（食品科学专业论文）水体中微囊藻毒素的高灵敏快速免疫检测技术的研究.pdf

摘要 摘要 博士研究生：赵晓联 导师：汤坚教授 采用胶体金免疫层析技术( c g i c a ) 和酶联免疫吸附技术( e l i s a ) ，建立了微囊 藻毒素( m c l r ) 的高灵敏快速检测方法，并研制出具有我国自主知识产权的高灵敏 度酶免检测试剂盒和快速“金标”检测试纸条。 在研究中采用“活泼酯法”和“碳二亚胺法”，分别制备了m c l r - k l h 免疫抗原 和m c l r b s a 检测抗原。按常规方法免疫新西兰大白兔2 0 周，经采血，饱和硫酸胺 沉淀纯化得到抗m c l r 的多克隆抗体。同时，免疫b a l b c 小鼠，用细胞融合和杂交瘤 技术筛选，获得了高特异分泌抗m c l r 单克隆细胞株，经小鼠体内扩大培养，纯化后 获得抗m c l r 的单克隆抗体。利用制备的多克隆抗体，m c l r - b s a 检测抗原，以及 相应的e l i s a 常规试剂，建立了m c l r 的间接竞争e l l s a 方法，对方法的灵敏度， 线性范围，特异性，重现性，误差影响因素等主要技术指标进行了考核，同时研制出了 相应的检测试剂盒，考核其稳定性和回收率，并与相关的其他检测方法及国内外同类试 剂盒进行了比对验证。利用制备的抗m c l r 单克隆抗体，m c l r b s a 检测抗原以及 相应的c g i c t 常规试剂和辅材，建立了m c l r 的胶体金免疫层析快速检测方法，对 方法的灵敏度，特异性，重现性，检测时间，误差影响因素等主要技术指标进行了考核， 同时研制出了相应的“金标”快速检测试纸条，考核其稳定性和回收率。用h p l c 法对 其进行了比对验证。 利用多克隆抗体建立的m c l r 间接竞争e l l s a 法和研制的酶免检测试剂盒，其灵 敏度为o 0 5 i _ t g l ，检测线范围为o 1 l a g l - 1 0 i _ t g l ，拟合线性方程为y = - 2 0 2 3 5 5 x 0 4 1 1 9 ， 相关系数r 2 = 0 9 9 8 7 ，i c 5 0 为o 6 5 1 a g m l ，与m c i m 交叉反应率 3 0 ，与m c - l w ， m c - l f 的交叉反应率均 0 0 5 ，无明显差异，与h p l c 方法比对，结果经c h i t e s t 检验，为0 9 9 9 6 ，具有良好的相关性。 利用单抗建立的m c l r 胶体金免疫层析检测技术及“金标”快速检测试纸条，最 低检出限为1 0 p g i , ，重现性非常好，与m c l f ，m c l w 交叉反应率均 o 0 5 ) t h er e s u l to ft h e c h i t e s tc o m p a r e dw i t hh p l cw a s0 9 9 9 6 ，w h i c hs h o w e dt h e yh a v eg o o dr e l a t i v i t y 1 1 伦r a p i dc g i c ai m m u n o s t r i p sa g a i n s tm c l rw e r ep r e p a r e db yu s i n gm o n o c l o n a l a n t i b o d y r e s u i t ss h o w e dt h a tt h e1 0 w e s td e t e c t i o nl i m i to fw h i c hw a sl o p g 1 ，a n dt h e r e p r o d u c i b i l i t yw a sg o o d 1 1 1 ec r o s sr e a c t i v i t i e sw i t l lm c l w , m c l fw e r ea l l l o w e r t h a n1 ， a n dl o w e rt h a n2 0 、i t hm c r r t h ed e t e c t i o nt i m ew a sl e s st h a n1 0 m i na n dt h es h e l fl i f e o ft h e s es t r i p sw e r el o n g e rt h a l l1 0m o n t h s t h er e c o v e r i n gr a t ef o rs a m p l e sw e r e7 6 9 - 8 3 3 t h el e s tr e s u l t so f t h i st e c h n o l o g yw a ss i m i l a rt ot h a to f h p l c a n dt h ec o i n c i d e a c er a t ew a s 9 5 k e y w o r d s ：m i c r o e y s t i n l r ( m c l r ) ：e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ； c o l l o i e d - g o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ca s s a y ( c g i c a ) ；a n t i b o d y ；k i t ；s t r i p i v 目录 a d d a a f b l a g b s a c b c f ：a c g m o a b c g i c a c v ( ) e d c e i a e l i s a f a 0 f p h a t h c g h g p r t h p l c h r p i c s o i c e l i s a i c f a i g g k l h l d 5 0 m c - l 烈r r , l f , l w ) m c l r b s a m c l r k l h m c y s t s ( m c s ) m d h a m o a b n c d 盼 p b s p e g p o a b p p l u a s d t e m t g t k t m b 主要缩略词 3 一氨基一9 - 甲氧基- 2 ，6 ，8 一三甲基- 1 0 - 苯基- 4 ，6 二烯酸 黄曲霉毒素b ， 8 - 氮杂鸟嘌呤 牛血清白蛋白 碳酸盐缓冲液 福氏完全佐剂 胶体金一单克隆抗体结合物 胶体金免疫层析技术 变异系数 1 一( 3 - 甲基胺) 丙基) - 3 乙基一碳化二亚胺 酶免疫分析法 酶联免疫吸附分析法 世界粮农组织 絮凝点 单抗筛选的选择性培养液 人绒毛腊促性腺激素 次黄嘌呤一鸟嘌呤酸核苷转移酶 高效液相色谱法 辣根过氧化物酶 5 0 抑制率的浓度 问接竞争酶联免疫吸附法 福氏不完全佐剂 免疫球蛋白 匙孔血蓝蛋白 半数致死量 微囊藻毒素- - l r ( 砌乙l f , l w ) 微囊藻毒素一l r 一牛血清白蛋白结合物 微囊藻毒素一l r 一匙孔血蓝蛋白结合物 藻毒素 n 一甲基脱氢丙氨酸 单克隆抗体 硝酸纤维素膜 鸡卵清蛋白 磷酸盐缓冲液 聚乙二醇 多克隆抗体 蛋白磷酸酶 放射免疫分析法 标准偏差 透射电镜 6 巯基鸟嘌呤 胸苷激酶 四甲基联苯胺 江南丈学博士学位论文 t i t f i a t w e 色n 2 0 w h 0 i l 时间分辨荧光免疫分析法 吐温一2 0 世界卫生组织 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 日期：年月日 关于论文使用授权的说明 繇砰蠹一 j 第一章绪论 第一章绪论 1 1 藻毒素的产生和理化性质 1 1 1 藻毒素的产生及生成途径 藻毒素( m i c r o c y s t i n s ，简写m c y s t s 或m c s ) 是淡水中某些蓝藻产生的次生代谢 物，广泛存在于水体和水生生物中，并通过生物链累积残留于食品和饲料中，对人类和 动物产生危害。1 8 7 8 年，g e o r g e 首次报道了藻毒素可以引起动物中毒f l 】，而1 9 9 6 年， 巴西1 2 6 名肾透析病人发生的藻毒素急性中毒事故【2 】，使人们对藻毒素的危害日益重视 3 , 4 , 5 1 。大量的流行病学调查和毒性试验表明，藻毒素对生物体包括人类的肝脏有毒害作 用，已证实是强致癌剂( s t r o n gt u m o rp r o m o t e r ) 【t7 一。 针对藻毒素的产生及生成途径，国内外学者进行了大量的研究，藻毒素是由蓝藻门 的微囊藻( m i c r o s y s t i s ) 、鱼腥藻( a n a b a c n a ) 和颤藻( o s c i l l g c o r i a ) 等为主的毒性藻类 产生的，属于细胞内毒素，在细胞内合成、破裂后释放出来并表现出毒性 蓝藻细胞构造见图1 - 1 1 胶质鞘 2 类脂颗粒 3 细胞壁 4 质膜 5 核糖体 6 原始核 7 光合作用片层 8 糖原颗粒 图1 - 1 电子显微镜下蓝藻细胞构造示意图 f i g l 一1e l e c t r o nm k r o o p ti m a g i n go f c y a n o p h y t ac e l l 目前，对藻毒素产生的机理有两种学说，即遗传学说和环境学说1 9 l ，遗传学说认为： 有毒株( t o x i cs t r a i n s ) 和无毒株( n o n t o x i cs t r a i n s ) 微囊藻是由基因决定的。基因序列测 定结果表明：m c y s t s 的合成是由毒素肽合成酶合成的，产毒的微囊藻株含有具同源性 的肽合成酶基因保守序列，其中至少含有两个多肽合成酶基因，而微囊藻无毒株不具有 这些基因。进一步的研究，应用基因转化和插入失活的方法，造成一个肽合成酶基因失 活，由此获得的突变微囊藻细胞不再产生m c y s t s ，这些结果表明，t o x i cs t r a i n s 和 n o n t o x i cs t r a i n s 的遗传差异在于是否存在一种或几种编码毒素合成的基因。而环境学说 坚堕查兰堡主差竺丝兰 认为：m c y s t s 的产生受光照、温度、营养盐、生长期等多种因素的影响。光强对m c y s t s 有显著的影响，而适合藻细胞生长的温度，并不适于毒素的形成，在小于1 5i te m 4 s 4 的光强下，毒素产量较高。近期的研究还表明了，光能是毒素产生的重要制约因素，另 外，营养盐对产毒的作用也不一样，磷( p ) 、铁( f e ) 、锌( z n ) 的影响非常明显，在 b g i l 培养基中降低铁和锌的浓度，明显提高m c y s t s 的产量。 1 1 2m c y s t s 的种类、结构和理化特性 至今已发现m c y s t s 有6 5 种异构体，是一类具有生物活性的环状七肽物质，相对 分子质量约为1 0 0 0 d 左右，根据1 9 8 8 年制定的藻毒素( m i e r o c y s t i n s ) 命名法规定1 0 , h i ， 藻毒素的基本结构为n 甲基脱氢丙氨酸加上两个l 氨基酸残基x 和z 。一般结构为： 环( d 丙氨酸l x 赤1 3 甲基d 异天冬酸l z a d d a - d 异谷氨酸- n 一甲基脱氢丙氨酸) ( 见图1 2 ) 。 o 图1 2 藻毒素的结构示图 f i 9 1 - 2s l t r u e t u r eo f m i c r o e y s t i u s 其中n 甲基脱氢丙氨酸( m d h a ) 为一种特殊氨基酸，含有a 、b 不饱和双键；a d d a 为一种特殊氨基酸，结构为3 氨基9 甲氧基2 ，6 ，8 三甲基1 0 苯基- 4 ，6 - 二烯酸；x 、z 为 两种可变的l 氨基酸，由于x z 的不同组合而产生多种的m c y s t s ，至少有2 0 多种已 被分离和明确结构，存在较普遍且毒性较大的是l r 、r r ，y r 、l w 、l f 、y a 和y m 等。l 代表亮氨酸( l e u ) ，r 代表精氨酸( a r g ) ，y 代表酪氨酸( t y r ) ，w 代表色氨酸 ( t r p ) ，f 代表苯丙氨酸( h i s ) ，a 代表丙氨酸( a l a ) ，m 代表甲硫氨酸( m e t ) 。目前，已 阐明结构的m c y s t s 均含有a d d a 部分，而毒性与结构效应的实验显示a d d a 的结构影 响其毒性，只有a d d a 中e 6 ( e ) 型异构体才有生物活性，而c 6 ( z ) 型在标准小鼠生 物分析中不表现出毒性( l d 5 0 1 2 0 0 i tg k g ) 和生物活性。说明a d d a 是m c y s t s 生物活 性表达所必须的氨基酸，而6 0 多种异构体主要分别在甲基化、去甲基化、羟基化、差 相异构化、多肽序列各有差异。 从微囊藻毒素的分子结构可看出，由于含环状结构和间隔双键，所以具有相当的稳 2 曼二兰堕堡 定性，同时耐p h 变化，溶于水、丙酮或甲醇，n 热n 3 0 0o c 仍能维持很长时间不分解。 尽管它们为多肽结构，但普通的蛋白水解酶对它们不起作用1 1 3 1 。 1 2m c y s t s 与生物安全 1 2 1m c y s t s 的危害和毒性机理 1 2 1 1m c l r 对动植物的危害 微囊毒素对动物的毒害程度主要与水华密度、水华毒素含量有关，也与动物种类和大 小有关。单胃动物没有反刍动物和鸟类敏感1 1 3 1 。产毒微囊藻的生长能够降低水质，增加 人和动物接触毒素的风险。多种生物如鸟类( 包括家禽和水禽) 、宠物和牲畜、猴子等 接触微囊藻毒素后都表现出中毒现象1 1 4 1 。动物通过直接接触或饮用含有m c y s t s 的水 而中毒，中毒症状主要有昏迷、肌肉痉挛、呼吸急促、腹泻，中毒严重者在数小时以至 数天内死亡。早在1 8 7 8 年，f r a n c i s 就首次报道了在澳大利亚南澳大利亚湖中泡沫节球 藻( n o d u l a r i as p u m i g e n a ) 会对动物产生毒害作用，随后m c s 的危害性报道目益增爹1 5 1 ， 如1 9 9 8 年，p u s e h m e r 等i l6 j 报道了1 7 5 头牛饮用被蓝藻污染的池塘水，2 4 头中毒死亡， 其它的牛发生急性中毒或表现出激怒、食欲减退、虚弱无力等症状，尸检结果表明，胃 中残留有蓝藻、肝脏肿大i 色暗红而淤血、易碎。 虽然浮游动物和鱼类对m c s 有较大的耐受性，但毒素在其体内有残留富积和放大 效应，达到相当高的浓度，通过食物链对人类健康造成潜在的危害。有资料表明，淡水 蚌类u d o u g l a s i a e 和a w o o d i a n a 是淡水环境中的优势种群，经常被当地居民捕食，因 它们能够蓄积肝毒性物质m c ，故它们造成的危害不容忽视。 1 2 1 2m c l r 对人类健康的危害 人们直接接触含有毒素的水华，如在湖泊、河流、水库中进行游泳等娱乐活动，会 引起皮肤、眼睛过敏，发烧、疲劳以及急性肠胃炎，如果经常暴露于含有毒素的水体， 会引起皮肤癌、肝炎以及肝癌。 最引入关注的是j o c h i m s e n 等【2 1 报道了1 9 9 6 年巴西的一血透中心发生医疗事故，1 2 6 个病人中有1 1 6 人出现恶心、呕吐等神经系统中毒症状，2 个月后造成6 0 人死亡。事故 原因是生产渗透液的水源中含有m c y s t s ，而后进入病人血循环引起的急性肝损伤。 2 0 世纪9 0 年代，我国的董传祥1 1 7 1 、陈刚l 墙1 、陈公超1 1 9 1 等多位学者应用流行病学方 法研究了原发性肝癌高发区如江苏海门、泰兴等地区饮用水源中m c y s t s 盼暴露量，证 实m c y s t s 含量与原发性肝癌的发生率有一定的相关性。m c y s t s 是水介导的一类致癌 因素，受其污染的饮用水有可能是原发性肝癌高发的因素之一 另外，9 0 年代n i s h i w a r k i l 2 0 1 的研究还揭示了m c l r 与其它多种肿瘤发病率有相关 性。2 0 0 0 年，我国学者周伦【2 1 1 等研究发现水源水中的m c y s t s 含量与大肠癌发病有显 性相关。 江南大学博士学位论文 1 2 1 3m c y s t s 的毒性机理 肝脏是m c s 主要的靶器官。m c s 极易从血液中转移到肝脏，在肝脏中m c s 依赖胆 酸转运系统才能进入细胞，因而它的毒性有高度的肝特异性。 腹腔注射m c ( l d 5 0 5 0 1 0 0 1 t g k g ) ，2 4 小时内小鼠即死亡1 2 2 1 。f a w e l l - j k 等在研 究m c l r 急性毒性时发现，经腹腔注射的毒性要比口服途径的毒性大3 0 1 0 0 倍【2 3 1 。 y o s h i d a 等1 2 4 用9 5 纯度的m c l r 给6 周龄b a l b c 小鼠染毒，所得结果一致。大体 解剖可见肝脏充血、肿胀，占体重8 1 0 杈正常对照为4 5 ) ，组织病理学检查可见 细胞肿胀、浓缩和坏死等改变，肝脏大面积出血，相应部位的肝血窦破坏。 m c s 对肝脏的毒性作用主要通过以下3 个途径：激活肝细胞内核酸内切酶而损 害d n a ，引起d n a 链的无规律断裂，并且呈现剂量和时间反应关系【2 5 】；脂质过氧 化引起的氧化损伤作用是m c s 致肝细胞毒性的重要机理之一。d i n gwx 等用m c 处 理原代培养的大鼠肝细胞，可引起乳酸脱氢酶( l d h ) 。释放率和细胞内活性氧基( r o s ) 的升高，并与时间和剂量有相关关系i 拍】；强烈抑制蛋白磷酸酶i 型( p p i ) 及2 a 型( p p 2 a ) 活性1 2 7 1 ，使磷酸化和去磷酸化调节失衡，从而引发细胞一系列生理病理变化。另一方面， 某些蛋白的磷酸化可解除对细胞增殖的正常抑制作用，促进肿瘤的生长。这可能是m c s 促癌或致癌的途径。b h a t t a r y a 2 副等给雄性大鼠腹腔注射o 、 5 、1o 、20l d 5 0 剂量的蓝 绿藻细胞提取物，发现血中尿素和肌酸水平升高，白蛋白含量下降，随后尿中出现血红 素、蛋白、胆红素，而肾脏l d h 及谷草转氨酶下降，提示蓝藻毒素可能具有肾毒性。 另外的研究还显示了m c y s t s 其他致癌机理。王红兵1 2 9 j 等将m c l r 加入b c 3 t 3 细胞中7 2 小时后，发现m c l r 对细胞间隙通讯链接( g a pi u n c t i o ni n t r a c e l l u l a r e o m m u n i c a t i o n ，g j i c ) 具有明显的抑制作用，同时还伴有不同程度的c a 2 + 浓度升高， 一方面，持续升高的c a 2 + 浓度可以激活蛋白激酶，诱导细胞进入分裂状态，而对g j i c 的阻断又可以解除周围细胞对启动细胞增殖的监控作用，使其实现自主性生长，使已经 实施启动的细胞增殖失控，经过连续的克隆选择后完全转化恶性成瘤一 一 1 2 2m c y s t s 在生物链中的分布 世界卫生组织( w h o ) 出版的饮用水水质准则( 第二版第2 卷) 1 3 0 l 中论述：c o d d g a 、b e l ls c 等科学家报道了对世界范围淡水水体的大量调查显示，蓝绿藻水华生长状 。况严重，6 0 以上的调查点发现m c y s t s i j l j 。 从加拿大、日本、芬兰、美国和中国等地对湖水、河水、水库水、井水以及自来水 等水样的检测结果看，有的水体中m c y s t s 检出率高达6 0 - - 8 7 ，原水中m c y s t s 浓 度从1 3 0 n g m l - 2 9 0 0 n g m l 不等。经加氯消毒等处理后的浓度亦有0 0 9 n e ；m t 柚6 n g m l 不等p 2 1 。 m c y s t s 主要存在于发生水华的淡水湖泊中，水中溶解性 l g l ，不易沉淀或被吸 附于沉淀物和悬浮颗粒物中。在河水中，7 d 以内会降解，也可被紫外线分解或发生化学 4 第一章绪论 异构和化学反应而丧失毒性，半衰期是1 0 d 。当紫外线波长接近m c y s t s 的最大吸收波 长时( 2 3 8 n m - 2 5 4 n m ) ，其降解速度大大增加。m c y s t s 也能存在于被污染的水域中的 鱼类和贝类的肌肉和腮等组织中，人群的暴露途径主要是饮用水摄入，暴露水平随着不 同水体中不同时段有很大的不同。 水华藻类除向水体释放m c y s t s 外，本身也含有较高浓度的m c y s t s ，有研究报道， 从冻干藻细胞中分离出来的毒素含量从5 7 9 0 0 1 a g g 不等，多以m c y s t s 为主。人群直 接接触这些藻类水华，会引起皮肤、眼睛过敏、发烧、疲劳以及急性肠炎和肾炎。这些 藻类也能被淡水中的水生生物直接摄入和吸附后，再通过食物链最终影响人类的健康。 另外，人工培养的藻类以及螺旋藻类、水球藻为主要成分的减肥食品中也有报道检 出m c y s t s 。f e n g - - y i hy u l 3 3 】等用e de l i s a 检测了1 1 种人工培养的微囊藻类和ll 份 藻类减肥食品，结果表明，各有6 份和8 份检出m c y s t s ，含量分别为1 4 9 i _ t g g ，一1 4 6 6 i _ t g g 和2 0 n g g 9 8 n g g 。 1 2 3 藻毒素的污染现状 近十多年来，由于社会经济和人类生活水平的发展，向水体中排放了大量的氮磷等 有机污染物，加之全球气候的日益变暖，使水体富营养化程度加剧，直接的后果就是水 体中藻类大量繁殖，其中不少藻类在代谢过程中或藻体破裂后向水体中排放藻毒素。日 本、美国、澳大利亚德国，台湾等2 0 多个国家和地区曾对其境内的淡水湖泊，水库 等饮用水源中“水华”现象进行了研究和报道，分离并检测出了藻毒素1 3 4 1 ，可见藻毒素 的污染已成为一个全球性关注的环境问题【3 ”。 在我国，早在6 0 年代，太湖中就曾发现了条状分布的蓝藻水体1 3 6 1 。8 0 年代，我国 有关部门对全国范围内的水源水质进行了全面的调查，结果表明3 4 个湖泊中有5 0 以 上的湖泊面积属于富营养化状况，而进入9 0 年代这一状况日益严重，涉及范围不断扩 大，长江，黄河松花江等主要河流以及鄱阳湖，太湖、巢湖、武汉东胡，昆明滇池 上海淀山湖等几大淡水湖泊都发现有大量的藻类繁殖，主要的毒素是微囊藻毒素 ( m c l r ) 。如1 9 9 2 年，以黄河为水源的郑州市水厂的调蓄池内藻类大量生长，检测发 现m c u t 的含量达2 6 4 n g l 1 3 7 1 。特别是9 0 年代以来，太湖几乎年年出现蓝藻“爆发”， 严重阻碍了无锡市水厂的正常运行，使全市8 5 的供水受到威胁。1 9 9 9 年，通过对太 湖中2 1 个监测点进行的监测结果表明：太湖水域中m c l r 的几何平均浓度为4 0 7 n g l ， 最高浓度高达1 8 3 6 0 n g l i j ”。 江南大学博七学位论文 图1 _ 4 太湖中蓝藻水华 f i g 1 - 4t h ec y n n o p h y l 随b l o u mi nt n il a k e 为了观察微囊藻毒素对螺旋藻类保健食品的污染状况，中国疾病预防控制中心有关 专家p 州于2 0 0 2 年7 8 月份对江苏、云南、福建和广东我国主要螺旋藻生产基地的3 3 份 水源水、1 6 0 份养殖水、8 6 份螺旋藻浆、7 0 份螺旋藻原料粉进行了微囊藻毒素( m c l r ) 的测定，同时随机采集了上述四省的1 9 种7 1 份市售螺旋藻产品，用e l i s a 法对样品 中的微囊藻毒素进行测定。结果是：水源水中的1 2 份自来水样均未检测出微囊藻毒素， 9 份地下水样中有6 份、1 2 份地表水样中有8 份检测出不同污染水平的微囊藻毒素；1 6 0 份螺旋藻养殖场池水和8 6 份螺旋藻浆中的微囊毒素平均水平分别为2 0 7 9 p g m l 和 3 1 9 n g g ，两者相差1 5 3 倍；7 0 份螺旋藻原料粉中的微囊藻毒素平均污染水平是 2 0 6 4 n e , g ；1 9 种7 1 份市售螺旋藻片剂和胶囊产品中总微囊藻毒素平均为3 1 7 2 n g ，微 囊藻毒素污染平均水平分别为1 4 2 7 n g g 和2 2 2 6 n g g 。说明螺旋藻生产过程和市售产品 中均有不同程度的微囊藻毒素污染，服用螺旋藻摄入的微囊藻毒素对人类健康的影响不 可忽视，有必要进行深入研究。 1 3 国内外微囊藻毒素的分析方法进展 藻毒素( m c y s t ) 常见的不同组合有l r 、r r 、y r 、y a 、y m 、l w 、l f 等，其 中微囊藻毒素( m c l r ) 是“水华”中最常检出的毒素之一，因此，分析方法的建立常 常也主要是针对这种化合物。m c l r 、m c r r 、m c l f 、m c l w 的结构式见图l 一5 ， m c l r 的分子式为c 4 9 h 7 4 n 1 0 0 1 2 相对分子质量为9 9 5 2 。 6 第一章绪论 。 j 最丫，之工。r r t 。 童逸爹袅冀争j 雾渗 强r 貉泌蛰。 蚤r 笺轰釜v “毽蚤。弩。 由于微量蓝藻毒素对人类有危害，迫切需要对水体中特别是做为饮水水源的湖泊、 河流和水库中的蓝藻毒素以及不断增长的藻类食品进行监测l 帅】。目前的监测技术是针对 分布广、毒性大的微囊藻毒素( 如m c y s t l r ) 建立的，分析方法主要可归结为四种， 即生物分析法、色谱分析法、免疫分析法和其他仪器分析法。 1 3 1 生物分析法 1 3 1 1 生物体鉴定法 和大多数藻类毒素一样，较早研究淡水毒类产生的毒素，采用的是a o a c 推荐的 检测贝类毒素的小鼠试验法。即通常采用小鼠腹腔注射或口腔灌喂评价微囊藻毒素的毒 性。用纯化的微囊藻毒素或水华蓝藻中粗提藻毒素进行测试，根据其生理病变及半致死 量可初步确定其毒性( 除个别异构体的l d 5 0 为2 0 0i le c k g 2 5 0pg 瓜g ，多数微囊藻毒素 的l d s o 为6 0 i ig k g 7 0 l l 班曲。这也是毒理评价的常用方法。目前已建立许多其他的 生物系统来监测m c y s t s ，有用无脊椎动物如虾、贝、水蚤及其卵进行毒性评价的研究， 以细菌进行生物分析也有报道。如k i v i r a n t a 【4 1 1 利用“盐虾”试验来检测“水华”样品 中的藻毒素，结果显示阳性。b a t t l e l 4 2 谰s v 4 0 l t 血浆法对比了m c y s t - l r 作用于肝细 胞的毒性( 细胞毒性法) ，用光扫描电子显微镜来观察毒素对细胞分裂的影响。和“盐虾” 一样简单，幼蚊和成蚊也可作为检测用生物体。但这类方法灵敏度较差，所得到的毒型 结果与小鼠的品系有关，可比性较差，且无法确定毒素类型及结构。 7 江南大学博士学位论文 1 3 1 2 徽毒素检测法( m i c r o t o xa s s a y ，简称m a ) 一种具有商业价值的毒素检测法，其原理是利用藻毒素能阻碍h b r i of i s h e r i 或 p h o s p h o r e u m 这些发光菌的发光性这一特性1 4 3 , 4 4 1 。l a h t i l 4 4 1 对比了m a 和“盐虾”检测法， 发现后者能很灵敏地检测出m c y s t 的l d 5 0 为3 p g 卜1 7 l a g l 。而l a w t o n 4 5 1 用m a 检 测m c y s t - l r 和含有五种m c y s t s 的蓝藻样品的l d 5 0 在o 0 2 1 a g ，m i ，_ o 4 6 p g m l 。 1 3 1 3 蛋白磷酸酶( p p l ，p p 2 a ) 抑制法 因为藻毒素能抑制蛋白磷酸酶( p p l 陀a ) ，利用这一特性可以建立一种这类毒素的 灵敏的检测方法。最初，由于m c y s t s 含量较低，放射性底物和天然酶标记的检测灵敏 度不能满足检测m c y s t s 。后来e y c l e e t 4 6 l j x 组利用大肠杆菌表达重组p p l 和选择p n p 作为显色底物改进了检测方法。c 砌i c l l a e i 【4 7 1 利用重组p p l 和p n p 底物在微孔 ( m i e r o w e l l s ) 中测定m c y s t s 抑制酶的动力学反应。c o d d l 4 s 】进一步研究了p p l 抑制法 的条件，发现甲醇提取液中甲醇浓度在1 0 * , - - - 8 0 之间对检测无影响，因此用7 0 的甲 醇提取液可直接测定，最低检测限为1 0 n g m l - - 2 0 n g m l ，m c y s t - l r 的l c 5 0 为3 0 r i g m e 。 用h p l c 和该方法验证2 3 种实验室培养藻和2 5 种天然蓝藻“水华”，发现这两种方法 有很好的相关性。 1 3 2 色谱分析法 由于藻毒素在紫外光谱的吸收很弱1 4 9 , 5 0 1 ，因此，建立化学分析法时，样品的前处理 很重要，通常要经过提取、离心、过滤、柱纯化( o d s ，c 1 8 反相柱) 等步骤【5 1 , 5 2 , 5 3 1 ， 提取溶剂一般为甲醇。 1 3 2 1 薄层色谱法( t l c ) 这是最简单的定性方法之一1 5 4 ，一般用k i e s e l g e l6 0f 2 5 4 ( o 2 r a m ) 薄层板，展开 溶剂系列有c h c l 3 ：m e o h ：h 2 0 ( 2 6 ：1 5 ：3 或者1 3 ：7 ：2 ) ，r f 值为o 3 3 。e t o a c ：i s o - p r o h ：h 2 0 ( 8 ：4 ：3 或4 ：3 ：7 ) ，r f 值为o 3 3 。显色荆为1 0 的磷钼酸乙醇溶液，热处理后在紫外波 长2 5 4 n m 下观察显色斑点，碘也可作为显色剂，灵敏度达i ig 级。 1 3 2 2 液相色谱( l c ) 一般用恒溶剂作为流动相，分离柱为o d s 反相柱，可以分离包括m c y s t l r 、r r 、 y r 和其他藻毒素，而利用梯度洗脱可以分离“水华”中更多的m c y s t s 。使用甘氨酸 - l 苯丙氨酸一l 苯丙氨酸( g f f ) 作为分配相键合在硅胶的孔径表面而制成的内表面活 化反相柱( 1 s i 冲) ，可以更有效地用于m c y s t s 分析。液相色谱通常用二极管阵列紫外 检测器，一般需柱前或柱后衍生化。该检测器检测水和藻细胞中m c y s t s 灵敏度分别为 o 0 5 p g l - - 2 0 0 0 9 l 和0 5 p r 1 0 0 p g ，而s h i m i z u l 5 5 铡用荧光检测，m 甜l u o t l 删利用 电位测定( 1 2 0 v a g a g c l ) ，以及电化学氢化反应来检测经h p l c 分离后的m c y s t s 。 s 第一苹绪论 除此之外，质谱和h p l c 的联用也已用于蓝藻“水华”中m c y s t s 的鉴定和定量 分析。e r h a r d i s t 利用基体辅助激光解吸电离飞行时问质谱( m a l d i t o f ) 鉴定了藻细 胞中的m c y s t s ，检测限为微克级。h a r a d a i s g 利用热喷雾液一质联用( l c m s ) 和气质 联( g c m s ) 用来筛选及检测不同的m c y s t s ，m c y s t - l r 检测线性范围分别为1 4 p m o l - - 8 3 0 p m o l 和2 5 p m o l - - 1 0 0 p m o l 。 1 3 3 免疫化学方法 免疫化学方法是基于抗体和毒素之间特异性反应的原理【5 9 1 。建立一个成功的免疫检 测的关键是抗体和标记物这两种试剂。许多实验室都已研究出高灵敏和特异性好的免疫 化学方法来检测水体、藻类中的毒素，竞争免疫是其中运用最多的方法之一，检测