（食品科学专业论文）果糖基转移酶及过氧化氢酶的固定化.pdf

摘要 摘要 果糖基转移酶及过氧化氢酶的固定化 学科：工科专业：食品科学 硕士研究生姓名：马玉红 指导教师：江波教授 本文主要研究了果糖基转移酶及过氧化氢酶的固定化，并在此基础上分别对 两种固定化酶的酶学性质进行了研究。 从1 8 种离子交换树脂和吸附树脂中，筛选出固定化效果较好的大孔弱碱性苯 乙烯系阴离子交换树脂d 3 8 0 为载体、以戊二醛为交联剂，采用先吸附后交联的方 法对果糖基转移酶的固定化进行分析，并对固定化条件进行了优化，结果表明， 最佳固定化条件为：加酶量为2 0 0 u g 树脂，吸附p h 值为6 0 ，吸附时间为6 h ，吸附 温度为3 0 ，交联剂戊二醛浓度为0 0 1 ，交联时间为6 h ，交联温度为4 ，固 定化酶活回收率最高可达8 7 6 以上。 固定化果糖基转移酶的的最适温度为5 0 5 5 ，比游离酶提高了5 ；热稳 定性与游离酶基本相同；最适p h 6 0 比游离酶提高了一个单位；p h 稳定性也稍有 提高；固定化酶的k m 值为0 。6 0 离酶的大；固定化酶重复使用1 0 次后残余酶活为 1 0 左右，固定化酶和游离酶均具有较好的贮存稳定性。 以一种无载体固定化技术一交联酶聚集体技术固定化过氧化氢酶，考察了交 联剂浓度、交联时间、交联温度对固定化效果的影响。优化的固定化条件为：交 联剂戊二醛浓度为1 、交联温度为4 1 2 、交联时间为4 h ，在此条件下可达到较好 的固定化效果。 固定化过氧化氢酶的最适温度为4 0 ，与游离酶相比提高了5 ；热稳定性 比游离酶稍有提高，在2 5 - - - 3 5 范围内保温3 0 m i n 后，二者都可保留9 0 以上的 酶活；游离酶与固定化酶的最适p h 相同都为8 ；p h 稳定性也稍有提高。 在低聚果糖的生产中，大量副产物葡萄糖的产生阻遏了底物的转化，可通过 葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的协调作用，消除普通低聚果糖中的葡萄糖，因此， 果糖基转移酶与过氧化氢酶的固定化，为得到高纯度的低聚果糖奠定了一定基 础。 关键词：固定化，果糖基转移酶，树脂，过氧化氢酶，交联酶聚集体 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t k s p a p e rs t u d i e di m m o b i l i z a t i o no ft h ef r u c t o s y l t r a n s f e r a s ea n dc a t a l a s e ，a n d t h e ns t u d i e dt h ep r o p e r t i e so ft h ei m m o b i l i z e de n z y m er e s p e c t i v e l y f r u c t o s y l t r a n s f e r a s ew a si m m o b i l i z e do ne i g h t e e nk i n d so fi o n - e x c h a n g ea n d a d s o r p t i o nr e s i n s ，a m o n gt h e md 3 8 0s h o w e dt h ee x c e l l e n tr e s u l tf o ri m m o b i l i z a t i o n t h e nt h ee n z y m ew a si m m o b i l i z e dt h r o u g hc r o s s - l i n k a g eo fg l u t a r a l d e h y d e 1 1 1 e o p t i m u mc o n d i t i o n sf o r t h ei m m o b i l i z a t i o nw e r ea sf o l l o w s ：2 0 0 uo fe n z y m ep e rg w e tr e s i n , p h6 0 ，3 0 ，a n d6h o u r s ，r e s p e c t i v e l y 1 1 1 ec r o s s l i n k i n gt e m p e r a t u r ea n d t i m ew e r e4 ca n d6hr e s p e c t i v e l y ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft h ec r o s s l i n k i n ga g e n t ( g l u t a r a l d e h y d e ) w a s 0 01 t h ea c t i v i t yy i e l do fi m m o b i l i z e de n z y m ew a sa b o v e 8 7 6 t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp ho ft h ei m m o b i l i z e df r u c t o s y l t r a n s f e r a s e 、耽陀 5 0 , - - , 5 5 。c a n d6 0 ，r e s p e c t i v e l y , w h e r e a sf o rf r e ee n z y m e ，w e r e4 5 - - 。5 0 。ca n d5 0 t h e r m a la n dp hs t a b i l i t yw e r eb o mi m p r o v e db yi m m o b i l i z a t i o nc o m p a r i n gw i t ht h e f r e ee n z y m e 1 1 1 ek mv a l u ew a s0 6 0 m ( f o rs u c r o s e ) ，w h i c hw a sh i g h e rt h a nt h a t ( 0 2 9 m ) o ft h ef r e ee n z y m e t h i si n d i c a t e dt h a tt h ea f f i n i t yb e t w e e ne n z y m ea n ds u b s t r a t e d e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y al 【i n do fc a r r i e r - f r e et e c h n o l o g yw a su s e di nt h ei m m o b i l i z a t i o no fc a t a l a s e ，t h e e n z y m ew a sa g g r e g a t e df n - s tt h e nc r o s s - l i n k e db yg l u t a r a l d e h y d e 1 1 1 eo p t i m u m c o n d i t i o n sf o rt h ei m m o b i l i z a t i o nw e r ea sf o l l o w s ：t h ec o n c e n t r a t i o no ft h e c r o s s l i n k i n ga g e n t ( g l u t a r a l d e h y d e ) w a s1 ，a n dt h ec r o s s l i n k i n gt e m p e r a t u r ea n d t i m ew e r e4 ca n d4 hr e s p e c t i v e l y t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo ff r e ea n di m m o b i l i z e dc a t a l a s ew e r e4 0 。ca n d3 5 , r e s p e c t i v e l y , o p t i m u mp ha n dp hs t a b i l i t yh a d n os i g n i f i c a n tc h a n g e ，t h et h e r m a l s t a b i l i t yw a sb e t t e rt h a nt h a to ff r e ec a t l a s e h i g h p u r i t yo ff r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e sw a sp r e p a r e da f t e rg l u c o s ew a sr e m o v e d i n n o r m a lp r o d u c t sb yg l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) a n dc a t a l a s e ( c a t ) s ot h es t u d yo ft h e i m m o b i l i z a t i o no ff r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e sa n dc a t a l a s ew i l lm a k eaf o u n d a t i o nf o rt h e p r o d u c t i o n k e yw o r d s ：i m m o b i l i z a t i o n ；f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e s ；r e s i n ；c a t a l a s e ；c l e a s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 哆年g 月弓日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：弓叁茎至导师签名：主三坌兰 日期：d 7 年8 月3 日 1 引言 1 1 固定化酶 1 引言 1 1 1 固定化酶概述 固定化酶是2 0 世纪6 0 年代开始发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶 性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，称为“水不溶酶”或 “固相酶 。后来发现，也可以把酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底 物与酶被截留在超滤膜一侧，而反应物可以透过膜流出，在这种情况下，酶自身 仍是可溶的，只不过被固定在一个很有限的空间内，因此用水不溶酶和固相酶的 名称就不恰当了。因此，在1 9 7 1 年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固 定化酶”( i m m o b i l i z e de n z y m e ) 的名称i 。 自6 0 年代以来，固定化酶得到了很大的发展，其原因在于它具有很多显著 的优点：( 1 ) 同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；( 2 ) 酶经固定化 后，能和反应物分开，因此，有可能较好的控制生产过程；( 3 ) 当酶经固定化后， 它的三级结构得到稳定，再加上抗干扰因素的存在，使得酶的稳定性得到显著的 提高；( 4 ) 固定化酶应用于生产后，产物中不含有酶，因此，省去了热处理使酶 失活的步骤，这对于提高食品的质量是极为有利的；( 5 ) 固定化酶能长期使用， 并可以预测它的衰变的速度；( 6 ) 固定化酶提供了研究酶动力学的良好模型 2 1 。 i i 2 传统的酶固定化方法 传统的酶固定化方法大致可分为物理法和化学法两大类。物理方法包括吸附 法( a d o s o r p t i o n ) 、包埋法( e n t r a p m e n t ) ，化学法包括共价法( c o v a l e n t b i n d i n g ) 和交联 法( c r o s s 1 i n k i n g ) 【3 】 ( 1 ) 吸附法 吸附法是利用离子键、物理吸附等作用将酶吸附在不溶性载体上的一种固定 化方法。吸附法操作简便，条件温和，吸附剂可再生反复使用，酶活回收率高。 但也有许多不足，如酶和载体之间结合力不牢固，易导致催化活力的丧失和污染 反应产物等。因此，其应用受到一定的限制，为提高其适用性能，常常将此法与 其他方法联合使用 4 1 。 ( 2 ) 包埋法 包埋法是将酶包埋于凝胶或其他聚合体格子内，这种结构可以防止酶渗出， 但是底物能渗入格子内与酶相接触。此法的优点是适用范围广，工艺简便，许多 种酶都可用此法固定；且固定化过程中酶本身并未参与化学反应，故可得到活力 江南大学硕士学位论文 较高的固定化酶【5 】。但是，用此法制成的固定化酶，不能对大分子底物的生化反 应起催化作用。 ( 3 ) 共价结合法 共价结合法是酶蛋白分子上功能团和固相支持物表面上的反应基团之间形 成化学共价键连接，以固定酶的方法。酶和载体的共价键合有三种方式：( 1 ) 与 载体直接反应连接；( 2 ) 通过同源双功能试剂与载体连接；( 3 ) 通过异源双功能试 剂与载体连接后再与载体反应连接【5 1 。由于酶和载体间连接牢固，因此不易发生 酶脱落，有良好的稳定性及重复使用性，但因其反应条件较为剧烈，酶活损失较 大，且对反应条件有较高要求。 ( 4 ) 交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，通过酶分子和多功能试剂之 间形成共价键，得到交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定 的分子内交联。交联法的优点是酶与载体结合牢固，不易脱落，稳定性较高；缺 点是有的方法固定化操作较复杂，进行化学修饰时易造成酶失活，且交联剂一般 价格昂贵；此法很少单独使用，一般与其它方法联合使用【6 】。 传统的固定化酶由于非催化功能载体的引入( 载体部分约占整个固定化酶结 构的9 0 - - - , 9 9 9 ) ，既“稀释 了固定化酶的浓度，又影响催化反应过程中物 质的扩散，而且通常会导致酶活性的严重损失r 圳，从而在一定程度上限制了载 体固定化酶在工业中的应用。另外载体的使用也会增加固定化的成本，并且一些 载体在酶促反应过程中由于化学稳定性差而污染产品，有的甚至本身就具有一定 的毒副作用【l o 】，这些都大大增加了固定化酶的制备费用及载体的选择难度。因 此，近年来一种新的酶固定化方法一无载体固定化技术倍受到人们的关注【1 1 1 。 1 1 3 无载体固定化 无载体固定化酶技术，即不需要非活性材料作为载体，而直接利用双功能试 剂如戊二醛等对不同形式的酶制剂( 如溶解酶，晶体酶，喷雾干燥酶粉，酶物理 聚集体等) 进行交联制备固定化酶的技术。与传统载体固定化酶相比，无载体固 定化酶具有许多明显的优势【1 2 1 3 1 ：( 1 ) 在催化体系中酶被高度浓缩，催化剂比表 面积大，催化活性更高；( 2 ) 受底物扩散限制的影响减小；( 3 ) 稳定性得到更大的 提高且制备费用较低，这更有利于固定化酶应用于工业化生产。因此，c l e a s 技 术是一种很有发掘潜力的酶固定化方法【l 引。 根据交联酶前体的不同，无载体固定化酶可分为四种：交联溶解酶( c l e s ) ， 交联喷雾干燥酶( c l s d s ) ，交联酶晶体( c l e c s ) ，交联酶聚集体( c l e a s ) 。 ( 1 ) 交联溶解酶( c l e s ) 交联溶解酶是人们研究最早的一种无载体酶，是用戊二醛等交联剂直接对酶 蛋白分子进行交联而获得。但c l e s 的缺点就是机械稳定性较差，因此，自上世 2 1 引言 纪6 0 年代以后，研究学者开始研究将交联溶解酶技术与载体固定化相结合，但 效果趋于载体固定化酶u 9 j 。 ( 2 ) 交联酶晶体( c l e c s ) 交联酶晶体是近年来发展起来的新型酶晶体催化剂，是通过对酶晶体进行交 联而制备的无载体固定化酶。酶晶体经交联后，其稳定性能及酶活保持率较之交 联溶解酶都得到很大程度的提高，并且可以通过控制交联酶晶体颗粒形成的大小 而改善固定化酶的稳定性能【2 0 1 。尽管c l e c s 各方面的性能都比较优越，但至今 真正用于商业化的并不多，仅脂肪酶、蛋白酶等2 0 几种【2 1 1 。其主要原因是c l e c s 的制各需要晶体酶，这对酶的纯化程度和结晶条件要求很高，一般实验室内难以 进行研究；另外，昂贵的制备费用也在很大程度上限制了c l e c s 技术的发展。 ( 3 ) 交联酶聚集体( c l e a s ) 交联酶聚集最近几年被纳入无载体固定化酶范畴，是采用物理方法使酶分聚 集、再经交联剂交联而成的。c l e a s 方法操作简单、成本低、应用范围广，理 论上能被沉淀下来的酶或蛋白都可用这种方法制备交联酶聚集体。其制备一般分 为两步：聚集体的形成和聚集体的交联。 ( 4 ) 交联喷雾干燥酶( c l s d s ) t 1 1 】 喷雾干燥酶颗粒也可以用于制备交联酣2 2 1 ，将喷雾干燥的酶粉通过交联制备 的固定化酶，即c l s d s 。c l s d s 虽然也具有一定的活性，但由于喷雾干燥过程酶 失活严重，导致c l s d s 酶活保持率很低。因此，交联喷雾干燥酶技术很少应用于 工业化生产中。 1 2 果糖基转移酶及其固定化 1 2 1 低聚果糖与果糖基转移酶 低聚果糖( f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e s ) ，简称f o s ，又称寡果糖或蔗果三糖族低 聚糖，分子式为：g f f n , n = l - 3 ( g 为葡萄糖，f 为果糖) 。它是由蔗糖和l 3 个果糖基通过p 2 1 糖苷键与蔗糖中的果糖基结合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、 蔗果五糖及其混合物。工业上一般由蔗糖经果糖基转移酶( f r u e t o s y l t r a n s f e r a s e ， e c2 4 1 9 ，f t s ) 作用而生成低聚果糖，其酶促反应机理可用图1 1 表示【l2 3 】： g - l g 挈够挈卿掣螂音叁q 音参吗隶叁q 图1 - 1f t a s c 酶促反应机理 p 果糖基转移酶( p f r u c t o s y l t r a n s f e r a s e ，e c 2 4 1 9 ，亦称p 呋喃果糖苷酶， i b - f r u c t o f u r a n o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 6 ) ，它能够催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖，并通 过转果糖基作用形成低聚果糖。1 9 5 0 年b a c o na n de d e l m a n 2 4 】及b l a n c h a r da n d 3 江南大学硕士学位论文 a l b o n 2 5 】在研究酵母转化酶( i n v e r t a s e ) 时，分别独立地发现了该转化酶除了具有 水解作用外，还具有转移作用。蔗糖水解时产生了不等量的葡萄糖和果糖，除此 外，还生成了一些低聚糖。这些低聚糖的结构后来得到了进一步的确定，并被命 名为蔗果三糖( k e s t o s e ) 族低聚糖。1 9 5 2 年w h a l l e y 等用酵母转化酶作用于蔗糖， 首先得到蔗果三糖( k e s t o s e ) 。次年b a c o n 和b e l l 【z 6 j 用高峰淀粉酶作用于蔗糖， 产生了一系列低聚糖，从中析出异蔗果三糖( i s o k e s t o s e ) 。1 9 5 4 年g r o s s 等暖7 】 从中又析出了新蔗果三糖( n e o k c s t o s c ) 。这三种蔗果三糖及其同系物，已在龙 舌兰属( a g a v e ) 、紫苑科( a s t e r a c e a e ) 、风铃草科( c a m p a n u l a c e a e ) 和百合 目( l i l i a l e s ) 等植物中发现。到目前为止，在植物中研究的较多是菊芋( j a r u s a l e m a r t i c h o k e ) 和芦笋( a s p a r a g u s ) 块根中低聚果糖及其转移酶。从此以后，有关能 催化果糖基转移的酶的研究逐渐多了起来。 1 2 2 固定化果糖基转移酶研究进展 1 9 9 2 年，h a y a s h i 等【2 引用多孔硅石吸附a u r e o b a s i d i u ms p 的果糖基转移酶并用 戊二醛交联后装柱，可保留酶活力4 4 4 ，在3 0 。c 下用4 0 ( w v ) 蔗糖溶液以 2 0 m l h 的流速连续操作2 6 日，得到蔗果三糖1 5 1 2 9 ，产率为3 0 。1 9 9 4 年， h a y a s h i 用d e a e - 纤维素固定果糖基转移酶，酶活力可保留9 5 ，在3 0 下，用 3 0 蔗糖溶液以流速2 0 m l h 连续反应3 6 0 d 、时，低聚果糖( 蔗果三糖、蔗果四糖) 含量为1 0 5 - - - 1 2 7 m g m l ，产率为3 5 - - 一4 2 3 。 1 9 9 5 年，y u n 等【2 9 】将果糖基转移酶固定在苯乙烯衍生的多孔离子交换剂上并 填入玻璃柱内，用6 0 0 一- 7 7 0 9 1 蔗糖为底物以不同流速于5 0 。c 连续操作，连续操 作3 0 日后，初始固定化酶的活性仅丧失8 。 1 9 9 7 年，c l l i a i l g 等【3 0 】将a s p e r g i l l u sn i g e r 和a s p e r g i l l u s j a p o n i c u s 的果糖基转移 酶纯化后共价结合在甲基丙烯酰胺( m e t h a c r y l a m i d e ) 高分子颗粒上，可保留酶活 力达1 0 0 ，以5 0 的蔗糖溶液进行批式反应，低聚果糖含量可达6 1 。 用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分离纯化后的酶，随着固定化技 术的发展，也可采用含酶细胞或细胞碎片进行固定化，直接应用细胞或细胞碎 片中的酶或酶系进行催化反应。这样便省去了那些复杂、费时的酶纯化步骤。 1 9 9 0 年，y u n 等1 3 l j 用2 的海藻酸钠固定a u r e o b a s i d i u mp u l l u a n s 细胞，以6 0 的蔗糖溶液在5 5 进行反应，2 4 d , 时后低聚果糖的含量达到5 5 5 7 。6 0 批反 应( 超过1 2 0 0 d 、时后) ，产率没有降低，十分稳定。 1 9 9 6 年，江波等【3 2 j 利用固定化黑曲霉增殖细胞与固定化葡萄糖异构酶协同 作用，在5 5 。c 将5 0 的蔗糖溶液通入柱式反应器，产物中低聚果糖含量6 3 。固 定化反应柱经连续一间歇反应( 每天8 小时) ，活性保持一个月以上无显著下降。 进入9 0 年代后，对果糖基转移酶的固定化也已出现了多种方法，但这些方 法或者是过于复杂或者是f o s 产率过低，尚不能十分令人满意。树脂是工业上使 4 1 引言 用最广的材料之一，它价格低廉，机械强度好，物化性能稳定，容易再生，作为 固定化载体使用有广阔的应用前景。 1 3 过氧化氢酶及其固定化 1 3 1 过氧化氢酶简介 过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ，e c l 1 1 1 6 ) ，是一类广泛存在于动物、植物 和微生物体内的末端氧化酶，酶分子结构中含有铁卟啉环，1 个分子酶蛋白中含 有4 个铁原子【3 3 1 。过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关 键酶之一，其生物学功能是催化细胞内过氧化氢分解防止过氧化。过氧化氢酶以 过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气。因 为所有的好氧生物在进行氧代谢时均会产生有害的氧自由基，这其中就包括 h 2 0 2 ，因此，过氧化氢酶是生物抗氧化体系中的重要成员酶。 1 3 2 过氧化氢酶的应用 商品过氧化氢酶是一种高效、安全、无毒的生物催化剂，近年来过氧化氢酶 得到了广泛的应用，成为农业，以及与之相关的食品与- 孚l * 0 品业、纸浆和造纸业， 以及农业环保产业中有应用价值的酶之一，其应用主要有以下几方面：( 1 ) 在食 品工业中的应用：在牛奶保存和奶酪制造前用h 2 0 2 对牛乳和干酪原料乳进行杀 菌消毒，然后再用过氧化氢酶去除残余h 2 0 2 。另外，利用过氧化氢酶分解h 2 0 2 放出0 2 的性质，可以在焙烤食品过程中同时添加h 2 0 2 和过氧化氢酶用作疏松剂 0 4 j 。( 2 ) 在纺织工业上的应用：纺织印染行业在棉针织物漂染色工艺中。采用过 氧化氢酶生物除氧，比传统的高温水洗工艺去除残留h 2 0 2 具有节省水、电、气、 人工的优点。又大幅度降低了成本，提高了生产效率，并减少了对环境的污染 ( 3 ) 在纸浆和造纸工业中的应用：在纸浆和造纸工业上，由于传统的含氯漂白剂 与浆中残余木素反应产生氯酚类化合物等毒性污染物质，因此近年世界造纸行业 相继以h 2 0 2 漂白来代替传统漂白方法。传统上用s 0 2 和亚硫酸氢钠去除漂白后 的h 2 0 2 ，随着世界各国对环境和安全问题考虑，促进了寻找替代s 0 2 和亚硫酸 氢钠去除h 2 0 2 方法研究，有研究表明过氧化氢酶，尤其是微球菌产生的过氧化 氢酶可在1 0 m i n 内将h 2 0 2 完全降解。( 4 ) 在环保工业上的应用：过氧化氢酶可以 取代化学试剂降解生产h 2 0 2 的工厂或在生产过程中使用h 2 0 2 的工厂排除的工 业废水中所含有的h 2 0 2 。利用h 2 0 2 和过氧化氢酶处理工业废水，可以降解芳环 化合物和脂族化合物，处理生物过滤器，还可提高其对废水脱臭效果。( 5 ) 在其 它方面的应用：利用过氧化氢酶与h 2 0 2 同时使用放出氧气的机理，可用于橡胶 成型，塑料及多泡性粘合剂。用葡萄糖氧化酶除去食品中葡萄糖或氧时，生成的 h 2 0 2 用过氧化氢酶分解，h 2 0 2 分解时生成的氧有杀菌和漂白的作用。利用2 羟酸 江南大学硕士学位论文 氧化酶和过氧化氢酶生产一种除草剂，h u n 瞵酰甲基甘氨酸，它是一种广谱的 植物毒素和除草剂，可用于控制许多种植物的生长等。 1 3 3 固定化过氧化氢酶研究进展 过氧化氢酶的固定化研究国内外报道较多，主要的固定化材料包括无机金 属化合物 3 5 , 3 6 1 ( 氢氧化铝、氧化铁等) 和改性生物材料【3 ”9 】等。形成的固定化 产物有微胶囊化和膜过氧化氢酶等。s i l g i a 4 0 ，4 1 】以氢氧化铝为载体固定化过氧化 氢酶，提高了酶对热和酸碱的稳定性：刘持标 4 2 1 利用乙基纤维素作为膜材，加 入一定量的明胶后，制备了较稳定的微胶囊化过氧化氢酶。从目前研究结果看， 固定化有利于提高过氧化氢酶的稳定性，并提高其实际应用价值。但是目前研究 所用的固定化材料多为金属类物质和化学合成材料，限制了其在食品行业中的 应用。 1 4 本课题的研究内容 虽然固定化酶在很多方面优于游离酶，但是只有少数固定化酶在工业中作为 催化剂，这主要是因为固定化成本高或固定化效果差等原因限制其使用。 目前国内工业化生产f o s 的技术多为液体深层发酵法，但该法的缺点是产酶 菌丝体只能利用一次，在f o s 生产过程中，由于菌丝体及其培养基成分的存在 并参与反应，使整个工艺繁杂，成本高 4 3 1 。而酶的固定化技术为提高酶的使用 效率、降低生产成本提供了可能性；因此，近年来果糖基转移酶的固定化也逐渐 成为研究的热点，现有的对果糖基转移酶的固定化也已出现了多种方法，但这些 方法或者是过于复杂或者是f o s 产率过低，尚不能十分令人满意。 在低聚果糖的生产中，大量副产物葡萄糖的产生阻遏了底物的转化，可通过 葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶的协调作用，消除普通低聚果糖中的葡萄糖，因此， 果糖基转移酶与过氧化氢酶的固定化，为得到高纯度的低聚果糖奠定了一定基 础。 综上所述，本课题主要进行了以下几方面工作的研究： ( 1 ) 筛选合适的载体对果糖基转移酶进行固定化； ( 2 ) 优化了果糖基转移酶的固定化条件； ( 3 ) 对固定化果糖基转移酶的酶学性质进行研究； ( 4 ) 以一种无载体固定化方法一交联酶聚集体技术固定化过氧化氢酶； ( 5 ) 对固定化过氧化氢酶的酶学性质进行研究 6 2 材料与方法 2 1 实验材料和试剂 2 材料与方法 2 1 1 实验材料 黑曲霉a s 0 0 2 3江南大学食品科学与技术国家重点实验室保藏菌种 过氧化氢酶江大绿康生物工程技术研究有限公司提供 树脂d 2 0 2 i i3 0 92 1 33 1 3苏青集团； x 5d a 2 0 1 bh 1 0 3d 3 0 1 i f i 南开大学化工厂； d 1 5 1d 1 5 2d 3 8 0 天津波鸿建材； 2 1 2 主要试剂 氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、柠檬酸、蔗糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、 2 5 戊二醛水溶液、3 0 过氧化氢，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司； 酵母浸膏，上海生物工程公司；蛋白胨上海生物工程公司；七水硫酸镁 上海金山区美兴化工厂。 2 1 3 主要实验仪器 电子天平梅特勒一托利多仪器上海有限公司 超净操作台苏州安泰空气技术有限公司 恒温调速回转式摇床上海杜科自动化设备有限公司 精密p h 计p h s 3 c 梅特勒一托利多仪器上海有限公司 s x 4 0 型扫描电子显微镜日本明石公司 超声波细胞破碎仪宁波新芝生物科技股份有限公司 s h a 2 a 冷冻水浴恒温振荡器江苏太仓实验设备厂 高速冷冻离心机 美国e p p e n d o r f 公司 超级恒温水浴上海实验仪器厂 磁力搅拌器 i k a 紫外可见光分光光度计美国v a r i a n a g i l e n t l1 0 0 高效液相色谱仪 美国a g i l e n t 公司 7 江南大学硕士学位论文 2 2 实验方法 2 2 1 游离果糖基转移酶的制备 2 211 发酵培养 培养方法：将种子从斜面管接到装有3 0 m l 液体培养基的2 5 0 m l - - 角瓶中，于 2 0 0 r m i n ，3 0 条件下振荡培养4 0h 。 发酵培养基( g l ) ：蔗糖1 0 0 9 、蛋白胨2 5 9 、酵母膏5 9 、七水硫酸镁l g 、 磷酸氢二钠l g 、p h 6 3 。 2 212 离心收集茵体 发酵液3 0 0 0 r m i n 离心2 0 m i n ，所得沉淀清洗重复离心三次，收集湿菌体冷 藏备用。 2 213 破壁提取 黑曲霉a s 0 0 2 3 细胞的制备见参考文献【删称取一定量黑曲霉细胞放入烧杯中， 加入约5 倍体积的0 0 5m o l l 、p h 5 0 的柠檬酸一磷酸缓冲液，在冰浴中用超声波 细胞破碎仪处理一定时间后，于4 。c 下冷冻离一c , , 0 0 0 0 0g ) 2 0m i n ；收集上清液在 4 。c 条件下进行超滤以提高单位酶活，压力0 1 5m p a ，截留相对分子质量1 0 0 0 0 ， 粗酶提取液放入冰箱保藏备用。 2 2 2 果糖基转移酶的固定化 2 2 2 1 固定化方法的选择 高分子复合物作为载体制备固定化酶是近年来引人瞩目的发展方向【4 5 。4 7 】，海 藻酸钠、明胶作为天然高分子材料因其安全、环保以及工艺方面的优良性能已应 用于酶的固定化，而海藻酸钠和明胶协同固定化制备的微胶囊与单一海藻酸钠微 胶囊相比具有更多的优点：能够提供更大的固定化空间，更有利于内外物质的扩 散【4 引。 磁性高分子微球是一种新型功能高分子材料，被广泛应用于酶的固定化f 协5 0 1 ， 可在外加磁场的作用下方便地分离。壳聚糖由于具有生物相容性、生物亲和性和 无毒等特性【5 1 1 ，分子链上大量存在的羟基和氨基又使其易于进行化学改性，常被 作为磁性高分子材料的“外壳”而应用于酶固定化【5 2 巧3 1 领域。 树脂是工业上应用较广泛的材料之一，它价格便宜，机械性能好，易再生， 所以越来越多的为人们所重视，在食品领域，其作为固定化载体的应用也日益广 泛酬。 因此，本实验分别尝试了明胶、海藻酸钠协同包埋法，壳聚糖磁性微球法及 树脂吸附法三种方法对果糖基转移酶的固定化，并比较了其固定化效果。 3 2 材料与方法 2 2 2 2 固定化载体的选择 在确定以树脂为固定化载体后，本实验选择了具有代表性的各类型树脂共1 8 种，进行固定化载体的筛选实验。 2 2 2 3 树脂的预处理 吸附树脂采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理，最后用蒸馏水冲洗至中性备用； 离子交换树脂先用蒸馏水浸泡胀润、去杂，然后用4 h c i 、4 n a o h 交替处理， 最后用蒸馏水冲洗至中性，置于4 冰箱保存备用。 2 2 2 4 酶的固定化 用滤纸吸干湿树脂表面的水后称取0 5 9 于三角瓶中，加入一定量的酶液，在 所需的p h 下在恒温水浴振荡器中缓慢振荡吸附一定时间后，加入一定量的戊二 醛进行交联。交联完成后，弃去上清，用缓冲溶液冲洗残余的戊二醛及未固定上 的游离酶，所得固定化酶用缓冲液浸泡待用。 2 2 3 果糖基转移酶酶活测定方法 游离果糖基转移酶活测定：一定体积底物浓度为1 0 ( w v ) o 0 5 m 、p h 5 0 的柠 檬酸一磷酸缓冲液于恒温夹套酶反应器中，5 0 下恒温搅拌反应6 0 m i n ，于沸水中 煮沸1 0 m i n 终止反应。 酶活力定义为：每分钟产生l u m o l 蔗果三糖( 1 k e s t o s e ) 为一个酶活力单位。 糖组分测定方法：h p l c ( 高效液相色谱) 法即】：h p l c ，a g i l e n t l1 0 0 系列， 配有s h o d e xr i 1 0 1 示差折光检测器和m 7 4 0 数据处理器；色谱柱，s h o d e xa s a h i p a k n h 2 p 5 0 ；流动相，乙睛水6 5 3 5 ，流速l m l m i n ；温度3 0 ；进样量，1 0 山。 固定化酶活测定方法同游离果糖基转移酶活测定方法。 固定化酶活回收率( ) = 固定化酶活力加入酶总活力1 0 0 2 2 4 果糖基转移酶固定化条件的优化 用离子交换树脂进行固定化可通过离子交换吸附的方式，但是吸附法固定在 树脂上的酶蛋白结合的不够牢固，在使用过程中容易脱落，固本实验选择了吸附 与交联相结合的方法，以双功能基团试剂戊二醛为交联剂，以增加固定化效果。 因此选择了加酶量、吸附时间、吸附p h 、吸附温度、交联剂用量、交联时间、 交联温度等七个因素进行了固定化优化实验。 2 2 4 1 加酶量对固定化效果的影响 选择不同的加酶量1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 、6 0 0 u g ，固定其它条件：吸 附时间为6 h ，吸附p n 6 0 ，吸附温度3 0 c ，戊二醛终浓度0 0 1 ( v v ) ，交联时间 6 h ，交联温度4 c ，进行固定化。 2 2 4 2 吸附p h 对固定化效果的影响 选择不同的吸附p h 3 、4 、5 、6 、7 、8 ，固定其它条件：加酶量2 0 0 0 g ，吸附 9 江南大学硕士学位论文 时间6 h ，吸附温度3 0 c ，戊二醛终浓度0 0 1 ( v v ) ，交联时间6 h ，交联温度4 c ， 进行固定化。 2 243 吸附时间对固定化效果的影响 选择不同的吸附时间2 、4 、6 、8 、1 0 、1 2 h ，固定其它条件：加酶量2 0 0 u g ， 吸附p h 6 0 ，吸附温度3 0 c ，戊二醛终浓度0 0 1 ( v v ) ，交联时间6 h ，交联温度 4 ，进行固定化。 2 2 4 4 吸附温度对固定化效果的影响 选择不同的吸附温度4 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 c ，固定其它条件：加酶量2 0 0 u g ， 吸附p h 6 0 ，吸附时间6 h ，戊二醛终浓度0 0 1 ( v v ) ，交联时间6 h ，交联温度4 c ， 进行固定化。 2 245 戊二醛量对固定化效果的影响 选择不同的戊二醛终浓度0 、0 0 1 、0 0 5 、o 1 、o 2 、0 3 ( v v ) ，固定 其它条件：加酶量2 0 0 u g ，吸附p h 6 0 ，吸附时间6 h ，吸附温度3 0 ( 2 ，交联时间 6 h ，交联温度4 ，进行固定化。 2 246 交联时间对固定化效果的影响 选择不同的交联时间0 、2 、4 、6 、8 、1 0 h ，固定其它条件：加酶量2 0 0 u g ，吸 附p h 6 0 ，吸附时间6 h ，吸附温度3 0 ( 2 ，戊二醛终浓度0 0 1 ( v v ) ，交联温度4 c ， 进行固定化。 2 247 交联温度对固定化效果的影响 选择不同的交联温度o 、4 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 。c 固定其它条件：加酶量2 0 0 u g ， 吸附p h 6 0 ，吸附时间6 h ，吸附温度3 0 ( 2 ，戊二醛终浓度0 0 1 ( v v ) ，交联温度 4 c 进行固定化。 2 2 5 固定化前后树脂超微结构的观测 扫描电镜( s e m ) 被广泛应用于物质超微结构的研究，本文采用s e m 分别观察 了对照组的树脂和固定化后的树脂的超微结构。 2 2 6 固定化果糖基转移酶的酶学i 生质 2 2 6 1 固定化酶的最适温度 取o 5 9 固定化酶加入到1 0 0 m l 底物( 蔗糖) 浓度1 0 ( w v ) 0 0 5 m 、p h 5 0 的柠 檬酸一磷酸溶液中，分别在4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、6 0 、6 5 下测固定化酶活，以最高 酶活为1 0 0 ，用相对酶活来表示酶活力变化的情况。 2 2 6 2 固定化酶的最适p h 取o 5 9 固定化酶分别在1 0 0 m l 底物( 蔗糖) 浓度1 0 ( w v ) 0 0 5 m 、p h 4 0 7 5 的柠檬酸一磷酸缓冲溶液中测定固定化酶活，以最高酶活为1 0 0 ，用相对酶活来 表示酶活力变化的情况。 1 0 2 材料与方法 2 263 固定化酶的热稳定性 取o 5 9 固定化酶加0 0 5 mp h 5 0 的缓冲溶液，分别在3 5 、4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、 6 0 保温处理6 0 m i n ，取出后测其酶活，以最高酶活为1 0 0 ，用相对酶活来表 示酶活力变化的情况。 2 264 固定化酶的p h 稳定性 将0 5g 固定化酶与不同p h 的缓冲液( p h3 0 - 8 0 为柠檬酸磷酸缓冲液， p h 9 0 - - 1 0 0 为硼酸缓冲液) 在2 5 恒温水浴中保温6 0m i n ，再按以上酶活测定 法测定其活力，以最高酶活为1 0 0 ，用相对酶活来表示酶活力变化的情况。 2 2 6 5 固定化酶的操作稳定性 。 固定化酶的批次操作稳定性表征了其可重复使用性，决定着固定化酶应用的 效率和成本，是衡量固定化效果的重要指标。 取o 5 9 固定化酶，加入到2 5 0 m l 的1 0 ( w v ) 的蔗糖溶液中，在恒温夹套酶 反应器中，5 0 下恒温搅拌反应6 0 m i n ，停止反应，将固定化酶滤出，用缓冲溶 液冲洗固定化酶三次，然后用于下一批反应，如此重复1 0 次。 2 2 6 6 酶的贮存稳定性 研究固定化酶和游离酶在4 。c 的贮存稳定性是衡量其商业化应用的重要指 标。将固定化酶和游离酶置于4 。c 冰箱内保存，每隔十天测定酶活力，以各自初 始酶活为1 0 0 ，计算其残余酶活，根据其在贮存过程中的残余酶活的变化比较 其稳定性。 2 2 6 7 固定化酶的动力学常数 米氏常数k m 是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶浓度无关， 其物理意义是当酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏公式则定 量地表明了底物浓度和酶反应速度之间的关系1 2 】 y ：塑：幽 k m + 跚 其中v 为酶促反应速度，v m 为最大反应速度，【s 】为底物浓度。 分别配制含有0 0 4 、0 0 8 、0 1 2 、0 1 6 、0 2 0m 浓度的蔗糖溶液1 0 0m l ，在 0 0 5 mp h5 0 磷酸柠檬酸缓冲液条件下，5 0 c 反应3 0r a i n ，分别测定反应速度 v 【4 1 】以反应初速度的倒数1 与底物浓度的倒数1 s 做双倒数图。 2 2 7 过氧化氢酶的固定化 交联酶聚集体( c l e a s ) 技术近几年被纳入无载体固定化酶范畴，是采用物 理方法使酶分子聚集、再经交联剂交联而成。由于其具有操作简单、不需要纯化 酶、酶活回收率和生产能力高及稳定性较好等优点被广泛应用于蛋白质的分离和 纯化及酶固定化等方面。目前在过氧化氢酶的固定化方面还未有文献报道采用此 江南大学硕士学位论文 方法，因此本实验采用一种无载体固定化方法一交联酶聚集体法固定过氧化氢 酶。 过氧化氢酶的固定化方法： ( 1 ) 过氧化氢酶聚集体的制备：取2 0 m l 酶液，加入l o m l0 0 5mp h 7 0 的磷酸