（食品科学专业论文）酶解酪蛋白产生酪啡肽的条件研究.pdf

酶解酪蛋白产生酪啡肽的条件研究 食品科学专业 研究生李培骏指导教师表永俊 摘要 酪蛋白是乳中含量最丰富的蛋白质，含有人体生长发育所必须的氨基酸。 近年来的研究结果表明，酪蛋白除具有营养功能之外。还具有非常重要的生理 功能，是生物活性肽的重要来源。其中酪啡肤具有抑制肠道运动，免疫促进， 促进胰岛素的分泌等生理作用而备受关注。大量科学研究表明，通过选择适当 的蛋白酶，水解的蛋白质可以得到大量的具有各种生物功能的生物活性肽。 研究了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶对干酪素的水解， 用甲醛固定法对蛋白质的水解度进行测定，并用水解度( d h ) 表征其反应历 程。分析了底物浓度( 【s 】) 、酶浓度( 【e 1 ) 及时间( t ) 等参数对d h 、水解速 度的影响。采用四因素三水平正交实验设计，以d h 为指标，对蛋白酶水解酪 蛋白的条件进行优化，以获得几种蛋白酶的最佳反应条件。 胰蛋白酶水解酪蛋白，最佳水解条件为酶浓度0 1 5 、温度5 5 、p h 7 5 、 底物浓度6 ，水解3 0 m i n 其d h 值为1 6 6 7 ；木瓜蛋白酶水解酪蛋白，最佳 水解条件为酶浓度0 8 、底物浓度2 、p h 6 0 、温度7 0 ，水解1 小时其d h 值为1 2 1 4 ；中性蛋白酶水解酪蛋白，最佳水解条件为酶浓度0 6 、底物浓 度2 、温度5 5 、p h = 8 0 。水解其d h 值为1 0 0 5 。 利用s e p h a d e xg 一1 5 交联葡聚糖凝胶柱( 1 7 c m x 5 7 5 c m ) 粗分离胰蛋白酶 一胃蛋白酶、中性蛋白酶一胃蛋白酶、木瓜蛋白酶一胃蛋白酶组合酶的酪蛋白 水解液，根据s e p h a d e xg 一1 5 分离蛋白质的标准曲线方程l g m = 4 8 2 2 1 6 - 2 8 1 5 3 1 k a v 得到水解度与分子量的关系。 用r p - - h p l c 检测1 3 酪啡肽7 ，采用0 d s 柱( 2 5 0 m m x 4 6 m m ，4 7 1 , m ) ， 以乙腈一水( 2 0 ：8 0 ) 为流动相。流速：l m l m i n ，检测波长2 1 5 n m ，柱温4 0 c ， 柱压9 6 m p 进行洗脱，得到标准品的比较理想的色谱图谱，保留时间为 2 9 9 1 2 m i n 。 用液相色谱对s e p h a d e xg 1 5 分离的收集组分进行检测，发现胰酶一胃酶 组合得到4 种与标准品b 一酪啡肽一7 相同保留时间的色谱图，中性酶一胃酶 组合得到1 种与标准品1 3 一酪啡肽一7 相同保留时间的色谱图。 关键词：酪蛋白酪啡肽酶解反相高效液相色谱 r e s e a r c ho nc a s e i ne n z y m a t i ch y d r o l y s i sc o n d i t i o nt o p r e p a r ec a s o m o r p h i n m a j o r ：f o o ds c i e n c e c a n d i d a t e ：l ip e i j u na d v i s o r ：y u a ny o n 自u n a b s t r a c t c a s e i n ，w i t he s s e n t i a la m i n oa c i df o ri n d i d u a lg r o w t h ，i st h em o s ta b u n d a n tp r o t e i ni n m i l k r e c e n t l y ，m a n yr e s e a r c h e sd e m o n s t r a t e dt h a tc a s e i nw a sn o to n l ys o u r c eo fn u t r i e n t s ，b u t m a ya l s ob eo n e so fb i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e s ，a m o n gw h i c hc a s o m o r p h i n sh a sr e c e i v e dt h e m o s ta t t e n t i o nf o ri t s s p e c i a lp h y s i o l o g i c a l a c t i o n ，s u c h a s i n h i b i t i n g i n t e s t i n a l m o v e m e n t ，a c c e l e r a t i n gi m m u n i t ya n da c c e l a r a t i n gi n s u l i ns e c r e t i o n m a n yr e s e a r c hw o r k sh a v e s h o w nt h a ta l a r g en u m b e ro fb i o a c t i v ep e p t i d e sc o u l db ef o u n dw h e ns o m ek i n d so fr i c h p r o t e i n sc o u l db eh y d r o l y z e db yp r o p e rp r o t e i n a s e t h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i so fc a s e i nb yt r y p s i n ，p a p a i n ，s u b t i l i s i na n dp e p s i n ，u n d e rt h e i r c o n d i t i o nw e r e s y s t e m a t i c a l y s t u d i e d t h ee f f e c t so f o p e r a t i n gp a r a m e t e r s e n z y m e c o n c e n t r a t i o n ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n dt i m e - - o nt h ed e g r e ea n dt h es p e e do fh y d r o l y s i so f h y d r o l y s e dp r o t e i nw a sm e a s u r e db yc o l o r i m e t i cm e t h o d t a k i n gd h a si n d e x ，o r t h o g o n a ld e s i g n o f f o u rf a c t o r st h r e el e v e l sw a st a k e nt oo p t i m i z et h eh y d r o l y s i sc o n d i t i o no f c a s e i nw i t l l p r o t e a s e s t h eo p t i m a lh y d r o l i s i sc o n d i t i o nw a sr e c e i v e d t h e o p t i m a l h y d r o l y s i s c o n d i t i o no f c a s e i nb y t r y p s i n w e r e ：e n z y m ec o n c e n t r a t i o n l 5 ， t e m p r a t u r e5 5 c ，p h7 5 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n6 a n dt h ed h i s1 6 6 7 ：t h eo p t i m a l h y d r o l y s i sc o n d i t i o no f c a s e i nb yp a p a i nw e r e ：e n z y m ec o n c e n t r a t i n no 8 t e m p r a t u r e 7 0 。c ，p h6 0 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n2 a n dt h ed hi s1 2 1 4 ；t h eo p t i m a lh y d r o l y s i sc o n d i t i o n o fc a s e i nb ys u b t i l i s i nw e r e ：e n z y m ec o n c e n t r a t i o n0 6 t e m p r a t u r e7 0 c , p h8 0 s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n2 a n dt h ed hi s1 0 0 5 t h er e l a t i o n sb e t w e e nd e g r e eo fh y d r o l y s i sa n dd i s t r i b u t i o no fm o l e c u l a rw e i g h tw e r e o b t a i n e da c c o r d i n gt ot h ee q u a t i o n ：l e , m = 4 8 2 2 1 6 - 2 8 1 5 3 1 k a y t h es e p h a d e xg 1 5c o l u m ( 1 7 c m x 5 7 5 c m ) w e mu s e dt oi s o l a t et h eb i o a c t i v ep c p t i d e so b t a i n e df r o mt h ec a s e i nh y d r o l y z e d b yt r y p s i n - p e p s i n ，s u b t i l i s i n - - p e p s i n ，p a p a i n - - p e p s m ， d e t e c t i n 9 1 3 - c a s o m o r p h i n 一7 t h r o u g h l u p 一册l c ，a o d s c o l u m n ( 2 5 0 m m x 4 6 n u n ，4 7 “m ) w a su s e d ，t h em o b h ep h a s ew a sa c e t o n i t r i l e h 2 0 ( 2 0 ：8 0 ) t h ef l o wr a t ew a sl m l m i na n d d e t e c t i v ew a v e l e n g t hw a s2 1 5 r i m , t h ec o l u m nt e m p r a t u r ew a s3 7 c ，c o l u m nt e m p r a t u r ep r e s s u r e w a s9 6 m p r e m n f i o nt i m ew a s2 9 9 1 2 m i n r p - h p l cw a su s e dt od e t e c tc o l l e c t i n g c o m p o n e n td e t a c h e db ys e p h a d e x ( 3 - 1 5 w e a t t a i n e d c h r o m a t o g r a m c h a nw i t ht h es a n l er e t e n t i o nt i m ea sb - c m 7s t a n d a r d s a m p l e a c c o r d i n gt ot h ec h r o m a t o g r a m s ，t h e r ew e r e4s a m p l e sh a v et h es a m er e s e r v a t i o nt i m e a sb - c m 一7i nt r y p s i n - p e p s i na n do n l y1s a m p l eh a v et h es a er e s e r v a t i o nt i m ei ns u b t i l i s i n - p e p s i n k e yw o r d s ：c a s e i nc a s o m o r p h i ne n z y m a t i ch y d r o l y s i sr p - h p l c 两华大学硕士学位论文 1 1 酪啡肽的结构与功能 第一章文献综述 1 1 1 酪蛋白( c a s e i n ) 乳脂、乳糖和乳蛋白构成了乳的基本成份，牛乳中蛋白质含量约为3 3 ， 人乳中蛋白质含量约为1 4 。主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳铁蛋 白和一些具有重要生理功能的酶类，其中酪蛋白( c a s c i ) 占7 8 8 t 1 】( 人乳中酪 蛋白约占总蛋白的3 2 ) 。a 。l 、a s 2 、b 和k _ 酪蛋白是酪蛋白的四种主要组成成 分，b 一酪蛋白占酪蛋自总量的2 8 2 ( 占人乳中酪蛋白总量的6 0 ) ，其次为乳 球蛋白( b l a c t o g l o b u i n ，占9 7 ) 。此外还有乳清蛋白( a l a c t a l b u m i n3 6 ) 、白 蛋白( 1 2 ) 、微量乳铁蛋白( 1 a c t o t 瑚s f e 仃i n ) 及少量的免疫疫球蛋白( 2 1 ) 。酪 蛋白( c a s e i n ) 中含有人体必需的8 种氨基酸，是一种全价蛋白质( p e r 值为2 5 ) ， 能够为生物体生长发育提供必需的氨基酸。除了营养功能外，其在动物消化道 中经蛋白酶分解产生的肽段的潜在生物学活性己受到广泛重视【2 】。 i h a r e g h t - l e u - g l n g i n1 e u - a s n - v a i - p r o g i v - - g l u - i l e h 卜c i u 一曲，儿u _ 受一世m 屯细十i 2 l g l u - s e r - - l l e t h r g r s - il e - s n - l y s l y a 一1l e - o l t l - l y s p h e - 6 1 ”f 刚一c l p ：c l u j c l n 吨】n l n l t n r g l u 一 s p - g l u l e u g i n - a s p _ l y s i i n - h i s p r 0 _ p f i c k i n g l n - t h r - g l n 。s e t 。l e u - v a l t y r - 6 l p r a 一p r o - 6 l ，一p r p 】l e 一：p r o ：一b n - s e r - k p p r 口_ 6 1 n - n i l p - p r o p r o - l c u - t h r g l r r t h r - 8 l p r o v a l - v a l h 卜p t o - p r o - p h e - l 州一l n _ p r o 吒i u 地卜_ t - g i y - v u s e r l v s v a i l y 5 - 6 ) u - 1 0 1 i a l e t 一 ! a - p r o l y s 一 h i s - b s - g l u - m e t p r o - p h p r o b p t ”一p r o v a l - g l n - p r o p h e - t h r 1 2 l 6 h s e r g i s e t - b e n 。t h k u n r - a s p - v a i - g i u - 咖州j s - l e u - p r o - p r o - l e u 。l e u - l e u i i 】 g i n s e t t r 口一h t h i s g i n - p r o h i s - g i n p r ol e u - p r m o _ 删_ 卜- e t n e p r 口- p r o - g i n 一 1 6 1 s e t v a l l e u s e t l e u t s r i n s e r - l y $ - v a l - l e u p r 卜v 一p r p - c 】u l v 一a l a - v a l - p r o t y r - 1 8 1 p r 0 4 3 1 n 。a t ；一 , s ：p - h e l p r o 。i l e - c l n 一 i a p i e l e r l e u t ”- g ；n - 6 】n p r o - 、j a l l e u - g l y p r o - 2 0 t 2 0 9 v o l - f l r i - g i r p r o p h e - p r o - l l e 1 l e - y a l 舢 f i g l - 1 p r i m a r ys t r u c t u r eo f b - c a s e i n 图1 - 1b - 酪蛋白的一级结构图【3 1 a 和b 酪蛋白含有高含量的磷酸丝氨酰残基，其中a 。酪蛋白氨基酸残基数 第1 页共6 9 页 西华大学硕士学位论文 为1 9 9 ，含8 个磷酸丝氨酰基，b 酪蛋白( 一级结构见图1 1 ) 由2 0 9 个氨基酸 残基构成，含5 个磷酸丝氨酰基。 1 1 2 阿片肽( o p i o i dp e p t i d e s ) 1 1 2 1 内啡肽( e n d o r p h i n ) 阿片受体的发现提示脑内可能存在相应的内源性阿片样活性物质，不久即 自脑内分离出两种五肽，即甲硫氨酸脑啡肽( m e n k e p h a l i n ) 和亮氨酸脑啡肽 ( l 广e n k e p h a l i n ) ，它们在脑内的分布与阿片受体的分布近似，并能与阿片受体 呈立体特异性结合而产生吗啡样作用，这种作用可被吗啡拮抗药纳洛酮所 拮抗f ”。继发现脑啡肽之后，又自垂体中分离出几种较大的肽类，称为内啡肤， 如b 一内啡肽( 1 3 c n d o r p h i n ) 及强啡肽( d y n o r p h i n a ) 。孤啡肽( o r p h a n i nf q ，o f q ) 是继脑啡肽、内啡肽和强啡肽之后，于1 9 9 5 年底发现的第4 种内源性阿片肽。 1 1 2 2 酪啡肽( c a s o m o r p h i n s ) 1 9 7 9 年脑啡肽( e n k e p h a l i n ) 的发现轰动了整个科学界，同年b r a n t l 等人从 食物中发现了b c m 7 和b c m 5 ，证明了食物中阿片物质的存在【4 1 。他们首先从 酶解的b 酪蛋白的水解产物中分离至l j t y r p r o p h e p r o g l y - p r o 1 i e ，为b - 酪蛋白 第6 0 6 6 氨基酸残基片段，命名为b c m 7 。并且通过人工合成了b c m - 7 和它的 同系物b c m 6 ，b c m 5 ，b c m 4 ，并证明b c m 5 在豚鼠回肠试验中具有最强 的阿片活性。此后，h 。m e i s e l 等从饲喂牛酪蛋白的微型猪空肠食麋中分离到 1 3 c m 1 1 ，被称为酪啡肽源。 牛乳酪蛋白是外源阿片肽的通常来源。从a 酪蛋白得来的阿片肽称为a - 外啡肽从b 一酪蛋白得来的阿片肽称为b 酪啡肽，从b 酪蛋自得来的阿片肽称 为酪新素( c a s o x i n s ) 。另外，乳清蛋白，如a 乳白蛋白和b 乳白蛋白，在他们 初级结构中含有阿片肽序列。 k w e n - j e n c h 锄g 等人吲报道了一种牛奶蛋白中合成的来自于b 酪蛋白的四 肽氨基酸片断( t y r - p r o p h c p r o - n h 2 ) ，它是一种p 阿片受体有力的特殊兴奋 剂。这种肽就叫做吗啡，它是b 酪啡肽的氨基末端四肽片断，但是在受体相连 的化验中前者是后者的5 0 - 1 0 0 倍。y u n d e nj i n s m a a 和m a s a a k iy o s h i k a w a 6 j 在 o d s 柱上通过反相h p l c 分析得到三种阿片活性级分，在级分a 中得到了一 第2 页共6 9 页 西华大学硕士学位论文 种新的六肽结构，与b 酪蛋白的第1 1 4 1 1 9 残基相对应。具有阿片活性的内啡 肽和乳酪啡肽如表1 - 1 所示。 表1 - 1 具有阿片活性的内啡肽和乳酪啡肽”1 t a b l e1 - 1e n d o g e n o u so p i o i dp e p t i d e sa n dm i l kp r o t e i n - d e r i v e dp e p f i d e sw i t ho p i o i d - l i k ea c t i v i t y f 培p l i d e a m i n oa c i d s e q u e n c ep t e c u r s o r f , s 0 , u r c r l e j e n # e o h aw i t ，r - gy - g l y p n e l e u p r o e n k e p 腩l i na v e ：吨n k e p h a h nt y c - gy - g l y - p l t e - m e lp r o a n k e p m l i na e n 懵卜nt 卅8y - g l y p h e 捌e “r r - $ e r - gu i l y s , s e r g i n - 彳艄p r o - l e u l j e i e - l y s - a i , i k v a l 呻 l 挎焉聃g n 0 神0 | p h m t ” - g y g l y p e - l e u t g - a r 口 e e - a n ；p t o - l y l l q l 归t 碲t a 0 m s n g ”0 h n 0 t e 驰时 o f p h a n 蚺f 0 e n a o 啪r d h h e n e o m o r d n n2 牛c a s o n 0 r ；肛 1 c o s e m o r , 0 h = p - 7 b c 的0 仃t o r o h n 5 睁c a s o m o p p b m o h 珊p h e - g l y - e , ￥p h e t n r - g w * j 峰l 跨s e l - a l a a 馆上y l e u a l a 值靳g i n - c h t n p m i t r p - p - 叱 t y r - p f o _ p h e - p t , e - n h 2 t y f - p f o - p h i - p e o - - g i 卜p r o - l e - p f o - n * ! k | l e a t y r - p | 扣p n p 。j 。q - p r o l i e t 铲p i 口p p m g t m p m p 协p r o 吨1 | e x o r p h i na r g t y r l e u g l ，啊l e u g l u 啦! - e l o r p h i n 稽- t ”o l e u - g y - t 押 - k e u c i i o x l n c n s o x f 5 c s o “n c c a s o x md ar l s c 抽m l i n b - l a c l 0 曙n t y r p r d s r - t y r o g 5 p l e u + a s n - t y r t y r - p r o - t ” - t f t y k - p t o q l e 长r 订r h v 刊l e a s e r - ar g t y r - v n h - p r o - p n e p r o p r o p f | t 盯gy - l e u l p h e t v r l e u - l e u - p h e p t 0 0 i ) b t 恃i a n o c o n 帆 m r p h n p r o c m c 艟e p t i n 0 n q o w n 且c a e m i c m n b - c a s e i n 墨c a ”i n 吨! - c a ”h 日吣- c a s e 岍 悱c a l e i n 时m n 睁c a e h 吨，- c a s e i n 西l o c 协b u m i n b 上a c 0 i 仲u b n a 乳吗啡( a 1 a c t o r p h i n ) 是在牛乳清蛋白a 乳白蛋白( 5 0 5 3 ) 初级结构 中发现的一种四肽( m g l y l e u p h e ) 。b 乳吗啡( t y r - l e u l e u p h e ) 来源于b 乳球蛋白。 外啡肽具有一些共同的结构特征，它们的氨基末端均具有t y r 残基 ( a e x o r p h i n 除外) ，而且在第三或第四位上还有其他的芳香族氨基酸如p h e 、 p r o 、t y r 的出现，这种结构特点对于类吗啡活性肽与体内受体位点的结合非常 第3 页共6 9 页 西华大学硕士学位论文 重要。因此，研究外啡肽的氨基酸序列，对于进一步探讨其结构和功效有着十 分重要的价值。 1 1 3 酪啡肽的生理活性作用 迄今为止，在乳中已经发现多种生物活性肽，主要的生物活性肽及其生物 学功能如表l 一2 所示。 表1 - ：2 主要的酪蛋白源生物活性肽及其生物学功能嗍 ! ! 唑! ：；：m 玺! ! ! ! 篮塑坐! ! 生! 匿匹堂! 堂旦翌! 墅巴! 丛些磐! 业堑墅鲤婴! 活性肽生物学功能 抗菌肽( f 1 2 3 ，f r o m a s l - c a s e i n )抗感染 a c e 抑制肽( t 2 3 - 3 4 ，f 1 9 4 - 1 9 9 ，f r o ma s l - c a s e i n ，抑制血管收缩，降血压作用 f1 7 7 1 8 3 ，f r o mb - c a s e i n ) 免疫调节肽( f9 2 9 4 ，f r o ma s l - c a s e i n ) 免疫刺激作用 酪磷肽( f 4 3 - 5 8 ，f 5 9 - 7 9 ，f 6 6 7 4 ，f r o m促进钙的吸收和利用 a s l - c a s e i n ，f1 - 2 5 ，f r o m8 - o s e i n ) 细胞生长调节肽仃1 6 5 1 9 3 ，f r o ma s l - c a s e i n )细胞生长调节作用 糖基化肽( c g p , f 1 0 6 - 1 1 6 ，f r o m k - c a s e 蛐 促进胆囊收缩素的释放，抑制胃 泌素的释放抑制血小板的凝集 c m p ( f1 0 6 - 1 6 1 f r o m r - c a s e i n ) 抑制胃酸分泌，免疫调节作用 凝乳酶抑制肽f f9 9 ，1 0 5 。f r o m k - c a s e i n )抑制凝乳酶活性 c a s e x i n ( f3 3 3 8 f r o m c - c a s e i n ) 阿片活性拮抗肽 b - c a s o m o p h i n s ( f 6 0 - 7 0 ，f r o m b - c a s e i n ) 抑制胃肠道运动，免疫促进作用， 促进胰岛素、生长激素分泌 a 1 a c t o r p h i n ( f 5 0 - 5 3 ，f r o ma 1 a c t o g l o b u l i n ) 阿片样活性 b - l a c t o r p h i n ( f 1 0 2 - 1 0 5 , f r o mb - l a c t o g l o b u l i n ) 诱导豚鼠回肠收缩 b - l a c t o t e n s i n ( f 1 4 6 - 1 4 9 , f r o mb - l a c t o g l o b u l i n ) 诱导豚鼠回肠收缩 抗血小板凝集肽9 - 4 2 ，f r o mh u m a n 抑制纤维蛋白原的结合抑制血小 l a c t o t r a n s f e r r i n ) 板凝集 由表1 2 可见，乳蛋白在消化道酶的作用下，产生各种具有特殊生物学功 能的肽几乎均为小肽，它们通过作用于胃肠道或吸收入体内，影响机体生理功 能。其中，酪啡肽( c a s o m o r p h i n s ) 具有如下的生理功能： ( 1 ) 对消化活动的作用 胃肠运动受中枢与周边神经递质机理作用的调节。b 一酪啡肽与其它阿片受 体一样，可以与中枢神经系统和肠肌丛中的阿片受体结合，从而影响胃肠运动。 这种影响主要是延迟胃排空时间，抑制肠道转运消化物。近年来，欧洲一些研 究人员接连报道了酪蛋白受胃肠适量蛋白酶作用后可以释放出生物活性肽，改 第4 页共6 9 页 西华人学硕士学位论文 变了长期以来把酪蛋白看作单纯营养性蛋白质的旧印象。 据报道，b 酪啡肽能明显提高胰岛素和胰高血糖素的分泌【9 】i 圳，当动物预 先摄食一定剂量的氨基酸和蔗糖，再摄食一定量的b 酪啡肽之后，激素的增加 量要比直接饲喂b 一酪啡肽提高7 倍。这种作用很可能与调节摄食后葡萄糖利用 率以及摄食行为有关。这些乳源生物活性肽增加餐后胰岛素和生长激素抑制素 水平的提高，而这种作用能被纳络酮所逆转。这些激素与调节餐后葡萄糖的利 用和摄食行为有很大的关系。在体内，b 酪啡肽可提高血浆胃泌素的水平【1 1 j ， 胃泌素能促进新生动物胃内酸性环境的建立，而且还具有营养和促进黏膜生长 的作用，胃泌素还能促进胃、十二指肠发育，从而有助于新生动物机能特别是 消化吸收系统的全面发育和完善，加速其对外界环境的适应。 ( 2 ) 免疫活性作用 酪啡肽可以通过胃肠道被吸收入血液，对免疫功能起到一定的促进作用， 仔猪在哺乳期初，胃肠道对一些母源大分子有通透性，例如可吸收母源抗体， 加强早期免疫力1 1 “。b 一酪啡肽很可能通过类似机制被吸收，影响机体一些机能 的发育，其中可能包括了免疫功能的发育健全。b 一酪啡肽很可能首先作用于肠 粘膜免疫系统，再可能通过血液循环，影响其他免疫系统。试验表明，饲喂b 酪啡肽7 和b 一酪啡肽一3 都能促进大鼠淋巴细胞转化功能和红细胞免疫功能i l ”。 据推测，b 酪啡肽还能通过调节淋巴细胞增殖而促进胎儿免疫系统的发育。 ( 3 ) 阿片活性作用 酪啡肽同吗啡的作用一样，具有镇静止痛、诱导睡眠等作用。在体内( 主 要脑中) ，b 一酪啡肽通过与中枢上“受体高效特异结合而实现其介导麻醉、呼吸 抑制、成瘾等作用。m a n t l 等给小鼠脑内注射b c m ，可以产生痛觉丧失，且通 过小鼠的实验证明高疏水的酪啡肽碎片能通过血脑屏障【1 。大鼠脑室内注入 0 0 6 缸m o l l - 1 b 酪啡肽即足以产生镇痛作用。对老鼠脑室注射b 酪啡肽，老 鼠痛觉丧失，并且将阿片样肽注入血液后同样会产生镇静镇痛作用。在预处理 的婴儿乳汁品中，高含量的b 一酪啡肽7 及其衍生物会减少婴儿的啼哭并增加他 们的睡眠。蛋白质在消化中水解产生的某些肽类具有神经递质的作用，例如， b 酪蛋白的水解生成的酪啡肽片段的氨基酸排列顺序与内源性的阿片肽的n 末端排列顺序相似( m o r l e y , 1 9 8 1 ，1 9 8 2 ) 。从b 一酪蛋白的水解产物中进一步纯化 第5 页共6 9 页 西华大学硕士学位论文 出的六肽( t y r - p r o p h e p r o g l y - l l e ) 和四肽( t y r - p r o p h e p r o ) ，在体外均具有 阿片肽的活性( b r a n t l c ，1 9 8 5 ) 。可以显著抑制细胞腺苷酸环化酶活性，降低细 胞内c a m p 水平，除酪蛋白外，小麦谷蛋白的胃蛋白酶水解产物中也存在有阿 片肽作用的肽。 ( 4 ) 对生殖内分泌的作用 内源性阿片肽与体内阿片受体结合，影响脑内多巴胺神经元的5 羟色胺释 放及下丘脑的功能活动，抑制丘脑下部促性腺激素释放激素( g o n a d a t r o p i n r e l e a s i n gh o r m o n e ，g n r h ) 的分泌或释放，促进生乳素释放，影响动物的发情、 排卵和性成熟，明显降低血清促黄体素释放激素( l h ，l u t e i n i z i n gh o r m o n e ) ，对 f s h 的分泌亦有部分抑制作用。吴金节等首次报道，山羊瘤胃灌注b c m 能显著 地降低血清促黄体素释放激素( l h ，l u t e i n i z i n gh o r m o n e ) 和睾酮仃，t e s t o s t e r o n e ) 浓度，且这种效应可被阿片受体拮抗剂纳络酮阻断，说明b c m 对垂体促性腺 激素和睾酮的影响是通过阿片受体介导的。1 3 - c m 吸收后与体内阿片受体结合， 很可能抑制丘脑下部g n r h 的分泌，通过丘脑下部垂体性腺轴，影响l h 和t 分泌。6 - c m 对血清f s h 浓度无显著影响，说明f s h 分泌除受g r h 调控外，很 可能还受其他因素的调节【1 5 】【1 6 】【切。 动物的生殖过程是一个高度受调控的过程，丘脑下部垂体性腺轴为其调 节核心。在雄性动物，g n r h 调节垂体l h 和f s h 的合成与分泌，f s h 促进生精 上皮细胞发育和精子的形成，l h 可刺激睾丸间质细胞合成和分泌t ，而血中t 反过束抑制g _ i l r h 和l h 的分泌。机体正是通过这种相互促进、相互抑制的复杂 关系，维持其正常的生殖活动。章孝荣【1 8 】试验结果表明，在无睾酮负反馈调节 作用下，瘤胃灌注b c m 溶液，能显著降低血清l h 浓度，且这种效应可被阿片 受体拮抗剂纳络酮阻断。从而进一步证实，b - c m 被胃肠道吸收后，与中枢阿 片受体结合，抑制g n r h 和l h 的分泌，影响动物的生殖活动。 ( 5 ) 对采食的影响 阿片肽具有促进采食的作用，酪啡肽也同样具有这样的作用。一般来说阿 片受体激动剂可以加强采食，而拮抗剂则相反。纳洛酮可使动物摄食选择能力 变化。但也有只粮中酪蛋白增加，摄食量减少的报道。p o r e t s c h e l 认为b c m 与 肠道肌层神经丛阿片受体结合后，经神经传导作用于摄食中枢影响摄食。但这 第6 页共6 9 页 西华大学硕士学位论文 可能仅是原因之一。酪啡肽对摄食的影响可能与酪啡肽对胰岛素、生长激素分 泌及胃肠运动的影响密切相关。张源淑【1 9 l 试验发现，随着食糜中阿片肽活性物 质古量的增加，粗料采食量增加7 9 9 ( p 0 0 5 ) ，机理研究认为阿片肽活性物质 可能通过影响胃肠道运动和循环血液中胰岛素水平来改变采食量。 ( 6 ) 其它作用 小鼠脑室内注射高剂量b 一酪啡肽5 可导致健忘症，而低剂量的注射可改善 由东莨胆碱引起的健忘症【2 0 】。b 一酪啡肽在b 酪蛋白酶解过程中形成并迅速被运 输入血液循环，这些物质与机体内各组织细胞中的一和d - 阿片类受体相互结合， 调节机体各系统成熟和性别形成。还有实验证明，每日系统饲喂1m g - k 9 1 8 酪啡肽一7 给1 0 2 3 日龄的白化变种大鼠，会产生抗焦虑作用，雌性大鼠和雄性 大鼠相比这种作用更加明显。显而易见，随着研究的不断深入，还会发现b 酪啡肽等外源性阿片肽的其它生理功能，目前对其生理功能及其意义的认识还 不是很清楚，尚待进一步研究。 乳源性8 酪啡肽，由于其分子量较小，在小肠内可以以完整肽段的形式被 机体吸收、不会引起机体的免疫排斥反应，加之其生理功能强、用量少的独特 优势，已越来越多地引起人们的重视。添喂活性肽8 c m 7 能不同程度地调整和 改善早期断乳应激引起的内分泌水平的改变和免疫器官的发育。乳源性b 酪啡 肽富有p r o f i t , 抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用，同时由于含有脂肪或芳香环侧 链的氨基酸残基，在一定程度上能抵抗微生物的作用。由于乳源性b 酪啡肽是 以无活性的形式隐藏在b 酪蛋白氨基酸序列中，必须通过适当酶解。在一定条 件下才能释放出来。因此最大程度地提取出酪蛋白中的b 酪啡肽是开发和利用 的关键。 1 2 酪啡肽的制备方法 1 2 1 酶解法制备酪啡肽 1 2 1 1 水解酪蛋白的常用酶类 利用酶解的方法可以得到大量短肽，成本也比化学方法低。另外，所用的 基质、反应剂及反应条件亦多无害。然而酶解所得的短肽在结构上具有不确定 性。常用的蛋白酶及其特性如表1 3 所示。 第7 页共6 9 页 西华大学硕士学位论文 表1 - 3 常用蛋白酶及其特性表 t a b l e l - 3p r o t e i n a s ea n dt h e i rs p e c i a l i t y 术，置白酶术瓜 ，v 76 0 , - , 7 5 专一性较克水解多肚、鞋肢及胎 ! 堡羹壁堡蔓萎璧垡堡曼墅笪壁 2 0 7 9地友芽阳 1 0 i i 4 0 , , 5 0 主要断裂蘸水氨基酸的c 端 碱性置白酶 杆茁 用于肽链断裂的蛋白水解酶或称蛋白酶( p r o t e i n a s e ，p r o t e a s e ) 已有十多 种，并且不断有新的蛋白酶发现并投入使用。最常用的蛋白水解酶有：动物蛋 白酶如胰蛋白酶( t r y p s i n ) ，胰凝乳蛋白酶( 糜蛋白酶) ( c h y m o t r y p s i n ) ，弹性 蛋白酶( e l a s t a s e ) 、胃蛋白酶( p e p s i n ) ；植物蛋白酶如木瓜蛋白酶( p a p a i n ) 、 无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶；以及蛋白酶- k 、细菌胶原酶、地农形芽孢杆菌碱 性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶( t h e r m o l y s i n ) 、枯草杆菌蛋白酶( s u b t i l i s i n ) 、放线 菌酶等，有报道说微生物酶具有更高的选择性，但单利用微生物酵解制取活性 肽还没见报道。 酶的选择性要求酶的专一性强，并且不会随着水解度的提高出现苦味。针 对不同底物，选用不同的混合酶。通常选择胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物， 因为胰蛋白酶能专一性的与赖氨酸或精氨酸残基结合，而胰凝乳蛋白酶仅能水 解酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸残基的肽键。在对酪啡肽水解制备的研究中，尤 以胃蛋白酶等动物消化蛋白酶最为常见，并且每一种酶都有自己的专一切割位 点。m a u b o i s 和k o n i l 【2 1 1 讨论了牛奶蛋白来源肽的酶学修正，由于在酶接合底 物的结合位点会有相对单一的结构改变，所以丝氨酸蛋白酶，诸如胰蛋白酶， 第8 页共6 9 页 西华大学硕士学位论文 胰凝乳蛋白酶，弹性蛋白酶的底物专一性会有所不同。 ( 1 ) 胰蛋白酶瞄2 i ( t r y p s i n ) 胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶家族，由2 2 3 个氨基酸组成，丝氨酸家族包 括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、纤溶酶、组织纤溶酶 原激活剂等。头三种蛋白酶为消化酶，在胰腺中合成，并以非活性的酶原形式 分泌到消化道中，在消化道中酶原通过除去部分肽链转变成活性酶形式。 胰蛋白酶原( t r y p s i n o g e n ) 是由胰腺细胞分泌的，进入小肠后，在有c a 2 + 的环境中受到肠激酶( i n t e r o k i n a s e ) 的激活，l y s 6 1 i e 7 之间的肽键被打断，从 氨基端水解下一个酸性6 肽，使构象发生变化，形成胰蛋白酶的活性部位 ( h i s 5 7 ，a s p l 0 2 ，s e r l 9 5 ) ，由酶原转变成有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶不仅可 以激活胰蛋白酶原，而且还可以激活胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶原及羧肽酶 原。因此被肠激酶激活形成的胰蛋白酶是所有的胰脏蛋白酶原的共同激活剂， 在它的控制下，可以使所有的胰蛋白酶同时起作用。 胰蛋白酶是最常用的蛋白水解酶，专一性强，只断裂碱性氨基酸即赖氨酸 或精氨酸残基的羧肽参与形成肽键。用它断裂多肽得到的是以a r g 和l y s 为 c 末端的肽段。产生肽断数目一般等于多肽链中a r g 和l y s 总数加1 。 胰蛋白酶的活性部位由h i s 5 7 、a s p l 0 2 以及s e r l 9 5 组成，通过链的回转，这 三个有催化作用的侧链在分子表面的凹陷处被带到一起形成