（食品科学专业论文）酶法改善大豆分离蛋白起泡性和乳化性的研究.pdf

摘要 摘要 大豆蛋白是人类重要的营养来源和工业原料，价格低廉，不含胆固醇，但由于其功 能性质例如起泡性与蛋清蛋白、乳化性与酪蛋白酸钠等天然优良性能的蛋白质相比还有 很大的差距，导致其在现代食品加工中的应用受到一定限制。本文以大豆分离蛋白为原 料，主要研究酶改性对其起泡性、乳化性以及结构性质的影响，研究对大豆分离蛋白的 结构功能改造具有一定的学术意义，对于提高大豆蛋白的使用价值具有重要的现实意 义。 论文首先研究了酶水解和酶交联并用的方法对于大豆分离蛋白起泡性以及乳化性 的影响。论文创新性地设计通过控制底物的分子量和疏水性以提高大豆分离蛋白水解物 交联产物的乳化性和起泡性的蛋白质改造方法。论文首先将大豆分离蛋白通过碱性蛋白 酶a l c a l a s e 水解，利用超滤进行分级获得不同分子量肽段( 5 k d a 以下以及1 0 k d a 以上) ， 利用谷氨酰胺转移酶( t g a s e ) 进行重组，测量其处理前后起泡性和乳化性的变化。实 验结果显示大豆分离蛋白经a l c a l a s e 水解并使用t g a s e 交联后，产物起泡能力和泡沫稳 定性有了显著的提高；但是乳化性略有不同，随着交联的不断进行，蛋白的乳化性逐渐 增加，乳化稳定性略有下降。论文接着从亲疏水性角度研究了酶改性对大豆分离蛋白起 泡性和乳化性的影响。同样将大豆分离蛋白进行水解，通过柱色谱将亲水性肽和疏水性 肽分离，然后使用t g a s e 进行交联，结果显示，将分子量1 万以上的亲水性肽段和疏水 性肽段以1 ：l 混合后进行交联，产物的泡沫稳定性有显著提高。通过水解、按照分子 量分级以及控制底物亲疏水性比例，酶交联后产物的起泡性和乳化性比原始大豆分离蛋 白都有显著提高。 在此基础上，论文测定不同改造程度的大豆分离蛋白水解的分子量、分子量分布、 表面疏水性、表面张力以及自由氨基含量等性质，初步探讨了酶改造对于大豆蛋白结构 性质的影响，以及这种结构改变对于功能性质的影响。结果显示：酶处理显著提高了大 豆分离蛋白的溶解性，改善了其表面疏水性和表面张力使得起泡和乳化过程更容易发 生，自由氨基含量随着交联程度的提高而下降，分子量分布显示出了酶处理对大豆分离 蛋白分子所做的改性。在结构性质与功能性质相关性方面，分子量分布对起泡能力的影 响不显著，分子量在5 0 k d a 左右产生好的泡沫稳定性，且分布越集中其泡沫稳定性越 好；乳化活性随着分子量的增加而变好，乳化稳定性与大豆分离蛋白相比变化不显著； 高的氮溶指数是好的起泡性和乳化性的基础，在一定程度下，起泡能力随氮溶指数的升 高而上升；起泡性和乳化性均随表面疏水性的增加而升高；起泡性与表面张力并未表现 出显著的相关性，乳化性随着表面张力的升高而降低；泡沫稳定性和乳化稳定性表现出 了随自由氨基升高而变好的趋势。 本论文的研究对大豆分离蛋白的结构改造以及应用的拓宽具有一定的指导意义和 实用价值。 关键词：大豆分离蛋白，起泡性，乳化性，酶水解，酶交联 a b s t r a c t a b s t r a c t s o y b e a np r o t e i ni sn o to n l ya l li m p o r t a n tp r o t e i ns o u r c ef o rh u m a nn u t r i t i o nb u ta l s oa n i n d u s t r i a lm a t e r i a lw i t hl o wp r i c ea n dl o wc h o l e s t e r o ll e v e l h o w e v e r , i t sp o o rf u n c t i o n a l i t y l i m i t e di t su s e di nt h ef o o di n d u s t r y f o re x a m p l e ，i t sf o a m i n gp r o p e r t yi sf a rw o r s et h a ne g g w h i t ep r o t e i n i nt h i ss t u d y , t h ei n f l u e n c eo fe n z y m em o d i f i c a t i o no nt h es t r u c t u r ea n d f u n c t i o n a l i t ys u c ha sf o a m i n gp r o p e r t yo fs o y b e a np r o t e i ni s o l a t ew a si n v e s t i g a t e d 。 s p lw a sh y d r o l y z e db ya l c a l a s e ，t h e nt h ed i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h th y d r o l y s a t e s ( m w 10 k d a ) w e r es e p a r a t e db yu l t r a f i l t r a t i o n s u b s e q u e n t l y , t h e h y d r o l y s a t e sw i t hp r o p e rm o l e c u l a rw e i g h t sw e r ec r o s s l i n k e db yt g a s e i nc o n c l u s i o n ：t h e f o a m i n gc a p a c i t ya n df o a m i n gs t a b i l i t yw e r ei m p r o v e ds i g n i f i c a n t l y a f t e rt h ee n z y m e m o d i f i c a t i o n ；t h ee m u l s i f y i n ga c t i v i t yw a si m p r o v e ds i g n i f i c a n t l yb u tt h ee m u l s i o ns t a b i l i t y w a sd e p r e s s e d t h e nt h ee n z y m em o d i f i c a t i o no nt h ef o a mp r o p e r t i e sa n dt h ee m u l s i f y i n gp r o p e r t i e so fs p l w a sr e s e a r c h e df r o mt h ev i e wo ft h eh y d r o p h i l i c h y d r o p h o b i cp r o p e r t i e s t h eh y d r o p h i l i c p e p t i d e sa n dt h eh y d r o p h o b i cw e r es e p a r a t e da n dc r o s s l i n k e db yt g a s eo nd i f f e r e n t c o m b i n a t i o n ，t h e nt h ef o a mp r o p e r t i e sa n dt h ee m u l s i f y i n gp r o p e r t i e sw e r em e a s u r e d t h e r e s u l t sw e r et h ef o a mc a p a c i t ya n df o a ms t a b i l i t yw e r ei m p r o v e db u tt h ee m u l s i f y i n ga c t i v i t y a n dt h ee m u l s i o ns t a b i l i t yw e r ed e p r e s s e d ，t h i sr e s u l t sw e r er e l a t e dt ot h ec h a n g eo ft h e s u r f a c eh y d r o p h o b i c i t ya n dt h ec o n t e n to fa m i n og r o u p t h es t r u c t u r a lp r o p e r t i e s ( s o l u b i l i t y , s u r f a c eh y d r o p h o b i c i t y , s u r f a c et e n s i o n ，t h ec o n t e n to f a m i n og r o u p ，t h ed i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a rw e i g h t ) ，t h ef o a mp r o p e r t i e sa n dt h ee m u l s i f y i n g p r o p e r t i e sw e r em e a s u r e da n db ec o m p a r e dw i t ht h eo r i g i n a ls p i t h ef o a mp r o p e r t i e sh a d o b v i o u sc o n n e c t i o nw i t hs o l u b i l i t y , s u r f a c eh y d r o p h o b i c i t y ，s u r f a c et e n s i o na n dt h e d i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a rw e i g h t t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es t r u c t u r a lp r o p e r t i e sa n df o a mp r o p e r t i e sa n dt h ee m u l s i f y i n g p r o p e r t i e s ：t h el a g e rt h em o l e c u l a rw e i g h tw a s ，t h eb e t t e r t h ef o a ms t a b i l i t ya n dt h e e m u l s i f y i n ga c t i v i t yw e r e ；t h eh i g h e rt h en s lw a s ，t h eb e t t e rt h ef o a mc a p a c i t yw a s ；t h el o w e r t h es u r f a c et e n s i o nw a s ，t h eb e t t e rt h ee m u l s i f y i n ga c t i v i t yw a s ；t h em o r et h ef r e ea m i n o g r o u p sw a s ，t h ef o a ms t a b i l i t ya n d t h ee m u l s i o ns t a b i l i t yw e r e t h er e s e a r c hi sm e a n i n g f u lt ot h es t r u c t u r em o d i f i c a t i o na n dw i d e l ya p p l i c a t i o no fs o y b e a n p r o t e i ni s o l a t e k e y w o r d s ：s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e ，f o a m i n gp r o p e r t i e s ，e n z y m eh y d r o l y s i s ，e n z y m e c r o s s l i n k i n g 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 到遂 日期：o 拶艿肜 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：到亟 导师签名： 日期： p 冬 老 塑茳：墨：! 墨 第一章绪论 1 1 立题背景和意义 第一章绪论 大豆蛋白是一种重要的植物蛋白产品，资源丰富，品质优良，含有丰富的蛋白质， 含量占干基的4 0 以上，其蛋白质含量接近动物蛋白，蛋白质组成中人体必需的8 种氨 基酸较为平衡，尤以赖氨酸最高，同时还含有大量对人体健康有益的必需脂肪酸、磷脂 和丰富的钙、磷等矿物质且不含胆固醇，具有较高的营养价值【l 】，再者大豆蛋白具有较 好的与食品的嗜好性、加工性等相关的功能特性等因素而成为某些食品加工中的重要原 料【2 1 。 大豆蛋白在国内资源丰富，除了部分被直接加工利用外，大部分存在于油料工业的 高蛋白副产物豆粕中。长期以来，由于上游加工路径、本身性能等原因，导致豆粕深加 工程度比较低。国内大豆蛋白资源达到4 0 0 多万吨，绝大部分用于饲料、酿造、水解蛋 白等附加值相对比较低的场合，而附加值略高的食品蛋白类配料功能产品，目前仅仅生 产浓缩蛋白和分离蛋白，主要用于肉制品工业，产能不超过6 万吨。分析造成这种局面 的主要原因是大豆蛋白尽管具有价格便宜，也具有一定的功能性质，但是各种性质例如 乳化性、胶凝性、起泡性等与动物源如酪蛋白、肌纤维蛋白、蛋清蛋白等相比，功能性 质仍然有相当大的差距【3 1 。 由于大豆具有良好的价格优势以及潜在的功能特征，对于大豆蛋白结构改造以及进 一步提高功能性质的研究一直是国内外研究的热点。大豆蛋白的改性技术，通常采用的 是物理改性如热、p h 、离子强度嗍等，化学改性如酰化5 3 等，酶法改造1 6 - 1 4 1 以及生物工 程改造等方法。化学改造方法由于具有副产物以及安全性问题而有大量疑虑。酶法由于 条件相对温和，而受到重视。对酶水解法改造大豆分离蛋白的研究结果显示，酶解可提 高其起泡能力但泡沫稳定性有所下降【1 2 3 1 ，适度酶解后( 水解度0 5 2 0 ) 采用谷氨 酰胺转移酶( t g a s e ) 进行交联，可以提高大豆蛋白的溶解度【1 4 j 。 大豆蛋白与其它类型的蛋白，譬如蛋清蛋白相比具有较差的起泡性，其在这方面的 应用也远远不及蛋清蛋白。尤其是蛋清蛋白的起泡性，在蛋糕类食品中的应用相当普遍。 但是，蛋清蛋白中含有较多的胆固醇，并且蛋清蛋白的价格高于大豆蛋白，因此，改善 大豆蛋白的起泡性与泡沫稳定性具有重要的社会意义和经济意义。本论文针对大豆蛋白 的起泡性，通过水解、水解后使用谷氨酰胺转移酶交联，探讨酶改造对于大豆蛋白结构 性质以及起泡能力和泡沫稳定性的影响，以期对大豆蛋白的结构改造以及应用的拓宽提 供一定的研究基础。 本课题来源于十一五“8 6 3 ”项目“植物源蛋白质性质的生物技术改良” ( 2 0 0 6 a a l 0 2 3 2 5 ) 以及益海嘉里集团食品技术研究所“植物蛋白质性质研究”项目支 持。 江南大学硕士学位论文 1 2 大豆蛋白功能性质研究进展 1 2 1 大豆蛋白成分分析 根据超离心分析结果，大豆蛋白可分为2 s 、7 s 、l l s 和1 5 s 1 5 1 等4 种组分，见表 1 1 所示【1 6 17 1 。l l s 组分基本上为一种单一蛋白质，占大豆蛋白总量2 5 3 5 ；7 s 组 分占3 0 3 5 。依免疫性质的差异又可将大豆蛋白分为大豆球蛋白及仪、p 、丫一伴大 豆球蛋白4 种球蛋白。大豆球蛋白即为1 i s ，仪伴大豆球蛋白为2 s 球蛋白。 表i - 1 大豆蛋白的组成 t a b1 1t h ec o m p o s i t i o no fs o y b e a np r o t e i n 1 2 2 大豆蛋白的功能特性 功能特性是指食品在加工、贮藏和消费过程中，决定蛋白质行为表现的性质引。大 豆蛋白除营养价值外，它还具有许多重要功能性质，这些功能性质对大豆蛋白在食品中 应用具有重要价值。大豆蛋白作为一种食品添加剂，在食品中不仅可有效提高蛋白质含 量，更为重要的是它所表现出的功能特性，如起泡性、乳化性、溶解性、凝胶性等，这 些特性被应用于改善食品特性中，如改善口感、增加弹性、增加保水性、增加吸油性、 提高贮存性【1 9 j 等。 大豆蛋白的功能特性与其结构有关，即氨基酸组成、排列顺序、构象、分子的形状 和大小、电荷分布以及分子内和分子间键的作用【2 0 1 。高比例的极性残基影响肽链间相互 作用、水化作用、溶解性和表面活性、疏水性相互作用在蛋白质三级折叠中相互重要， 它影响乳化作用、起泡性和风味结合能力。带电氨基酸能增强静力相互作用，起到稳定 球蛋白，结合水分的作用，以及水化作用、溶解度、凝胶作用和表面活性。巯基能被氧 化形成二硫键，硫醇和二硫化物的相互转化会影响流变特性。共价键和非共价键的性质 和数量决定了蛋白质的大小、形状、表面电荷。所有这些性质又受p h 、温度等环境因 素及加工处理的影响p 。 大豆蛋白在不同溶解体系中的溶解程度和溶解稳定性是加工中首要考虑的问题，而 且大豆蛋白发挥所具有的各种功能特性，首先也要以蛋自质的溶解操作为前提。大豆蛋 白的溶解性又叫做大豆蛋白的分散特性，是指处于特定环境下的大豆蛋白中可溶性蛋白 质所占的百分比。影响大豆蛋白溶解性的主要因素有温度、介质的p h 值和离子强度拉引 等，同时蛋白质的溶解性对其它功能特性有着密切的关系i l 引。 2 第一章绪论 凝胶性是大豆蛋白重要的功能特性之一，蛋白质凝胶能力作为水、油、糖、风味和 其他添加剂的载体在食品应用和新产品的开发中具有重要的作用【2 2 】。7 s 和1 1 s 球蛋白 具有不同的结构和凝胶特性。蛋白质凝胶结构中的作用力包括氢键、疏水键、二硫键及 离子作用【1 8 ，2 3 。2 4 】等。大豆蛋白中，7 s 球蛋白和1 1 s 球蛋白的凝胶化性质也有差异【2 5 】。 经过测定，1 1 s 球蛋白凝胶的硬度和凝聚性大，凝胶除了具有较高的粘性外，还具有可 塑性、弹性等性质。蛋白质的种类和浓度、加热温度和时间、p h 、离子强度和变性剂 的作用等各种各样的原因都是影响其粘性以及凝胶形成的因子。大豆分离蛋白通常作为 食品添加剂应用在肉制品的加工中，如火腿、香肠等，在这些食品中，分离蛋白可以在 8 0 以下形成凝胶是非常重要的性质，因为高温会影响肉制品的组织状态【2 4 】。 大豆蛋白分子中同时含有亲水和亲油的两亲结构，当它聚集于油水界面时，使其表 面张力降低，促进形成油一水乳化液。形成乳化液后，乳化的油滴被聚集在其表面的蛋 白质所稳定，形成一种保护层，这个保护层可以防止油滴聚集和乳化状态的破坏，这就 是大豆蛋白的乳化稳定性1 2 倒。大豆蛋白的乳化性受蛋白质变性程度和蛋白质组分的影响 拉引。大豆分离蛋白作为表面活性剂来稳定乳化结构，可以防止脂肪的析出，延长某些产 品的货架期，如汤料、香肠等。 由于大豆蛋白分子在分散液中表现出较强的界面活性，在一定程度上具有降低界面 张力的作用，所以当大豆分离蛋白溶液受到急速机械搅拌时大量混入的气体和水形成界 面，大豆蛋白分子吸附在界面上，降低界面张力，促进界面的形成，就形成了泡沫【2 4 1 表1 2 表明了大豆蛋白的功能特性与其在食品工业中的应用。 表i - 2 大豆蛋白功能特性在食品中的应用 t a b l et - 2f u n c t i o n a l i t i e so fs o y b e a np r o t e i n si nf o o ds y s t e m s + 本表格中内容来源于参考文献2 2 ，2 7 2 8 1 2 3 大豆蛋白起泡陛 泡沫是一种气体分散在连续液体相中的两相系统。一般认为它有两种极端的结构状 况。一种叫稀泡沫，它是一种有许多接近球形的气泡被有些粘性的、较厚一些的液体膜 所分开的分散系。另一种是浓泡沫，它大部分是气相，气体被很薄的液体膜分开成为许 里宴奎兰婴主堂垡丝苎 多多面体气泡单元。对于食品工业，研究浓泡沫才有意义。同时，要作为食品泡沫必须 具备一下条件：含有大量的低密度躯体；在气相和连续液相之间有较大的表面积；溶质 的浓度在表面较高；有膨胀而坚硬或半硬并有弹性的膜或壁：可反射光，看起来不透明 【1 8 】 o 蛋白质的泡沫主要由蛋白质溶液包裹着的小气泡群体组成。大豆蛋白溶胶受到急速 的机械搅拌时，有大量的气体混入，形成许多水一空气界面，而大豆蛋白分子由于具有 典型的两亲结构，因而在分散液中表现出较强的界面活性，具有一定程度的降低界面张 力的作用。大豆蛋白溶胶收到急速的机械搅拌时，会有大量的气体混入，形成相当量的 水空气界面，溶液中的大豆蛋白分子吸附到这些界面上来，降低界面张力，促进界面 形成，同时由于大豆蛋白的部分肽链间( 包括分子内和分子间) 的相互作用，形成了一 个二维保护网络，使界面膜得以加强，这样就促进了泡沫的形成与稳定【2 引。所谓的“稳 定”，就是指泡沫形成以后能保持一定时间，并具有一定的抗破坏能力，这是实际应用 的先决条件。 蛋白质可否作为乳化剂或起泡剂取决于以下两个方面的能力，即蛋白质迁移至界面 的速率和其形成稳定膜的能力。 在大豆蛋白中，分离蛋白的起泡性最好。大豆蛋白功能特性主要是由蛋白质内在属 性所决定的。凡是影响大豆蛋白内在结构及其聚集状态的因素，必然影响其起泡性。除 蛋白质内在属性外，其它一些外在因素，如p h 值、温度、离子强度及与其它食品组分 相互作用【1 8 2 - 引，对起泡性也有影响。 通常大豆蛋白的起泡性使用于高级糕点上的装饰及冰淇淋和啤酒的生产【l j 。大豆蛋 白虽然能够形成相当稳定的亚稳态泡沫，但与工业生产的实际要求相比，还有一定差距， 因此需要对大豆蛋白进行改性以提高其起泡性。一般来说，提高起泡特性既要提高其起 泡能力又要提高其泡沫稳定性，而对于蛋白质来说，提高其泡沫稳定性更有意义。 1 2 4 大豆蛋白乳化性 乳化性是指油和水混合在一起形成乳状液的性能。大豆分离蛋白是表面活性剂，它 既能降低水和油的表面张力，又能降低水和空气的表面张力，易于形成稳定的乳状液【2 酬。 许多因素影响着乳状液的特性和乳化试验的结果：设备的类型及几何形状、输入量、加 入油的速度、油相体积、温度、p h 、离子强度、糖的存在、低分子量表面活性剂的存 在等等口7 j 。 大豆蛋白分子中同时含有亲水和亲油的两亲结构，当它聚集于油水界面时，使其表 面张力降低，促进形成油一水乳化液。形成乳化液后，乳化的油滴被聚集在其表面的蛋 白质所稳定，形成一种保护层，这个保护层可以防止油滴聚集和乳化状态的破坏，这就 是大豆蛋白的乳化稳定性 2 8 】。大豆蛋白的乳化性受蛋白质变性程度和蛋白质组分的影响 2 5 1 。大豆分离蛋白作为表面活性剂来稳定乳化结构，可以防止脂肪的析出，延长某些产 品的货架期，如汤料、香肠等，在烤制食品、冷冻食品以及汤类食品的制作中，己见大 量加入大豆分离蛋白作乳化性使制品状态稳定的研究报道。 4 第一章绪论 1 3 蛋白质改性研究 1 3 1 改性方法 目前蛋白质的改性方法主要有物理改性、化学改性、酶法改性以及生物工程改性。 物理改性是利用加热、机械作用、声波等方式改变蛋白质高级结构和分子间聚集方 式，一般不涉及蛋白质一级结构；实际上，物理改性就是在控制条件下蛋白质定向变形。 物理改性常用方法有：加热、高静压、超高压、超声等；另外，张春红等1 2 9 】研究了使用 氮气改善大豆分离蛋白凝胶性、保水性、乳化性和乳化稳定性。 化学改性可改善植物蛋白功能和营养特性，其实质是通过改变蛋白质结构、静电荷 和疏水基，除去抗营养因子，从而改善植物蛋白性质。化学改性包括氨基酸共价连接、 硫醇化、酰化、磷酸化、胍基化或用酸、碱、盐部分水解以改进植物蛋白功能性【5 3 u 。圳 等。 酶法改性技术是利用蛋白酶内切作用及外切作用将蛋白分子切割成较小分子，使其 蛋白功能特性有所改变。酶法改性程度取决于所用的酶、处理时间及人们所需要功能性 质，同化学改性相比，酶法改性还具有以下几个方面优点：( 1 ) 酶解过程十分温和，很 少或没有不受欢迎副反应或副产品；( 2 ) 最终水解产物经平衡后，含盐极少且最终产品 功能性质可通过选择特定的酶和反应因素加以控制；( 3 ) 蛋白水解物可直接为消化不良 者提供营养。可用于植物蛋白酶法改性的酶有木瓜蛋白酶、谷氨酰胺转移酶( t g a s e ) 、 枯草杆菌蛋白酶【3 4 1 以及动物蛋白酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶【3 5 j 等。 生物工程改性主要是指基因工程改性。基因工程改性是指应用植物育种和分子技 术，改变蛋白质分子结构，进而影响其功能性质方法。广义基因工程改性包括基因工程 重组、基因突变和染色体变异；狭义基因工程改性则指基因定点修饰f 2 引。 1 3 2 酶法改性影响起泡性和乳化性的国内外研究进展 1 3 2 1 酶法改性影响起泡性的国内外研究进展 蛋白质分子由于具有典型的两亲结构，因而在分散液中表现出较强的界面活性，具 有一定程度的降低界面张力的作用，在剧烈搅拌时形成泡沫。泡沫形成的机理：首先蛋 白质在空气与水界面上延伸，在界面吸附，亲水基团和疏水基团分别定向于水相和非水 相；然后蛋白质多肽链相互作用，通过静电力、亲水作用及氢键连接，从而形成了连续 的薄膜。最后在稳定的泡沫体系中，蛋白质多肽链相互作用缔合形成连续的分子间聚合 物，包围空气。此泡沫是由液态连续相包裹空气分散相所形成，p h 值、能量供应和溶 质的存在都会影响蛋白的起泡能力，另外蛋白质的构型及氨基酸的也是重要影响因素 【2 8 】 。 o 酶解可以使得蛋白质的构象展开，对蛋白质的功能性相应地产生影响。酶解可显著 提高蛋白质的起泡能力，但会降低其泡沫稳定性，s a r a 眩】，a i t i r ob 3 1e l f a d i l 3 6 1 等人已经 实验得出了结果，r 萄a f l 4 】研究表明适度酶解后( 水解度o 5 2 o ) 采用谷氨酰胺转移 坚堕奎堂婴主兰垡笙茎 酶( t g a s e ) 进行交联，可以提高大豆蛋白的溶解度，有报道表明谷氨酰胺转移酶对起泡 能力无影响，但可以显著提高蛋白质的泡沫稳定- | 生 3 7 , 3 8 j 。 谷氨酰胺转移酶( t g a s e ) 是一种可以催化转酰基反应，催化蛋白质中赖氨酸上的 氨基和谷氨酸上的1 ，羟酰胺基之间的结合反应，从而导致蛋白质( 或多肽) 之间发生共 价交联形成共价化合物的聚合酶【8 】。它可通过胺的导入、交联以及脱胺3 种途径改性蛋 白质，不仅可以通过引入赖氨酸等氨基酸而提高蛋白质的营养效价，还能改善食品的功 能特性，延长货价期以及减少食品中的过敏源。e l f a d i l1 3 8 1 研究了大豆分离蛋白经胰凝乳 蛋白酶水解后使用t g a s e 交联对其功能性的影响，结果显示，经酶处理后大豆分离蛋白 的泡沫消散时间由1 8 m i n 增加到4 3 一4 5 m i n ，显著提高了其泡沫稳定性。唐传核 3 7 , 3 8 等人研究了转谷氨酰胺酶对大豆蛋白其他功能特性的影响，结果显示：( 1 ) 显著地提高 了大豆蛋白对p h 的稳定性，降低了它的溶解性能，但在等电点附近有点增加；( 2 ) 降 低了大豆蛋白的乳化能力，但其乳化稳定性稍有增加；( 3 ) 对起泡能力影响不大，但可 显著地改善泡沫稳定性。 谷氨酰胺转移酶可以改善泡沫稳定性的国内外研究结果可以作为论文研究的基础， 通过选择其他影响因素来更有目的性地提高大豆分离蛋白的起泡性。 1 3 2 2 酶法改性影响乳化性的国内外研究进展 蛋白质是具有两亲结构的有乳化能力的生物大分子，作为一种符合要求的天然食品 添加剂有着广泛的应用领域。但一般来说，由于大分子吸附的特点，蛋白质的表面活性 远远低于小分子乳化剂，即乳化能力远远低于小分子乳化剂，而且蛋白质的乳化性能对 体系环境变化非常敏感。提高蛋白质的乳化能力、乳化稳定性以及适用范围一直是食品 科学领域的一个研究重点。 酶改性用来改善蛋白质乳化性的研究非常广泛，a m r o ，g a m m a a 等【l3 】研究了粟米蛋 白经胰凝乳蛋白酶处理后再使用多糖交联以及t g a s e 处理后对其功能性的影响，经处理 之后的乳化性与原始蛋白相比有很大提高；b i r b e l 和g e r d 3 9 j 在研究中发现将小麦蛋白 使用木瓜蛋白酶有限水解，水解度大于3 后，起泡性开始下降，而水解度为2 8 时， 乳化活性达到最高值，随着水解度升高到3 ，乳化稳定性逐渐变好，水解度在3 以 上时，乳化稳定性随着水解度的提高而下降。谷氨酰胺转移酶用于改善蛋白乳化性的研 究也很多，k i n g s l e y ，y l x i o n g 4 0 】等研究了小麦蛋白经胰凝乳蛋白酶有限水解后使用 t g a s e 交联显著提高了小麦蛋白的溶解性同时降低了其表面疏水性，从而对乳化性产生 影响；c r i s t i n a , c r i s t i n a i lo j 研究了使用t g a s e 分别将豌豆蛋白、大豆分离蛋白、蛋清蛋 白和小麦蛋白连接到大米蛋白上，这样的处理显著地提高了大米蛋白的乳化活性，但乳 化稳定性有所下降。 蛋白水解后再交联可以使其结构发生明显的变化，而且可控性更强，将蛋白水解后 使用t g a s e 交联可以更加明朗的探讨蛋白质某些结构性质和功能性质的关系。 6 第一章绪论 1 4 主要研究内容 本课题主要研究了使用酶法改性对大豆分离蛋白的起泡性和乳化性进行改善，另外 重点探讨在大豆分离蛋白水解、交联过程中各结构性质对起泡性和乳化性的影响，为提 高大豆分离蛋白的功能性质，拓宽其应用面以及提升附加值提供一定的理论和实践基 础。主要的研究内容如下： 1 研究酶改性对大豆分离蛋白起泡性和乳化性的影响； 2 研究酶改性对大豆分离蛋白结构性质的影响； 3 初步探讨酶法改造大豆分离蛋白过程中结构与功能性的关系。 7 江南大学硕士学位论文 第二章酶改性对于大豆分离蛋白起泡性和乳化性的改良研究 2 1 引言 适度酶解可以提高大豆蛋白的起泡能力，却降低其泡沫稳定性1 1 2 , 1 3 j 。另外已经有很 多研究表明，疏水性也是影响大豆分离蛋白功能性质的重要指标之一，蛋白质乳化能力 的高低与表面疏水性存在正相关，且起泡能力与表面疏水性之间也有重要的关系【6 圳。 关于大豆蛋白性质的改良，前人大部分研究集中在只使用蛋白酶水解或只使用 t g a s e 交联，本研究考虑到分子量以及疏水性的影响，创新性的设计通过控制底物的分 子量和疏水性以提高大豆分离蛋白水解物交联产物的乳化性和起泡性地蛋白质改造方 法。本章通过将大豆分离蛋白水解、根据分子量分级分离，然后采用t g a s e 交联，探讨 控制分子量对于大豆蛋白起泡性和乳化性的影响，在此基础上，再次对大豆分离蛋白进 行水解，根据疏水性分级，然后采用t g a s e 交联，探讨控制疏水性对于大豆分离蛋白起 泡性和乳化性的影响。通过更加有目的性地对蛋白质进行改性，以期为大幅度提高大豆 分离蛋白功能性质的结构改造方法提供新思路。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料与试剂 大豆分离蛋白 碱性蛋白酶a l c a l s e 商品级谷氨酰胺转移酶( t g b ) 1 苯胺基8 一萘磺酸( a n s ) 金龙鱼大豆色拉油 s d s ，其它试剂 2 2 2 实验设备 高速乳化均质机 加热制冷循环器 p e l l i c o n 2 超滤系统、超滤膜 机械搅拌器 u v - 2 8 0 0 h 型紫外可见分光光度计 磁力搅拌器 南通光合生物技术有限公司 美国s i g m a 公司 江苏省泰兴市一呜精细化工有限公司 美国s i g m a 公司 食用级，上海嘉里粮油工业有限公司 a r ，国药集团化学试剂有限公司 广州仪科实验仪器有限公司 德国h a a k e 公司 m i l l i p o r e ( 上海) 公司 广州仪科实验仪器有限公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 广州仪科实验仪器有限公司 2 2 3 实验方法 2 2 3 1 大豆分离蛋白( s p i ) 的水解 将一定量水置于酶反应器中加入s p i 使其完全溶解，配成一定底物浓度的s p i 溶液， 8 笙三童堕墼丝型主盔呈坌塞笙鱼壑塑丝塑塾丝丝塑墅堕 搅拌均匀，保持温度5 5 ，用1m o l l n a o h 调p h 至8 0 ，加入a l c a l a s e ( 2 ，v w ) ， 反应一定时间( 期间维持p h8 o ) ，水解结束后，沸水浴加热1 0m i n 灭酶，水解液离心 ( 5 0 0 0r m i n ，2 0m i n ) ，收集上清液，加入0 0 3 叠氮钠以防止微生物生长。 2 2 3 2 蛋白质水解度( d h ) 的测定 通过p h s t a t 法【5 l 】计算蛋白质的水解度，公式如下： d h ：b xn b x 1 0 0 口m p h t o t 其中：b 一水解过程中消耗n a o h 溶液的体积( m l ) ；n b n a o h 溶液的浓度( m o l l ) ； 0 一0 【氨基解离度；m p 一底物蛋白质含量( g ) ；h t o t 一蛋白质中总的可被水解的肽键数( 大 豆蛋白为7 8m e q v g ) 。 2 2 3 3 超滤 使用截留分子量为1 0k d a 和5k d a 的聚砜膜对大豆分离蛋白水解液进行超滤。 2 2 3 4 测定水解液中多肽含量 使用双缩脲法【5 1 】测定。 2 2 3 5t g a s e 交联 多肽含量为1 的底物溶液中加入一定量的t g a s e ，4 0 。c 、p h 6 0 条件下反应一定 时间 3 9 , 5 2 , 5 3 】。交联结束后，8 0 。c 水浴中保温5 m i n 灭酶，2 5 c 水浴中冷却3 0 m i n 。 2 2 3 6 亲水性肽与疏水性肽的分离 大豆分离蛋白使用a l c a l a s e 水解，控制水解度d h = 3 ，所得的肽液经超滤得分子 量大于1 0 k d a 的部分。使用超纯水将实验室自组装的c 1 8 柱浸润充满，肽液每次上样 2 0 0 m l ，待肽液充满c 1 8 柱之后，使用6 0 0 m l 超纯水清洗，流速2 m l m i n ，收集流出 液旋转蒸发即得亲水性肽液，超纯水清洗过后使用6 0 0 m l 甲醇( 分析纯) 清洗，流速 2 m l m i n ，收集流出液旋转蒸发即得疏水性肽液。 2 2 3 6 起泡性测定方法 将一定浓度的s p i 溶液l o o m l 置于5 0 0 m l 量筒( 口径6 c m ，高为2 0 c m ，实验室自 制) 中，使用高速乳化均质机以一定速度均质4 0s ，连续3 次共计2m i n ，记录均质后 液面高度记为v o ，静置3 0m i n 后记录液面高度，记为v 3 0 m i n o 起泡能力( f o a m i n gc a p a c i t y ) 公式如下： 粥f ) ：g o - 1 0 0 1