（食品科学专业论文）羟脯氨酸的测定及其在酱油掺假鉴定中的应用.pdf

西南大学硕士学f 讧论文摘要 羟脯氨酸的测定及其在酱油掺假鉴定 中的应用 食品科学专业硕士研究生胡华 指导老师张惟广副教授 朱永红高级工程师 摘要 酱油是以富含蛋白质的豆类和富含淀粉的谷类及其副产品为主要原料，在微生物酶的催化 作用下分解熟成并经浸滤提取的调味汁液。配制酱油是指以酿造酱油为主体，与酸水解植物 蛋白调味液( a c i dh y d r o l y z c dv e g e t a b l ep r o t c i n 踮吲m i n 吕a h v p s ) 、食品添加剂等配制而成的液 体调味品。为了迎合消费者的需求，市场以非酿造酱油冒充酿造酱油，在酱油行业内较为普 遍。酱油掺假较为常见的是掺加a h v p s 、水解胶原蛋白，其中a h v p s 可加入到酱油中，其 标签必须是配制酱油，而水解胶原蛋广1 不能加入到酱油中。目前有芙酱油中掺加水解植物蛋 白液的检测方法有较多文献报道，而关于酱油中掺加水解胶原蛋白液的检测方法未见报道。 本文主要针对可能在酿造酱油或a h v p s 中掺入的水解胶原蛋白的现象，通过检测胶原蛋 白特有组分羟脯氨酸( h y d r o x y p r o l i n e ，羟脯氨酸) ( 羟腑氨酸在胶原蛋白中的含量约为l3 ) ，并探讨了酱油样品中检测羟脯氨酸的含量来区分其中是否添加了水解胶原蛋白的可能 性。 通过研究，本文建立了高效液相色谱法、液质联用法、比色法对酱油中羟脯氨酸的检测 方法，对纯酿造酱油、a 嗍、酸水解动物蛋白液中的羟脯氨酸进行了分析，提出了纯酿造 酱油中羟脯氨酸含量的正常值范围上限，并采用建立的方法对实际样品进行了分析，探讨了 对羟脯氨酸含量的分析在区分酿造酱油和非酿造酱油中的应用价值。主要研究结果如下： 1 建立了高效液相色谱法检测酱油中羟脯氨酸，样品经乙醇提取，以2 ，4 - 二硝基氟苯 为衍生试剂，采用g e m i n ic 1 8 ( 4 6 x 2 5 0m m ，5t t m ) 色谱柱分离，检测波长为3 6 0n m 。酱油 中的羟脯氨酸质量浓度与其峰面积在1 0 - 3 2 0m g l 范围内具有良好的线性关系，相关系数为 0 9 9 9 2 。回收率为9 7 1 9 1 1 0 1 8 ，该方法的检出限为2 5m g l 。 2 建立了高效液相色谱质谱质谱分析酱油样品中羟脯氨酸的方法，采用v e n u s i lm p - c 1 8 柱( 2 5 0m m 4 6i n mi d ，5 “m ) 色谱柱分离，在电喷雾( e s i ) 正离子模式下，以m z1 3 2 为母 离子，以m z8 6 和m z6 8 为子离子进行选择反应监测。在1 0 0u g l 1 6 0 0u g l 范围内，羟脯 氨酸质量浓度与其峰面积呈良好的线性关系，相关系数为0 9 9 3 3 。 3 建立了比色法检测酱油中的羟脯氨酸的方法。当样品中的羟脯氨酸的质量浓度在3 2 m g l 1 2 8m 叽范围时，羟脯氨酸的浓度与吸光度之间具有良好的线性关系，相关系数为 两南大学硕士学位论文摘要 0 9 9 8 8 。该方法前处理简单，所需实验设备简便，可以快速的检测酱油中的羟脯氨酸。此方法 是目前常用的方法之一，但是它在检测精度方面与色谱法相比还有很大的不足。 4 对方法的准确性、灵敏度比较，高效液相色谱法作为对本文样品的分析方法。对样品 中相对羟脯氨酸含量( 表示为每克氨态氮中所含羟脯氨酸的毫克数) 进行检测发现，纯酿造 酱油在o 5m g g , 1 9m g g 之间，酸水解植物蛋白液在9 5m g g 2 0 2m g g 之间，酸水解猪皮 和猪肌肉分别为8 5 5 6m g g 和3 7 o m g g ，三类样品间存在显著差异。结果提示，羟脯氨酸并 非胶原蛋白中所特有，但通过检测酱油样品中羟脯氨酸含量有可能区分酱油中是否添加酸水 解蛋白液。 5 本文采用高效液相色谱法对4 0 个纯酿造酱油中的羟脯氨酸进行定量分析，按正态分 布法计算其单侧9 9 正常值范围上限相对羟脯氨酸含量为2 1m g g 氨态氮。本论文以酱油样 品中羟脯氨酸超过2 1m g g 氨态氮为非酿造酱油。 6 采用木项目建立的高效液相色谱法对来自我围多个省市及日本、韩围、新加坡的5 0 个酱油样品进行了羟脯氨酸分析，其中4 9 个标识为酿造酱油，1 个为配制酱油，经检测发现 有1 2 个样品为非酿造酱油，其中有1 1 个标签标识为酿造酱油，1 个标识为配制酱油。 关键词：酿造酱油非酿造酱油羟脯氨酸胶原蛋白 d e t e r m i n a t i o no fh y d r o x y p r o l i n ei ns o y s a u c ea n di t sa p p l i c a t i o ni f fi d e n t i f i c a t i o do f s o ys a u c ea d u l t e r a t i o n c a n d i d a t e ：h uh u a a d v i s e r ：a p r o f z h a n gw e i g u a n g 一一一 s e n i o re n g i n e e rz h u y o n g - h o n g a b s t r a c t s o y 辎m sa 托m a i n l ym a d eo fb e a n s ，w h i c ha 舱r i c hi np r o t e i n , a n dt h eb y p r o d u c t so fg r a i n s c o n t a i n e ds t a r c h , d e c o m p o s i t e db ym i c r o b i a le n z y m e s ，a n de x t a c t e d b l e n d e ds o ys a u c e sa r e _ l i q u i d s e a s o n i n gm a i n l ym a d eo f b r e w e ds o y , a c i dh y d r o l y z e dv e g e t a b l ep r o t e i ns e a s o n i n g ( 啪v p s ) ，f o o d a d d i t i v ea c ta st h el i q u i ds e a s o n i n g i ns o ys a l v ei n d u s t r y , i t sc o m m o nt h a tn o n - f e r m e n t e ds o y s a u c e sw e r em a k e da sf e r m e n t e ds o y 戳m c e s ，f o rp u r p o s eo fs a t i s f y i n gc u s t o m e r s g e n e r a l l y , f e r m e n t e ds o ys a u c e sa l ea d u l t e r a t e dw i t hh y d r o l y z e dv e g e t a b l ep r o t e i na n db y d r o l y z e dc o l l a g e n p m t e i n a l t h o u g hh v p c a nb em i x e di n t os o ys a u c e sl e g a l l y , t h el a b e lm u s tb em a r k e da sb l e n d e d s o ys a u c e s h o w e v e r , h y d r o l y z e dc o l l a g e np r o t e i nw a sf o r b i d d e nt oa d di n t os o ys a u c e s s of a r , t h e r e a 糟l o t so fr e p o r t si nt e r m s o fm e a s u r i n ga h v p s ，b u tf e wr e f e r st oh y d r o l y z a dc o l l a g e np r o t e i n t m sp a p e rw o u l df o c u so nt h es e n s eo fm i x i n gh y d r o l y z e dc o l l a g e np r o t e i ni n t of e r m e n t e ds o y s a u c o so ra h v p s ，b yd e t c e t i n gt h eh y d r o x y p r o l i n e ( h y p ) h y pw b sas p e c i a lm a t e r i a lt h a ts h a r e e d 13 o f c o l l a g e np r o t e i n , a n di tw a sp o s s i b l et h a tw ec o u l di d e n t i f yw h e t h e rt h es a m p l e sa d u l t e r a t e d w i ma c i dh y d r o l y z e dp r o t e i nb yd e t e c t i n gh y pi ns o ys a u c e s b yr e s e a r c h , a na n a l 蛳c a lm e t h o do fh y pi ns o ys 卸c e sw a se s t a b l i s h e d , s u c ha sh i i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，h i g hp e r f o r m a n c el i q i u dc h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m c t c r y ( h p l c - m s m s ) , c o l o r m e f i cm e t h o d u s i n gt h ea b o v em e t h o d s ，t h i sp a p e re s t a b l i s h e d a n a l y t i c a lm e t h o do fh y pi np u r es o ys a u c e s ，a h v p s ，a c i dh y d r o l y z e da n i m a lp r o t e i ns e a s o n i n g , o f f e r e dt h en o r m a lc o u n to fh y pi np u r es o ys a u c e sb ye x p e r i m e n t s , d i s c u s s e dt h ev a l u eo fh y pw a s u s e f u lt od i f f e r e n t i a t ef e r m e n t e ds o ys a u c e sa n db l e n d e ds o y 鞠峭1 r i 把f o l l o w sw e r et h em a j o r f i n d i n g s ： 1 a na n a l y t i c a lm e t h o do fh y pi ns o ys a u c e sw s se s t a b l i s h e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , t h es a m p l e sw e r ee x h 甚c = t e d f r o me t h a n o la n dt h e nd e r i v a t i z e dw i l2 , 4 一 d i n i n o f l u o r o b e n z e n e , c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o nw a sp e r f o r m e dw i t hg e m i n ic18c o l u m n ( 4 6 x 2 5 0i r o n , 5p m ) ，a n dd e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s 3 6 0n m t h e r ew a sg o o dl i n e a rc o r r e l a t i o n b e t w e e nt h ec o n c e n t r a t i o n sa n dp e a l 【a 他ao fh y pi nt h er a n g eo f10 , - 。3 2 0m g l ，t h ec o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n tw a s0 9 9 9 2 t h er e c o v e r yw a s9 7 1 9 4 - - 1 1 0 1 8 ，a n dt h el i m i to fd e t e c t i o nw a s2 5 i n 西南大学硕+ 学位论文 a b s t r a c t m g l 2 a na n a l y t i c a lm e t h o do fh y pi ns o y 鞠u c 鹤w a se s t a b l i s h e d b yh p l c - m s m s c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o nw b sp e r f o r m e dw i t hv e n u s i im p - c i8c o l u m n ( 2 5 0m n l 4 6m mi d , 5 ：1 1 ) ，h y d r o x y p r o l i n ew a si d e n t i f i e da n dq u a n t i f i e db ye l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm s s ss p e c t r o m e t r y ( e s i - m s ) ，w h i c hw a s0 p e 腿t e di np o s i t i v e i o nm o d ew h i l et h em z1 3 2 弱t h ep a r e n ti o n , t h em z8 6 a n dt h em z8 6a st h ep r o d u c ti o n sw e r er e c o r d e di nt h es e l e c t e dr e a t i o nm o n i t o r i n g ( s r m ) m o d e ， t h e r ew a sg o o dl i n e a rc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ec o n c e n t r a t i o n sa n dp e a ka 冶o fh y pi nt h er a n g eo f 10 0u g l 一- 16 0 0u g l ，t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a s0 9 9 9 6 3 a na n a l y t i c a lm e t h o do fh y pi ns o ys 绷嘲：e sw a se s t a b l i s h e db yc o l o r m e t i cm e t h o d t h e r ew a s g o o dl i n e a rc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ec o n c e n t r a t i o n sa n dp e a l ca l g ao fh y pi nt h er a n g eo f3 2m g ，i j 1 2 8m g l t h i sm e t h o dc o u l db ea p p l i e dt om e a s u r et h eh y pi nt h ec o l l a g e nr a p i d l y , t h eo p e r a t i o n w a ss i m p l i f i e da n dt h ep r e t r e a t m e n tw a ss i m p l i f i e d t h i sm e t h o dw a so n eo ft h em e t h o d sw h i c h w e r eo f t e nu s e dm o s t l y 砒p r e s e n t b u ti ts t i l lh a di n s u f f i c e n c yc o m p a r e d 、硐t hi - i p l ci nt h e e x a m i n a t i o np r e c i s i o na s p e c t 4 c o m p a r i n gt h ea c c u r a c ya n ds e n s i t i v i t yo ft h em e t h o d , h p l cw h i c hw a sd e f i n e da st h el a s t m e t h o d ，m a k e dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fs a m p l e si nt h i sa r t i c l e t h er e l a t i v ea m o u n t so fh y p ( w h i c h e x p r e s s e da sm i l l i g r a m so fh y pp e rg r a mo fa m m o n i an i t r o g e n ) w e r ed e t e r m i n e di nd i f f e r e n t s a m p l e s t h er e l a t i v em o u n t so fh y pw e r ea p p a r e n t l yd i f f e r e n ti ns a m p l e sd e t e c t e d rr a n g e d f i - o m0 5m g gt o1 9m g gf o rf e r m e n t e ds o ys a u c e sa n df r o m9 5m g gt o2 0 2m g gf o ra c i d h y d r o l y z e dv e g e t a b l ep r o t e i ns o l u t i o n s t h er e l a t i v ea m o u n t so fh y pi na c i dh y d r o l y z e dp i g s k i n sa n d p o d 【w e r e8 5 5 6m g ga n d3 7 0m g gr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec o l l a g e np r o t e i nw a s n o tt h es o l es o u r c eo fh y p , b u ti tw a sp o s s i b l et h a tw ec o u l di d e n t i f yw h e t h e rt h es a m p l e s a d u l t e r a t e dw i t ha c i dh y d r o l y z e dp r o t e i nb yd e t e c t i n gh y pi ns o ys a u c e s 5 u s i n gh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yt om a k eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so n4 0h y pp u r e s o ys a u c e s ，c a l c u l a t e da c c o r d i n gt ot h en o r m a ld i s t r i b u t i o n , 9 9 o fi t sn o r m a lr a n g eo fu n i l a t e r a l u p p 盯l i m i tw a se q u a lt o2 1m g go fa m m o n i an i t r o g e n 。i nt h i ss t u d y , n o t - f e r m e n t e ds o ys a u c e sw a s j u d g e db yt h ec o u n to f a m m o n i an i t r o g e n , w h i c ho v e r p a s s2 1m g li nt h es a m p l e 6 h y pw s sd e t e r m i n e di n5 0s a m p l e sb yh p l cw h i c hc o m e df r o mv a r i o u sc i t i e sa n dp r o v i n c e s i nc h i n a , j a p a n , k o r e a , s i n g a p o r e a m o n gt h es a m p l e s , 4 9w e r em a r k e da sf e r m e n t e ds o ys a u c e s , 1 w a sm a r k e da sb l e n d e ds o ys a u c e h o w e v e r , t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t1 2s a m p l e sw e r eb l e n d e ds o y s s u c e s ，w h i l e1 ll a b l e df e r m e n t e ds o ys a u c e s ，ls a m p l em a r k e db l e n d e ds o ys a u c e k e yw o r d s ：n o n - f e r m e n t e ds o y 鞠u c es o yl h l u c eh y d r o x y p r o l i n ec o l l a g e n i v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：嵋a 翠 签字日期：d 如归年町月o b o 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：拆保密，e l 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：畅窝翠导师签茗习彬 签字日期： 犯卅p 年j 月眇日签字日期：矽i 。年5 月2 。日 西南大学硕十学位论文文献综述 第一章文献综述 1 1 酱油简介 酱油起源于中国，它是一种古老的调味品，迄今已有2 0 0 0 多年的历史了。酱油是指以富 含蛋白质的豆类和富含淀粉的谷类及其副产品为主要原料，在微生物酶的催化作用下分解并 经浸滤提取的调味汁液。由于酱油中含有多种对人体有利的营养成分，酱油不仅成为我国老 百姓的生活中必备的调味品，也成为日韩、东南亚各国乃至欧美人们饮食生活中不可或缺的 调味品。我国是酱油生产大国，也是酱油出口大国。目前世界酱油年产量约为8 0 0 多万吨， 其中，我国年产5 0 0 万吨，居世界第一i n 。随着生活水平的提高，健康、安全的饮食已成为人 们普遍追求的目标，作为日常调味品的酱油其品质和安全也受到越来越多的关注。 按生产工艺的不同，我国的国家标准将酱油分为两种，一种是酿造酱油( f e r m e n t e ds o y s a n t a , , f s s ) ，一种是配制酱油( b l e n d e ds o ys 锄c e ，b s s ) 。 1 1 1 酿造酱油 酿造酱油是以大豆和或脱脂大豆、小麦和或麸皮为原料，经微生物发酵制成的具有 特殊色、香、味的液体调味品f 2 1 。我国酿造酱汕产品根据生产工艺的不同，划分为两大类：一 类是高盐稀态发酵工艺酱油，另一类是低盐固态发酵工艺酱油。 1 1 1 1 高盐稀态发酵工艺 高盐稀态发酵法是以大豆和或脱脂大豆、小麦和碱小麦粉为原料，经蒸煮、曲霉菌制曲 后与盐水混合成稀醪，再经发酵制成的酱油，其关键是低温制曲和酱醪发酵过程。目前该生 产工艺还可以细分为浸出法生产工艺、固稀法发酵工艺和压滤法三种。 以高盐稀态发酵工艺的酱油产品的香气成分高达2 6 7 种3 1 ，主要包括烃类、醇类、醛类、 酮类、有机酸、酚类、呋喃类、内酯类、吡啶等等。其风味和营养物质高达3 0 0 多种，主要 是多肽、氨基酸、低聚糖、脂肪酸、甘油以及各种有机酸与醇类经酯化生成的各类芳香脂类。 1 1 1 2 低盐固态酱油生产工艺 低盐固态酱油是以脱脂大豆及麦麸为原料，经蒸煮、曲霉菌制曲后与盐水混合成固态酱 醅，再经发酵制成的酱油【2 l 。该工艺生产周期短，产量大，目前我国以该工艺进行酱油生产的 产品占总产量的9 0 ，由于氨态氮含量上不去主要以三级酱油为主【1 1 。 酱油在酿造过程经过多种微生物酶的作用还产生了维生素b 1 2 、核酸、核苷酸、蛋白黑色 素和芳香族化合物f 4 羽，同时产生了具有重要生理活性物质的异黄酮【6 l 。 1 1 2 配制酱油 配制酱油是以酿造酱油为主体，与a h v p s 、食品添加剂等配制而成的液体调味品i 刀。 a h v p s 是以含有食用植物蛋白的脱脂大豆、豆粕、小麦蛋白或玉米蛋白为原料，经盐酸水解， 两南大学硕士学位论文文献综述 碱中和制成的鲜味调味品眇o i 。标准中还规定配制酱油中的酿造酱油比例不得低于5 0 。 a h v p s 在酸水解时却可能产生副产物氯丙醇。a h v p s 在酸解过程中，为了获得高效 的氨基酸转化率，投入过多或高浓度的盐酸，如果原料中含有脂肪酸和油脂，将会被水解生 成丙三醇，丙三醇经与氯原子发生亲核取代后形成氯丙醇，生成一系列氯丙醇产物，如l 3 二氯2 丙醇、2 , 3 二氯1 丙醇、2 氯1 ，3 丙二醇和3 氯1 2 一丙二醇掣1 1 l 。氯丙醇中已被确定 为有致癌性1 1 2 , 1 3 , 1 4 l 、还具有生殖毒性【1 5 1 。因此食用配制酱油极有可能威胁到人们的身体健康。 1 2 当前酱油产业发展中存在的问题 我国酿造酱油虽有2 0 0 0 多年的历史，但是目前我国酱油生产工艺与日本还有一定的差距， 其发酵技术、生产工艺、发酵设备的落后，以及氯丙醇超标等问题，使得我国的酱油产品在 国际市场上举步维艰。同时我国的标准也还不够健全，标准中对酿造和配制酱油没有提到加 以区分的方法，现行酱油标准中仅在配制酱油标准要求“配制酱油中酿造酱油的比例( 以 全氮计) 不得小于5 0 哆扩，在实际生产过程中是否按此比例，我们不得而知。从标准中的理化 指标来看，a h v p s 的理化指标远远高于配制酱油的理化指标，如果将其直接标注成配制酱油， 或者将配制酱油直接标注成酿造酱油，甚至有可能将酿造酱油的比例小于5 0 的非酿造酱油标 识成酿造酱油，这些行为按现行标准，根本无法区别出来。当前我国对酱油等级的划分主要 依靠氨态氮的含量来评定，部分企业为了利润以添加氨态氮含量较高的酸水解植物或动物蛋 白液来冒充酿造酱油或高档酱油，从而使我国酱油的发展形成恶性循环。 上述问题中，以非酿造酱油冒充酿造酱油，由于缺乏相应的检测方法，在酱油行业内较 为普遍，具有严重的欺骗性。以非酿造酱油冒充酿造酱油虽然对消费者的食用安全不会构成 严重威胁，但却严重侵害了消费者的合法权益，更为重要的是，这种掺假行为侵害了广大传 统酿造酱油生产厂家的利益。挫伤了广大酿造酱油生产厂家进行酿造工艺改进的积极性，从 而导致目前市场上高品质的酿造酱油产品匮乏，严重阻碍了整个酱油行业的健康发展。 鉴于以上原因，需要寻找能有效鉴别酿造酱油与非酿造酱油的指标，完善目前酿造酱油 与配制酱油标准的鉴别指标体系，从而建立酿造酱油和配制酱油鉴别检验方法。建立和完善 行之有效的标准对指导酱油掺假检验，促进酱油产业健康发展，维护广大消费者的合法权益， 具有重要意义。 1 3 酱油的鉴别方法现状及存在的问题 我国现有的酱油相关标准包括酿造酱油( g b1 8 1 8 6 - - 2 0 0 0 ) 1 2 ) 、配制酱油( s b 1 0 3 3 6 - 2 0 0 0 ) 1 7 1 、酸水解植物蛋白调味液( s b1 0 3 3 8 2 0 0 0 ) 1 8 1 、 酱油卫生标准( g b2 7 1 7 2 0 0 3 ) 1 1 6 1 、酱油生标准分析方法( g b t5 0 0 9 3 9 - 2 0 0 3 ) 【阴，依据标准中现有的技术指标无法鉴 别某种标识为“酿造酱油”的样品是否为真正的酿造酱油。 乙酰丙酸( 又称为果糖酸) 被认为是区别酿造酱油和非酿造酱油最为理想的一个指标i t s , t 9 ， 是酸水解植物蛋白调味液中特有的一种成分，酿造酱油在生产过程中，因不可能采用强酸的 2 两南大学硕十学化论文文献综述 条件参与发酵，因而一般都不含有乙酰丙酸。在台湾和韩国酱油标准中，通过规定酿造酱油 中乙酸丙酸的含量来达到防止酿造酱油中掺加酸水解植物蛋白液。我国学者吴鸣等1 2 0 i 建议采 用该指标来区别酿造酱油和非酿造酱油，并已制定相应的检测方法标准1 2 。不过，需要指出 的是，李国基等瞰l 发现，焦糖色素中也能检测到乙酰丙酸，而有些酸水解植物蛋白调味液由 于其原料或制备工艺不同，其中乙酰丙酸的含量很低，因此，单独采用乙酰丙酸作为区别酿 造酱油和非酿造酱油的指标存在一定缺陷。此外，对于不是掺加酸水解植物蛋白调味液的样 品。单纯检测乙酰丙酸不能识别其是否掺假。 氯丙醇被认为是酸水解植物蛋白调味液中一种特有的毒副产物i n 捌，酸水解植物蛋白调 味液( s b1 0 3 3 8 - 2 0 0 0 ) 8 1 标准中专门对其限量进行了规定。由于酿造酱油基本不受氯丙醇污 染 2 2 , 2 3 1 ，因此有可能通过测定氯丙醇的含量来区分酿造酱油和非酿造酱油。不过，随着国内外 对酱油中氯丙醇污染的普遍重视，通过改进生产工艺，酸水解植物蛋向调味液中氯丙醇的污 染得到了有效控制，文献中还有关于水解蛋白液中氯丙醇脱除工艺的报道【2 4 郐, 2 6 1 ，因此，采用 氯丙醇来区分酿造酱油和非酿造酱油也可能存在一定缺陷。武致等 2 7 1 发现，老抽酱油中加入 经酸水解制成的焦糖色素后，可能引入氯丙醇，对酱油制品造成污染，可见氯丙醇不仅可来 源于酸水解植物蛋白调味液，还可来源于焦糖色素。此外，氯丙醇在酱油中的含量通常很低 ( 小于0 0 1m g k g ) ，须采用气相色谱质谱( g c m s ) 法进行检测，检测成本高，在很大程度 上限制了其应用。 颜勇掣邓l 提出采用氨基酸态氮与全氮的比值来判断酿造酱油中是否添加了酸水解植物蛋 白液及其添加比例，作者认为正常酿造酱油中氨基酸态氮与全氮的比值为0 5 左右，一般不大 于0 5 7 ，而酸水解植物蛋白调味液的氨基酸态氮与全氮的比值为0 7 9 ，通过检测样品中氨基 酸态氮与全氮的比值即可判断酱油样品中是否添加了酸水解植物蛋白调味液。该方法利用现 行标准中已有的2 个理化指标进行判断，十分简便。但需要指出的是，该方法的作者未提供 具体的实验数据支撑，仅停留在理论计算与推测上。 王生 2 9 1 报道了采用铵盐含量区分酿造酱油和配制酱油的方法，其原理是正常酿造酱油中 铵盐含量很少，而酸水解植物蛋白液在生产时使用盐酸，在将蛋白质水解成氨基酸时产生氨， 氨与酸结合成铵盐，因此其铵盐含量相对较高。不过，酱油在发酵过程中可能冈细菌污染产 生铵盐，此外，氨法生产的焦糖中也含有铵盐，焦糖的加入会影响铵盐的含量。因此，铵盐 的含量只能作为鉴别酿造酱油和配制酱油的参考指标。 石俊 3 0 l 介绍了一种通过检测色氨酸鉴定真假酱油的方法，该方法采用n , n - - - 甲基- 4 氨基 苯甲醛显色法来区分酿造酱油和假酱油。但作者只是对方法做了简要介绍，未给出针对具体 样品的实验结果。我们按照该方法进行实验发现，酱油本身的色泽干扰显色反应，即使用活 性碳进行脱色，干扰反应仍然存在。不过，该文献为筛选酿造酱油中的特征组分提供了很好 3 两南大学硕士学位论文文献综述 的线索。 到目前为止，国内外有关酿造酱油和酸水解植物蛋白调味液特征性组分的研究报道均很 少。国内毕丽君等f 3 l l 采用固相萃取高效液柏色谱法分析了酱油中9 种有机酸( 草酸、酒石酸、 甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸) ，其中草酸和酒石酸因分离度不好，只 作定性，未作定量。但该研究只对3 个酱油样品进行了检测，且未注明是酿造酱油还是非酿 造酱油，没有筛选出酱油中的特征组分。徐兰等【3 2 1 报道，采用顶空气相法鉴定酱油质量，通 过观察色谱峰的数量及峰面积来鉴别酱油真假及质量，但该研究仅涉及4 个样品，样品数量 太少，且未对色谱峰进行质谱定性确定，未能确定各种酱油中的特征组分。 近年来，国内有关酱油中挥发性或风味性组分分析的报道较多f 3 3 , 3 4 , 3 卯，但这些研究主要是 对酿造酱油中的挥发性或风味性组分进行分析鉴定，未见将挥性组分用于酱油掺假鉴定的报 道。冯笑军等1 3 6 l 报道了采用气相色谱质谱法对天然酿造酱油和配制酱油中的香气成分进行比 较分析的结果，发现酿造酱油中醇、酚、醛酮、酯类物质的种类均比配制酱油多一倍以上 酸类物质的总含量也明显多于配制酱油而配制酱油的杂环类化合物比较丰富。该项研究虽 然给出了酿造酱油和配制酱油中特有成分，但该项研究涉及的样品数量少，特有成分在区分 酿造酱油和配制酱油中的应用价值有待进一步证实，该项研究也未给山具体的区别酿造酱油 和配制酱油的方法。 国内还有作者葛冬梅 r q 采用高效液相色谱法对酱油中的游离氨基酸组成进行了分析，发 现市售酱油中的氨基酸组成与酿造酱油中的氨基酸组成存在一定差异，该研究认为同一工艺 条件下酿造酱油中氨基酸的组成较稳定，并提出根据酱油中必需氨基酸占总氨基酸的比例来 判断该酱油是否为酿造酱油，但该研究结果仅是初步分析结果，作者未给出具体的操作方法。 在国外，k i n o s h i t a 等! 强l 采用高效液相色谱法对三种品牌的日本产发酵酱油进行了比较分 析，发现3 种能区分不同品牌发酵酱油的关键组分，经鉴定证实这三种组分为异黄酮类衍生物。 但不清楚这些组分是否能作为区别酿造酱油和非酿造酱油的指标。w a n a k h a c h o m k r a i 掣3 9 l 报导 了采用顶空气相色谱法及g c m s 法检测酱油中挥发性组分的方法，但该方法仅对2 种品牌的酿 造酱油进行了分析，未同时对其它非酿造酱油组分进行分析。 l e e 等 4 0 1 分别用溶剂抽提和固相微萃取( s p m e ) 技术对酸水解植物蛋白调味液和酿造酱 油中的挥发性组分进行了比较分析及鉴定，为寻找二者间的差异组分提供了重要线索，遗憾 的是该项研究所涉及的样品数量较少，未涉及酱油的掺假鉴定。 综上所述，目前尚缺乏有效的区别酿造酱油和非酿造酱油的指标和方法。因此，寻找新 的区别酿造酱油和非酿造酱油的指标，对深入开展酱油掺假检验工作具有重要意义。 4 西南大学硕士学位论文文献综述 1 4 酱油中掺加胶原蛋白水解液研究现状 如前所述，当前酱油掺假表现最为突出的是以非酿造酱油冒充酿造酱油，其中较为常见 的掺假手段是在酱油中掺加酸水解蛋白液，酸水解蛋白液中最常见的是a h s ，目前所研究 鉴别方法也主要是关于a h v p s 的如乙酰丙酸、氯丙醇，但是这些方法还尚不能有效对a h v p s 进行鉴别，对a h v p s 的鉴别存在一定的瓶颈。与a h v p s 相似，酸水解动物蛋白液也是一类富 含氨基酸的蛋白液，其中以酸水解胶原蛋白液及毛发水解液为代表。考虑到动物水解蛋白液 与酸水解植物蛋白液一样具有氨基酸含量高的特点，极有可能被掺加到酱油中，如毛发水酱 油即有较多报道【4 1 ，4 2 l ，且有关于酱油中掺加毛发水的检测方法的研究报道【4 3 l 。酱油中掺加水 解胶原蛋白液及相关的检测方法研究报道相对较少，因此有必要建立相关检测胶原蛋白水解 液的方法。 1 4 1 胶原蛋白及羟脯氨酸 胶原蛋白作为哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的2 5 - - 3 0 ，相当于 体重的6 4 4 1 。水解胶原蛋白含氮量达1 4 以上，富含有1 8 种氨基酸h 卯。 胶原蛋白主要存在于动物的皮，以及骨、软骨、牙齿、肌肉、韧带、血管中，是结缔组 织重要的结构蛋白质。除此之外胶原蛋白还来源于制革工业的副产品皮革渣、皮革屑、皮角 废料等作为原料，经酸碱水解后并脱铬处理而生产的新型高蛋白产品。在我国皮革制品中每 年产生的制革废弃物约1 4 0 万吨，其中约含2 0 7 0 的胶原蛋白，可以从这些制革废弃物中 提取出1 0 多万吨的胶原蛋白产品m 。因此胶原蛋白的来源丰富，而且廉价。 胶原蛋白分为i 、i l 、i i i 型，其中i 型胶原蛋白是动物皮的主要成分之一，它含有大量的脯 氨酸和羟脯氨酸，羟脯氨酸是胶原蛋白所特有的氨基酸【4 7 骢l ，在正常胶原蛋白中含量约1 3 4 ， 在其他蛋白中很少发现。羟脯氨酸是一种亚氨基酸，含有4 种同分异构体，分别在脯氨酸的4 位或3 位上带有羟基，其中主要以反式的4 羟脯氨酸存在( 占总羟脯氨酸的9 5 ) 4 9 5 0 ，羟脯 氨酸含量与胶原蛋白之间的相应系数在7 1 4 7 6 9 之间p ，因此可以通过测定羟脯氨酸的含量 来计算胶原蛋向的晕，羟脯氨酸的存在已成为衡最胶原蛋向的一个重要指标。 羟脯氨酸常被认为是胶原蛋白中特有的一种标志物，在正常胶原蛋白中的含量在约为 1 3 e 1 4 9 4 75 3 1 ，而胶原蛋白在多种动物组织中均可检测到羟脯氨酸1 4 7 , 5 2 , 5 3 , 5 4 。 不久前，卫生部公布了第二批食品中非食用物质名单【5 卯，其中包括在乳制品中可能添加 的皮革水解蛋白，并推荐了相应的检测方法，即通过检测羟脯氨酸作为乳制品中是否添加皮 革水解蛋白的指标【5 5 1 ，但公告中未提及可能受影响的酱油产品。到目前为止，已有许多乳与 乳制品中胶原蛋白检测方法的文献报道，这些方法基本上都是通过分析样品中的羟脯氨酸g 来 鉴定胶原蛋白的存在 5 5 , 5 6 , 5 7 , 5 8 , 5 9 。 基于以上事实，检测酱油样品中的羟脯氨酸有可能提示其中是否存在水解动物蛋白液或 水解胶原蛋白液。 5 两南大学硕士学位论文文献综述 1 4 2 羟脯氨酸检测方法研究进展 1 4 2 1 高效液相色谱法 近些年来，对氨基酸的检测通常以柱前衍生与液相色谱法相结合来分析氨基酸，柱前衍 生先将氨基酸转化成衍生物，再进行色谱分离的一种衍生方法，具有操作简便、快速，灵敏 度高等特点1 6 0 , 6 1 1 。李景红等人1 5 6 1 以柱前衍生与高效液相色谱法相结合的方法检测水解后牛乳 中的羟脯氨酸，并通过羟脯氨酸的量换算出掺加胶原蛋白的量。 高效液相色谱法分析羟脯氨酸常用的柱前衍生试剂有2 ，4 二硝基氟苯( d n f b ) 1 5 6 , 6 2 ，该 衍生物稳定性好，过量的d n f b 对分析没有影响，分析时间短，成本低，重现性好等特点。a s a m i k o n d o l 6 3 l 等以芴甲基氯甲酸酯( f m o c ) 作为衍生试剂测定羟脯氨酸，其操作方便，但是干扰较 大，分离效果欠佳。唐志毅等1 6 4 采用邻苯二甲醛和芴甲基氯甲酸酯两个衍生剂测定尿中的羟 脯氨酸，以国产c 8 柱为色谱柱，无杂质干扰，特异性好l 研究者也有以异硫氰酸苯酯( p i t c ) 1 6 s 为衍生试剂，测定了保健食品中游离和非游离的羟脯氨酸。另外，t s u r u t a 等1 6 6 1 采用了敏感 荧光标记试剂( 二甲基硫酰氯) 检测尿液中羟脯氨酸含量，该方法具有高度敏感，重现好并 且只需要少量的生物样品。 1 4 2 2 比色法检测 蛋白质含有几十种氨基酸，但大多数在紫外光范围内吸收很弱或没有吸收。目前通常用 的检测方法是将氨基酸分子中的氨基、羧基或其它活性基团与