（食品科学专业论文）高密度CO2杀菌过程中的萃取机理研究.pdf

高密度c 0 2 杀菌过程中的萃取机理研究 摘要 高密度c 0 2 杀菌技术是近年来发展起来的一项新型非热力加工杀菌技术，它具有 很多以往杀菌技术无法比拟的优点，如杀菌温度低、无污染、营养损失少等。因此开展 高密度c 0 2 对微生物致死效果及致死机理的研究是非常有意义的。 本文主要讨论了在不同的压力、温度、处理时间、溶解介质、菌悬液p h 值等条件 下高密度c 0 2 对大肠杆菌杀灭效果的影响。并对对致死效果影响较大的四个因素三个 水平进行了正交实验，充分考虑了交互作用对实验的影响。最佳工艺参数为：处理压力 2 0 m p a ，温度4 0 ，时间3 0 m i n ，菌悬液p h = 6 。该条件下的杀灭对数值为7 3 1 。实验 结果表明采用高密度c 0 2 杀灭大肠杆菌效果较明显，而且杀灭对数可以达到6 以上。 c 0 2 在高密度状态下是一种良好的溶剂，高密度c 0 2 处理能萃取出微生物细胞内、 细胞膜和细胞壁上的功能性物质，使微生物细胞受到损伤，从而使微生物失去活性而死 亡。在这项研究中通过对大肠杆菌的细胞悬浮液进行高密度c 0 2 处理( 在最佳杀菌工艺 条件下) ，并在此条件下收集处理后菌悬液，在扫描电镜下观察对比处理前后大肠杆菌 细胞形态的变化。对不同时间段萃取物中成分的分析，追溯其来源，探讨了高密度c 0 2 杀菌过程中的萃取机制。通过对不同时间萃取物的成分分析发现萃取物主要分为两类成 分：一类是极性较弱的小分子氨基酸类物质，另一类是脂肪酸类物质。通过分析高密度 c 0 2 处理后的萃取液成分，并追溯这些成分的来源，证实在大肠杆菌细胞中含有这些功 能性成分。而扫描电镜观察结果发现细胞形态未发生明显变化。从而证明了在高密度 c 0 2 杀菌的过程中确实发生了萃取作用。 关键词：高密度c 0 2 大肠杆菌杀菌萃取 s t u d yo ne x t r a c t i o nm e c h a n i s mo fs t e r i l i z a t i o ni n s u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d e a b s t r a c t s u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d ei san o n - t h e r m a lm e t h o dw h i c hh a sr e c e i v e dc o n s i d e r a b l e a t t e n t i o nf o rp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nan u m b e ro fp r o c e s s i n gf i e l d s t h e r ei sal o to ft h e a d v a n t a g e st h a na n yo l ds t e r i l i z a t i o n ss u c ha sl o wt e m p e r a t u r e ，n o n - r e s i d u a l ，n o c o n t a m i n a t i o n a n dn u t r i t i o n a l t h i sa r t i c l ed i s c u s s e st h ek i l l i n ge f f e c to fs u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d et oe c o l iu n d e rt h e c o n d i t i o n so fd i f f e r e n t p r e s s u r e ，t e m p e r a t u r e ，p r o c e s s i n gt i m e ，m e d i u ma n dt h ec e l l c o n c e n t r a t i o n ，p hv a l u eo fs u s p e n s i o n i na d d i t i o n ，c o n d u c ta no r t h o g o n a le x p e r i m e n to nt h e f o u rf a c t o r so ft h et h r e em a i nl e v e l s ，g i v e nf u nc o n s i d e r a t i o nt ot h ei m p a c to ft h ei n t e r a c t i o n o fe x p e r i m e n t 。s i n g l e - f a c t o re x p e r i m e n t ss h o wt h a tw h e np r e s s u r eo f2 0 m p a , t e m p e r a t u r eo f 4 0 。c ，t h ep r o c e s s i n gt i m ef o r3 0 m i na n db a c t e r i as u s p e n s i o np ht o5 ，t h es t e r i l i z a t i o ni s b e s ti f a l lf a c t o r sb ec o n s i d e r e di ni s o l a t i o n t h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n ts h o w st h a tt h e p r e s s u r ea n dt e m p e r a t u r ea r et w os i g n i f i c a n tf a c t o r st h a ta f f e c tt h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，t h e i n t e r a c t i o no fp r e s s u r ea n do t h e rf a c t o r si sn o ts i g n i f i c a n t n l ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a t t h en e w t e c h n o l o g yt ok i l lec o l ii sm o r ep r o n o u n c e de f f e c t i v ea n di nl i n ew i n ln a t i o n a l s t a n d a r d si ns t e r i l i z a t i o n s u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d ei sag o o ds o l v e n t s u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d ec a ne x t r a c t f u n c t i o ns u b s t a n c e sf r o mm i c r o b i a lc e l l s ，e e l lm e m b r a n ef u n c t i o na n de e l lw a l lb yw h i c ht h e m i c r o b i a lc e l l sw a sd a m a g e d ，s ot h a tt h em i c r o o r g a n i s m sd i eo ft h el o s so f a c t i v i t y i nt h i s s t u d y ，t h r o u g ht h ep r o c e s so fe c o l ic e l ls u s p e n s i o nb ys u p e r c r i t i c a lf l u i dw eh a v ef o u n do u t t h eb e s tc o n d i t i o n so fs t e r i l i z a t i o np r o c e s s ，a n dt h ec h a n g e si nc e l lm o r p h o l o g yo fec o l i b e f o r ea n da f t e rt h es u p e r c r i t i c a lf l u i dp r o c e s s i n g a n a l y z e dt h ec o m p o n e n t so fd i f f e r e n tt i m e q u a n t u me x t r a c t i v e ，t r a c e db a c kt ot h e i rs o u r c e si nec o l im i c r o b i a le e l l ，i n v e s t i g a t e dt h e e x t r a c t i o nm e c h a n i s mi ns u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d ee x t r a c t i o np r o c e s s t h r o u g ha n a l y z e dt h e c o m p o n e n to f t h et i m eq u a n t u me x t r a c t i v e ，i tc a nb ef o u n do u tt h a tt h ee x t r a c t i v em a i n l yd i v i d e d i n t ot w ot y p e so f c o m p o n e n t s ：o n ei ss m a l lm o l e c u l ea m i n oa c i dw i t hl o wp o l a r i t y ，a n o t h e ri s a l i p h a t i ca c i d t ov i s u a l i z et h ec h a n g e so c c u r r i n gi nt h es u p e r c i i t i cc a r b o nd i o x i d et r e a t e da n d u n t r e a d ，t h ec h a n g e sw e r eu n o b v i o u s t h r o u g ht h ea n a l y s i so fs u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n t r e a t m e n tc o m p o n e n t s ，a n dt r a c e dt h es o u r c eo f t h e s e c o m p o n e n t s ，w h i c hc a nb ec o n f m n e d t o c o n t , f f m e di nec o l ic e l l s i tp r o v e dt h a tt h ee x t r a c t i o nd i do c c u r e di nt h ep r o c e s s o f s u p e r c r i t i c a l s t e r i l i z a t i o n k e yw o r d s ：s u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d e ，ec o l i ，s t e r i l i z a t i o n ，e x t r a c t i o n l l 插图清单 图1 1 大肠杆菌革兰氏染色图3 图1 2 大肠杆菌细胞壁结构图3 图1 3 大肠杆菌肽聚糖的单体图解4 图1 - 4 磷脂构成4 图2 1 菌悬液计数流程图1 0 图2 2 高密度c 0 2 灭菌设备工艺流程图1 1 图2 3 压力对杀菌效果的影响1 3 图2 4 温度对杀菌效果的影响1 4 图2 5 处理时间对杀菌效果的影响1 5 图2 6 菌悬液p h 对杀菌效果的影响1 5 图2 7 菌悬液溶解介质对杀菌效果的影响1 6 图3 1 高密度c 0 2 处理3 0 m i n 萃取液气相色谱图2 5 图3 2 高密度c 0 2 处理6 0 m i n 萃取液气相色谱图2 5 图3 3 高密度c 0 2 处理9 0 m i n 萃取液气相色谱图2 6 图3 4 空白对照图。j 2 6 图4 1 扫描电镜制样流程图31 图4 2 处理前的大肠杆菌细胞的扫描电镜图3 2 图4 3 处理后的大肠杆菌细胞的扫描电镜图3 2 v i i 表格清单 表2 1 因素水平表1 6 表2 2 正交实验结果表1 7 表2 3 正交实验的结果分析1 7 表2 - 4 方差分析表18 表2 5 验证结果表19 表3 1 高密度c 0 2 处理3 0m i n 2 7 表3 2 高密度c 0 2 处理6 0m i n 2 7 表3 3高密度c 0 2 处理9 0m i l l 2 7 表3 - 4 氨基酸的r f 值和最小检知量2 7 表3 5 氨基酸自动分析结果2 8 v t l i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得 金蟹王些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名：程丽梅签字日期：2 0 1 0 匀z 0 4 月3 0 日 锥飞和 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金胆王些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权盒监 工些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：硼构 签字日期：加匆年t 月钿 学位论文作者毕业后去向： 工作单位； 通讯地址： 导师签名： 签字日期：扫，口年厂月v 日 电话： 邮编： 致谢 时光匆匆而逝，近三年的研究生求学生活即将结束，站在毕业的门槛上，回首往昔， 经历过的所有酸甜苦辣都己成为丝丝美好的回忆，心中有着太多的不舍与眷恋，但更多 的是无尽的感激，因为在这期间，我得到了许多让我铭记在心的关怀与帮助，值此毕业 论文完成之际，我谨向所有关心、帮助过我的人表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。 我特别要感谢我的导师周先汉副教授。近三年来，导师渊博扎实的专业知识，认真 严谨的治学态度，孜孜不倦的工作热情，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德， 豁达宽广的胸怀气度，朴实无华、幽默风趣的人格魅力，对我影响甚远，成为我学习的 楷模和典范典范。虽仅历时三载，但恩师以身作则，言传身教，不仅授我以文，而且教 我做人，赋予了我终生受益无穷之道。 此外，在整个实验阶段，还得到了曾庆梅教授、王武老师、韩卓老师等对我的实验 的指导和提出的宝贵意见，在此表示感谢! 在实验阶段，实验室的同学们也给了我无数的帮助和鼓励。感谢张安、郑钰、孟凡 莉、宋俊骅等同学一直以来对我的关心和帮助。感谢实验室的本科生周典飞、卢志峰师 弟在实验中给予的帮助。 感谢我的亲人们，是他们在生活和精神上给予了我巨大支持和鼓励! 由于本人水平有限，文中难免有不妥和不足之处，敬请各位专家、老师批评指正。 i u 作者：程丽梅 2 0 1 0 年4 月2 7 日 第一章前言 1 1 食品灭菌法 灭菌是食品加工的必经工序，灭菌法系指用适当的物理或化学手段将食品中活的微 生物、从食品包装容器带入的、加工与调配过程中由操作人员和设备引入的以及生产环 境中存在的各种有害微生物杀灭或除去的方法。目前灭菌技术方法主要有加热灭菌、化 学药物灭菌、超高密度灭菌、紫外线灭菌、超声波灭菌、微波灭菌及电离辐射灭菌【i 叫 等多种方法。 1 1 1 新兴灭菌技术高密度c 0 2 杀菌技术 随着社会生产力的不断发展和人民生活消费水平的不断提高，现代消费者对于食品 的安全性和高品质有着很高的期待，除了要求食品没有受到微生物和农药等化学物质等 的污染，还要注重食品的嗜好性和功能性等。为了确保食品的微生物安全性，防止食品 腐败变质、延长食品货架期，传统而有效地方法仍然是加热杀菌。然而，对于一些生鲜 食品和一些热敏性物质不能采用传统的加热杀菌方法，而且在一些场合，传统的加热杀 菌方法也无法满足既要保持产品的高品质又要确保杀菌的多重要求。随着科学技术的发 展，一些非热杀菌高新技术应运而生，并逐渐在实践中得到广泛应用，其中高密度c 0 2 杀菌技术【7 】就是近年来引起世界广泛关注的新型杀菌方法。 c 0 2 气体无色、无味、无毒，性质非常稳定，呈化学惰性，临界温度3 1 1 ，临界 压力7 3 6 m p a ，易于压缩，是常用的超临界溶剂，因此被广泛应用于超临界流体萃取之 中【8 】。超临界c 0 2 流体具有气体的低粘度、高扩散系数和液体的高密度特性，对许多物 质具有很强的溶解能力，而且其溶解能力对温度和压力的变化较为敏感，易于调节。 c 0 2 作为一种天然抗微生物剂，单独作用能抑制微生物生长，但不能杀死微生物， 若与压力结合则能达到有效杀菌的效果。因此，高密度c 0 2 技术已经成为一种新型的 非热力杀菌技术 2 1 。高密度c 0 2 杀菌技术是指在1 0 0 m p a 以下压力、在常温或较低的温 度下，通过酸化、破胀力和其他未知原理的作用，使细菌或其他微生物中的酶、蛋白质 等生物大分子变性，达到杀菌保鲜目的。同时，食品的天然味道、风味和营养价值不受 或很少受影响、能耗低、不产生毒素。 高密度c 0 2 杀菌技术最早是在1 9 51 年被f r a s e r 发现1 7 1 ，但是在当时的条件下该法 的杀菌率没有达到大多数场合要求的大于6 个对数的商业要求。1 9 8 0 年日本学者 k a m i h i r a i s , 9 1 等和t a n i g u c h i 1 0 , 1 1 】等用c 0 2 对具有热敏性特征的生物制品、化合物、食品 进行了杀菌实验，还分别使用了有助于杀菌的有机溶剂和水两类夹带剂。文献推测机理 可能是其生理代谢酶的失活及胞内物质被萃取导致的，但是没有数据的证实。 高密度c 0 2 杀菌作为一种富有吸引力的非热力杀菌方法，其杀菌机理还没有被广泛 l 和深入的研究。有关研究发现，高密度c 0 2 杀菌可缩短灭菌时间和降低灭菌温度。张 骊等【1 2 】曾研究利用高密度c 0 2 钝化蒜酶和保留大蒜s o d ，取得了较好的效果。近年研 究表明，高密度c 0 2 对微生物具有很好的致死作用，目前研究集中在对食品中常见微 生物杀灭效果及其机理研究，建立一些相关杀菌模型f 1 3 】。高密度c 0 2 使细胞致死的机 理相对比较复杂，到现在还没有文献对其进行明确的阐明，大多是在相关推测与实验相 结合的基础上提出的一些假设。目前普遍认为，其灭菌机理主要是以下几种【l 7 】：( 1 ) 高密度c 0 2 处理能抽出微生物细胞内或细胞膜功能性物质，使微生物细胞收到损伤；( 2 ) 由于进入细胞内c 0 2 电离，使细胞质氢离子浓度增大，p h 下降；( 3 ) 微生物细胞内某些 酶由于浸透在c 0 2 中而失活；( 4 ) 溶解于微生物细胞内的c 0 2 急速减压时体积膨胀而使 细胞破裂。但以上均为试验事实提出的假设或推断，缺少试验数据支持。 国内学者对高密度c 0 2 杀菌技术一直关注不够，直到上世纪9 0 年代末开始才有几 篇综述文献提及和推荐将“超临界c 0 2 流体”技术用于于卫生、食品杀菌保鲜领域。中国 农业大学廖小军、胡小松 1 8 , 1 9 等在温度为5 5 c 、体系p h 5 6 、压力为常压至3 0 m p a 的 条件下，研究了超临界c 0 2 流体处理对高纯度辣根过氧化物酶的酶活力及其二级和三 级结构的影响，得出了非常满意的结果，揭示了酶失活机理。但是对于高密度c 0 2 杀 菌的萃取机理还未见报道。 1 1 2 高密度c 0 2 杀菌技术与传统杀菌技术的对比 传统食品保鲜加工普遍采用热力杀菌，而目前工业生产过程中常用的是超高温瞬时 , 灭菌c o h t ) t 2 0 ，2 1 1 。但是热处理导致分子的剧烈运动和化学反应，不仅破坏了其共价键使 蛋白质、多糖等高分子物质变形，同时也可能破坏共价键使维生素、色素和风味物质等 发生质变，加速低分子挥发性香气成分丢失，还会产生毒素，使产品的色香味遭到极大 的破坏。而富含热敏性成分和风味物质的食品如苹果汁等用高密度c 0 2 处理后不仅能 够达到杀菌的目的，而且不会导致营养物质的损失及产生难闻的煮熟气味f 2 2 2 3 2 4 1 。作为 一种新兴的杀菌技术它很好的解决了热敏性果汁杀菌过程中营养成分损失及色香味严 重劣化等问题【2 1 ，2 5 1 。因此，与加热处理相比较，能够保持产品中容易变质的维生素和色 素等成分是超临界c 0 2 杀菌过程中的突出优势。 从能量消耗的角度看，与加热处理相比较，高密度c 0 2 杀菌的另外一个特点就是节 能【2 6 j 。对于需要通过加热将原料温度升高到一定程度而进行杀菌的场合，由于物料含 水量大、比热大，因此需要耗费相当大的热量，另外由于水分的蒸发潜热将使热能的消 耗大大增加，而且由于大多数加热杀菌处理都采取热蒸汽间接加热的方式，导致部分热 能向周围环境逸散而损失。综合考虑，采用高密度c 0 2 杀菌是一种杀菌效果好，对食品 2 成分损害小、节能降耗的新型非热杀菌方式1 2 6 2 7 i 1 2 实验采用菌种大肠杆菌 恻i - 1人肠杆菌革兰氏染色闰 f i 9 1 - 1g r a ms t a i no f e s c h e r i c h i a c o l i 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ，e c o i l ，如图卜l 所示) 为革兰氏阴性短杆菌 2 8 , 2 q ，兼性 扶氧菌，大小o5 卜3 微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气， 是人和动物肠道中的f 常栖居菌，下常栖居条件下不致病，在一定条件下可引起肠道外 感染。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一1 2 82 ”。目前已被国内外广泛应用于 食品卫生工作中。孩菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便 污染指标。因此选取大肠杆菌为试验用菌种。 1 2 1 大肠杆菌细胞结构 太肠杆菌细胞壁【2 8 4 t 的结构阁如图1 2 所示。肚聚糖层是单层，并且不含有磷壁酸， 此外在肽聚糖外还覆盖一层脂双层膜。 图1 2 大肠杆菌细胞壁结构圈 f i 9 1 - 2 t h ec e l l w a l l o f e s c h e r i c h i ac o i l 肚聚糖是连接这些物质的支架，具有固定细胞外形和保护细胞不受损伤等多种生理 功能，其基本组成单位为图i - 3 所示：图中o 代表n 一乙酰葡萄糖胺、m 代表n 一乙酰胞 壁酸、l - a l a 代表l 一丙氨酸、d g l u 代表d 谷氨酸、d a p 代表内消旋二氨基庚二酸、 3 卢国 d a l a 代表d 丙氨酸。 图1 3 大肠杆菌肽聚糖的单体图解 f i g 1 3t h ep e p t i d o g l y e a no fe s c h e r i c h i ac o l i 从图l 一3 中可知丙氨酸、谷氨酸及内消旋二氨基庚二酸是大肠杆菌细胞壁肽聚糖的 重要组成部分。 训一c h r c h 4 。一 - 。f i i i f 曰 训l c h r c h 井。一蜂一o 9 h 2 o ll - r 2 t c l - h i 删- - u 十旷 一r 1 极性头部非极性尾部 图1 - 4 磷脂构成 f 嘻i - 4t h es t r u c t u r a lf o r m u l ao fp h o s p h o l i p i d 大肠杆菌细胞膜【2 8 。1 1 的主要成分为磷脂，膜是由两层磷脂分子整齐的对称排列而成 的。其中的每一个磷脂分子均由一个带正电荷且能溶于水的极性头和一个不带电荷、不 溶于水的非极性端所构成。如图l 一4 所示：s n - l ( r 1 ) 位主要是棕榈酸和硬脂酸，s n 2 ( r 2 ) 位含有更多的p u f a ，包括花生四烯酸( 2 0 ：4 ) 和d h a ( 2 2 ：6 ) - - 十二碳4 ，7 ，1 0 ，1 3 ，1 6 ， 1 9 六烯酸等。 4 大肠杆菌细胞质2 8 。o 】的主要成分为核糖体、贮藏物、酶类、中间代谢物、质粒、各 种营养物质和大分子的单体等。核区的化学成分是一个大型的环状双链d n a 分子。 1 2 2 细胞主要功能性构成成分及检测方法 1 2 2 1 氨基酸类 四大类生物分子中蛋白质是生物功能的主要载体，而氨基酸是蛋白质的构件分子。 氨基酸在结构上的共同点是与羧基相连的a 碳原子上是一个氨基，连接在位碳原子上 的还有一个氢原子和一个可变的侧链，称r 基，各种氨基酸的区别就在于r 基的不同。 多数的氨基酸均能溶于水。 纸色谱法【3 0 ，3 2 】是分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于氨基酸成分的定性鉴 定。纸层析所用的展层溶剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。滤纸纤维的o h 基的亲 水性基团，可吸附有机溶剂中的水作为固定相，有机溶剂作为流动相，它沿滤纸自下向 上移动，称为上行层析；反之，使有机溶剂自上而下移动，称为下行层析。将样品点在 滤纸上进行展层，样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配，由于它们各自的分配 系数不同，故在流动相中移动速率不等，从而使不同的氨基酸得到分离和提纯。 在纸层析中，从原点至氨基酸停留点的距离r 与原点至溶剂前沿的距离之比， d 即导称为r f ，即相对迁移率。只要溶剂系统，温度、湿度和滤纸型号等实验条件确定， k o 则每种氨基酸的r f 值是恒定的。通过计算滤纸上氨基酸斑点的r f 值即可确定氨基酸的 种类。 氨基酸自动分析仪【3 3 ，3 4 1 是利用各种氨基酸的酸碱性、极性和分子大小等性质的不 同，使用阳离子交换树脂在层析柱上进行层析。当样品加入层析柱顶端后，用不同的 p h 值和离子浓度的缓冲液依次将他们洗脱下来。洗脱下来的氨基酸用茚三酮显色，进 行定性定量分析。 测定样品中的游离氨基酸，需要除去脂肪、糖类等杂质后直接上柱进行分析。 1 2 2 2 脂肪酸类 脂质【3 0 川是四大类生物大分子之一，脂质是类低溶于水而高溶于非极性溶剂的生 物有机分子。对大多数脂质而言，其化学本质是脂肪酸和醇所形成的酯类及其衍生物。 脂质按其生物学功能可分为贮存脂质、结构脂质和活性脂质。天然脂肪酸的碳原子数目 几乎都是偶数，碳骨架长度为4 3 6 个碳原子，多数为1 2 2 4 个碳，最常见的为软脂酸、 硬脂酸和油酸等。而大肠杆菌细胞中的脂肪酸类物质主要有硬脂酸，软脂酸，油酸、亚 油酸、亚麻酸、桐油酸、花生四烯酸及二十二碳六烯酸( d h a ) 等。这些物质被提取后可 用气相质谱联用仪【3 1 】进行分离鉴定。 1 3 研究背景及进展 从前人1 3 6 ，3 7 】的研究可以发现一定压力下的c 0 2 具有使某些微生物致死的作用，这与 常压下的c 0 2 仅仅是抑制好氧性微生物的生长有所不同。超高压灭菌技术【2 】对微生物同 样有致死作用，但是一般仅在1 0 0m p a 以上的高压下才有较好的效果，而高密度c 0 2 对 微生物的致死作用在相对较低的压力( 1 0m p a ) - f 鳓g 著了3 8 矧。 用高密度c 0 2 处理后不仅能够达到杀菌的目的，而且能够完好保持原料天然的营养 物质和风味【4 0 ，4 1 1 。作为一种新兴的杀菌技术它很好的解决了杀菌过程中营养成分损失及 色香味严重劣化等问题，因此开展对高密度c 0 2 灭菌的研究具有较高的学术价值和重要 的实际意义【2 2 2 3 1 。 高密度c 0 2 条件下的致死机理是非常复杂的，前人对微生物在高密度c 0 2 条件下的 致死机理的研究多数只是对于现象和操作条件的研究，多数还是停留在对实验现象的分 析和假设阶段，总结前人对致死机理的研究和推测，主要有以下几个方面： 1 ) 酸化：c 0 2 气体溶于水之后降低了环境的p h 值，同时进入细胞内的c 0 2 电离，使 细胞质氢离子浓度增大，p h 下降，改变了微生物的生长环境，从而抑制其生长代谢； 2 ) 萃取：高密度c 0 2 对物质的溶解度很大，能抽出微生物细胞内或细胞膜功能性物 质，使微生物细胞收到损伤； 3 ) 机械破碎：溶解于微生物细胞内的c 0 2 急速减压时体积膨胀而使细胞破裂。但没 有足够的针对性强的实验数据支撑，需要进一步确定； 4 ) 酶失活：微生物细胞内某些酶由于浸透在c 0 2 中而失活，中国农业大学廖小军、 胡小松等【1 8 , 1 9 , 4 2 】研究了超临界c 0 2 流体处理对高纯度辣根过氧化物酶的酶活力及其二级 和三级结构的影响，初步揭示了酶失活机理。 本文主要争t - x 寸高密度c 0 2 对大肠杆菌的杀灭效果及其在杀菌过程中的萃取机制进行研究。 1 4 本课题的主要研究内容 高密度c 0 2 杀菌处理开始，高密度c 0 2 分子将会与细胞壁膜接触，溶解萃取细胞壁 外层的非极性或极性较小的物质，时间延长可能会渗透进入细胞，首先与细胞膜接触， 细胞膜的两性双层磷脂具有非极性头部，有被萃取的可能，萃取的结果将会导致细胞壁 膜的局部损坏；当c 0 2 分子进入细胞质中的时候，会萃取成分复杂的细胞质中小极性的 分子，并通过损坏的细胞膜和细胞壁渗出。假如上述假设成立，又由于细菌细胞壁、细 胞膜和细胞质的成分各不相同，具有各自的特征，那么，通过检测不同时间段的萃取物 6 成分，即能够判断其来源，根据萃取物来源可以判断是细胞壁、细胞膜还是细胞质受损。 细胞壁、细胞膜受损将弱化其保护作用，直至细菌被杀灭；细胞质受损可能影响细胞的 正常代谢，导致微生物失活。因此，通过对萃取物的分析有可能揭示萃取杀菌机制。 细胞壁、细胞膜和细胞质所含化学成分特征明显，本课题将采用气质联用以及氨基 酸分析仪等手段分析萃取成分；根据需要结合电子显微镜观察细胞表面的物质缺失等方 法，分析高密度c 0 2 杀菌的萃取杀菌机理。 研究表明，高密度c 0 2 灭菌效果主要取决于三个方面【2 7 3 5 1 ：对象微生物( 种类、生 长阶段及水分含量) ；食品或培养液性质；处理条件( 压力、温度、处理时间等) 。根据文 献资料及实验条件从压力、温度、处理时间及菌悬液的浓度及p h 值等五个方面考察高 密度c 0 2 对大肠杆菌等的杀灭效果。采用细胞杀灭对数值来表征致死效果。细胞杀灭 对数值定义为： 杀灭对数值= l g 釜差黼 以高密度c 0 2 处理的压力、温度、时间、溶解介质以及大肠杆菌细胞悬浮液的的 浓度及p h 值等为变化因素，通过对高密度c 0 2 处理前后大肠杆菌菌悬液中的菌落数对 l l ( a l j 每组实验中细胞杀灭对数值的对比) ，寻找高密度c 0 2 杀菌的最佳工艺条件。 研究在最佳杀灭工艺条件下处理过的大肠杆菌细胞形态及结构的变化；研究高密度 c 0 2 处理后萃取液的主要成分；通过对不同时间段萃取液中的标志性成分的分析，追溯 其来源，探讨c 0 2 杀菌过程中的萃取机制。 7 第二章高密度二氧化碳杀灭大肠杆菌工艺优化研究 传统食品保鲜加工普遍采用热力杀菌，但是热处理不仅会破坏共价键使蛋白质、多 糖等高分子物质变性，同时也可能会使维生素、色素和风味物质等发生质变，加速低分 子挥发性香气成分丢失，还会产生毒素，使产品的色香味遭到极大的破坏。 k a m i h i r a 2 8 j 等在1 9 8 7 年发现一定压力下的c 0 2 具有使某些微生物致死的作用，这 与常压下的c 0 2 仅仅是抑制好氧性微生物的生长有所不同。超高压灭菌技术对微生物 同样有致死作用，但是一般仅在1 0 0m p a 以上的高压下才有较好的效果，而高密度c 0 2 对微生物的致死作用在相对较低的压力( 7 之后，杀灭对数值又出现回升，说明茵悬液偏碱性也有利于 灭菌，但是偏酸性效果更佳。 3456 789 p h 图2 - 6 茵悬液p h 对杀菌效果的影响 f i g 2 - 6t h ee f f e c to fp ho nt h ef a t a l i t yr a t e 2 3 5 菌悬液介质对杀菌效果的影响 菌悬液介质对杀菌效果的影响如图2 7 所示。 1 5 z&支t王2 l n n邑一 8 7 6 5 4 3 2 l n 善磐 磷酸盐缓冲液生理盐水蒸馏水 溶解介质 图2 - 7 菌悬液溶解介质对杀菌效果的影响 f i g 2 7 t h ee f f e c to fs o l v e n to nt h ef a t a l i t yr a t e 根据图2 7 可知，溶解在不同的介质中，杀灭对数值相差几乎可以忽略，考虑到实 验要在不同的p h 下进行，因此选择可以通过改变配制比例调节p h 的磷酸盐缓冲液比 较合适。 从上面五个单因素实验可以看到，压力对高密度c 0 2 灭菌效果影响最为显著，其 他温度、处理时间及菌悬液初始p h 三个因素影响也较显著，因此在做正交实验时四个 因素均要考虑，且要考虑压力这一主要因素与其他三个因素的交互作用。 2 3 6 正交实验结果与讨论 从灭菌效果和可操作性等各方面考虑，确定对杀灭对数值的影响较大的因素为压 力、温度、时间和初始p h ，每个因素选取了三个主要水平，选用正交表l 2 7 ( 3 1 3 ) 设计四 因素三水平的正交试验，正交实验因素水平表见表2 1 ，正交试验结果见表2 2 。 表2 1 因素水平表 t a b l e 2 1t h ef a c t o r sa n dl e v e l so f t h ee x p e r i m e n t a t i o n 1 6 8 7 6 5 4 3 2 l o n0己一 表2 - 2 正交实验结果 t a b 2 - 2t h eo r t h o g o n a ld e s i g na n dr e s u l t so ft h ee x p e r i m e n t a t i o n 试 1234567 891 0 验 a b ( a x b ) l ( a x b ) 2 c ( a x c h ( a c ) 2 ( a x d ) 2d( a d ) l l g ( n o n - ) i l1l1l11 1117 1 5 2 1ll12 222226 7 0 j 11 1 1 333333 6 9 2 4 l222lll2 227 4 2 ) l222222 3336 9 5 o l2223 33lll7 1 0 l333 l1l333 5 9 8 5 l3 33222l 1 1 6 3 0 y l3 3333 32226 6 3 1 0 21231 23l236 1 0 11 2l232 3l2315 6 7 1 2 2l 23312312 5 8 6 l j 22 3ll232 3l6 2 3 1 4 223123 13l25 9 7 l ， 223l 312l23 6 1 0 l o 23l 2123312 5 9 8 1 7 23l223ll 235 9 6 1 5 2312312 2315 9 6 1 9 3132l 321326 9 6 ：z u 3l32 2l32l3 6 6 6 z l 3 l3232132 l6 8 3 z z 3213l32 3237 1 4 z j 321321 3l3l6 9 8 z 4 32l3 3 2 l2l27 0 6 z 33 21l322ll6 1 0 ：z o 3 3212l3 3225 7 4 2 7 332132l1 335 9 2 从上表可以看出，2 7 次实验中有1 8 次杀灭对数值大于或等于6 o o ，按照经验，杀 灭对数值达到6 及以上就是符合多数场合要求的灭菌标准，这就是说实验有2 3 符合标 准。其中第4 号实验的结果最好，杀灭对数值为7 4 2 。 表2 - 3 正交实验结果极差分析 t a b 2 - 3 a n a l y s i so fo r t h o g o n a l i t ye x p e r i m e n tr e s u l t s l23456 7891 0 垒里f 垒：垒21 一一( a x b ) 2 c ( a x c h ( a x c ) 2 ( a x d ) 2 d ( a d ) l k l 6 8 016 5 3 96 6 5 06 314 6 5 6 96 4 3 46 4 4 76 4 9 76 4 5 36 4 8 0 k 2 5 9 816 7 7 96 3 2 4 6 6 5 36 3 2 66 。4 5 26 4 5 26 4 8 86 5 4 26 4 8 7 k 3 6 5 9 96 0 6 36 4 0 76 413 6 4 8 76 4 9 46 4 8 26 3 9 76 38 66 414 r0 8 2 00 7 160 3 2 6 0 3 3 90 2 4 30 0 6 00 0 3 50 10 00 15 6 0 0 7 3 1 7 通过极差分析可以看到，在不考虑交互作用的情况下，根据各个均值的大小可以确 定各因素的优水平，压力、温度、时间和p h 的优水平分别是2 0 m p a 、4 0 、6 0 m i n 和 p h = 7 。单因素实验结果显示p h = 5 灭菌效果最好，所以各优水平只有p h 与单因素实验 结果不一致，可能是两者的温度和时间设定不同所致。优方案的确定还需参考下面的方 差分析结果和验证实验。 表2 - 4 方差分析表 t a b 2 _ 4 a n a l y s i so fv a d a n c e 从方差分析表可以得到，压力和温度为显著性因素，全部的交互作用对实验结果均 无显著影响。在确定因素a 、b 、c 、d 的优水平时可以不考虑交互作用。 在确定优方案时，由于压力和温度为显著性因素，应根据均值与极差的结果取优水 平，即压力为2 0 m p a ，温度为4 0 c 。拟缩短实验时间在优方案中取c 2 ( 3 0 m i n ) ，考虑到 正交实验结果中第4 号实验之所以是p h 为7 ，可能是长时间灭菌处理时酸性环境会抑 制c 0 2 的溶解从而影响e c o l i 的杀灭对数值，因此当处理时间较短为3 0 r a i n 时，可选择 p n 为6 的酸性环境。最后优方案初步确定为a l b 2 c 2 d l ，即压力为2 0 m p a ，温度为4 0 ，处理时间为3 0 m i n ，菌悬液p h 为6 。 2 4 验证实验 从正交实验得到的最佳实验结果及正交实验中选取前四组进行验证实验，其设计与 结果见表2 5 。 表2 - 5 验证结果 t a b 2 5t h er e s u l t so f v a l i d a t e dt e s t 验证结果显示，当其他条件相同时，处理时间为6 0 m i n 比3 0 m i n 灭菌效果略好， 二者都远远高于商业无菌要求的6 个对数级。从生产效率考虑，选择处理时间为3 0 m i n 相对于6 0 m i n 可以成倍提高。同等条件下，菌悬液p h 为6 时灭菌效果较好而且更稳定。 综合考虑，最终的优选杀菌方案确定为：压力2 0 m p a ，温度4 0 ，p h 6 0 ，处理时间 3 0 m i n 。 2 5 本章小结 通过单因素实验确定对高密度c 0 2 杀灭大肠杆菌杀灭对数值影响较大的四个因素， 在此基础上进行正交实验，确定最佳工艺条件。实验结果表明，高密度c 0 2 杀灭大肠 杆菌的最佳工艺条件参数为：处理压力2 0 m p a ，温度4 0 ( 2 ，时间3 0 m i n ，菌悬液p h = 6 。 该条件下的杀灭对数值为7 3 1 。实验结果表明采用高密度c 0 2 杀灭大肠杆菌效果较明 显，达到6 个对数