（食品科学专业论文）谷氨酰胺转胺酶高产菌株的选育及其酶学性质的研究.pdf

沈| f f 】农业人学顾l 学位论史 独创性声明 本人卢明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名 婚黾均 剥币签名：强痞缸 时问： a 俯 年r 月9 同 时间： 硎z年上月p 同 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体匕发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究化签名： 导师签名： 蝽问拂 维杏红 时问： o 内6 年rj 】尸 时间： 2 ”年j j j 扩 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 谷氨酰胺转胺酶是一种新型的酶制剂，能够催化体外多种蛋白质之间、蛋白质和氨 基酸之阳j 的交联反应，使蛋白质改性，提高蛋白质的功能性和营养价值。因此，在食品 加工领域里具有多种重要的用途。国外对该酶的研究较早，而且产品已投入市场。在国 内，利用微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的历史较短，主要是摇瓶发酵条件的摸索与 分析，且多为实验室小试水平。有关酶的分离纯化等下游技术及酶学性质等方面的研究 报道，多限于对国外资料的综述。因此对谷氨酰胺转胺酶的研究显得尤为重要。 本文主要从以下四个方面进行研究： 1 谷氨酰胺转胺酶高产菌株的选育。通过紫外线和h e 一激光对其孢子进行复合诱变， 以谷氨酰胺转胺酶活力为指标，筛选获得高产菌株。 2 摇瓶发酵条件的优化。通过单因素实验和正交实验确定谷氨酰胺转胺酶发酵过程中 的最佳营养条件和环境条件。 3 谷氨酰胺转胺酶的分离纯化。对发酵后所产的谷氨酰胺转胺酶采用硫酸铵盐析、透 析脱盐、冷冻浓缩和s e p h a d e xg 一1 0 0 凝胶过滤层析方法进行纯化。 4 谷氨酰胺转胺酶酶学性质的研究。确定该酶的最适反应温度、最适p h ，研究该酶的 温度稳定性、p h 稳定性及金属离子对它的影响。 主要研究结果如下： 1 以灰轮丝链轮丝菌z c 0 3 为出发菌株，采用紫外线和h e n e 激光对其孢子进行复合 诱变，筛选获得一株遗传性状稳定、产酶能力提高5 7 的突变株z c 一6 0 。 2 以诱变后的菌株z c 一6 0 作为研究对象，对它的摇瓶发酵条件进行优化，得到其最佳 培养基组成为：可溶性淀粉3 0 0 9 几，蛋白胨3 0 o g 儿，酵母膏2 0 9 l 。最适环境条 件为：液体种子种龄为4 8 h ，接种量为l o ，初始p h 值为7 o ，2 5 0 m l 三角瓶装液量 为4 0 m l ，培养温度为3 0 ，摇床转速为1 6 0 r m i n ，发酵时间为6 4 h 。谷氨酰胺转胺酶 活力达1 3 4 u 1 1 1 l 。 3 经过盐析、透析脱盐、冷冻浓缩和s e p h a d e xg 一1 0 0 凝胶过滤层析，发酵后所得的粗酶 被纯化了5 2 6 倍，酶活回收率为6 1 3 2 。通过s d s p a g e 电泳检测纯度，样品达到电 泳级纯。 4 对冷冻浓缩后得到的粗酶的酶学性质进行研究，得到该酶的最适反应温度为5 0 ，最 适p h 为7 0 ：酶的温度稳定范围为0 5 0 ，p h 稳定范围为6 0 7 5 ；k + 、n a + 、c a ”、 l 中文摘要 b a ”、m g ”对m t g 的活性几乎没有影响而p b ”，c u 2 + 抑制酶活。 关键词：谷氨酰胺转胺酶，灰轮丝链轮丝菌，诱变，摇瓶发酵，纯化，酶学性质 2 沈阳农业大学硕七学位论文 a b s t r a c t t h et r a n s g l u t 锄i n a s ei san e wc r u d ee n 可m e i tc a f lc a t a l y s i st h er e a c t i o no fi n t e r s e c ta n dj o i na m o n g m a n yp m t e l n 、b e t w e e np r o t e i na 1 1 da m i n oa c i d ，m a k ep r o t e i nd e n a t u r e ，i n c r e a s ec a p a c i t ya n dn u t t i o no f p r o t e i n ，s oi t i si m p o r t a n tm o r ea n dm o r ei nt h ef 曲dt e c h n o l o g y t t h es t u d yo nm l n s g l u t a m i n 硒ei se a i e r a b r o a d ，a n dh a sm a d ep r o d u c ti nm a r k e t b u tt h eh i s t o r yo f 峭i n gm i c r o o 曙a n i s et of e n l l e n tt op r o d u c e t m n s g l u t a m i n a s ei ss h o r t e l a r i do n l ys t u d i n go nt h ec o n d i t i o n so fs h a l c 一订a s kf b n n e n 忸t i o n s t u d i e sa n d r 印o r to nm ep u r m c a t i o n 锄dp r 叩e r t i e so ft r a n s g l u t a m i n a s eh a v eo n i yg e n e r a l j z e dt h ef o r e i g nr e f e r e n c e s s oi ti sv e r yi m p o r t a n tt os t u d ym et r a r i s g l u 诅m i n a s e 。 t h i ss t u d yi n c l u d et h ec o n t e n tf o l l o w i n g ： 1 s c r e e n i n g o f m i c r o b es t r a i n f o rh i g h p m d u c t i o n t h e m i c r o b es 扛a i n i s m u t a t e d w i t hu l t r a v i o i e ta n d h e - n el a s e l 2 o p t i m i z i n gf b m l e n 诅t i o nc o n d i t i o n so fp r o d u c i n gt r a n s g i u t a l t l i n a s e t h r o u g hs i n g l ef 乱t o rd e s i g na n d o n h o g o n a ie x p e r i m e n tt oe s t a b l i s ht h esu i l a b l ec u l t u r ec o n d i t i o n so f s h a k e 一日a s k 3 s t t l d yo nt h ep u r 讯c a t i o n t h ec n l d ee n 纠m eo ft r a l l s g l u 诅m i n a s ei sp u r 访e du s i n gs a t u r a c i o no f 帅m o n l u ms u l f a t e d i a l y z i n 舀仃e e z ec o n c 怕t i n g 龃ds e p h a d e xg - 1 0 0 4 s t u d yo n 他p r o p e r t i e so f c m d ee n 2 y m e t h em a i nr e s u a r ea sf o o w i n g ： 1 s t r e p t r o v e r t i c i l l i u m 鲥s e o v e r t i c i i i a m mz c 0 3i sm u 纽t e dw - mu l 怕v i o l e ta n dh e - n e1 a s e l as 协b i ea n d h i g h - p r o d u c e ds t r a i nz c 6 0i so b t a i n e d ，i t si r a n s g l u t a m i n a s ea c t i v 时i n c r e a s e db y5 7 2 t h ea u t h o rs t u d i e dt h en a s kf 色m l e n t a t i o nc o n d i t o n s t h eb e s tc o m n e n t so f m e d i u m i ss o l u b i es t a r c h 3 0 9 ，p e p t o n e3 0 y e a s ie x t r a c to 2 9 ，t h es u i t a b i ec u l t u r ec o n d i t i o n so fs h a k e n a s ka r et h a ts e e da g ei s 4 8 h ，i n o c u l u ma m o u n ti s1 0 ，v o l u m eo f2 5 0 m l 玎a s k4 0 m l n i t j a lp hi s7 0 ，s h a k i n gi n3 0 a t 1 6 0 r m i nf o r6 4 h t h et r 湘s g i u t a m i n a s ea c t i v i t yr e a c h e dl f 3 4 u ，m l 3 b y s a t u r a t i o no fa m m o n i u m s u l 伽e ，d j a l y z i n f r e e z ec o n c e n t r a t i n g a n d s e p h a d e xg 一1 0 0 ， t r a n s g l u t a m j n a s ei sp u r 行e d5 2 6t i m e st h ee x t r a c tr e c o v e rm t eo ft h ee n 巧m ea c t i v i t yi s61 3 2 t h e a p p a r e n tp u r i t yi se x a m i n e d b ys d s - p a g e 4 t h ep r o p e n i e so ft h ec r u d ee n z y m ea r es t u d i e d t h e 叩t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp ha r e5 0 a n d 7 0 ，r e s p e c t i 、，e 】y t h ec r u d ee r i 珂m ei ss 忸b l eb e i o w5 0 a n dw n h i np h6 o - 7 5 m e t a li o n so fk + 、_ n a 十、 3 英文摘要 4 c 矛+ 、b a 2 + a n dm f + h a dl i t t l ee f e c to nt h ea c t i v 时o fm t gb u tp b 2 t 卸dc u 2 + c 蚰i i l l l i b i tt h ea c t i v 时o f t h ee n z y m e k e yw o r d s ：1 y a n s g l u t a m i n a s e s t m p t m v e r t i c i m u mg r i s e o v e r t i c m a t u m ，m u t a t i n 函s h a k e - n a s k f e r m e n t a t i o n ，p u r i n t i o n ；p m p e r t i e s 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 谷氨酰胺转胺酶的概况 蛋白质作为食物中的最重要的成分之一，向来受到人们的重视。但是许多蛋白质由 于氢基酸组成不理想，或是缺乏适当的结构和构想，使得这些蛋白质缺乏良好的功能性 质如溶解性、发泡性、乳化性、乳化稳定性，或者本身的营养价值不高。许多学者曾广 泛研究了对这些蛋白质进行化学修饰以改善它们的功能性质，但是考虑到化学试剂的安 全性问题及对食品营葬的影响，这些方法未能被人们普遍接受和应用。而酶法修饰由于 具有安全、快速、专一性强、对食品营养无破坏等优点，越来越受到人们的认可( s h i n y a t a n i m o t 0 ，j o h ne k i n s e l l a j ，1 9 8 8 ) 。 至今，人们用酶法对蛋白质进行修饰大量集中在利用一些蛋白水解酶类对蛋白质进 行局部水解来改善它们的溶解性和发泡性，而这些是远远不够的( 张雅丽等，1 9 9 4 ) 。 谷氨酰胺转胺酶( t r a n s g l u t a r n i i l a s e ，ec 2 32 1 3 ，以下简称m t g ) ，又称转谷氨酰胺酶， 是一种能催化蛋白质或肽链中谷氨酰胺残基的羧酰胺和伯胺之间的酰胺基转移反应，并 且使蛋白质分子之问交联聚合的酶( 郑美英等，2 0 0 1 ) 。可以催化蛋白质分子内的交联、 分子问的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接及蛋白质分子内一y 一谷氨酰胺酰胺基的水 解，从而赋予蛋白质产品特有的结构特性和粘和性能( 江波，周红霞，2 0 0 1 ) 。 1 1 1 来源 t g 广泛分布于各种生物体内，如微生物、植物和动物中，并在其中起重要的作用。 通常，t g 按其来源被分为动物来源的( g t g ) 、微生物来源的( m t g ) 和植物来源的三大 类。这些来源不同的t g 在理化性质、分子结构、酶学性质等方面有较大差异( m 0 t o k i m ， 1 9 8 4 ) 。 g t g 的生理功能涉及细胞生长、分化及凋亡等各个方面，与人类的一系列疾病有关， 如乳糜泻、自身免疫疾病、皮肤病、组织纤维化、慢性精神抑郁等。植物t g 既能催化 蛋白质交联，又能催化蛋白质与多胺的结合，参与细胞骨架的重组影响细胞分裂和生 长，并能稳定蛋白质结构，影响叶绿体光化学反应性能。但是由于两者来源稀少、分离 提纯工艺复杂，导致该酶的价格十分昂贵，不可能应用于食品工业。 利用微生物发酵法生产t g ，直到上世纪8 0 年代未才见诸报道。与动植物来源的t g 相比，微生物来源的酶具有很多优势( 王鑫，2 0 0 3 ) ： 相比，微生物来源的酶具有很多优势( 王鑫，2 0 0 3 ) ：5 第一章前言 ( 1 ) 对钙离子的非依赖性； ( 2 ) 对热、p h 的稳定性明显优于动植物来源的酶； ( 3 ) 更有利于保存，发酵液经离心和过滤后的酶液在一2 0 下可以贮存几个月而酶活 性仅损失l o ，而经过纯化的酶则更加稳定。 所有这些对该酶在工业过程中的使用都是很有利的，因而微生物谷氨酰胺转胺酶具 有广泛的研究价值。 1 1 2t g 的性质与结构 1 1 2 1 性质 m t g 是一种胞外酶，克分子量为4 0 k d ，为球状结构，单肽链，由3 3 1 个氨基酸构成， 活性中心包括带有自由硫巯基的位于链上6 4 位的c y s 残基。不同来源的t g 的性质不同， 如表1 1 所示。 表1 1 不同来源的时g 的性质( 叶丹英等2 0 0 0 ) t a b 】1f e a t i l r e so fm 1 bf r n md jf f e r e n ts o r c p r 未直到 1 1 2 2 结构 k a n a j i 等人通过快速原子轰击质谱及多肽链片断的e d m a n 降解，对不同来源的t g 结构进行分析。他们发现，s 一8 1 1 2 菌株的谷氨酰胺转胺酶包含3 3 1 个氨基酸。为单核 苷酸肽链，二级结构中q 一螺旋占2 1 ，b 一片层占3 1 ，三级结构为球形，整个分子为 亲水性，也点缀着一些疏水基团，酶分子中无c a 2 + 结合位点，故其催化作用与c a ”无关。 哺乳动物与s 一8 n 2 的谷氨酰胺转胺酶整体结构不相同，但都以6 4 位的半胱氨酸为活性 6 沈阳农业大学硕士学位论文 部位，若此半胱氨酸被取代则整个分子失去活性。h i y ak 柚a j i 等由此推断，它们的二 级结构是相似的，故均可起转氨基反应。哺乳动物的谷氨酰胺转胺酶又可分为i 型和i i 型，它们的整体氨基酸排列次序亦不同，但在活性部位半胱氨酸附近结构很相似，同时 均含有c a 2 + 结合位点，故其催化活性与c a ”结合位点的氨基酸序列有关。h i s a s h iy 酗u e d a 等发现非哺乳类动物的谷氨酰胺转胺酶与上二者均不同，它需c a ”，但并无含半胱氨酸 活性部位，只含有一些与豚鼠肝脏谷氨酰胺转胺酶相同的氨基酸序列( e n a i l t oy i l i l y 等 2 0 0 2 ) 。 1 1 3t g 的反应机理 t g 利用肽链上的谷氨酰胺残基的y 一甲酰胺基作为乙酰基供体。受体可以是蛋白质 上的或游离的赖氨酸的e 一氨基、伯氨基、水。 ( 1 ) 多肽链中赖氨酸残基的e 一氨基，形成蛋白质分子内和分子间的e 一( y 一谷氨 酰) 赖氨酸异肽键，使蛋白质分子发生交联，改善蛋白质的溶解性起泡性、乳化性等许 多物理性质，同时改变食物的质地和结构： ( 2 ) 伯氨基，形成蛋白质分子和小分子伯胺之间的连接，利用该反应将一些限制 性氨基酸引入蛋白质，提高其营养价值； ( 3 ) 水，当伯胺不存在时，水成为酰基受体，使谷氨酰胺残基中的氨基脱去，生 成谷氨酸残基，该反应可用于改变蛋白质的等电点和溶解度( 常中义等，2 0 0 0 ) 。 a 蛋白质或多肽的g 1 n 和l y s 之间的交联反应 r g l u c o n 1 2 + n 1 2 - r r _ g 1 u - c 0 - n i 一r + n l 3 b 酰基的转移反应 r g l u _ c o - n h 2 + n h 2 一l y s r 一r 书l u c o - n | i l y s r + n h 3 c 脱氨反应 r g l u c 0 一n h 2 + h o h r g l u c o 一0 h + n h 3 图1 1谷氨酰胺转胺酶催化反应机理 f i g 1 ，lp r i n c i p l eo fr e a c t i o nw h i c ht gc a t a ly z e d 1 1 4t g 活力的测定 关于谷氨酰胺转胺酶的活力测定到目前为止，还没有制定统一的、标准的方法。大 致可以依据以下原理进行测定：胺反应法是依据标记的丁二胺做底物以比色法测定其交 联反应的速率；氨基消去法是用三苯基磺酸盐测定剩余氨基的数量；分子量法是用s d s 第一章前言 聚丙烯凝胶电泳法测定分子量；氨释放法是用氨选择性电极检测氨的生成量。此外，还 可通过测定蛋白质的功能性、粘度及凝胶强度的变化来测量酶的活力。以上方法之间没 有必然的联系，测定结果受酶的来源、底物类型及具体反应条件的影响( p e r e z m a t e o s m 试a m 等，2 0 0 2 ) 。 目前应用最广的是f o l k l 9 5 7 年提出的单氧肟酸法。在t g 含量较低的情况下，可考 虑采用荧光法或同位素原子示踪法等更为灵敏的检测手段。 1 2t g 的生产 1 2 1 动植物中提取谷氨酰胺转胺酶 t g 存在于动物、植物和微生物中。从六十年代以来，对来自动物的t g 的纯化方法、 性质以及应用进行了广泛研究。豚鼠肝脏是近三十年商业用t g 的唯一来源，由于豚鼠肝 脏来源少，分离纯化过程复杂，其价格昂贵( z h uy e t a l ，1 9 9 5 ) 。而从鱼及植物组织中 提取的研究仍处于初级阶段。豌豆种子、羽扇豆种子等植物中存在t g ，但酶的分离纯化 工艺不适合进行工业化生产( f o l k ，1 9 8 0 ) 。 l2 2 微生物发酵提取t g 1 2 2 1m t g 产生菌株的选育 土壤是微生物的大本营，要从众多的微生物群体中，筛选到t g 产生菌种，是一件 相当困难的事。这主要是因为人们对t g 在微生物体中起的作用还不清楚，同时对t g 本 身了解的也不够全面。因此，到目前为止尚未见文献报道t g 产生菌的平板筛选方法。 1 9 8 9 年，日本a n d oh 等报道利用微生物发酵法生产婀g 。从土壤中筛选出5 0 0 0 株菌， 在这些菌中发现链轮丝菌s 一8 1 1 2 、茂原链轮丝菌、狄肉链轮丝菌、肉桂链轮丝菌等微 生物可产生谷氨酰胺转胺酶。链轮丝菌属其他菌株也产生m t g ，如肉桂链轮丝菌、茂原 链轮丝菌、灰肉链轮丝菌。另外，链霉菌属中菌株也产生m t g ( 周楠迪等，2 0 0 0 ) 。 1 2 2 2m t g 的发酵生产和代谢调控 发酵过程在原理上和其他各种微生物一样，葡萄糖、蔗糖、淀粉等作为碳源，无 机氮和有机氮等作为氮源：还需要矿物质及微量元素。如果需要，还需要加入非离子型 表面活性剂。整个发酵过程为好氧发酵，因此在发酵过程中需要通氧并进行搅拌。 1 9 8 9 年，同本a n d oh 等最早对谷氨酰胺转胺酶的生产进行了报道。微生物接种在 1 0 0 毫升培养基中p h 7 0 ，3 0 培养4 8 h ，然后将发酵液加到2 0 l 的新培养基中，通气1 0 l 矗 沈雕农业大学硕士学位论文 m i n ，转速2 5 0 r p m ，3 0 培养3 d 。发酵液酶活力范围在o 2 8 2 5 0 u m l 。主要由所用 菌种决定( a n d o l ，1 9 9 2 ) 。 1 9 9 6 年，台湾海洋大学的w uj e i w e n t 报道菌种旭w ，r f c 肌删缸出勋n 姗能够产t g 。 据报道，当有1 0 3 一1 0 4 c f u m l 的接种物在2 5 2 8 。l o o 一1 5 0r p m 培养4 天时，m t g 活性最 高。当加入2 p p m 抗生素c o l i s t i n 时可以提高产率3 0 9 6 。达到2 1 u m l 。另外，对生产m t g 的轮枝链霉菌s k l 的摇瓶条件进一步研究，当起始p h 6 5 8 o ，氮源、碳源为蛋白胨与 甘油，培养l l o h ，酶活最商达到1 8 u m 0 1 ( m i n m l ) 。在摇瓶条件下，以淀粉为碳源，蛋 白胨及酵母膏为氮源，又对茂原链轮丝菌w s h z 2 生产盯g 条件进行了探讨，发酵适宜初 始p h 值为6 1 ，淀粉质量浓度为2 9 d l ，接种量为1 0 ，菌体干重和酶活最高可达到 1 8 3 u m o l ( m i n m l ) 。对茂原链轮丝菌w s h z 2 分批发酵过程中的影响因素进行研究，发 现曲值对菌体的生长和产酶模式产生明显的影响，当发酵过程的p h 控制在6 5 ，最有利 于菌体的生长和酶的合成，在此条件下可达到较高的菌体干重和酶活：初始淀粉浓度以 3 9 d l 较适合，其菌体干重和酶活力最高，分别为2 5 1 9 l 和2 9 4 u m l ；中后期采用流 加碳源的策略使发酵时间缩短1 2 h 左右，酶活提高到3 0 5 u m l ( w u j e i w e n t 等，1 9 9 6 ) 。 1 9 9 8 年，z h u 等运用质量平衡原理，分析了发酵产酶过程中氨基酸的代谢情况。发 现仰v e ，f c f f f f “m 埘d 6 删腼p 在发酵后期，由于发酵液中的游离氨基酸与蛋白质被t g 交联，影响了菌体的生长和产酶，因此采用流加硫酸氨的方法可以使酶活提高8 0 ( z h u y 等，1 9 9 8 ) 。 2 0 0 0 年郑美英等运用质量平衡原理，用s f r e v e r f f c i f f j “巩m d 6 r 口 s e 生产t g ，采用流 加硫酸氨的方法使酶活达3 9 7 u m l ( 郑美英等，2 0 0 0 ) 。 2 0 0 1 年，常忠义从产t g 的轮枝链霉菌中筛选到一株命名为s k 4 0 0 1 的t g 产生菌， 通过添加人造沸石鳃除了铵离子对菌产t g 的阻遏，酶活达5 2 5 u m o l ( m i n m l ) ( 常中 义等，2 0 0 1 ) 。 1 2 2 3m t g 的分离纯化 t g 是一种胞外酶，分泌在发酵液中。分离纯化工艺类似干其他胞外酶的提取过程。 发酵结束后，先把发酵液离心分离，除去菌体然后处理上清液，即可得到酶制剂的产 品。超滤、离子交换、纸层析、色谱等其他技术也可用于m t g 的分离纯化。据报道，将 这些方法有机结合使用，可提高酶的纯度和分离效果。 a n d oh ( 1 9 8 9 年) 等报道，经超滤、a i i l b e i l i t ec g 一5 0 离子交换、b l u es e p h a r o s e 柱分离等步骤，酶被纯化了1 7 4 倍，总回收率为4 2 。g e r b e r ( 1 9 9 4 年) 等报道利用 9 第一章前言 s 抛w ，f f c 珊f “m 0 6 d m 甩s e 产t g ，经过离心和过滤后，滤液一次性通过强酸性阳离子交 换树脂，酶被纯化了1 2 8 倍，回收率达6 0 。该法选择性强，分离效果较好，酶活力 损失小，该酶在一2 0 下可贮存数月而酶活性仅损失1 0 。1 9 9 6 年，n 0 v e 公司报道利 用肼t e p f d 坩p so 础c 淞产t g ，发酵液经压滤后，滤液用3 k d a 超滤膜浓缩6 倍，然后加 入硫酸铵沉淀t g ，将沉淀溶解、透析、上s p s e p h a r o s e 柱分离，收集比酶活高的组分， 用1 0 k d a 超滤膜浓缩，再用b l u e s e p h a r o s e 柱除去杂蛋白，即可得到电泳纯的t g ( d o n d e r om 等，2 0 0 2 ) l o ( y 拈u e d a 等，1 9 9 4 ) 微生物 罱 ( a n d o 等1 9 8 9 ) ( a r o k h a r t 等，1 9 8 3 ) 图1 2 不同来源谷氪酰胺转胺酶的生产流程 f i g 1 _ 2 p r o c e s sc h a r to f t gd r o d u c t i o nd i f f e r e n ts 叫r c e s 团圆囤固 甲舄 蕃 沈阳农业火学硕士学位论文 1 3t g 的应用 由微生物生产的谷氨酰胺转胺酶广泛应用于食品、化妆品、皮革制品及纺织品工艺， 尤其在食品加工领域中有着广泛的用途。t g 在食品加工过程中的主要功能包括：( 1 ) 对 各种食品蛋白质进行改性，保护赖氨酸不发生各种化学反应，包封类脂质和脂溶性物资： ( 2 ) 形成抗热和抗水薄膜，胶凝蛋白质时避免进行热处理：( 3 ) 提高弹性和持水能力； ( 4 ) 改变可溶性和各种功能性质，从而生产出营养价值较高并含有人体所必须氨基酸 的食晶蛋白( 张红城等，1 9 9 8 ) 。 1 3 1 在肉制品加工中的应用 在肉制品加工中一个重要的问题是如何重组低价值的碎肉，提高制品的外观、风味 和质构，提高产品附加值。t g 在肉制品重组过程中可以发挥重要作用，因此t g 应用最多 的是肉制品工业。 研究发现，在体外多种蛋白质可作为t g 的底物发生交联反应，包括乳清蛋白、大豆 蛋白、肌球蛋白和酪蛋白等。而肌球蛋白是肉类中的重要蛋白，由于t g 可以使肌球蛋白 发生交联，所以能够改善肉制品的质构。对于蛋白质溶液，由于蛋白质分字发生交联时 会将水分子包裹在其中，因而会发生凝胶化作用。肉类蛋白质之间发生交联后，使得肉 制品更加富有弹性，形成良好的口感，而该酶对肉制品的其它风味不会产生影响( 王卫， 1 9 9 9 ) 。不仅如此，t g 催化e 一( y 一谷氨酰) 赖氨酸异肽链的生成，可以防止赖氨酸在 肉制品加工过程中发生副反应而损失( 王淼。吴小平，2 0 0 1 ) 。 s a k a l l l o t o 和s o e d a ( 1 9 9 1 年) 提出一种生产重组碎肉制品的方法。碎牛肉、碎猪 肉和其他原料包括t g 、面粉、奶粉、品质改良剂等，混含、成型、放入耐压容器内杀菌， 用此方法可以生产汉堡包、肉丸、烧卖等。s a k a f l l o t o ( 1 9 9 4 年) 提出另一种新方法生产 新鲜重组肉制品，该方法不需加热，只需加入食盐或磷酸盐，在t g 的作用下将碎肉粘结 在一起。从上面可以看出，在重组肉制品中使用t c ，可以充分利用肉制品加工中的副产 品( 如机械脱骨碎肉、明胶、血蛋白等) ：可以在低温条件下发生交联反应，进行重组； 并且可以将各种非肉蛋白质交联到肉蛋白质上，从而提高肉制品口感、风味、组织结构 和营养价值( 王海滨，1 9 9 8 ) 。 交联的蛋白质还可以作为脂肪替代物，用于生产低脂肉制品。n o v o 公司使用交联酪 蛋白凝胶作为脂肪替代物，在色拉米香肠的生产中代替了5 0 的脂肪( 吕心泉等，2 0 0 2 ) 。 用t g 处理还可提高肉制品的颜色，将血红蛋白交联后，可作为抗氧化剂在肉制品中 应用( w 瓠h i z uk 等，1 9 9 4 ) 。 第一章前言 1 3 2 在乳制品中的应用 乳制品中的a 一酪蛋白、b 一酪蛋白、x 一酪蛋白以及a 一乳清蛋白、b 一乳球蛋白等 都是t g 的良好底物，因而t g 在乳制品工业中也有很高的应用价值( a b o u l l l a 1 m o u d r ， s a v e i l op ，1 9 9 0 ) 。t g 在乳制品中的应用主要有： ( 1 ) 在奶酪生产中，经过t g 处理后，使乳清蛋白与酪蛋自交联在一起，可以提高奶酪 的产量( n i e l s e np m ，1 9 9 5 ) 。在酸奶生产中使用t g 可以生产高品质低脂酸奶。r e y a i l 等利用t g 交联乳清蛋白的a 一乳清蛋白和b 一乳球蛋白，干燥后可得优质乳清粉。在牛奶 生产中，添加0 0 2 的t g 可使产品奶粉不易结块，溶解性好，不易氧化变质。 ( 2 ) 乳中蛋白经过t g 处理后，可作为可食性涂膜、包装材料，提高产品外观及保质期 ( m o t o k i m ，1 9 8 7 ) 。 ( 3 ) t g 还可用于催化n 一酪蛋白交联形成网络状结构，并将各种酶包裹在此网络结构 中( m o t o k i m ，1 9 8 7 ) 。事实上，交联的酪蛋白网络被用作了酶固定化的载体，经过这 种固定化处理的酶能反复使用而不丧失活性。在t g 催化下，各种酶本身能与酪蛋白交 联，形成一种在可溶性一不溶性介质之间相互转化的酶催化系统。这些对于酶催化的理 论和应用研究都是非常有意义的。 1 3 3 在水产品中的应用 鱼肉蛋白在低温下形成凝胶，据报道是由于鱼肉本身所含的t g 作用的结果。在六 种不同种类的鱼中，t g 活力大约o 卜2 4 l u g ( 湿重) 。因此当原料品质比较差时，可 通过添加t g 提高产品凝胶强度、减少蒸煮损失、提高产品品质。 i c h i h a r a ( 1 9 9 0 ) 和w a k a n e d a ( 1 9 9 0 ) 报道了用t g 与鳕鱼肉、食盐、土豆粉等混 合，生产鱼肉饼的方法。t a n i ( 1 9 9 0 ) 报道了用骨胶或明胶在p h = 7 水溶液中加入t g ， 挤出成型，形成凝胶，最后干燥制成仿鱼翅制品。 1 3 4 在植物蛋白制品中的应用 i k a r a 和1 w a n i 使用t g 将赖氨酸交联到面筋蛋白、酪蛋白、大豆蛋白上，其中与 面筋蛋白交联最有效。f a e r g e m a n d ( 1 9 9 2 ) 研究表明，t g 对于优质小麦不能改善面团性 质：对于低质小麦可以促进面团性质，提高面包体积，改善组织结构。在生产蛋糕时每 克面粉加入3 个单位t g ，蛋糕口感、外观得到了提高( 张红城等，1 9 9 8 ) 。 所有研究都表明经过t g 处理后，大豆蛋白都发生交联，交联程度与球蛋白的表面 1 2 沈阳农业大学硕士学位论文 赖氨酸、谷氨酰胺的含量有关。因此要通过热处理、化学处理，使球蛋白结构打开，增 加表面的赖氨酸和谷氨酰胺的含量。大豆蛋白经过改性后，溶解性、对酸稳定性、乳化 性、乳化稳定性、凝胶性都得到提高( 彭志英，1 9 9 9 ) 。 k a t o ( 1 9 9 1 ) 使用t g 生产麻婆豆腐，在2 5 贮存6 个月后，仍有良好质构、口感和 外观。 1 3 5 其它应用 除了上述几种应用以外，t g 还能应用于很多方面。t g 不仅可以催化同种蛋白质之 间的交联，还能催化不同蛋白质之间的交联。各种蛋白质的氨基酸组成互不相同，因而 不同的蛋白质中的限制性氨基酸也不一定相同，通过t g 将它们连接起来，可以达到优 势互补的效果，提高蛋白质的营养价值。t g 在食品工业中的应用情况见表1 2 。 袭1 2 - t g 在食品工业中的应用情况( 郑美英等，2 0 0 1 ) t a b 1 2a p p “c a t i o no fm t gi nf o o dp r o c e s s i n g 第一章前言 总之，t g 作为一种新型的食品添加剂，通过对蛋白质的交联修饰作用，大大改善 了蛋白质的功能特性，对开发新型产品和提高产品品质具有积极的促进作用，应用前景 十分广阔。随着国内科研人员对t g 的发酵生产和应用方面研究的迸一步深入，以及国 内食品级的谷氨酰胺转胺酶制剂的推出，利用该酶研究开发出更多的新形食品，提高产 品的附加价值，增加经济效益，将对我国食品工业的发展起着巨大的推动作用。 1 4 研究意义和内容 1 4 1 研究意义 t g 作为一种新型酶制剂，能催化许多食品中蛋白质的交联反应，改善各种蛋白质 的功能性质，因而在食品工业领域具有极大的应用潜力。近年来，国夕 加快了微生物发 酵法生产t g 的研究，并使之应用于食品工业。目前市场上的微生物t g 商品化酶制剂均 为日本味之素公司所生产。但其在国内的销售价格较高，很难为国内的食品生产商所接 受，从而限制了该酶在生产中的应用。而在国内，该酶的研究尚处于起步阶段，但由于 发酵法生产t g 的历史很短，关于该酶优良菌种的选育、发酵生产后的分离提纯以及获 得纯酶的方法及酶的酶学性质等方面的研究报道很少，因而具有重要的研究价值。 1 4 2 本论文研究的主要内容 ( 1 ) 婀g 高产菌株的选育。通过紫外及h e n e 激光两种方法对其孢子进行诱变，获得 遗传性能稳定，高产m t g 的优良菌株。 ( 2 ) m t g 高产菌株实验室发酵条件的优化。通过摇瓶发酵，确定最佳的培养基和培养 条件。 ( 3 ) m g 的分离纯化。研究酶的下游技术，对从发酵液中提取的粗酶进行纯化，得到 纯酶产品。 ( 4 ) m t g 酶学性质的研究。研究粗酶的部分酶学性质，为该酶在食品工业中的应用奠 定基础。 1 4 沈阳农业大学硕士学位论文 第二章谷氨酰胺转胺酶高产菌株的选育 2 1 材料与方法 2 1 _ 1 实验材料 2 1 1 1 菌种 灰轮丝链轮丝菌z c 0 3 ：本实验室保藏菌种。 2 1 1 2 主要试剂 n a c b z g l n g l y ，l 一谷氨酸y 一单羟胺酸( s i g m a 公司) ，还原型谷胱甘肽( 中国 医药上海化学试剂公司) ，t r i s ( 天津大茂化学试剂公司) 。 2 1 1 3 培养基 2 1 1 3 1 生孢培养基( g l ) 牛肉浸膏1 o ，酵母浸膏1 o ，胰蛋白胨2 0 ，葡萄糖1 0 ，硫酸亚铁痕量，琼脂 1 5 o ，p h 7 2 。 2 1 1 3 2 斜面种子培养基( 高氏合成一号培养基) ( g l ) 可溶性淀粉2 0 0 9 ，硝酸钾1 0 ，磷酸氢二钾o 5 ，硫酸镁o 5 ，氯化钠o 5 ，硫酸 铁0 0 1 ，琼脂1 5 0 ，p h 7 o 。 2 1 1 3 3 平板培养基 同生孢培养基 2 1 1 - 3 4 液体种子培养基( g l ) 可溶性淀粉2 0 0 。蛋白胨2 0 0 ， 水磷酸二氢钾2 o ，p h 7 o 。 2 1 1 3 5 摇瓶发酵培养基( g l ) 可溶性淀粉2 0 0 ，蛋白胨2 0 0 ， 水磷酸二氢钾2 0 ，p h 7 0 。 2 1 1 4 实验仪器 s w c j l f 超净工作台 h i m a cc r 2 l g 高速冷冻离心机 b p 2 1 0 s 万分之一天平 酵母膏2 o ，无水硫酸镁2 o ，磷酸氢二钾2 o ，无 酵母膏2 o ，无水硫酸镁2 0 ，磷酸氢二钾2 0 ，无 苏州安泰空气技术有限公司 日本日立公司 德国 第二章谷氨酰胺转胺酶高产菌株的选育 f a 一2 0 0 4 型电子天平上海天平仪器厂 u v ll o o 紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司 h z q f 1 6 0 全温震荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发公司 h g 3 0 3 3 a 型电热干燥培养箱南京试验仪器厂 l o 卜2 a 型数显电热鼓风干燥箱 上海沪南科学仪器联营厂 p h s 一2 5 型酸度计上海理达仪器厂 不锈钢手提式灭菌器 上海申安医疗器械厂 h h 一6 型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司 b x 4 1 系统显微镜 日本奥林巴斯光学工业株式会社 p m 2 0 全自动显微照相设备 日本奥林巴斯光学工业株式会社 g y 一3 型h e n e 激光器天津 2 1 2 实验方法 2 1 2 1 培养方法 2 1 2 1 1 种子培养 将保藏予4 的斜面种子接到新鲜斜面种子培养基上，2 8 恒温培养6 7 天，活 化传代两次。然后将活化好的斜面菌丝接到装有7 0 m l 液体种子培养基的5 0 0 m l 三角瓶 中，2 8 、1 6 0 r m i n 培养4 8 h 。 2 1 2 1 2 摇瓶发酵培养 将培养好的液体种子按1 0 9 6 的接种量接入装有4o f f l l 摇瓶发酵培养基的2 5 0 m l 三角瓶 中，2 8 、1 6 0 r m i n 恒温培养6 5 h 7 0 h 。 2 1 2 2 诱变方法 微生物诱变育种，一般按照图2 1 ( 杜连祥等，1 9 9 2 ) 所示工作程序进行。 2 1 2 2 1 孢子悬浮液的制备 用无菌生理盐水将斜面上生长成熟的孢子沈下来，倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶 中，振荡3 0 m i n 使孢子充分散开，用脱脂棉过滤，离心洗涤两次，适当稀释调整孢子浓 度为1 0 8 个m l ( 祖诺夫等，1 9 9 3 ) 。 1 6 沈阳农业火学硕士学位论文 赢 细胞或孢子悬浮液制备 i 活细胞计数 诱变预备实验诱变剂处理 上活细胞计数 中间培养 突变株分离 士 初筛卜复筛 图2 1诱变育种工作程序 f i g 1 ，2 t h eg e n e r a lp r o c e d u r eo fm u t a ti o n 2 1 2 2 2 紫外线致死曲线的制作 方法参照文献( 张贵友，2 0 0 3 ) ，略有改动。各取l o i i l l 的孢子悬浮液于9 个9 c m 的 无菌培养皿中，在1 5 w 的紫外灯( 紫外灯须预先打开稳定1 5 m i n ，使其输出功率稳定) 下，距离保持在3 0 c m ，分别照射1 0 s 、2 0 s 、3 0 s 、4 0 s 、5 0 s 、6 0 s 、7 0 s 、8 0 s 、9 0 s 。取 1 0 一、1 0 一、1 0 。3 三个稀释度的菌液各0 2m l 涂布平板，将平皿用黑布包好，2 8 避光培 养5 d ，计算菌落数，以未经紫外照射的孢子悬液为对照组，计算致死率。以照射时间 为横坐标，致死率为纵坐标，作紫外线的致死曲线。 2 1 2 2 3h e n e 激光致死曲线的制作 各取2 m l 的孢子悬液于6 个1 5 1 0 0 的无菌试管中，用h e n e 激光器( 波长为6 3 2 8 n m ， 1 5 m w ，距离3 0 c m ) ，照射时间分别为5 m i n 、1 0m i n 、1 5 m i n 、2 0 m i n 、2 5 m i n 、3 0m i n 。 取l o 一、l o 、1 0 。= 三个稀释度的菌液各o 2 m l 涂布平板，2 8 恒温培养5 d ，计算菌落数， 以未经照射的孢子悬液为对照组，计算致死率。以辐射剂量为横坐标，致死率为纵坐标， 作h e n e