（食品科学专业论文）重金属在鱼、蔬菜体内的分布及其存在形态的研究.pdf

重金属在鱼重金属在鱼蔬菜体内的分布及其存在形态的研究 摘 蔬菜体内的分布及其存在形态的研究 摘 要要 近年来食品受有毒重金属污染的现象已越来越多地引起人们的重视但 是目前的研究大多侧重于测定食品中重金属的总量而对其形态的研究相对 较少本论文研究在重金属胁迫下鱼及蔬菜对重金属吸收和累积的规律 同时采用排阻色谱与电感耦合等离子体质谱联用的方法研究鱼及蔬菜体内重 金属的存在形态研究结果揭示了重金属在鱼及蔬菜体内的吸收分布和累 积特征以及重金属的主要存在形态有助于进一步研究鱼及蔬菜在重金属 污染环境中的响应机理以控制食品重金属污染的程度 全文共分为三章1.重金属污染与食品安全2.重金属在鱼体内的分布 累积规律及其存在形态的研究3.芥菜对镉的吸收累积规律及形态的研究 第一章对食源性动植物受重金属污染的危害和现状进行综述特别就目 前广泛应用于食品中微量重金属检测中的原子光谱分析方法进行了论述此 外通过对中外文献的查阅综述了电感耦合等离子体质谱icp-ms在 食品等生物样品中微量元素检测中的应用以及 icp-ms 与高效液相色谱 hplc联用技术用于重金属在生物体内结合形态研究的进展 第二章以鲤鱼为实验动物研究暴露在复合重金属hgcdpb中的鲤 鱼对 hgcd 和 pb 的吸收积累及多金属结合金属硫蛋白mts的诱导特征 通过比较不同暴露时间条件下重金属在鱼组织中的分布和累积规律发现吸 收重金属在鱼组织中的累积规律为鳃肾肝肌肉随着暴露时间的延 长鱼各组织中的多金属结合 mts 的诱导量均随之增多同时组织中不同 重金属诱导生成的 mts 量也显著不同尽管鳃中累积的重金属规律为 hgcdpb但 cd-mts 的诱导量远高于 hg-mts由于鳃易于累积重金属并诱 导产生大量的 mts因此鱼鳃可作为水体微量重金属污染的重要检测器官 第三章以不同形态及不同浓度镉作为胁迫液 研究培养液中的镉在芥菜植 株不同组织的分布累积规律及在其体内的结合形态结果表明镉在芥菜 植株的累积顺序为根叶茎芥菜对不同镉形态的吸收能力不同表现为 柠檬酸镉氯化镉硝酸镉edta-镉随着胁迫浓度的增大芥菜各组织累 积的 cd 量也显著增大 镉在芥菜组织中的结合形态主要以植物螯合肽 pcs 类金属硫蛋白mt-like及大分子量的蛋白结合形态hmm且随着胁迫液 镉浓度的增大hmm 含量显著增大 关键词关键词重金属鲤鱼芥菜色谱-质谱联用技术 an investigation into the distribution and chemical species of heavy metals in fish and vegetables abstract more and more attention has been paid to the heavy metal pollution of food in recent years. however, the researches have been mostly restricted in the determination of the total quantities of heavy metals in food samples. there has been little research about the important chemical species of the heavy metals in food samples. therefore, in the present study, the absorption and accumulation of heavy metals in fish and vegetables exposed to heavy metals respectively are measured by inductively coupled plasma mass spectrometry (icp-ms).in addition, the multimetal-binding fractions in the samples are investigated with the hyphenated technique of size-exclusion chromatography (sec) and icp-ms. the results may be useful for the further studies about reacting mechanisms of heavy metals of the aquatic products and plants in contaminative environment. the full thesis consists of three chapters: 1. review of heavy metal contamination and food safety; 2. investigation into metal distribution, accumulation and metal-binding metallothioneins in carp exposed in waterborne heavy metals; 3. investigation of cadmium distribution and cd-binding fractions in mustard cultured in cadmium solution. in the first chapter, the danger and the present situation of heavy metal contamination in foods were reviewed. the discussion mainly focused on the analytical methods of atomic spectrometry generally used in the present for trace heavy metals in foods, and the hyphenated techniques of high performance liquid chromatogram (hplc) and inductively coupled plasma mass spectrometry (icp-ms) used for the speciation analysis of heavy metals. in the second chapter, the bioaccumulation of metals and induction of metallothioneins in carp co-exposed to cadmium, mercury and lead were investigated. the results indicated that the accumulation order of three heavy metals was as follows: gillskidneys liversmuscle; the amount of mts induced in fish tissues increased with the longer exposure time. gill would significantly assimilate heavy metals and the assimilated metals in the gill caused higher mts concentrations in this organ, therefore, mts in gill could be used as a marker to reflect the toxic metal pollution in the third chapter, the absorption and accumulation of cadmium in mustard stressed with different species and different concentrations of cadmium were investigated. meanwhile, the cadmium-binding fractions in mustard were analyzed with the hyphenated technique mentioned above. the results indicated that the accumulation order of cd was ranged as rootsleavesstems. the main (cdzn)-binding fractions included high molecular mass (hmm), mt-like and phytochelatins (pcs). comparing with the content of pcs and mt-like, the amount of hmm induced in roots of mustard increased significantly with the higher stressed cd concentrations. key words: heavy metal, carp, mustard, hyphenated technique 学术诚信声明学术诚信声明 兹呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取 得的研究成果除文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果本人依法享有和承担由此 论文产生的权利和责任 声明人签名 时 间 保护知识产权声明保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留使用学位论文的规定即学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘允许论文被查阅和借阅可以采用 影印缩印或扫描等复制手段保存汇编学位论文同意集美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表传播学位论文的全部或部分内容 作 者签名 导 师签名 时 间 重金属在鱼蔬菜体内的分布及其存在形态的研究 1 第一章 重金属污染与食品安全 1.1 食品安全 第一章 重金属污染与食品安全 1.1 食品安全 食品安全与食品卫生为同义词1984 年世界卫生组织在食品安全在卫生 和发展中的作用的文件中将食品安全与食品卫生作为同义词定义为生 产加工储存分配和制作食品过程中确保食品安全可靠有益于健康并且适合人消费 的种种必要条件和措施 1996 年世界卫生组织在其加强国家级食品安全计划指南 中则把食品安全与食品卫生作为两个概念加以区别其中食品卫生所指的范 围似乎比食品安全稍窄一些食品卫生指为了确保食品安全性和适用性在食物 链的所有阶段必须采取的一切条件和措施而食品安全被定义为对食品按其原定 用途进行制作和/或食用时不会使消费者健康受到损害的一种担保按中华人民共和 国食品卫生法规定食品应当无毒无害和防止食品污染和有害因素对人体健康 的危害保障人民身体健康增强人民体质就是食品安全的根本内容和定义 民以食为天饮食是人类社会生存发展的第一要素病从口入指的就是饮食 不卫生不安全是百病之源重金属对食品的污染越来越严重这些有害重金属包括 汞镉铅铬铜锡等其中毒性很强有汞镉铅铬等它们通过食物链最终进 入人体并造成危害随着我国工农业生产的发展工业三废的排放环境中的重金属 含量越来越多重金属对食品原料的污染已引起社会越来越多的关注1重金属对食品污 染的特点主要表现在以下几个方面1隐蔽性强同化肥农药等食品污染源比较重 金属污染明显不易为人察觉2毒性大某些重金属元素可能与生物体内有机物结合生 成毒性更大的化合物3放大性生物从环境中摄取重金属可以经食物链的生物放大作 用在较高级生物体内成千上万倍地富集然后通过食物进入人体的某些器官中积蓄起来 造成慢性中毒4微量性一般重金属在浓度较低的情况下即具有毒性作用法国 christelle 等2于 2006 年的一份报道中指出 由于吸入被污染的粉尘和摄食生长于被污 染土壤中的农产品有超过 10% 生活在污染区儿童体内血液中铅含量高于 100 礸 /l 在污染区中心甚至有超过 25% 儿童血铅达到该水平 1.2 重金属对人体的危害 1.2 重金属对人体的危害 有些重金属虽然是人体所必需的微量元素如铜和锌等但是当它们的浓度或体内积 蓄量达到一定阀值时就会对人体产生毒性甚至严重危害健康重金属进入人体的途径 有口腔呼吸道和皮肤三种以饮食带入人体居多由于进入人体的重金属不仅以离子的 形式存在而是与体内有机成份结合成金属络合物或金属鳌合物从而对人体产生毒害 因此重金属对人体的毒害主要与其化学形态代谢速度及种类有关 集美大学硕士学位论文 2 铅是对人体危害极大的一种重金属它对神经系统骨骼造血机能消化系统男性 生殖系统等均有危害 特别是大脑神经系统处于发育敏感期的儿童 对铅有特殊的敏感性 研究表明儿童智力低下的发病率随铅污染程度的加大而升高儿童体内血铅每上升 0.1 礸/ m l儿童智力则下降 6-8分 3 为此美国普遍认为对儿童产生中毒的血铅含量下限由 0.25 g/ml下降到 0.10 g/ml 世界卫生组织 who 对饮用水中铅的控制线已达到 0.10 g/ml我国对食品铅最高残留限量也做出了规定如豆类为 0.8 mg/kg鲜乳为 0.05 mg/kg水产品为0.5 mg/kg4 汞的毒性极大它主要在动物体内蓄积工厂排放含汞的废水可导致水体被污染湖 泊沼泽等中的水生植物水产品易蓄积大量的汞通过食物链的传递导致在人体内蓄积 体内蓄积汞最多的部位为骨髓肾肝脑肺心等5汞可以与蛋白质形成疏松的蛋 白化合物从而对组织产生腐蚀作用我国对食品中汞的残留限量规定为蔬菜水果 鲜乳中汞的限量为 0.01 mg/kg水产品中汞的限量为0.3 mg/kg4 镉属中等毒性重金属和其它重金属一样它能抑制体内的各种巯基酶系统使组织 代谢发生障碍也能损伤局部组织细胞引起炎症和水肿镉被人体吸收进入血液后绝 大部分首先与血红蛋白结合而存在于红细胞中之后逐渐进入肝肾等组织并与组织中 的金属硫蛋白结合在各脏器中的分布以肾最高其次肝胰甲状腺等6可溶性镉化 合物对人体产生毒害的剂量约为 15-30 mg国家食品重金属残留限量标准规定镉限量 如水果为 0.03 mg/kg蔬菜蛋为 0.05 mg/kg水产品为0.1 mg/kg4长期摄入微量镉 通过器官组织的积蓄还会引起骨痛病这种病曾在欧洲出现过而日本神通川流域由于镉 污染引起的骨痛病更是举世皆知的人体尿镉和血镉的浓度高反映体内镉负荷高镉中 毒的症状如全身性疼痛由于病理性骨折而引起骨骼变形身躯显著缩短同时也出 现头痛头晕流涎恶心呕吐呼吸受限睡眠不安等症状 1.3 蔬菜重金属污染的研究现状 1.3 蔬菜重金属污染的研究现状 重金属对农作物的污染是一个世界性的问题 印度的singh等7对新德里郊区的蔬菜受 重金属污染现状进行了调查结果表明新德里郊区菠菜中铜锌铅镉等含量分别为 18.3-29.769.6-154.91.7-7.02.0-7.1 礸/g超标率分别为 139578 和 100% 澳大利亚的anthony等8对new south wales地区 4 个蔬菜生产农场中 46 个采样点的蔬菜 中重金属含量进行了调查结果表明几乎所有采自boolaroo地区的蔬菜中的铅镉含量都 超过了澳大利亚食品标准中关于铅镉限量标准俄罗斯的kamnev等9利用原子吸收的方 法检测南瓜和甜菜中重金属含量结果表明采集的样品中铅最高含量为 36.22 礸/g铜 最高含量达到 96 礸/g 我国蔬菜受重金属污染的情况亦不容乐观目前受镉砷铬铅等有害重金属污染 的耕地面积近 2000 万公顷约占耕地总面积的 1/5全国每年因重金属污染而减产粮食 1000 多万吨被重金属污染的粮食每年也多达 1200 万吨合计经济损失至少 200 亿元 重金属在鱼蔬菜体内的分布及其存在形态的研究 3 10 在我国东南地区土壤中汞砷铜锌等元素超标面积占污染总面积的 45.5%11 据报道华南地区部分城市有 50% 的农地遭受镉砷汞等有毒重金属和石油类的污染 长江三角洲地区部分城市万亩连片农田受锡 铅 砷 铜 锌等多种重金属污染 致使 10% 的土壤基本丧失生产力12辽宁省城市郊区农田工矿区周围农田及污灌区农田污染比较 严重全省受污染面积约达 300 万亩主要污染物有镉汞铜砷铅铬锌等 据监测沈阳抚顺本溪部分菜田水田土壤中镉平均超标率达 37.46%鞍山郊区土 壤中汞铜的超标率分别达 40%10%沈阳市近郊受到污染的农田面积超过 10000 km2 菜田蔬菜的检测结果表明大白菜中铅和铜的超标率分别为 100% 和 58%黄瓜中的镉 汞铅超标率为 72.727.2 和 18.2%番茄的镉和铅超标率为 75% 和 12%菜豆的镉 汞铅超标率为 8060和70%13李立君等14对陕西省六大城市郊区的 17 种蔬菜的铅 铬镉元素污染程度进行了调查污染较重的蔬菜有:茄子芹菜西红柿葛笋菜花 黄瓜甘蓝和青椒赵锁劳等15对西安市郊区的 10 种蔬菜 80 个样品中重金属元素铜 锌汞砷铅铬和镉的含量进行了调查表明西安市郊区 10 种蔬菜品种均受到了不 同程度的重金属元素的污染10 种蔬菜的污染水平依次为:青椒韭菜芹菜筒篙茄子 油菜西红柿生菜土豆黄瓜7 种重金属元素在 10 种蔬菜中的平均残留量依次为:pb hgcrzncuascd李其林等16对重庆市蔬菜主要蔬菜种类和品种中重金属特 征进行了研究同国家食品卫生限量标准比较发现超标的蔬菜品种主要为叶菜类超标地 区主要在近郊区超标的重金属主要为cdpb李霞等17报道太原市 45 个蔬菜样品中的 农药重金属等项目超标超标率达 59.2%其中白菜菠菜等叶类蔬菜超标明显高于西 红柿茄子等果类蔬菜个别蔬菜的重金属汞含量高出正常值一倍多据广东省地质勘查 部门对珠江河口周边约 1 0000 km2 耕地的调查高锡异常区超过 6000 km2 受人为污 染导致土壤中有毒有害重金属元素异常之高锡汞砷铜铅镍铬等8种元素污 染面积达 5500 km2其中仅汞污染便达 1257 km2污染深度达 40 厘米经对蔬菜水 果大米抽样检测这些元素均不同程度超标18杭州市郊菜园土中zncupb元素含量 范围均己超过自然土壤的背景值总体污染状况为pbcuzn19赵玲等20对宁波市各类蔬 菜的污染状况进行了调查发现锌镉铬 3 种元素超标率都在 60% 以上其中铜最高 为 85%铬次之为 72.3%蔬菜的污染面积和产量均占总量的 70% 以上袁大伟等21对 上海市郊主要设施蔬菜园艺场土壤 灌溉水中污染物含量进行评价 发现在浦东北蔡潘姚 闵行七宝联明松江泗径和宝山现代化 4 个园艺场锌污染指数1特别是闵行七宝联 明园艺场锌污染严重 其平均含量 258.12 mg/kg 有一个采样点土壤中锌含量高达 517.15 mg/kg超标达 5 倍之多各园艺场土壤中重金属污染表现为zncrcuashgni cdpb 福建黄金煌等22报道 福州郊区的部分菜园土受到cd污染 土壤cd范围在0.123-0.351 mg/kg空心菜芥菜白包菜及日木大葱的cd含量(以鲜重为基数)全部超标茄子芋 头青包菜萝卜中有部分样品cd含量超标最严重的为标准的 15 倍 集美大学硕士学位论文 4 1.4 水产品受重金属污染研究现状 1.4 水产品受重金属污染研究现状 水生生物可通过吸收吸附和摄食等途径从周围环境中积累浓缩重金属水中的 重金属被鱼类所摄取并在组织中积累其排出又相对缓慢因而造成鱼类的重金属积累性 中毒23 重金属在各种鱼体以及鱼体的不同组织中的分布都是不均衡的一般来说重金属在 肌肉中的含量较低杨美兰贾晓平等24分析了北部湾东北部鱼区和东南部鱼区 24 种主 要经济鱼类体中cupbzncdcrni的含量结果表明鱼体各组织器官重金属含 量呈非均匀分布一般有如下顺序cu内脏鳞腮骨皮肌肉pb鳞骨腮 皮内脏肌肉zn鳞皮骨腮内脏肌肉cd内脏鳞腮骨皮肌 肉ni鳞骨腮皮内脏肌肉cr鳞骨腮皮内脏肌肉mg在头 尾躯干三个部分中的含量大致相同梁涛等25的研究指出金属cu在鱼腮中的含量高于鱼 肉中含量陆超华等26研究了南海北部海域经济鱼类的重金属cupbzncdcr和ni等 的含量与分布结果表明重金属在鱼体不同组织中的分布是不均衡的肌肉中的重金属 含量最低肉食性鱼类的cd含量较高但其余 5 种金属含量与鱼类食性的关系不明显 近海鱼类的重金属含量与河口咸淡水鱼类的重金属含量之间无显著关系经济鱼类受重金 属污染的影响不明显其食用价值尚未受影响 孟晓红等27分别对铅镉镧铈单一重金属在鲤鱼体内的积累与分布进行了室内实 验结果表明重金属及稀土元素在鱼体各部位均有较强的富集作用其中肌肉部分富集 能力较弱内脏富集能力最强鱼体各部位对重金属及稀土元素的富集作用随时间的增加 而增加在一定的时间后趋于平衡鱼体中各部位对重金属及稀土元素的生物富集作用存 在较大差异张秀云等28研究了天津污水养鱼池中五种重金属元素(hgcdpbcrcu) 在鲤鱼鲢鱼体内的积累情况并以水库中同种鱼作为对照结果表明各种元素在鱼肉中 的积累倍数变化很大从 10 倍至 136 倍鱼肉中各种元素的浓度符合国家标准的卫生 要求刘长发等29从天津污水鱼塘中采集养殖的各种鱼测定其鳃肝肾肌肉等部位 中的铜铅蓄积量并与水相金属形态化学平衡计算结果进行了比较研究表明铜铅 蓄积量在鱼体中呈对数正态分布与不同鱼种无显著关系但在各部位之间明显不同由 于吸收排放的动力学差异养殖后期鱼体中铅铜蓄积比中期低反映了铅铜相对蓄积 速率的下降趋势不同鱼塘中鱼鳃的金属蓄积量与金属有效态含量呈正相关 1.5 食品中微量重金属的检测方法 1.5 食品中微量重金属的检测方法 目前国内外学者对食品中微量重金属的分析方法进行了广泛深入地研究常用的检 测方法有电化学法分子光谱法原子光谱法质谱法等下面介绍几种广泛应用于蔬 菜及水产品中微量重金属检测的原子光谱质谱分析方法 1.5.1 原子吸收光谱法 1.5.1 原子吸收光谱法 重金属在鱼蔬菜体内的分布及其存在形态的研究 5 原子吸收光谱法(atomic absorption spectrometryaas)火焰原子吸收光谱法 faas是一种成熟的分析技术具有操作简单分析速度快测定高浓度元素时干扰小 信号稳定等优点石墨炉原子吸收光谱法gf-aas是一种常用的痕量分析技术灵敏度 很高且具有取样量少化学预处理简单能直接分析固体及高粘度液体试样等优点金 彩杏30等利用gf-aas法测定贝类产品中的铅镉含量与aas法相比该方法具有更好的 准确度和精密度平均rsd为5.7%pb和4.7%cd平均回收率为 98.0%pb和98.6% cd乔英31等利用原子吸收法测定灵芝中铅镉砷汞的含量方法的加标回收率 在 98-110%之间精密度(rsd)小于 3.0%穆丽32等用原子吸收法测定马齿苋中八种矿物 元素 结果表明该方法的相对标准偏差为 0.34-3.78% n=5加标回收率为 95.5-101.9% 方法前处理简单干扰小但是这两种方法的缺点分别为faas不宜测定在火焰中不能完 全分解的耐高温元素(如bvta wmo) 碱土金属元素以及共振吸收线在远紫外区 的元素(如ps卤素)gf-aas 法基体干扰较严重此外aas法不能同时进行多元素分 析 1.5.2 原子荧光光谱法 1.5.2 原子荧光光谱法 氢化物发生-原子荧光光谱法hydride generation atomic fluorescence spectometryhg-afs在食品卫生检测中已定为国家标准测量方法之一在土壤中砷 汞铅的测定也已被定为行业标准分析方法之一原子荧光光谱法方法灵敏度高精度好 设备简单成本低国产化程度高但是目前原子荧光光谱法仅仅能够测定11种能够发生 氢化物的元素 葛家春33等用氢化物原子荧光法测定水产品中的砷 汞 结果显示在 0-12 礸/l 浓度范围内ashg标准曲线相关系数达0.999as检出限为 0.2 礸/l hg为 0.3 礸/las回收率在 100-162 % 之间 hg回收率在 124-152 % 之间郭彦军34等用氢化物 原子荧光法同时测定蔬菜中的砷和汞结果表明采用氢化物发生-原子荧光法同时测定蔬 菜中的砷和汞具有操作简便灵敏度高准确度高基体干扰少节省试剂等优点该 方法的回收率为:砷 87.25-113.15 % 汞 89.0-106.5 % 检出限为:砷 0.13 礸/l 汞 0.09 礸/l线性范围为:砷 0.5-150 礸/l 汞 0.2-50 礸/l相关系数达 0.9995原子荧光 光谱法测定样品中重金属含量的缺点是反应条件尤其是酸度要求严格控制且原子荧光能 测定重金属种类较少 1.5.3 原子发射发射光谱法 1.5.3 原子发射发射光谱法 原子发射光谱法(atomic emission spectrometryaes)是利用气态原子(离子)在受 到热或电的激发时发射出紫外及可见光的特征辐射进行检测的一种方法该方法灵敏度 高选择性好多道aes能同时分析多种元素尤其是电感耦合等离子体发射光谱法 icp-aes 法更加优越 其具有基体效应小或易于补偿 抗干扰能力强 线性范围宽 3-5 个数量级多元素同时分析等优点与faas法比较在周期表中可以测定的元素中大部 分元素的检出限相当而碱土金属贵金属稀散元素的检出限比 faas法要低同时 集美大学硕士学位论文 6 icp-aes法可以测定aas法不能测定的部分稀土元素目前该方法在测定食品中重金属含量 应用较多范柯等35用端视icp-aes 法同时测定酒中六种重金属(pbmncdcufe zn)结果表明该方法的回收率为91.4-103.8 %李光等36人电感耦合等离子体发射光谱 法测定奶粉中的 9 种元素cafeznnakmgcumnp结果表明该方法检出 限为 0.05-50 mg/kg相对标准偏差为 0.3-4.5 %加标回收率为 91.0-105.8 %谢华 林等37用微波消解电感耦合等离子体发射光谱法同时测定水产品中有害元素在选定的最 佳条件下测铅镉铬汞砷硒的检出限分别为 0.00080.00070.00180.0028 0.00120.0046 g/l回收率为 94.5-104.2 %rsd为 1.4-2.6 % 1.5.4 电感耦合等离子体质谱法 1.5.4 电感耦合等离子体质谱法 电感耦合等离子体质谱inductively coupled plasma-mass spectrometryicp-ms 是 20 世纪 80 年代发展起来的新的分析测试技术它以独特的接口技术将icp-ms的高温 电离特性与四极杆质谱计的灵敏快速扫描的优点相结合而形成的一种新型的元素及同位 素分析技术快速扫描四级杆分析器仅用大约 4 min就可以测定样品中的全部可以测定的 元素 其分析能力使其几乎可以取代所有的传统的元素检测技术对于测定各种样品中 微量痕量超痕量金属元素来说icp-ms是一种非常强有力的分析检测技术高灵敏度 和低背景信号相结合可以得到很低的检出限多数情况下为 ng/l这些优点使得icp-ms 在许多领域中得到广泛的应用更是许多设备先进的痕量金属分析实验室必不可缺的仪器 之一38-39 icp-ms与icp-aes相比检出限更低干扰更少线性范围更宽icp-ms与gaas相比 检出限低精密度好干扰少气动雾化进样分析速度快且能多元素同时测定对于批 量样品测定是 gaas 无法相比的 icp-ms在元素定量分析中还有一个优势即同位素稀释法id该方法的基础是同位 素丰度比的准确测量在待测样品中定量加入待测元素的同位素浓缩剂待样品中该元素 的同位素组分混合均匀后进行同位素比值的精确测量而样品处理中少量的损失不会对 最终测量结果产生影响被公认为微量痕量成分的准确测量技术之一 icp-ms法在食品样品中重金属测定方面利用较多杨振宇等40建立开放式微波消化 -icp-ms法快速测定食品中多种微量元素的方法对 4 类食品(奶粉鹅肝酱水果片 燕麦片)中的 12 种元素(alcrnigeasseagcdsnsbpbhg)进行了直 接测定绝大部分回收率在 85-110 % 之间线性相关系数均大于 0.999精密度(rsd) 值10% 刘丽萍等41利用电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)测定运动员食品中铅 砷 镉 铜的含量结果表明回收率在 85.5-115.5 %rsd5.0 %刘江晖42用icp-ms法测定海产 品中汞含量结果表明在 0.10-50.00 礸/ l 范围内呈线性关系( r=0.9997)回收率为 95-104 %相对标准偏差为 1.4-3.5 % 1.6 重金属存在形态及其联用分析技术 1.6 重金属存在形态及其联用分析技术 重金属在鱼蔬菜体内的分布及其存在形态的研究 7 传统的元素分析大多只有对元素的总量进行检测但现代科学表明元素的行为效应 并不仅取决于该元素的总量特定的元素只有在特定的浓度范围和一定的存在形态时才能 对生命系统和生物体发挥作用iupac定义元素的形态是该元素在不同种类化合物中的 表现或分布形态分析是样品中元素的一个或多个化学形态的定性和定量分析活动在生 物学领域中金属以何种方式作用于生物体系其决定因素是金属元素的化学形态而不是 总量仅仅测定元素的总量已不足以满足环境科学和生命科学领城的需要甚至有时导致 错误的结论例如在水生贝壳类动物中可发现较多的三甲铵乙内酯胂(即甜菜碱胂)化合 物但是这种化合物却是没毒的无机砷尤其是三价砷是毒性较强的物质(如砒霜)而 五价砷却基本上无毒(雄黄)三价砷比五价砷更容易与蛋白质的硫醇基团结合三价砷转 化成五价砷的甲基化过程有利于对人体器官的保护 又如 三价铬是人体必需的营养元素 而六价铬则被用作除藻剂可引起皮炎肺癌等疾病其化合物是有毒的因而不仅要对 元素总量测定更需要进行形态分析以了解其化合物在生物体中的赋存形态迁移转化 规律及毒理效应43 联用技术是现代分析科学的重要研究手段自 1980 年由hirschfeld44首次提出联用 技术以来各种联用手段迅速发展其中高效液相色谱毛细管电泳ce气相色谱做 为分离手段与原子吸收发射光谱质谱等金属检测仪器的联用是发展较为完善的技术 目前这些联用技术已广泛应用于食品和生命科学等样品中元素的形态分析 1.6.1 原子吸收光谱与不同色谱技术联用 1.6.1 原子吸收光谱与不同色谱技术联用 原子吸收光谱aas作为元素特效检测器与气相色谱仪gc联用它具备了gc 分 离能力强基体干扰少的特点也具备了aas灵敏度较高和选择好的特点弥补了gc检测 器对金属不灵敏和 aas 对同一元素的不同形态无法区别的缺陷gc-aas 联用已经应用于 环境和生物样品饲料精细化工食品药物中痕量有毒有机金属化合物的形态分离与 测定45逯海等46报道用气相-氢气发生-电热原子吸收联用装置分析溴化三甲基铅和四甲 基铅的混合物结果表明在h2流速 45-75 ml/min 范围内可以得到最大的me4pb和me3pb 信号测量结果重现性良好可以满足有机铅形态分析的需要walsh等47利用gc-aas研 究软体动物体内及贝类中重金属结合形态 表明不同部位重金属结合形态不一致 harms48 在利用gc-aas检测鱼组织中甲基汞的时候改进了gc与aas的接口技术提高了检测的灵敏 度获得了较好的重现性由于icp-ms技术越来越完善用于金属信号监测的aas越来越 多的为icp-ms代替使得gc-aas的应用受到了一定的限制 1.6.2 原子发射光谱与不同色谱技术联用 1.6.2 原子发射光谱与不同色谱技术联用 高效液相色谱与等离子体原子发射光谱hplc-icp-aes联用对于同一种元素不同 形态间性质差异如hg2+和饱和烷基汞se4+和饱和烷基硒这两类极性差别很大以及砷 化物锡化物这些不易挥发且热不稳定的化合物无法用gc-aas而可以采用hplc-icp-aes分 离测定目前hplc-icp-aes已成功应用于海洋生物中as的化学形态分析rubio49等利用 集美大学硕士学位论文 8 hamilton prpx-100分离含as(iii) as(v)二甲基次胂酸钠及甲基胂酸二钠的水样洗 脱液用低压汞灯辐照k2s2o8 氧化经nabh4 还原成ash3 后用icp-aes测定roussel50 等优化了hplc-icp-aes仪器的工作条件使得用于砷形态分析时获得了很好的检测限其 中as(iii)二甲基砷dma一甲基砷mma均为 10 g/las(v)为 20 g/l 1.6.3 电感耦合等离子质谱与色谱的联用技术 1.6.3 电感耦合等离子质谱与色谱的联用技术 目前用于金属形态分析研究的联用技术主要还有hplc-icp-ms 联用氢化物发生原 子荧光光谱 hplc-hg-afs 联用 毛细管电泳 ce -icp-ms 联用 超临界流体色谱 sfc 与icp-aes或icp-ms联用以及气相色谱-微波诱导等离子体原子发射光谱联用 gc-mip-aes等以上各种用于形态分析手段以hplc-icp-ms联用技术最为成熟占 70% 以上51-53 hplc-icp-ms联用技术结合了hplc和icp-ms的优点它融合了hplc高效分离的特点及 icp-ms具有的低检测限宽动态线性范围及能跟踪多元素同位素信号变化等优点通过对 元素形态信息的了解有助于研究其各形态在食品及生命科学样品中的作用机理54 raimund wahlen等55利用hplc- icp-ms快速准确测定鱼肉组织中的砷甜菜碱(asb) 采用等度洗脱一次可分离分析多达 6 种不同形态的砷仅需 10 分钟何小青等56将 hplc-icp-ms联用技术应用于四种不同形态砷混合液的形态分析成功地分离了as(iii) as(v)mmadma四种砷化合物陈登云等57应用hplc-icp-ms联用技术进行三种形态hg混 合液的形态分析研究证明了ppt甚至亚ppt量级hg的形态分析是快速和可行的adel等58 利用hplc-icp-ms联用技术研究铬在蔬菜中中结合形态证明蔬菜中cr主要为cr3+结合形 态无cr6+生成而且cr含量较低对人与动物无害 1.7 重金属在鱼及蔬菜中结合形态的研究 1.7 重金属在鱼及蔬菜中结合形态的研究 生物体内金属形态的种类很多由于生物体中往往富含巯基-sh受到重金属的刺 激后 往往产生一类含有巯基的蛋白与其结合 其中mts pcs就是研究较多的这类蛋白59 动物受重金属胁迫后体内产生金属硫蛋白metallothioneinmtsmts的分子量为 6-7 kd等电点(pi)一般在ph 4-4.5分子中富含巯基-sh其中半胱氨酸约占氨基酸 总量的 30 %但其分子中不含芳香氨基酸一般在mts分子中会形成两个结构域即- 结构域和-结构域如图1-1 所示这两个结构域使mts分子形成两个结构不同的金属- 蛋白质族在这两个族中巯基与金属结合的亲合力有所不同其中-结构域包含的一个 族包括从mts分子的第 1 到第 30 个氨基酸并结合有 4 个两价的金属离子通常结合 力顺序为cdzncu而含有分子中第 32 至 61 个氨基酸的-结构域结合有 3 个两 价金属离子其结合力顺序却是cuzncd-结构域常处于肽链的碳端而-结构域 处于氮端哺乳动物的mts一般有一条含有 61 或 62 个氨基酸组成的多肽链其中有 20 个排序严格的半胱氨酸60mts的这种结构使其具有许多重要的作用如对重金属的解毒 重金属在鱼蔬菜体内的分布及其存在形态的研究 9 作用对营养元素的调节作用和清除自由基的作用等 图1-1 mts分子的结构模型 mts具有独特的氨基酸排列顺序即多肽的n 端和c 端具有两个富含cys 的金属结合 结构域其中的半胱氨酸cys 按cxc 或cxxc 的方式排列x表示非cys的其他氨基酸 残基c表示cys在结合金属的mts分子中金属与半胱氨酸cys中巯基的结合是以 s-m-s键形成对角式或三角形或四面体的方式与肽键交联这些类似硫化物的金属键合位 点被带极性基团的肽键包裹着形成三维的空间结构61 目前mts的定量分析方法已有很多如电化学方法光谱法免疫分析法mtmrna的 聚合酶链式反应pcr测定法金属饱和法62-66但传统的测量方法存在各种各样的测 量问题如极谱法dpp可因共存的其他氧化还原体系而产生干扰酶联免疫法elisa 虽灵敏度高但需要具有强特异性的抗体金属饱和法虽适用于不同生物组织中mts的测 量但对于mts含量极低的样品测定前仍需要浓缩富集的预处理过程否则难以获得准 确的测量结果而且传统的mts测量方法都无法表征出mts分子中金属的键合信息除了免 疫分析及pcr分析技术外 其他的传统分析方法都无法定量mts及其各亚型 如mt-1和mt-2 的相对含量在mts的现代表征方法中由于采用具有高分辨率高选择性的分离纯化设 备如高效液相色谱hplc或毛细管电泳如ce等技术hplc 可分离极性的离子 化的不易挥发的相对分子质量大和对热不稳定的化合物其有多种分离模式如用阴离 子交换色谱法可分离mts的亚型如mt-1mt-2还可用反相色谱法进一步分离mts的次 亚型结构将分离设备与高灵敏度的检测系统联用如与电感耦合等离子体质谱icp-ms 及各种软电离质谱如电喷雾电离质谱esi-ms联用可直接对mts及其mt-1和mt-2等 各亚型和次亚型进行分离表征67-69 目前动物受重金属刺激后产生mts的研究非常广泛jackson等70利用sec-icp-ms研究 黑鲈体内微痕量金属结合形态结果表明在肝脏腮生殖腺等组织中cuzncd 都以与mts结合的形态存在而se主要存在形态为低分子量的蛋白质hyllandt等71研究 集美大学硕士学位论文 10 鳕鱼在不同zncd处理条件下鱼体不同部位中mts诱导情况结果表明腹腔注射cd1 mg/kg后体内几乎所有的cd均与肝肾产生的mts结合但是腹腔注射zn10 mg/kg 后鱼肝中zn-mts生成量明显增加但是肾中zn-mts生成量没有明显变化 到目前为止有关植物在外源重金属胁迫下内部作用机制的说法基本上是一致的即 当植物被重金属胁迫后植物体自身会合成配体如酚类化合物有机酸低聚肽多聚 肽或蛋白质这些配体能够络合过量的重金属并与之形成对植物有机体无害的化合物特 别是一类称为植物螯合肽phytochelatinspcs的低聚肽化合物72grill等73研究发 现 pcs是由glu cys gly 3 种氨基酸组成 一般化学式为-glu-cys n-gly n=2-11 最近的研究发现 某些植物与重金属接触 可产生一系列与pc结构相似又不相同的化合物 称为同源pcspcs与同源pcs有 3 个共同的特征1glu位于氨基酸的末端2glu相 邻的碱基为cys与glu以-羟基相连(3) -glu-cys被重复 2 次或更多次因此可 以根据以上 3 个共同特征来识别-glu-cys肽又根据羧基末端氨基酸的不同分为 5 类 74 图1-2 图1-2 各种-glu-cys肽的结构 自植物螯合肽pcs被发现后关于它在植物中的作用的研究报道很多主要有两 方面一是对植物体内重金属的解毒作用另一作用是调节和维持植物体内金属离子的平 衡75 用于鉴定pcs传统的方法是rp-hplc需要-sh的柱前或柱后衍生常用的衍生试剂为 5,5,-二硫代硝基苯甲酸方法繁琐且可能受到其他含硫化合物的干扰所以不能准确的 对色谱峰进行鉴定另外一些分析方法诸如hplc-uv/aas/icp-ms/放射性标记等方法也 被用于pcs和pcs-cd配合物的分析但是这些方法都不能直接给出pcs-cd配合物的结构 76-77 许多研究表明pcs的产生与重金属浓度及存在形态有关huerta等78研究表明对cd 而言10-100 mol/l为pcs合成最适浓度ahner等79对海生的矽藻类进行研究发现 -glu-cysn-gly 的产生主要决定于cd2+cu2+ni2+pb2+的自由离子的浓度而不 是金属的总浓度 1.8 选题依据和本工作主要内容 1.8 选题依据和本工作主要内容 蔬菜水产品中重金属含量的检测及其存在形态的分析研究与食品安全紧密相关但 重金属在鱼蔬菜体内的分布及其存在形态的研究 11 是目前大部分这方面的研究工作都侧重于食品中重金属总量的测定及重金属在蔬菜水产 动物体内不同部位的分布研究为研究重金属污染对食品安全的影响本论文主要开展了 以上2方面的工作 1.以鲤鱼为实验动物研究在3 种复合重金属hgcdpb水环境中研究鲤鱼组 织中重金属的分布和累积规律及重金属的存在形态考察不同的暴露时间条件下鱼体内 重金属的积累量和分布规律用色谱-质谱sec-icp-ms联用方法研究鱼体内诱导多 金属结合金属硫蛋白mts的情况研究组织中重金属含量与重金属结合mts量的关系 2.以不同浓度不同形态的cd胁迫液研究cd在芥菜体内不同部位根茎叶的 积累规律用sec-icp-ms联用方法研究芥菜体内cd的结合形态及其变化规律 集美大学硕士学位论文 12 第二章 重金属在鱼体内的分布第二章 重金属在鱼体内的分布累积规律及 其存在形态的研究 2.1 引言 累积规律及 其存在形态的研究 2.1 引言 近年来鱼贝虾类等水产品中有害重金属元素含量的检测已受到越来越多的重视 重金属在水产品中的吸收分布和累积规律也已进行了较多的研究 目前国内关于这方面的报道大多侧重于对重金属总量的测定80-85而对重金属在鱼体 中结合形态的研究相对较少重金属进入鱼体能诱导细胞产生金属硫蛋白 (metallothioneins mts)将具有活性或毒性的金属离子转化成相对稳定的形式86使 毒性得到暂时的或永久的解除正常的脊椎动物组织中都含有一定量的mts分子而且与 mts分子结合的金属主要是锌镉和铜但体外研究发现mts分子不仅能与这三种金属结 合还能与银金铋钴铁汞镍铅 和铂等金属结合并能够被这