果糖1 9 8 3 年即达到产业化生产规模，开始进入市场 7 1 。目前日本国内低聚糖的生 产无论产量、价格优势及消费量、出口量均居世界领先地位【引。美国已利用其在糖化 学方面的优势，在特殊低聚糖的研究开发上进展迅速，多种低聚糖药物、低聚糖疫苗 等正在开发【9 1 。比利时、法国、荷兰等欧洲国家也有多年开发低聚糖的历史，低聚果 糖已被欧盟批准为食物配料，而不是食品添加剂 7 1 。2 0 世纪8 0 年代，我国开始对低聚 糖的研究，在“九五 期间形成工业规模和商品化，经历了初步研究一实验室生产一 工业化生产一产业化一高纯度专业化的五个阶段。目前，国内功能性低聚糖的主要品 种有低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、大豆低聚糖、 水苏糖等【1 0 1 。 1 2 磷酸寡糖概述 磷酸寡糖的概念最早是由日本学者k a m a s a k a , h 等于1 9 9 5 年提出的，是指麦芽低 聚糖中的葡萄糖残基与磷酸根通过共价键连接的一种新型功能性低聚糖，由麦芽三糖 至麦芽六糖组分组成【i 。 1 2 1 磷酸寡糖的组成与结构 磷酸寡糖是分子中带有磷酸酯键，且聚合度在3 - 6 之间的麦芽低聚糖混合物。 t a k e d a 和h i z u k u r i 研究表明，约6 0 * , - 7 0 的磷酸基团是结合在葡萄糖残基中的c - 6 上，余下的部分主要结合在c 3 上【1 2 】。磷酸基团与麦芽低聚糖中葡萄糖残基的主要结 合方式如图1 1 所示( 图中r 代表葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖或麦芽四糖) 。相关研 究叫表明，磷酸寡糖的平均聚合度为4 0 3 ，由p o 1 和p o 2 两部分组成，其中主要 组分为p o l 。对p o 。1 和p o 2 进行组分分析发现：p o 1 的平均聚合度为4 0 2 ，由麦 芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖构成，每一葡萄糖残基上连接有个磷酸基团：而p o 2 的平均聚合度为5 8 2 ，由麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖和麦 芽八糖组成，其中麦芽五糖和麦芽六糖为主要组分，每一个葡萄糖残基上至少连接有 两个磷酸基团。日本学者【l l 】研究结果表明：磷酸寡糖中的p o 1 部分主要是由3 磷 酸寡糖和6 磷酸寡糖组成，见图1 2 所示。 图l l 磷酸寡糖中磷酸根与葡萄糖残基的主要结合方式 f i g 1 lc o m b i n a t i o no f g l u c o s y lr e s i d u ea n dp h o s p h a t eg r o u pi np h o s p h o r y lo l i g o s a c c h a r i d e s 6 p i 油 6 p 占， 礴酸寡艟 6 - w l 练曩 图! - 2 磷酸寡糖p o - i 组分的结构简i t l i 哪 f i g 1 - 2i l l u s t r a t i o no f t h es t r u c t u r e so f t h ep o - if r a c t i o no f p h o s p h o r y lo l i g o s a c c h a r i d e s 4 】 c f 1 ：表葡萄塘残基代表葡萄糖残基还原末端3 p 代表与葡萄塘残基第3 位碳原子相结合的磷酸基团6 p 代表与葡萄骱残基的第6 位碳原子相结合的磷酸基团 1 2 2 磷酸寡糖的功能特性 研究表明，磷酸寡糖具有促进体内钙、铁等矿物质吸收和溶解、抗龋齿、抗淀 粉老化等独特的功能特性。此外，将磷酸寡糖可添加到液体或粉末状肥料及药剂中， 还可起到保持植物如水果和切花的保质期的作用【1 5 】。现对已有的主要研究结果综述如 2 k c甲p ( 为1 0 m m 的p o 2 添加至含有钙离子及磷酸盐的溶液中，2 4 小时后仍能使溶液中的可 溶性钙离子浓度保持在原来的6 0 左右【1 3 1 。采用大鼠空肠结扎的方法进行实验，分 别将相当于0 8 m g m l 钙含量的磷酸寡糖钙、氯化钙、乳酸钙注入结扎空肠中，隔一 定时间检测空肠腔洗脱物中钙离子的含量。研究结果表明，大鼠肠道对磷酸寡糖钙的 吸收能力与其对可溶性钙复合物中钙的吸收能力基本相当，都保持在6 0 左右【1 4 l 。 此外，作为铁的强化剂磷酸寡糖具有增加无机铁溶解性的生理功效。分别将p o 1 和 p o 2 溶液与f e c l 3 溶液混合，用n a h c 0 3 溶液或0 2 m 的n a 3 p 0 4 缓冲液调节p h6 5 7 4 ，3 7 条件下保温4 8 h ，检测上清液中铁离子的含量。实验结果表明，p o 1 组分 能够促进与其自身摩尔质量相当的铁离子溶解，而p o 2 则能促进约1 0 倍于其自身摩 尔质量的铁离子溶解【2 。 1 2 2 2 抗龋齿、促进牙齿再矿化 随着人民生活水平的不断提高，饮食中致龋因素不断增多，预防工作显得尤为重 要。龋齿是由于牙齿结构遭到破坏而引起的一种传染性流行病 2 2 1 。龋齿病的发生是口 腔细菌造成牙釉质、牙本质、牙骨质脱矿的结果【2 3 1 。磷酸寡糖具有p h 缓冲能力，可 降低口腔中的酸度。此外，磷酸寡糖亦不能被口腔细菌代谢利用，从而达到抗龋齿的 功效。k a m a s a k a 等【2 4 】取经过人工去矿化的牙釉质切片，在3 7 c 条件下，分别用矿物 质溶液( a ) 和含有磷酸寡糖钙的矿物质溶液( b ) 再矿化一周，结果如图1 3 所示。由图 可以看出含有磷酸寡糖钙的矿物质溶液对牙齿的再矿化效果较好。基于磷酸寡糖不被 口腔微生物发酵利用的特点，日本学者已将其作为一种功能性添加剂加入口香糖中， 实验证明磷酸寡糖确实起到了加强牙齿釉质的再矿化，防止齿质损坏的效果。 图1 3 牙釉质片段扫描电镜枷 f i g 1 - 3s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p eo fp l a n o p a r a l l e ls e c t i o n sf r o me n a m e l 2 4 1 1 2 2 3 抗淀粉老化 淀粉的老化是一个淀粉分子从无序到有序的过程，分子链间借氢键相互吸引与排 列，使体系自由焓降低，最终形成结晶【2 5 】。影响淀粉老化的因素有淀粉来源【2 6 】，直链 淀粉的含量【2 7 1 ，水分，温度【2 砌等。磷酸寡糖分子中的羟基，可与水分子较好的结合， 维持产品的水分活度；葡萄糖残基上的磷酸基团可阻碍淀粉分子的定向取向，从而综 合抑制淀粉的老化。有研究表明【1 5 】，在相同的时间内，磷酸寡糖的抗淀粉老化的能力 超过日本已上市的抗淀粉老化制剂“刑i o l i g o ( 含6 0 以上的麦芽三糖) 。因此，可 将磷酸寡糖作为抗老化保鲜剂，添加于面包、米团、年糕等制品中，以起到保韧及延 长保质期的功效。 1 2 2 4 无不良风味及口感 酪蛋白磷酸肽( c p p s ) 是由酪蛋白经酶水解分离纯化而得的一种天然活性肽产 品【2 9 1 。由于含有三个磷酸基团，同磷酸寡糖一样，可在中性或碱性的条件下，与金属 离子，特别是钙离子形成可溶性复合物【3 们。但研究表明，c p p s 具有苦昧或迟发苦味。 在感官审评实验中，c p p si i ( 由含量大于1 2 的c p p s 去除苦味化合物得到) 的苦味 阈值为5 x l o 五，而磷酸寡糖溶液浓度在1 时仍无苦味【1 3 】。因此，磷酸寡糖作为添 加剂添加于食品中时，不会影响产品原有的风味及口感。 1 3 磷酸寡糖的制备工艺研究 1 3 1 磷含量的分析研究 淀粉中通常含有少量的无机盐，而无机盐主要是磷酸和某些阳离子形成的赫类。 磷在淀粉中一部分以磷脂质的形式存在，一部分以磷酸酯的形式结合在葡萄糖残基上 【3 1 1 。t a k e d a 和h i z u k u r i 掣1 2 】研究表明，磷酸基团主要是结合在支链淀粉的b 链上， 且约6 0 - 7 0 的磷酸基团是结合在葡萄糖残基的c 6 上，余下的部分主要结合在c 3 4 上。马铃薯淀粉作为结合磷含量最高的天然淀粉磷酸酯，平均每2 0 0 - 5 0 0 个葡萄糖 基中结合有一个磷酸基团【1 3 1 ，结合态磷含量约在1 0 0 1 0 0 0 p p m 3 2 】。但由于不同的马 铃薯品种及种植条件，其结合磷含量亦存在一定差异 3 3 , 3 4 】。目前，淀粉磷酸酯中磷含 量的测定主要有重量法、原子吸收法、容量法、分光光度计法、x 射线荧光法等。其 中分光光度法是我国和国际上分析淀粉磷酸酯总磷含量的标准方法【3 5 , 3 6 】。姜元荣等【3 7 】 采用分光光度法以6 8 0 n m 为检测波长研究了淀粉磷酸酯取代度的测定方法：t a k a h i r o n o d a 等人3 8 3 9 1 以能量色散x 射线荧光光谱法( e d x r f ) 对5 3 5 种马铃薯淀粉中的 磷含量进行了分析测定，表明马铃薯淀粉总磷含量在3 0 8 1 2 4 4 p p m 。 1 3 2 低d e 值麦芽低聚糖浆的制备研究 磷酸寡糖是分子中结合有磷酸基团的麦芽低聚糖混合物，因此，制备其前体低 d e 值麦芽低聚糖浆是磷酸寡糖研究的重要前提。淀粉酶作用于底物的过程包括液化、 糖化、脱支等多重反应。传统的酸液化法生产低聚糖易生成有色物及复合糖类，产物 复杂，产率低1 4 0 】。随着现代酶制剂工业的不断发展，制糖工业也进入了一个全新的发 展阶段，酶法液化以其工艺简单、成本低、产品质量高的优势逐渐替代了原有的液化 工艺。可以采用的酶主要有耐高温a 淀粉酶，p 淀粉酶，糖化酶，真菌a 淀粉酶，普 鲁兰酶等。蒸汽喷射液化器的研制成功更进一步加速了制糖工业的发展，亦由此产生 了喷射液化法制糖工艺。蒸汽喷射液化器是将两种不同压力的流体高速混合，并发生 物质和能量交换的装置】。喷射液化法的原理为：在喷射时，高压蒸汽与薄膜状淀粉 浆料直接混合，蒸汽在高物料流速和局部强烈湍流作用下迅速凝结，释放出大量潜热， 使淀粉在极短时间内均匀受热糊化1 4 2 1 。 工业上以d e 值表示淀粉糖液中还原糖含量( 以葡萄糖计) 占干物质含量的百分 率【4 0 l ，它是控制淀粉水解程度的关键指标。d e 值低，则制备的糖液中葡萄糖的含量 低；反之，葡萄糖的含量较高。d e 值的控制受多方面因素的影响，如p h 值、酶用 量、酶解时间、酶解温度等。马涛、李福谦等人【4 3 朋】以大米淀粉为原料研究了制备低 d e 值麦芽糊精的酶解条件；韩玉洁等【4 5 】对以马铃薯淀粉为原料制备高麦芽糖浆的液 化影响因素进行了研究；杨铭铎等 4 6 1 对马铃薯淀粉制备低de 值麦芽糊精的工艺条 件进行了优化。 从表面上看，磷酸寡糖前体与普通麦芽低聚糖的制备过程相似，但在淀粉酶作用 于马铃薯淀粉时，将受到连接在葡萄糖残基上的磷酸基团的电荷效应和空间位阻效应 的影响【1 3 j ，使得酶解产物为聚合度较大( 一般在1 0 以上) 的麦芽低聚糖，酶解反应的 转化率大为降低，且产物中麦芽三糖至麦芽六糖组分的比例偏低。毛跟年等人【4 7 】对磷 酸寡糖前体麦芽低聚糖的制备做了初步研究，但并未进行优化处理。本课题研究小 组成员亦在实验室进行了前期优化研究。实验中采用耐高温铲淀粉酶、葡萄糖氧化酶 及普鲁兰酶共同作用制备麦芽低聚糖浆，但由于实验室不能进行喷射液化，d e 值不 易控制，导致产物中葡萄糖含量高，而低聚糖类含量较低。 1 3 3 磷酸寡糖的分离纯化 由于磷酸寡糖分子中结合有磷酸基团，其分离特性与果糖1 , 6 二磷酸有相似之 处。磷酸基团带有负电荷，因此可以采用离子交换法除去不带电荷的中性糖。 k a t a y a m a t a t s u o 等人【4 8 】采用d o w e xs a r 作为树脂填料，以0 4 mn a c l ( p h = 2 ) 为洗 脱剂，分离纯化出f d p 。应汉杰等【4 9 】对2 0 1 7 ，d 3 0 1 ，d 2 0 1 ，h j - 3 0 ，7 1 7 等不同型号树 脂分离f d p 的性能进行了研究，筛选出了型号为h j 3 0 的树脂，分离f d p 效果较好。 s v e nm 娃l l e r - l o e r m i e s 等【5 0 】采用高效阴离子色谱c a r b o p a cp a l 半制备柱，以h 2 0 和 6 0 0 m m n a o a c 为洗脱剂，从e c o l ij 5 脂质糖中成功分离出磷酸化的低聚糖类。m a r t i n h o r s t 等【5 1 】采用q a e s e p h a d e xa 2 5 对6 磷酸甘露糖及6 磷酸葡糖酸盐的分离情况进 行了研究。日本学者【l5 】采用壳聚糖修饰的离子交换层析柱，以含有盐溶液的乙酸缓冲 液对磷酸寡糖进行分离纯化。本课题研究小组成员采用h j 3 0 弱碱性阴离子交换树 脂，0 5 m o l l n a c l 作为洗脱液，亦可将磷酸寡糖分离出来【5 2 l ，但得率过低。 1 3 4 低聚糖的分析检测方法 低聚糖的分离检测方法目前有多种，如：薄层色谱法、气相色谱法、高效毛细管 电泳法，高效液相色谱法( h p l c ，折光示差检测器) ，高效阴离子色谱法( 电化学检 测器) 等。气相色谱法( g c ) 测定糖类，具有选择性好、样品用量少、分辨率高、快速 准确、灵敏等优点，但糖类物质本身没有足够的挥发性，必须要将其转化为挥发性衍 生物【5 3 1 。张威等嗍对土壤中的8 种单糖进行糖腈乙酰酯衍生化，而后通过气相色谱 法对这8 种糖的含量进行了测定，但