（食品科学专业论文）细菌发酵法生产透明质酸的研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文 细菌发酵法生产透明质酸的研究 摘要 透明质酸是由m y e r 和p a l m e r 于1 9 3 4 年从牛眼的玻璃体中最先分离出此物 质并加以命名的。它是生物体内普遍存在的酸性粘多糖类物质，化学本质为( 1 1 3 - 4 ) d 葡糖醛酸和( 1 b 3 ) n 一乙酰基- d 氨基葡糖组成的双糖单位重复连接构成 的大分子糖胺聚糖。透明质酸主要分布于动物的结缔组织中，但不同来源的透明 质酸化学结构完全相同，仅存在相对分子量的差异，而没有种属特异性。 由于特殊的生理作用，独特的流变学特性和极强的持水保湿能力，透明质酸 在化妆品工业，医学研究，临床治疗等领域有着广泛的应用。 目前，透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法。细茵 发酵法生产透明质酸具有产量不受原料资源限制，成本低，产量高，有较高的相 对分子量，分离纯化工艺简便，易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展 方向，应当进一步深入研究。 本文作为吉林省科技厅“深层发酵法生产透明质酸”课题的部分内容，对细 茵发酵法生产透明质酸进行了有益的探索，主要完成了以下工作，并得到了相关 结论。 1 、确定了有效的菌种筛选方法，从1 4 0 份牛鼻粘膜中成功地筛选到了三株 产透明质酸的茵株，为生产透明质酸奠定了基础。在初筛过程中，该菌株经血琼 脂平板培养后的形态观察及荚膜染色镜检，证明为带有荚膜的乙型溶血娃链球 菌。在复筛过程中，利用红外吸收光谱法以目的代谢产物即透明质酸为目标，以 s i g m a 公司生产的透明质酸为标样进行筛选。s i g m a 公司h a 标准样品的红外谱 图与发酵液精提物的红外谱图各自吸收峰的位置和形状基本相同，峰的相对强度 相近。上述结果提示筛选菌株的产物呈较典型的h a 红外吸收图谱。 2 、确定了茵种诱变方法。紫外线诱变和亚硝基胍诱变，即物理诱变和化学 试剂诱变相结合的复合处理，使血琼脂平板上的茵落形态明显变大，呈较大透明 黏液状，并得到一株不具有溶血性的突变菌。 用紫外分光光谱法对发酵液精提物和标样透明质酸的水溶液进行分析，发酵 液精提物的紫外光谱在1 9 6 r i m 处有特征吸收，与s i g m a 标样的相同。并且随着 h a 含量的增加吸光度值也变大，表明利用其最大波长处紫外光谱分析可以作为 衡量发酵液中h a 含量多少的依据。但发酵液中提取物在2 5 7 n m 和2 8 0 n m 处存 在紫外吸收，这表明发酵液中提取物较s i g m a 标样存在核酸和蛋白质等杂质。 将诱变处理前后的菌株发酵液精提物分别在波长1 9 6 r i m 处进行紫外分光测 吉林农业大学硕士学位论文 细菌发酵法生产透明质酸的研究 量，其吸收分别为1 8 1 3 和2 0 7 1 。表明诱变后透明质酸的产量提高幅度不大。 3 、确定了茵株种子培养基的最佳组成。基于茵体生长和透明质酸合成相偶 联，选择透明质酸的产量为试验指标，进行了碳源，氮源，碳氮比，有机氮和无 机氮协同作用对应指标的单因素试验。试验结果表明在其它控制条件不变的情况 下，以2 葡萄糖作为碳源，蛋白胨和酵母膏作为氮源，碳氮比为1 ：1 ，有机氮与 无机氮的比为5 ：1 时，试验指标最高。 4 、确定了摇瓶发酵培养基的最佳组成。同样选择透明质酸产量作为试验指 标，以葡萄糖，蛋白胨和酵母膏，n a n o ，为试验因素设计正交试验k ( 3 勺，通过对 获得数据进行分析和综合实际，摇瓶发酵培养基最佳组成确定为葡萄糖1 ，蛋 白胨1 ，酵母膏1 ，n a n 0 3o 5 。通过对种子培养基和发酵培养基优化得到 以蛋白胨和酵母膏复合氮源为主要成分的培养基，它们可以代替血清培养基，茵 体的生长良好。 5 、确定了菌株的最佳培养条件。绘制出种子培养基中茵体的生长曲线，取 1 4 1 6 h 为接种的最佳种龄，发酵培养基中的最佳装液量确定为2 0 r a l 2 5 0 m l 。培养 基和培养条件优化后，菌抹发酵液精提物的紫外吸收由2 0 7 1 提高至2 5 6 2 ，表明 透明质酸的产量有所提高。 6 、确定了透明质酸的分离提纯工艺。通过乙醇沉淀和c p c 络合等手段提取 出化妆品级透明质酸，其白色精提物h a 中葡萄糖醛酸的含量为3 6 2 ，比旋光 度为陶2 0 d = _ 一6 8 。但透明质酸产量较低，每1 0 0 0 r r d 新鲜发酵液中得到浅黄色初 提物h a2 7 7 9 , 白色精提物h a0 9 4 9 。 关键词：透明质酸筛选诱变发酵 吉林农业大学硕士学位论文 细菌发酵法生产透明质酸的研究 a b s t r a c t h y a l u r o r f i ca c i dw a s f i r s td i s c o v e r e dt h r o u g ht h ev i t r e o u sb o d yo ft h ec a t t l ee y e s i n1 9 3 4 b ym y e r a n d p a l m e r h y a l u r o n i c a c i di s c o m p r i s e d o f l i n e a r , u n b r a n c h i n g ，p o l y a n i o n i cd i s a c c h a r i d eu n i t sc o n s i s t i n go fd g l u c u r o n i ca c i da n d n - a c e t y lg l u e o s a m i n ej o i n e da l t e m a t e l yb yb e t a 1 - 3a n d1 - 4 g l y c o s i d i c b o n d s h y a l u r o n i ca c i dj sm a i n l yi s o l a t e df r o mt h ej d t e r c e 】l u l a rm a t f i xo fa n i n a 】c o n n e c t i v e t i s s u e s t h ec h e m i c a l c o m p o s i t i o n o fh y a l t t r o n i ca c i df r o md i f f e r e n ts o u r c e si s c o m p l e t e l y s 8 1 n e o p p o s i t i n g t ot h em o l e c u l a r w e i g ha n ds p e c i f i c c h a r a c t e r i s t i c s b e t w e e n g e n u s e s a t en o te x i s t e d b e c a u s eo fi t ss p e c i a lp h y s i o l o g i c a la c t i o n ，e x t r a o r d i n a r yt h e o l o g yc h a r a c t e ra n d m o i s t e r - h o l d i n gf u n c t i o n ，h y a l u r o n i ca c i di se x t e n s i v e l ya p p l i e dt o a r e a si n c l u d i n g m e d i c a lr e s e a r c h ，c l i n i c a lt h e r a p ya n dc o s m e t i ci n d u s t r y t o d a y , t r a d i t i o n a lh y a l u r o n i c a c i d p r o d u c i n gm e t h o db ye x t r a t i o n o fa n i m a l t i s s u e sh a s b e g a n t ot u r n t om i c r o b i a lr o u t e b e c a u s eo fs u f f i c i e n ts o u i e s 1 0 w c o s t ，h i g ho u t p u t ，r e l a t i v e l yh i g hm o l e c u l a rw e i g l la n de a s yp u r i f i c a t i o n ，h y a l u r o n i c a c i d b yb a c t e r i a lf e r m e n t a t i o ns h o u l d b e p a i dm o r e a t t e n f i o na n ds t u d i e d f u r t h e r l y t h i sp a p e ra sp a r tt a s ko fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g yd e p a r t m e n to fj i l i np r o v i n c e d i ds o m eu s e f u ls t u d i e so n h y a l u r o n i c a c i d p r o d u c t i o nb y b a c t e r i a l f e r m e n t a t i o n b e l o ww o r k sw e r e c h i e f l yc o m p l e t e l e da n dc o r r e l a t e dc o n c l u s i o n sw e r e o b t a i n e d 1 e f f i c i e n t s c r e e n i n g m e t h o df o rb a c t e r i aw a sd e t e r m i n e d t h r e es t r a i n so f h y a l u r o n i ca c i d p r o d u c i n gb a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o m1 4 0c a t t l et u n i c am u c o s a n a s i s u c c e s s f u l l y t h i s l a i daf o u n d a t i o nf o r h y a l u r o n i c a c i d p r o d u c t i o n b - h e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s w i t h c a p s u l e s w a sd i s c o v e r e d t h r o u g h o b s e r v a t i o no fb a c t e r i a l c o n f o r m a t i o no nb l o o d a g a r f l a t p l a t e a n de x a m i n a t i o nt o d y e i n gc a p s u l e w i t h m i c r o s c o p e i n f r a r e ds p e c t r o p h o t o m e t r yw a su s e di nr e s c r e e n i n g i td e m o n s t r a t e dt h a t h y a l u r o n i ea c i df r o ms i g m ac o r p o r a t i o na n d e x t r a c tf r o mf e r m e n t a t i o nb r o t hh a dt h e s a m ea b s o r p t i o ns p e c t r u m t h ea b o v e m e n t i o n e dr e s u l tp r o r a t e dt h a tt h ee x t r a c tf r o m f e r m e n t a t i o nb r o t ho fs c r e e n e db a c t e r i ah a dt h et y p i c a li n f r a r e da b s o r p t i o ns p e c t r u m o f h y a l u r o n i ca c i d - 吉林农业大学硕士学位论文 细菌发酵法生产透明质酸的研究 2 m u t a t i o nm e t h o df o rb a c t e r i aw a sd e t e r m i n e d t h ec o m p o u n dm u t a i o nw i t h u va n dn t gm a d et h ec o l o n yf o r m o b v i o u s l yl a r g e a n d p r e s e n t e dt r a n s p a r e n tm u c u s s h a p e a n dam u t a n tw i t h o u t h a e m o l y s i sw a s f o u n d u v s p e c t r o p h t o m e t r yw a sa p p f i e dt oa n a l y z i n gb o t he x t r a c tf r o mf e r m e n t a t i o n b r o t ha n dh y a l u r o n i ca c i df r o ms i g m ac o r p o r t a t i o n t h e yh a dt h es a l t l em a x i m u m a b s o r p t i o n a t1 9 6 n mw a v e l e n g t h n l em o r e h y a l u r o n i c a c i de x i s t e dt h em o r e a b s o r b e n c y i n c r e a s e d s ou v s p e c t r o p h t o m e t r y c a nb eu s e da sw a r r a n t yf o rm e a s u r i n g t h ec o n t e n to f h y a l u r o n i ca c i d b u te x t r a c tf r o m f e r m e n t a t i o nb r o t hh a dt h ea b s o r p t i o n a t2 5 7 n ma n d2 8 0 n mw a v e l e n g t h t i l i si n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r ei m p u r i t ys u c ha s n u c l e i ca c i da n d p r o t e i na n d s oo n t h ea b s o r b a n c eo fe x t r a c tf r o mf e r m e n t a t i o nb r o t ho fo r i g i n a lb a c t e r i aw a s 1 8 1 3 w h i l et h a to fm u t a n tw a s2 0 7 1 i ts h o w e dt h a tt h ey i e l do f h y a l u r o n i ca c i da f t e r m u t a t i o nd i dn o t i m p r o v e t o om u c h 3 o p t i m i z ds e e dm i d i u mw a sd e t e r m i n e d h y a i u r o n i ca c i df e r m e n t a t i o nw a sa k i n do fa s s o c i a t e df e r m e n t a t i o ni nw h i c hh y a l u r o n i ca c i do u t p u ta n dg r o w t ho f b a c t e r i aw e r eo ft h es a m e i m p o r t a n c e t t l es i n g l e f a c t o rt e s t so nc a r b o n s o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e ，r a t i oo f c a r b o ns o u r c ea n d n i t r o g e ns o u r c e ，s y n e r g yo fo r g a n i c a n di n o r g a n i c n i t r o g e ni n f l u e n c i n gh y a l u r o n i c a c i d o u t p u t w a sd o n e t h er e s u l t i n d i c a t e dt h a t h y a l u r o n i n a c i d o u t p u t w a sh i g h e s tw h e nc a r b o ns o u r c ew a s2 g l u c o s e ，n i t r o g e ns o u r c ew a sp e p t o n ea n dy e a s t , r a t i o o fc a r b o ns o n f c ea n dn i t r o g e n s o u r c ew a s1 ：1 , r a t i oo fo r g a n i ca n di n o r g a n i cn i t r o g e nw a s5 ：1a n do t h e rc o n d i t i o n s w e r ec o n t r o l l e d i n v a r i a b l y 4 o p t i m i z e df e r m e n t a t i o nm a d i u mi n c u l t u r ef l a s kw a sd e t e r m i n e d c h o s i n g h y a l u r o n i c a c i d o u t p u t a s i n d e x e s ，g l u c o s e , p e p t o n e a n d y e a s t ，n a n 0 3 a s f a c t o r s ，o r t h o g o n a ld e s i g nl 9 ( 3 4 ) w a sm a d e b ya n a l y z i n gt h ed a t aa n dc o n s i d e r i n gt h e p r a c t i c e s ，o p t i m i z d f e r m e n t a t i o nm e d i u mw a s c o m p o s e d o fl g l u c o s e ，l p e p t o n e ， 1 y e a s ta n d0 5 n a n 0 3 i tf o u n dt h a tt h em e d i u m c o n t a i n i n gp e p t o n e a n d y e a s ta s m a i ni n g r e d i e n tc o u l db es u b s t i t i o no fs e r u mm e d i u m 5 o p t i m i z e dc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d t h eg r o w t h c u r v eo fb a c t e r i ai n s e e dm e d i u mw a sm a d ea n d1 4 1 6 hw a ss e l e c t e da st h eb e s tt i m eo fi n o c u l a t i o n 2 0 m l f e r m e n t a t i o nm e d i u mi n2 5 0 m lf l a s ka l s oc a l lo b t a i nt h eh i g h e s th y a l u r o n i ca c i d o u t d u t a f t e ro p t i m i z a t i o no fm e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n s ，u va b s o r b a n c eo fe x t r a c t 吉林农业大学硕士学位论文细菌发酵法生产透明质酸的研究 f r o mf e r m e n t a t i o nb r o t h e si n c r e a s e df r o m2 0 7 1t o2 5 6 2 t h i si n d i c a r e dt h a tt h ey i e l d o fh v a l u r o n i ca c i dh a ds o m e w h a t i m p r o v e m e n t 6 s e p e r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c h n i c sw e r ed e t e r m i n e d b ym e a n s o fe t h a n o la n d c p c d e p o s i t i o n ，h y a l u r o n i ca c i df o rc o s m e t i cw a so b t a i n e d n l ec o n t e n to f9 1 u c u r o n i c a c i di nw h i t e p u r i f i e d e x t r a c tw a s 3 6 2 。o p t i c a lr o t a t i o nw a s 【o t d = 一6 8 。b u t t h e y i e l do fh y a l u r o n i ca c i di sn o th i 曲t h e b u f fc o a r s e h y a l u r o n i ca c i dw a s1 7 7 e e la n d t h ew h i t e p u r i f i e dh y a l u r o n i ca c i dw a s0 4 9 9 l k e y w o r d s ：h y a l u r o n i c a c i ds c r e e nm u t a t i o nf e r m e n t a t i o n v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：粕彰 签字日期：押年月6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可咀采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。f 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 靴敝储戳盼 铷雠：缃毛。oz j 签字同期：抑 年月6 日签字日期：抄；年6 月，6 同 学位论文作者毕业后去向：才负碍掘晒妃毛专是 工作单位：专橐扫柚存谚寸菩品? 弓； f 屯 电话：。弁l 一吣弓j 了。工 黼龇长秭删矧工皂毽皂 ：i 吾川8 吉林农业大学硕士学位论文 细菌发酵法生产透明质酸的研究 月j j吾 1 国内外研究现状 透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d ，以下称h a ) 是一种大分子酸性粘多糖，由葡 萄糖醛酸和n 一乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成的直链多糖，依组 织的来源不同，相对分子量变化为( 1 1 0 ) 1 0 6 。h a 广泛分布于动物和人体结 缔组织的细胞间质和某些细菌的荚膜中。1 9 34 年，m y e r 和p a l m e r 。从牛眼的玻 璃体中最先分离出此物质，并发现它的水溶液有很大的粘性。他们在酸性条件下 沉淀得到酸型产物，经测定含有糖醛酸( u r o n i ca c i d ) ，m a y e r 据此将该多糖命 名为h y a l u r o n i ca c i d 。根据全国科学技术名词审定委员会公布的生物化学名 词将其译为“透明质酸”。但是早期研究认为鼢仅是一种细胞空问填充物，是 一大分子粘弹性物质，没有明显的生物活性，未能引起人们的重视。在过去的十 年里，随着对h a 结构、性能、生物功能认识的深入，h a 已成为细胞生物、病理、 免疫学等领域的研究热点”】。 1 1 h a 的性质 1 1 1h a 的理化特性 h a 具有许多天然粘多糖共有的性质：呈白色，为无定形固体，无臭无味，有 强吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂“。但较其他粘多糖而言，h a 具有独特的性 质，兼具有高分子量和大分子体积的特性。 h a 是由相同的二糖单体，即( 1 一b 一4 ) d 一葡糖醛酸( 1 一p 一3 ) n 一乙酰基d 氨 基葡糖，重复排列而形成的无支链的直链多聚物，结构非常规则。结构图如下： 剥蜃。响妇 “f ”钒”“la ”；眠 透明质酸分子结构 吉林农业大学硕士学位论文 细菌发酵法生产透明质酸的研究 电子显微镜下观察证实h a 为一线性单链“1 在水溶液中扩展成随机的线圈状， 线圈的直径约5 0 0 纳米。由于直链轴上单糖之间氢键的作用，h a 分子在空间呈 刚性的螺旋柱型”1 ，柱内侧因有大量的羟基而产生强的亲水性，溶液中的h a 亲 和水分约为其本身重量的1 0 0 0 倍，这种粘液体能象橡胶物一样被提起，但实际 是溶液，能被稀释“1 。 除亲水性外，h a 溶液还有着独特的流体力学特性。h a 溶液具有独特的粘弹 性和应变性。这些性质主要取决于其本身分子量的大小和溶液浓度与酸度的高 低。剪切力对粘度值的影响也很大，溶液受高剪切力作用时，粘度可为i i 0 0 0 以下。g i b b s 等发现”1 ，低浓度h a 溶液主要表现为粘性，而高浓度溶液主要显示 为弹性。在粘性和弹性之间有一明确的临界浓度转变点，这个点与溶液的p h 值 有着很大的关系。 1 1 2h a 的生理功能 近几年对h a 生理功能的认识有了重大的突破，发现h a 在体内不仅是通过其 大分子网状结构、粘弹性等发挥渗透压调节、细胞连接、物理屏障和机械离缓冲 等功能，而且具有调节细胞功能、灭活自由基等生理活性，在胚胎形成、肿瘤扩 散、伤口愈合、抑制疼痛和炎症反应中具有重要的作用。单就h a 对细胞的作用 来说，它可以保护细胞，影响细胞移动、增殖和分化，改变细胞的吞噬功能，屏 蔽细胞膜上的机械感受器等。此外，h a 还有可以通过反馈作用调节h a 合成细胞 的合成能力。 1 2 h a 的应用 1 2 1h a 在化妆品和保健食品中的应用 1 2 1 1h a 与化妆品 由于h a 具有良好的保湿作用，又是皮肤和其他组织中广泛存在的天然生物分 子，从2 0 世纪8 0 年代开始用于化妆品中，被誉为理想天然保湿因子。 研究表明，人体表皮和真皮中含有高浓度的h a ，占人体h a 总量的一半以上”。， 皮肤中的含水量和h a 的含量直接相关，随着年龄的增长，皮肤老化，被认为是 皮肤中h a 含量下降和聚合度改变的结果“1 。当含有h a 的护肤品涂在皮肤表面时， h a 能形成一层粘弹性水化膜，该水化膜能润湿角质层，维持和加强角质层自身 的吸水能力和屏障功能，促进皮肤对护肤品中其他活性营养成分的吸收，防止皮 肤干燥，使皮肤柔软光滑，延缓和防止皮肤老化”i 。与其他保湿剂相比，周围环 2 吉林农业大学硕士学位论文细菌发酵涪生产透明质酸的研究 境的相对湿度对其保湿性的影响较小。h a 在低相对湿度的吸湿量最高，而在高 相对湿度下的吸湿量低。这种独特的性质正适应皮肤在不同季节，不同环境湿度 下对化妆品保湿作用的要求。 同时，分子量较小的h a 可渗入皮肤表皮层，促进皮肤营养的供给和废物的排 泄。”，起到美容和养颜作用。h a 通过促进表皮细胞的增殖和分化，以及清除氧 自由基的作用，可促进因阳光暴晒所引起的光灼伤和轻度的烧烫伤等受伤部位皮 肤的再生，事先使用也有一定预防作用。 在国际化妆品行业中，h a 是公认的最好的保湿剂和保湿因子。含一定量的透 明质酸或其盐的头发调理剂能使头发更加柔顺。它还起到延长彩妆和唇膏在皮肤 上的附着作用，并能遮盖化妆品中其他有效成分不尽人意的性质。“许多生产商 竟相开发含h a 系列的护肤品，如日本资生堂公司的“b h 一2 4 ”精华素，国内的永 芳、自然美等品牌。目前国际上h a 的化妆品种类已从最初的膏霜、化装水、膜 贴扩展到浴液、粉饼、口红、洗发护法剂等应用日趋广泛。 1 2 1 2 h a 与保健食品 2 0 世纪8 0 年代末，口服h a 美容保健食品出现于日本。其基本理论依据是： h a 通过口服经消化吸收，增加体内h a 合成的前体，使皮肤和其他组织中的i - i a 合成量增加，从而使皮肤的饱水性能增加，富有弹性，皱纹减少。“。 h a 化妆品仅作用于涂抹部位的皮肤表层，而口服h a 美容保健品是全身性作 用，可由人体吸收，由真皮至表皮增加内源性h a 的含量，使细胞括化，发挥全 身作用，与化妆品局部使用具有明显的不同。真皮基质主要由胶原蛋白和h a 等 粘多糖组成，皮肤老化由于胶原蛋白产生变化所致，而胶原蛋白的改变是由于 h a 的减少所致。因此，维持胶原蛋白的功能就必须补充h a 。 除皮肤外，h a 在关节腔、血管、心脏、眼、脑等组织和器官中也同样具有润 滑保水等重要的生理作用，因为这些组织中h a 的含量减少可导致关节炎、动脉 硬化、脉搏不齐、眼老化、脑萎缩。口服h a 可补充体内h a 的不足，预防组织和 细胞老化，特别是维持老年人的健康具有特殊的功能。在日本和我国台湾均有 h a 美容保健食品上市。现在口服h a 美容保健食品受到越来越多的人的重视和接 受。 1 2 2 透明质酸在临床医学中的应用 1 2 2 1 h a 在关节疾病中的应用 f , a 及其盐是构成关节软骨和滑液的主要成分，对关节生理功能的活动起着至 关重要的作用。h a 与蛋白形成的复合物覆盖在软骨表面形成薄的不定型结构层。 吉林农业大学硕士学位论文扫茸发酵击生产透明质酡的研究 该结构具有很强的变形性和荦陛，可起到滑动层和吸收应力的作用，当关节受力 产生滑动时，该结构可先于软骨表层被破坏，有缓冲作用，从而发挥保护软骨、 维持软骨基质完整等功能。当发生骨性关节炎 o a ) 、类风湿性关节炎( r a ) 以及其 他感染性和非感染性关节疾病时，h a 在关节内的产生和代谢发生异常，滑液中 的h a 的浓度和相对分子质量明显降低，软骨发生降解和破坏，导致关节生理功 能障碍。粘弹性补充疗法因此应运而生，在通过补充外源性h a ，恢复滑液的润 滑功能，促进软骨的修复，改善关节功能。迄今为止，大量的临床使用结果表明， h a 对o a 、r a 等关节疾病治疗效果明确、安全，具有很好的应用前景“”。 1 2 2 2h a 在眼科中的应用 【a 是现代眼科手术的最理想的原料，如用于眼球晶体移植手术，能使盲人复 明，因为具有较强的粘度，是眼科“粘性手术”中最理想和至今唯一可有效使用 的材料。1 3 的h a 溶液具有高度的粘牵陛，术中将其注入到前房后，可有效地 支撑前房，同时涂布于眼内组织表面及手术器械表层形成保护膜，可避免器械损 伤。“。h a 对眼组织保护作用的机理时多方面的，而不仅局限在机械缓冲垫的作 用，它还广泛地应用于眼用制剂中。h a 本身为人体天然存在的成分，具有很好 的生物相容性和安垒陛。 1 2 2 3h a 在给药体系中的应用 h a 作为具有重要生理活性的物质，在胚胎生成、免疫细胞的调控及肿瘤转 移方面具有不可缺少的作用。迄今为止，人类没有发现h a 合成缺陷者，人们认 为具有h a 合成缺陷的生命根本不能生存。随着人们对h a 生物活性的认识，些 新的应用开始尝试，如利用其对伤口愈合的促进作用和对炎症的抑制作用，开发 了防粘连和促伤口愈合制剂的应用；改构的h a 应保留其良好的生物相容性，对 人体无毒、无刺激，其分子中携带大量羧基、羟基及氨基可与药物通过酯化、氢 键等结合，作为药物的载体可达到缓释、控释等作用。生成的h a 衍生物应用于 软组织填充和眼用制剂。此外，利用体内某些相关细胞h a 受体的特异性表达， 药物与腿结合后，利用h a 受体发挥靶向作用，可使药物定位释放。由此，开发 了h a 的给药体系。 另外， 【a 在组织的再生、重塑和愈合“过程中具有促进作用。还可作为疾 病的诊断指标。“，已经证实，h a 是反映肝内皮细胞功能和肝硬化的有实用价值 的新指标。 1 2 2 4h a 预防术后粘连和对软组织的修复作用 h a 及其盐和交连的h a 衍生物 b y l a n ) 在预防粘连和软组织方面有明显的作 4 吉林农业大学硕士学位论文细菌发酵法生产透明质酸的研究 用，其基本原理是基于h a 和h y l a n 分子良好的生物相容性、物理特性和独特的生 物作用。预防粘连的目的是在保证正常伤口愈合和避免感染的前提下，消除或减 少粘连的发生和严重程度。而h a 和h y l a n 对生物系统产生多种影响，包括抑制 细胞迁移，限制血纤蛋白原扩散和抑制超氧化物从p m n 中的释放是抑制粘连形成 的主要作用机理。同时，h a 对多种细胞的移动、分化具有重要的调节功能；能 改善损伤部位微循环，使局部的微血管得以血液冲灌，加速创面的闭合。h a 的 合成在生长促进物质的表达方面发挥举足轻重的作用。 1 3h a 的生产方法 1 3 ，1 动物组织提取法生产h a 在2 0 世纪3 0 年代和4 0 年代，m a y e r 等除在动物的眼玻璃体提取得到n 外， 又从脐带、皮肤、结缔组织、软骨、鸡胚、关节滑液及雄鸡冠等许多软结缔组织 提取得到。后证实h a 在动物组织中分布较为广泛，几乎所有的动物组织中都含 有h a ，只是含量不同。但考虑到原料h a 含量的高低，数量的多少和易于取得的 程度等成本因素，能够用于生产的主要原料为鸡冠“”、人脐带“”和动物眼球“”。 主要工艺过程包括提取、除杂、酶解、沉淀和分离，不同组织h a 的提取纯化过 程有一定差别。提取液中的杂质主要是蛋白质，可直接滴加三氯乙酸变性沉淀蛋 白质，但三氯乙酸会使h a 分子量下降，并带来废水处理问题。实际生产中多采 用一些专一性较低的蛋白酶大范围地分解消化蛋白质，其优点是只降解蛋白部 分，不分解和破坏h a 。硅藻土、活性白土和活性碳能吸附多肽及蛋白质，常用 于酶解液的除杂、脱色、助滤。 用生物原料提取的h a 常含较多的蛋白质而纯度不高。在提取过程中还会造 成分子量的下降。用这种方法h a 时，分子量、产率和纯度之间存在矛盾。尽管 提取法成本高、效率低，但它仍是当今最主要的生产方法“”。 1 3 2 细菌发酵法生产h a 1 9 3 7 年，f o r r e s te ta l ”。等首次发现链球菌可以制备h a ，随后很多人进 行了大量的研究”。研究结果证明某些种属链球菌在一定的环境条件下，能同化 吸收葡萄糖或其他碳源，以代谢物形式产生h a 。发酵法生产h a 的质量主要取决 于菌种、培养基和分离提纯工艺。 用链球菌制备h a 的过程一般如下：链球菌复苏培养后，用诱变剂诱变，挑 出不溶血、不含h a 酶的高产率菌株。进行稳定传代后增菌培养，所得的菌即可 吉林农业大学硕士学位论文细茁发酵法生产透明质酸的研究 作为生产菌株。放人发酵培养液后，在通风搅拌的情况下发酵4 0 小时，对粘稠 的发酵醪处理后得到分子量高、粘度大h a 。发酵过程中的条件控制非常重要， 如温度，酸度，培养基成分等。溶氧量、发酵方式和营养供给对h a 的产量影响 也很大。综合文献，可以发现酸度通常控制在6 5 - 7 5 ，但对于最佳的数值，还 有争议，这可能是实验用的菌株和发酵液的成分不同所致。搅拌速率常控制在 1 0 0 8 0 0 转分”“之间。发酵温度一般控制在3 7 度。 分离纯化链球菌h a 有许多种方法，大体上都是通过加杀菌剂或7 5 8 0 度加 热来杀灭发酵液中的菌体。h a 含量较高时，发酵液的粘度很高，直接过滤或离 心除菌体非常困难，需要先进行稀释。然后乙醇沉淀、氯仿处理、离子交换、超 滤等方法进行分离纯化，最后用有机溶剂沉淀、真空干燥或冷冻干燥制得h a 精 品。 微生物发酵法生产h a 的实现是h a 生产领域近年来取得的最重大的进展。 不仅可以实现大规模生产，降低生产成本，而且提高了h a 的产率及质量。 2 细菌发酵法生产h a 的理论意义与实际价值 由于细菌发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中，向胞外分泌以 h a 为主要分的荚膜而形成的。与组织提取法相比，具有成本低，生产规模不受 动物原料限制，发酵液h a 必游离态存在，易于分离纯化和形成规模化生产，无 动物来源的致病病毒污染的危险等优点。各种来源h a 无种属差异，不同动物组 织提取的及不同菌种发酵生产的h a ，在化学本质和分子结构上是一致的，只是 相对分子质量有差别。而动物组织提取制备h a 时需除去夹杂的蛋白质和其他粘 多糖、核酸等物质，精制过程十分复杂。同时，原料收集困难，限制了该方法的 市场竞争力”“ 利用细菌发酵法生产h a 的研究主要是集中在日本，英美等国也有少量报道， 大多见于专利。2 0 世纪9 0 年代以来，对由细菌发酵法生产h a 的报道增多。日 本近几年用发酵法生产了h a 制剂，并对该产品做了大量的药效、毒理、药代动 力学等非临床实验和临床实验。结果表明，发酵法生产的h a 无局部及全身毒副 作用，安全性高，疗效确切。发酵法生产的h a 由于生产成本低、相对分子量高、 疗效好，因此具有很好的应用前景。目前已有多种品牌的发酵法生产的h a 制剂 上市。 我国发酵法生产h a 的应用研究起步较晚，技术尚未成熟，近年来虽有发酵 6 吉林农业大学硕士学位论文细菌发酵法生产透明质酸的研究 法制备盼的报道，但h a 生产仍主要从鸡冠、脐带等组织中提取，产量满足不了 市场需求，大部分医用h a 需从国外进口，进口试剂非常昂贵，如2 5 m i 的骨外 科h a 试剂，价格高达15 5 0 元支”“。根据目前状况，我国应立足采取组织提取 法，努力开发细菌发酵法生产h a ，特别是医用级 i a ，具有重要意义。 3 课题研究的目的 本课题的主要目的是筛选出产透明质酸的菌种；利用物理诱变和化学试剂诱变 除去菌种的溶血性，提高质量；通过对培养基组成和培养条件的优化，降低菌种 较为苛刻的营养要求，提高产品产量；确定透明质酸分离提纯的关键工艺过程以 提高透明质酸的纯度。 吉林农业大学硕士学位论文细菌发酵法生产透明质酸的矸究 正文 1 材料 1 1 菌种 1 1 1 样品来源 采集长春皓月肉牛公司，海南省三亚市防疫站牛鼻黏膜1 4 0 份。 1 1 2 诱变菌种 通过菌种筛选获得的产透明质酸的野生菌株。 1 1 3 培养基和培养条件优化采用的菌种 为经紫外线和亚硝基胍诱变处理后的实验室保藏菌。 1 1 4h a 提取液 发酵摇瓶中透明质酸新鲜发酵液。 1 2 培养基 1 2 1 斜面培养基 牛脑浸液8 0 0 m l ，牛心浸液2 0 0 m l ，牛肉膏0 3 ，蛋白胨1 ，n a c l0 5 ， 琼脂1 8 ，灭菌前p h7 0 ，1 2 1 9 c 灭菌2 0 m i n 。 1 2 2 初筛分离平板培养基 葡萄糖2 ，蛋白胨1 ，牛肉膏1 9 ，m g s o 。? 7 h ：oo 1 9 ，k h ：p o 。o 2 ，琼 脂1 6 ，灭菌前p h 7 0 ，1 2 1 。c 灭菌2 0 m i n ，冷却至温度低于5 0 ，无菌条 件下加入无菌脱纤维兔血。 1 2 3 复筛摇瓶培养基 葡萄糖4 ，蛋白胨1 ，牛肉膏1 ，m g s o 。? 7 h ：0o 1 ，k h ：p o ；0 2 ，灭 菌前p h7 0 ，1 2 1 。c 灭菌2 0 m i n ，冷却至温度低于5 0 屯，无菌条件下加入1 0 ( v v ) 小牛血清。 1 2 4 种子培养基 葡萄糖2 ，蛋白胨1 ，酵母膏1 ，n a n o ，o 4 ，m g s o 。? 7 h 。o0 1 ，k h ：p o 。 吉林农业大学硕士学位论文 细菌发酵法生产透明质酸的研究 0 2 ，灭菌前p h7 0 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。