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上海海洋人学硕士学位论文 食品中过敏原成分检测方法的建立 摘要 食物过敏是人们对食品产生的一种不良反应，属机体对外源物质产生的一种 变态反应，目前，国际公认的主要八大类过敏食品为：大豆、麦类、鸡蛋、甲壳 类、奶类、芹菜、花生、坚果。本研究针对常见的大豆、荞麦、羽扇豆三种过敏 原食物进行了研究，建立了常规及实时荧光p c r 来检测食品中三种物质的成分， 结果表明，该方法对被检物种具有良好的特异性，并对该方法进行了评价。主要 研究结果如下： 1 、对于大豆的常规p c r 检测结果在重量百分比水平上，引物l e c t i n f r 及 p 3 4 f r 的检测灵敏度为1 0 m g k g 大豆粉( 洲) ；在d n a 浓度的水平上，通 过两对引物进行检测，灵敏度检测中均可达到0 0 0 1 n g i _ t l 。在四种试剂的平行 p c r 扩增试验中g ot a qf l e x id n ap o l y m e r a s e ( p r o m e g a ) 较其他三种试剂具有 较高的灵敏度。 实时荧光p c r 灵敏度检测过程中使用引物l e c i t i n f r 和探针l e c t i n p 在核酸 浓度梯度稀释与重量比浓度梯度稀释中分别为1 0 - 3 n g g l 和1 0 0 m g k g ，而使用 大豆引物p 3 4 f r 和探针p 3 4 p 在核酸浓度梯度稀释与重量比浓度梯度稀释的检 测下限达到了l o 3 n 虬和1 0 m g k g 。 2 、食品中荞麦成分的检测中，使用g ot a qf l e x id n ap o l y m e r a s e ( p r o m e g a ) 进行实验常规p c r 检测，在重量比及d n a 浓度上可以检测出0 0 1m g k g 的荞 麦粉( w w ) ，小麦d n a 中的1 0 6 n 儿的荞麦d n a 。对于实时荧光p c r 方法 在灵敏度的检测中，荞麦在小麦中o 1 m g k g ( w w ) 的含量即可被检出，d n a 浓度的灵敏度测定，结果显示检测底线为1 0 5 n 儿。 3 在羽扇豆的检测中，通过常规p c r 方法检测的灵敏度为：使用g ot a qf l e x i d n a p o l y m e r a s e ( p r o m e g a ) 检测，重量比水平的最低检测下限为1m g k g ，d n a 浓度水平的最低检测下限为0 0 0 1n g , l 。实时荧光p c r 的检测灵敏度为：重量 比和d n a 浓度的最低检测限分别为lm g k g 和1 0 4 n 儿 4 酪蛋白是牛奶中主要的蛋白成分，也是食品中常见的致敏成分，由其诱发 的过敏现象多发于儿童阶段。本实验的目的在于建立并评价酪蛋白酶联免疫 ( e l i s a ) 检测方法。本课题组选用了e l i s a s y s t e m s 酪蛋白残留试剂盒进行研究。 结果显示，此试剂盒对食品中的酪蛋白成分特异，与其他几种过敏食品均无交叉 反应。试剂盒体现了较高的精密度( c v 5 ) 和准确度。定性检测限小于1 5 6 2 上海海洋大学硕+ 学位论文 m g l ，定量范围为0 2 4 4 1 9 2 6 m g l 。在热n - r 过程中，由于蛋白质变性导致抗 原表位发生变化不能被抗体识别从而减弱了对酪蛋白成分的识别能力。实验表 明，使用e l i s as y s t e m s 酪蛋白残留检测试剂盒通过e l i s a 方法检测食品中的 酪蛋白成分可以得到可靠稳定的结果。 关键词：过敏原，检测方法，大豆，荞麦，羽扇豆，酪蛋白 上海海洋入学硕士学位论文 t h em e t h o do fd e t e c t i n ga l l e r g e ni nc o m m o nf o o d a bs t r a c t t h ef o o dp r o t e i nt r i g g e r i n gt h ea l l e r g i cr e s p o n s ei st e r m e daf o o da l l e r g e n t h e m o s tc o m m o nf o o da l l e r g i e si na d u l t sa r es h e l l f i s h , p e a n u t s ，n u t s ，m i l kc e l e r y , s o y b e a r t , w h e a ta n de g g s t h ea i mo ft h ep r e s e n tw o r kw a st od e v e l o pa n de v a l u a t ea m e t h o dt od e t e c t i n gt h et r a c eo fs o y b e a r t , b u c k w h e a t ，a n dl u p i n et h r o u g hr e s e a r c h i n g t h ea l l e r g e no ft h e m t h em e t h o do fc o n v e n t i o n a lp c ra n dr e a l - t i m ep c rw a s e s t a b l i s h e dw h i c hs h o w ss p e c i f i c i t ) rt ot h ea l l e r g e na n dn e g a t i v ec r o s s r e a c t i v i t yw i m s o m ea l l e r g e n i cf o o d t h ee v a l u a t i o nr e s u l t sa r ea sl i s t e da sf o l l o w e d ： 1 t h ed e t e c t i o na b i l i t yo fc o n v e n t i o n a lp c ro fw e i g h tr a t i o nb yu s i n gs o y b e a n p r e m i e rl e c t i n - f ra n dp 3 4 - f ri s 10 m g k g ，t h ed e t e c t i o na b i l i t yo fn u c l e a ra c i d c o n c e n t r a t i o nb yu s i n gs o y b e a np r i m e rl e c t i n f ra n dp 3 4 一f ri so 0 01n g p l t h e r e a g e n to fg ot a qf l e x id n ap o l y r n e r a s e ( p r o m e g a ) u s e df o ra m p l i f i c a t i o ns h o w s h i g hs e n s i t i v i t yc o m p a r i n gw i lt h eo t h e r3r e a g e n t s t h ed e t e c t i o na b i l i t yo fr e a l - t i m ep c ro fw e i g h tr a t i o nb yu s i n gs o y b e a r l p r e m i e rl e c t i n f 瓜a n dp r o b el e c t i n - po fn u c l e a ra c i dc o n c e n t r a t i o na n dw e i g h t r a t i o ni s10 3 n 肛la n dlo o m g k gr e s p e c t i v e l y , w h i l et h ed e t e c t i o na b i l i t yo f r e a l t i m ep c ro fw e i g h tr a t i o nb yu s i n gs o y b e a np r e m i e rp 3 4 - - f ra n dp r o b ep 3 4 - p o fn u c l e a ra c i dc o n c e n t r a t i o na n dw e i g h tr a t i o ni s10 3 n g “la n d10 m g k g r e s p e c t i v e l y 2 t h es e n s i t i v i t yo fp c rm e t h o de s t a b l i s h e df o rd e t e c t i n gt h eb u c k w h e a ti nf o o d i se v a l u a t e db yt w op a r a m e t e r s t h ed e t e c t i o na b i l i t yo ft h ec o n v e n t i o n a lp c ro f n u c l e a ra c i dc o n c e n t r a t i o na n dw e i g h tr a t i o ni s 0 o1m g k g , 10 - 6 n g p lr e s p e c t i v e l y b yu s i n gg ot a qf l e x id n ap o l y m e r a s e ( p r o m e g a ) t h ed e t e c t i o na b i l i t yo ft h e r e a l - t i m ep c ro fn u c l e a ra c i dc o n c e n t r a t i o na n dw e i g h tr a t i o ni so 1m g k g , 10 - 5 n g l - i lr e s p e c t i v e l y 3 t h es e n s i t i v i t yo fp c rm e t h o de s t a b l i s h e df o rd e t e c t i n gt h el u p i ni nf o o di s e v a l u a t e db yt w op a r a m e t e r s t h ed e t e c t i o na b i l i t yo ft h ec o n v e n t i o n a lp c ro fn u c l e a r a c i dc o n c e n t r a t i o na n dw e i g h tr a t i o ni slm g k g , o 0 01n g p lr e s p e c t i v e l yb yu s i n gg o t a qf l e x id n ap o l y m e r a s e ( p r o m e g a ) t h ed e t e c t i o na b i l i t yo ft h er e a l t i m ep c ro f n u c l e a ra c i dc o n c e n t r a t i o na n dw e i g h tr a t i o ni s1m g k g ，10 4 n g lr e s p e c t i v e l y 4c a s e i nw h i c hi st h em a i nf u n c t i o n a lp r o t e i ni nm i l ki saf r e q u e n tc a u s eo ff o o d a l l e r g y , e s p e c i a l l yi nc h i l d r e n t h ea i mo ft h ep r e s e n tw o r kw a st od e v e l o pa n d 4 上海海洋大学硕士学位论文 e v a l u a t ec a s e i ne n z y m e l i k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y s ( e l i s a ) f o rt h ed e t e c t i o no f c a s e i ni nf o o d t h ec o m m e r c i a l l ya v a i l a b l ee l i s as y s t e m sc a s e i nr e s i d u ed e t e c t i n g k i tw a sc h o s ea n du s e di nt h i ss t u d y t h er e s u l tr e v e a l e dt h ek i ti ss p e c i f i ct ot h e c a s e i na n dn e g a t i v eg r o s s r e a c t i v i t yw i ms o m ea l l e r g e n i cf o o d t h ee l i s ak i t e x h i b i t e d h i g h p r e c i s i o na n d a c c u r a c y t h e d e t e r m i n e dl i m i to f d e t e c t i o n ( l o d ) ( a p p r o x i m a t e l y 0 16 m g l ) w a sl o w e rt h a nt h i sc l a i m e d b yt h e m a n u f a c t u r e r , q u a n t i f i c a t i o nr a n g ef o re l i s as y s t e m sk i tw a s0 2 4 4 - 1 9 2 6 m g l 1 1 1 e d i f f e r e n c e si na n t i b o d yr e c o g n i t i o no fh e a td e n a t u r e dp r o t e i n sc a ni m p a i rt h ed e t e c t i o n a n dp a r t i c u l a r l yt h eq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fc a s e i nd u r i n gt h eh e a tp r o c e s s i n g r e s u l t so b t a i n e di n d i c a t e dt h a tu s i n ge l i s as y s t e m sc a s e i nr e s i d u ed e t e c t i n gk i t c o u l dg e tt h es t a b l ea n dr e l i a b l er e s u l t st h r o u g ht h ee l i s am e t h o di nd e t e c t i n gc a s e i n i nf o o d s k e y w o r d s ：a l l e r g e n , d e t e c t i n gm e t h o d ，s o y b e a n ，b u c k w h e a t , l u p i n ，c a s e i n 5 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期：年月日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密口 学位论文作者签名： 日期：年月 日 指导教师签名： 同期：年月日 上海海洋人学硕士学位论文 第一部分大豆过敏原检测方法的建立 1 引言 由于大豆及其制品具有高蛋白、独特的营养及加工特性，目前在世界范围内 的需求量日益增加，现在全球有5 2 个国家和地区种植大豆 1 ，2 9 ，但大豆的致 敏性并没有得到足够的认识。 食品中大豆成分p c r 检测方法的关键步骤是对引物的设计。本研究根据已 有文献和n c b i 上已公布的大豆内源管家基因l e c t i n 基因的核酸序列，在引物的 设计上对大豆内源管家基因检测引物和探针得退火温度的一致性，g c 含量的相 似性等因素进行了充分的考虑，采用d n a m a n8 0 软件设计了大豆内源管家基 因l e c t i n 的引物。除此之外与胰蛋白酶抑制因子等其他一些大豆糖蛋白相比，大 豆抗原蛋白具有较高的热稳定性，传统的加热处理不能使其有效灭活，因而广泛 地存在于大豆制品中【2 ，3 0 1 ，目前根据大豆过敏原g l y mb d3 0 k 蛋白设计了p 3 4 引物。本研究采用大豆l e c t i n 内源基因引物和针对大豆过敏原蛋白检测的p 3 4 引 物共同对食品中大豆成分进行检测。 1 1 大豆致敏的简述 大豆为豆科大豆属一年生草本植物，原产我国，是一种其种子含有丰富蛋白 质的豆科植物。根据大豆的种皮颜色和粒形分为五类：黄大豆、青大豆、黑大豆 等。世界各国栽培的大豆都是直接或间接由我国传播出去的。大豆发酵制品，包 括豆豉、豆汁、黄酱及各种腐乳等，都是用大豆或大豆制品接种霉菌发酵后制成 的。用大豆制作的食物种类繁多，可用来制作主食、糕点、小吃等。将大豆磨成 粉，与米粉掺合后可制作团子及糕饼，也可作为加工各种豆制品的原料，如豆浆、 豆腐皮、腐竹、豆干、百叶、豆芽等。大豆是人类摄入蛋白质的主要来源之一， 自十九世纪6 0 年代以来，各种新型大豆不断被开发，如大豆粉、大豆薄片、大 豆粗粉、大豆蛋白浓缩物和大豆提取蛋白等。由于其丰富的营养特性和功能属性 ( 如水和脂肪吸收、乳化作用、发泡作用、凝胶作用、凝固作用) 被广泛应用于 配方食物、肉类和家禽类产品、面包点心、乳制品和各种可食用产品 1 。大豆 同样可应用于化妆品行业、医药行业和工业。然而，限制大豆应用发展的主要问 题之一就是致敏蛋白的存在。有9 0 的食物过敏情况都是由八大食品造成的，而 o 上海海洋人学硕十学位论文 大豆就是其中之- - 2 ，3 。 1 1 1 大豆的致敏特点 食物过敏是人们对食品产生的一种不良反应，属机体对外源物质产生的一种 变态反应，这种外源物质就是过敏原。过敏症状的主要表现包括呼吸系统、胃肠 道系统、中枢神经系统、皮肤、肌肉等不同形式的临床症状。据估计，全世界人 口将近有0 5 对大豆过敏，大豆过敏的临床表现形式与其它食物过敏症状基本 相似，主要表现为小肠结肠炎、遗传性过敏湿疹、i g e 介导全身性多系统反应。 然而据报道与花生、坚果、鱼和甲壳类的过敏反应相比，摄食大豆后有过敏致死 性的事件发生 4 】。自1 9 6 1 年，就有记录对面包、披萨和香肠中的大豆成分过敏 事件的发生 5 】。 1 1 2 过敏的免疫学发生机制 过敏反应是指机体再次接触抗原时引起的在数分钟至数小时内以出现急性 炎症为特点的反应。食品过敏原的免疫效应机制是以i g e 介导的i 型超敏反应为 主要效应，包括致敏和发敏两个阶段。参加反应的成分涉及到过敏原i g e 抗体、 肥大细胞( m a s tc e l lm e ) 、嗜碱性粒细胞( b a s o p h i l ，b a s ) 和i g e 的f c 受体( f e r ) 。 主要由i g e 抗体介导，以肥大细胞( m a s tc e l l ，m c ) 和嗜碱性粒细胞( b a s o p h i l ，b a s ) 为关键的效应细胞，它们释放的生物活性物质如组胺、激态原酶、趋化因子、细 胞因子、白三烯等是引起各种临床病症的分子基础。当过敏原通过呼吸、消化道、 注射等途径进入机体，抗原物质选择性激活c d 。h i ，2 细胞，诱发其分泌细胞 因子i l 一4 和i l 一3 ，在t h 2 细胞释放的i l 4 和i l 一3 以及t h l 细胞产生的 i f n 一丫和i l 一2 ( 起拮抗作用) 协调作用下诱导下产生i 卵抗体。i g e 的产生依 赖于t 细胞的复杂调节机制活化特定的b 细胞克隆。诱导抗体的类型转换。研 究认为c d 8 + t 细胞可能也影响i g e 的生成及过敏反应。一定量的过敏原可诱导 易感个体产生足够量的i g e ，i g e 通过血液循环分布全身，并与m e 、b a s 膜表面 特定的受体结合，从而使机体处于致敏状态 6 ，7 】。 1 1 3 大豆过敏原的识别 大豆种子中接近9 0 都是盐溶性球蛋白，其余均是水溶性的白蛋白。大豆蛋 白的超速离心分析研究显示了斯韦德贝里系数大约为2 s 、7 s 、1 1 s 、1 5 s 的4 个 组分 8 ，9 ，这些组分为不具同源性的混合蛋白质并从不同程度上均被研究定性 ( 图1 ) 。 l o 上海海洋大学硕士学化论文 碳承化合物 矿物质5 图卜1 ：大豆的一般成分 f i g l 一】t h e c o m p o s i t i o no f s o y b e a m 质，3 5 2 s ( 胰蛋白酶抑制荆、2s 白蛋白) 7 s ( 0 伴大显球蛋白、 植物凝集素、a 一淀粉酶、脱氧台酶、 细胞色素c ) l l s ( 人豆球蛋白) l5 s ( 蚩白寨台物) 目前通过抗原识别技术，大豆的抗原蛋白成分先后被识别和定性，。加拿大 学者l a m i al h o e i n e 1 0 对目前大豆抗原的识别鉴定结果进行了系统的总结( 表 1 ) ，并详细描述了主要抗原蛋白的分子结构、理化特点和生物学特性等。 表卜l ：大豆过敏原及相关性质： t a b2 4 ：t h ec h a r a c t e ro f s o y b e a n a l l e r g e n i g e 一结台蛋白过敏原命名分子量 族参考 疏水蛋白 来知 抑制蛋白 g l ym1 ( i u i s ) g l y l0 1 0 1 g l ym 10 1 0 2 g l y 2 ( i u i s ) g l y 3f i u i s ) g l y 4 ( i u i s ) p 3 4 g 】ymb d3 0 k 未知犬冬氨酸一连接糖蛋白g l ym b d2 8 k b 伴大豆球蛋白来命名 大豆球蛋向 未命名 2 s 白蚩白未命名 植物凝集素( 凝集素)未命名 脱氧台酶未命名 k u n i t z 胰蛋白酶抑制剂术命名 脂质转运蛋白g o n z a l e z 等人 75 k i ) a 70 k d a 8 0k d a 储存蛋白 c o d i n a 等人 1 4k d a 抑制蛋白 r lh s 等人 1 66k d a致病k l e i n e t e b b e 等人 相关蚩白p r 1 0n e u d e c k e r 等人 1 4 0 1 7 0k i ) a 3 2 03 6 0k 1 ) a 1 2k i ) a 1 2 0k 1 ) a 1 0 2k d a 2 1k d a 蚩白酶 知 储存蛋白 储存蛋白 酵溶蚩白 植物凝集素 酶 蛋白酶抑制剂 u i t t a 等人 o g a w a 等人 t s u j i 等人 o g a w a 等人 z e e c e 等人 f l e l m 等人 g u 等人 f u 等人 b a u r 等人 b a u r 等人 如i r c 等人 上海海洋大学硕十学位论文 i u i s * ：国际免疫学会联合会官方免疫命名 i u i s 木：i n t e r n a t i o n a lu n i o no f i m m u n o l o g i c a ls o c i e t i e s 1 2 大豆过敏原蛋白的检测研究现状 近年来，随着食品安全问题的日益突出，食品过敏原的识别和检测技术得到 了长足的发展。除经典的免疫印迹、酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 、免疫组织化学 技术等免疫学技术外，p c r 技术、蛋白质组鉴定技术、表面等离子体共振技术 和侧流装置在食品抗原检测和识别中也得到了一定的应用。但针对不同抗原物 质，检测方法的选择也有所不同。大豆抗原蛋白的识别、检测方法主要有以下几 种。 1 2 1 免疫印迹法免疫印迹( i m m u n o b l o t t i n g ) 又称蛋白质印迹( w e s t e r nb l o t t i n g ) ，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效 方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫生化技 术。由于免疫印迹具有聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s - - p a g e ) 的高分辨力和固相免疫 测定的高特异性和敏感性，因此可用于抗原的定性和半定量检测【1 1 】。 1 2 2 免疫组织化学技术 利用免疫组织化学技术并结合图像分析系统，可直接对食品或饲料混合物中 的目的抗原蛋白进行直接的定位和定量。鲍男【1 2 等成功利用该技术对仔猪小肠 壁中的大豆球蛋白和b 伴大豆球蛋白进行了定位和定量分析。但较长的分析时 间和较高的设备投入限制了该技术的推广和应用。 1 2 3 酶联免疫吸附试验( e l i s a ) e l i s a 是一种经典的免疫学检测技术，其中夹心e l i s a 和竞争e l i s a 是食 品工业及动物营养学研究中用于抗原定量检测的主要方法，已广泛应用于大豆球 蛋白、b 伴大豆球蛋白等大豆中主要抗原物质的检n i l 1 3 。m e i s e l z 1 4 对大豆球 蛋白酸性肽链的测定结果表明，其检测下限几乎可以达到纳克水平。用于e l i s a 的特异性抗体一般可通过激发鼠、兔、羊等实验动物的过敏反应而获得，但不同 动物种属或个体对致敏程序的反应存在差异，因此实验动物的选择和致敏程序的 制定十分关键。另外，由于大豆是动物日粮的主要蛋白源，因此致敏后难以获得 高效价的抗体，选用未食用过大豆蛋白的实验动物可在一定程度上克服这一问题 1 2 上海海洋大学硕士学位论文 1 5 】。鉴于e l i s a 技术具有精度高、易操作且适于批量检测的特点，目前已有几 种商业试剂盒在推广使用，该技术也己成为生产和研究领域的首选抗原检测方法 1 6 】，然而，食品基质、食品加工免疫原对此方法产生了一定的影响，也存在着 缺陷。现在研究出了一种标新立异e l i s a 技术：通过电镜对食品中大豆蛋白质 进行免疫定位，这项技术通过免疫组织化学联合图像分析使定性及定量食品基质 中的大豆蛋白质的具有实际操作意义，这个过程通过组织学直接分析了食品中大 豆成分的存在与否，但此项技术的主要缺点是分析时间较长和设备的高成本。 1 2 4p c r 技术 1 2 4 1 常规p c r 一对能与目的d n a 分子互补的寡聚核苷酸作为引物，并能被d n a 聚合酶 相向延伸，那么被该引物结合的模板区就可通过变性、退火和聚合的循环来大量 扩增，这一过程被称为聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n , p c r ) ，其 特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，三个步骤具体为：l 模板d n a 的变性，模板d n a 经加热至9 4 c 左右一定时间后，使模板d n a 双链或经p c r 扩增形成的双链d n a 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作 准备；2 模板d n a 与引物的退火( 复性) ：模板d n a 经加热变性成单链后，温 度降至5 4 6 0 。c 左右，引物与模板d n a 单链的互补序列配对结合；3 引物的延 伸：d n a 模板一引物结合物在t a q d n a 聚合酶的作用下，以d n t p 为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板d n a 链互 补的半保留复制链并重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的半保留 复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2 - - 4 分钟， 2 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍，从而达到检测的目的。 1 2 4 2 实时荧光p c r 实时荧光定量p c r 技术于19 9 6 年由美 雪a p p l i e db i o s y s t e v n s 公司首次推出，由 于该技术不仅实现了p c r 从定性到定量的飞跃，而且采用完全闭管检测，不需 p c r 后处理，避免了交叉污染。从检测开始到定量结束，整个过程可全部自动化、 而且耗时短、操作方便。这种方法采用一个双标记荧光探针来检测p c r 产物的积 累，可以非常精确、重复地定量基因拷贝数，比传统的定量方法劳动强度小、易 于标准化和推广应用 1 7 】。 实时荧光p c r 关键就是使用了荧光探针及其相应的荧光信号检测装置。所用 荧光探针种类很多，实现的途径也不完全相同，但基本原理都是根据荧光共振能 量转移现象( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r , f r e t ) 设计的。当一个荧光分子 ( 又称为供体分子) 的荧光光谱与另一个荧光分子( 3 z 称为受体分子) 的激发光谱相 重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，这种现象即是f r e t 。f r e t 现象发 生程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7 1 0n i n 时即可发生f r e t ； 上海海洋大学硕十学位论文 随着距离延长，f r e t 呈1 0 6 显著减弱。f r e t 现象已广泛应用于核酸分子检测、 生物大分子内和分子间相互作用等生物学研究 1 8 】。 实时荧光定量p c r 所用荧光探针主要有三种：t a q m a n 荧光探针、杂交探针 和分子信标探针三种，其q h t a q m a n 荧光探针使用最为广泛，本研究主要应用的 也是t a q m a n 荧光探针。 t a q m a n 探针根据其3 端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的 t a q m a n 探针和t a q m a nm g b 探针。m g b 探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团 ( n o n f l u o r e s c e n tq u e n c h e r ) ，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。 同时探针上还连接有m g b ( m i n o rg r o o v eb i n d e r ) 修饰基团，可以将探针的t m 值 提高l o o c 左右。因此为了获得同样的t m 值，m g b 探针可以比普通t a q m a n 探针设 计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板 的d n a 碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明， t a q m a nm g b 探针对于富含a 厂r 的模板可以区分得更为理想 1 9 】。 t a q m a n 技术是在普通p c r 原有的一对特异性引构基础上，增加了一条特异 性的荧光双标记探针。t a q m a n 探针是一段5 端标记报告荧光基团，3 端标记 淬灭荧光基团的寡核苷酸。报告荧光基团( 如f a m ) 共价结合到寡核苷酸的5 端，t e t 、v i c 、j o e 及h e x 也常用作报告荧光基团。所有这些报告荧光基通常 都被位于3 端的t a m r a 所淬灭 2 0 。t a q m a n 探针的纯度在很大程度上决定了检 测结果的真实性和可靠性。这是因为探针的纯度直接影响探针荧光本底的高低， 任何标记报告基团而无淬灭基团的分子都是污染源，未淬灭的报告荧光使探针的 荧光本底增高，导致难以辨认出个探针裂解而产生的报告荧光的变化。同时，由 于探针标记不完全，即只标记了报告荧光素或只标记了淬灭荧光素或二者均未标 记上，这样，即使荧光探针与扩增产物结合，也不能检测到荧光信号的增长，很 容易降低检测灵敏度、甚至造成假阴性。另外，镁离子浓度的高低也直接影响了 检测的灵敏度 2 1 。 当探针完整时，由于报告基团与淬灭基团在位置上很接近，导致其报告荧光 的发射受到抑s u ( 图1 1 a ) 。当p c r 反应进行到延伸阶段时，t a q 酶在引物的引导下， 以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链( 图1 1 - b ) ；当 链延伸进行到探针结合部位时，t a qd n a 聚合酶的5 一3 外切活性将t a q m a n 探针水解成单核苷酸，报告荧光基团和淬灭荧光基团由于探针水解而相互分开。 与此同时标记在探针上的报告基团游离出来( 图1 1 c ) ，随后t a q 酶的5 一3 聚 合酶活性使新链继续延伸，聚合结束合成完整的新链( 图1 1 d ) 。t a q m a n 探针的3 端则经过化学修饰，以防止其在p c r 过程中被延伸。探针与产物的结合发生于 p c r 的每一循环，但并不影啪j p c r 产物的指数积累。报告荧光基因与淬灭荧光基 团的分离导致报告荧光信号的增加，而荧光信号的增加可被系统检测到，它是模 板被p c r 扩增的直接标志 2 2 。 1 4 上海海洋大学硕十学位论文 t a q m a n 探针水解有两个前提：第一，引物和探针都必须与模板结合( 杂交) ； 第二，与探针特异结合的d n a 模板得到扩增。基于这两点要求，即使发生非特 异性扩增，也不会影响检测结果。 一- - - 爹3 3p一3；- - 手 蔓：e 塑! ! 丝亟幽，q = 淬灭寥光三里或? ， 一 = = j 反向弓l 物 。 聚 图1 2t a q m a n 荧光探针工作原理 f i g 1 2w o r k i n gp r i n c i p l eo f t a q m a np r o b e 如上所述，p c 砌挂行一个循环，合成了n 条新链的同时，就水解了n 条探针， 亦释放了相应数量的荧光基因。仪器所接收到荧光信号的强度与p c r 反应产物的 量呈对应关系。随着p c r 反应的循环往复，p c r 产物呈指数形式增长，荧光信号 也相应增长。如果以每介p c r 循环结束时所测得的荧光值为纵坐标，以p c r 循 环数为横坐标作图，即可得到一条连接每一个循环后荧光值的曲线称为扩增 曲线。 粤 米 粼 g 1 5 上海海洋大学硕七学位论文 图1 3 实时荧光p c r 扩增曲线 f i g 1 3t h ea m p l i f i c a t i o nc u r v eo fr e a l t i m ep c r 图1 3 中的c t 值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循 环数。c 代表循环( c y c l e ) ，t 代表阈值( t h r e s h o l d ) ，在荧光定量p c r 技术中，c t 值是个很重要的概念。p c r 反应的前1 5 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧 光阈值的默认设置是3 一1 5 个循环的荧光信号的标准偏差的1 0 倍。 每个模板的c t 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越 多，c t 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。因此，只要获得 未知样品的c t 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 2 3 】。 p c r 方法是分子生物学领域的一种常规技术。2 0 世纪9 0 年代以来p c r 技术被 广泛用于食品中微量大豆 2 4 、榛子 2 5 ，2 6 、花生 2 7 】等抗原成分的检测。研究 证实p c r 法具有准确、敏感和特异性强的特点，可准确识别蛋白质的抗原部分 【2 8 】。 1 3 本课题的意义和目的 近年来食品安全问题受到人们的广泛关注，食品过敏也已成为一个新兴的公 众性健康问题，特别是在发达国家，一些国家政府先后通过严格的科学调查和立 法论证，相继修改和出台规范食品中过敏原标示的法律法案，对食品标签上的过 敏成分的标注作出严格的规定。 1 9 9 9 年国际食品法典委员会第2 3 次会议公布了常见过敏食品的清单，包括8 种常见和1 6 0 种较不常见的过敏食品，8 种食品和成分的清单有：大豆、花生及其 制品；甲壳类及其制品；蛋和蛋制品；鱼和鱼制品；含有谷蛋白的谷物或其杂交 系及其制品；奶和乳制品；坚果和坚果制品；以及含亚硫酸盐浓度耋1 0 m g k g 的 食品。美国2 0 0 4 年发布的食品过敏原标签法规食品过敏原标签及消费者保护法 要求，食品标签必须清楚写明食品成分是否含有任何源自含有牛乳，鸡蛋，虾蟹 等甲壳类动物，小麦，坚果，大豆，花生，鱼等8 种主要过敏食品的蛋白质，对 于未声明过敏原的进口食品，美国f d a 将扣留或退亏这些食品。欧盟对致敏食品 的标示要求除了上述8 类过敏原外，还包括芹菜，荠菜，芝麻和二氧化硫或亚硫 酸盐。此外，日本，澳大利亚，新西兰，加拿大等国家也先后出台了相关法规。 由此可见，各国正在越来越重视对食品过敏原的标识要求，随着人类对自身安全 意识的增强，严格对过敏原的标识规定已成为食品业的一个重要发展趋势。 目前我国质检系统还没有相应标准对进出口食品中的过敏原进行检测，这不 仅在一定程度上制约着我国进出口贸易的发展，更是给消费者健康带来了隐患， 因此质检系统非常迫切需要对进出口食品开展过敏原的检测研究工作。 1 6 上海海洋大学硕士学位论文 2 1 材料 2 材料与方法 供试样品：大豆、黑豆、青大豆、白芸豆、红豆、绿豆、燕麦、大麦、小麦、 花芸豆、番茄、土豆、玉米、油菜籽、扁豆、长四季豆、短四季豆、豌豆、蚕豆、 棉花、鹰嘴豆、大米、鸡肉、鸭肉、羊肉、猪肉、驴肉、三文鱼，均购自于上 海市场。 2 2 试剂 所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或相应的去 离子水。 2 2 17 0 乙醇： 2 2 2双蒸水 2 2 3 液氮； 2 2 4 异丙醇； 2 2 5 氯仿； 2 2 6d n t p 含1 0m m o l ld a t p 、d u t p 、d c t p 、d g t p ； 2 2 。7 引物 表2 1 大豆的引物序列 t a b l e2 1t h es e q u e n c eo fs o y b e a np r e m i e r 上海海洋大学硕士学位论文 2 2 8溴化乙锭1 0m g m l ； 2 2 9d n a 分子量标记1 0 0 ，2 5 0 ，5 0 0 ，7 5 0 ，1 0 0 0 ，2 0 0 0b p ； 2 2 1 0 琼脂糖； 2 2 115 0 x t a e 缓冲液 2 2 1 2t e ( 1 0 m m o l 1t r i s h e lp h 8 0 ，1 0 m m o l 1e d t a ) 2 2 1 31 0 x 上样缓冲液( 含0 2 5 溴酚蓝，0 2 5 - 甲苯青f f ，3 0 甘油水 溶液) 2 2 1 4 实时荧光p c r 反应试剂：a b it a q m a nu n i v e r s a lp c rm a s t e rm i x ( p a r tn u m b e r4 3 0 4 4 37 ) 2 2 1 5 常规p c r 反应试剂： 2 2 16g o t a q f l e x id n ap o l y m e r a s e ( p r o m e g a ，c a t n o m 8 2 91 ) ，d n t p m i x ( p r o m e g a ，c a t n o u 1 5 1 5 ) ， 2 2 17f a s t s t a r tt a qd n ap o l y m e r a s e ( r o c h e ，c a t n o 12 0 3 2 9 5 3 0 0 ) ，p c r n u c l e o t i d em i x ( r o c h e ，c a t n o 1 1 5 8 1 2 9 5 0 0 1 ) ， 2 2 1 8p r e m i xt a q ( t a k a r a ，c o d e ：d r r 0 0 3 a ) ， 2 2 1910 r e a c t i o nb u f f e r ( p r o m e g a ，l o t n o r p 0 4 0 2 7la ) ，t a qd n a p o l y m e r a s e ( p r o m e g a ，l o t n o r p 0 4 0