（食品科学专业论文）有机相脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸二酯的研究.pdf

摘要 有机相脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸二酯的研究 学科、专业：工学、食品科学 硕士研究生姓名：赵佳 指导教师：冯螽，张晓鸣 摘要 入学时间：2 0 0 7 年9 月1 日 答辩时间：2 0 0 9 年1 2 月1 1 日 授予学位时间： 糖酯是一类用可再生资源合成的、无毒、易生物降解的非离子型表面活性剂，目前 已经广泛应用于食品、制药和化妆品等行业，是世界卫生组织( w h o ) 和联合国粮农组织 ( f a o ) 推荐使用的食品添加剂。本文以麦芽糖和月桂酸为原料，以n o v o z y m4 3 5 脂肪酶 为生物催化剂，在有机相中合成麦芽糖月桂酸酯。 首先，研究了5 种脂肪酶的催化性能，筛选出适合合成麦芽糖酯的生物催化剂。通 过比较，发现n o v o z y m4 3 5 在合成反应时间曲线、酶添加量以及酶稳定性三个指标方面 的性能均表现出较大的优势，其他四种脂肪酶或不表现出催化活性或催化活性相对较 低。因此选定n o v o z y m4 3 5 为合成用酶。 在研究脂肪酶在几种常用溶剂中的催化性能基础上，为选择性合成麦芽糖月桂酸二 酯，选择叔戊醇d m s o 、乙腈丙酮、乙腈正己烷和丙酮正己烷四种双组分溶剂组合， 改变组合中溶剂配比，考察脂肪酶对麦芽糖酯的合成选择性及其与混合溶剂的疏水性之 间的关系。确定丙酮正己烷混合溶剂体系为合成麦芽糖月桂酸二酯的最佳反应体系，并 在该体系中优化了麦芽糖月桂酸二酯的合成工艺。得出最佳条件为：麦芽糖添加量 7 5 m m o l l ，酸醇摩尔比4 ：1 ，脂肪酶添加量 0 9 l ，分子筛添加量6 0 9 l ，5 0 下水浴 振荡反应7 2 h ，麦芽糖月桂酸二酯酯化率为6 7 5 。 研究了麦芽糖月桂酸酯的表面性质如水溶性、h l b 值、起泡性能以及乳化性能。配 置一系列不同配比的单酯二酯混合溶液，研究其起泡性能与乳化性能，发现：添加1 0 的二酯能使单酯乳化性从8 2 提高到9 5 ，乳化稳定性从8 2 提高到9 1 ，但对起泡 性能没有提高。 关键词：脂肪酶催化；混合溶剂体系；麦芽糖月桂酸二酯；表面性质 a b s t r a c t a b s t r a c t c a r b o h y d r a t ef a t t ya c i de s t e r sa l en o n i o n i cs u r f a c t a n t st h a tc a nb es y n t h e s i z e df r o m r e n e w a b l es o u r c e s n l cm a i np r o p e r t i e so ft h e s ec o m p o u n d sa l et h e i rb i o d e g r a d a b i l i t ya n d n o n t o x i c i t y s u g a re s t e r sa r er e c o m m e n d e df o o da d d i t i v e sb yf a o a n dw h o n o wt h e yh a v e b e e nw i d e l yu s e di nf o o d p h a r m a c e u t i c a la n dc o s m e t i ci n d u s t r i e s i nt h i sa r t i c l e ，l a u r o y l m a l t o s ew a ss y n t h e s i z e db yl a u r i ea c i da n dm a l t o s e f i r s t l y , t h er e a c t i o nt i m e ，t h ed o s ea n ds t a b i l i t yo fl i p a s ew e r es t u d i e d b yc o m p a r i s o n ， n o v o y z m e4 3 5l i p a s ep r e s e n t e dh i g h e rs e l e c t i v i t ya n da c t i v i t y s ow ew o u l du s en o v o y z m e 4 35a sc a t a l y s ti nf o l l o w i n gw o r k t h e nt h ec o n v e r s i o nr a t i oo fl a u r o y lm a l t o s ee s t e r , t h es o l u b i l i t yo fm a l t o s ea n dt h e r e s i d u a le n z y m a t i ca c t i v i t yo ff i v es o l v e n t s ( d m s o ，t e r t - p e n t a n o l ，a c e t o n e ，a c e t o n i t r i l ea n d 甩一h e x a n e ) w i t hd i f f e r e n th y d r o p h o b i c i t yw e r et e s t e d a m o n gt h ef i v es o l v e n t s ，a c e t o n e w a st h em o s ts u i t a b l em e d i u m ，b u tt h es e l e c t i v i t yw a sn o ty e ts a t i s f a c t o r y i np a r t i c u l a r , t h ep r o p o r t i o no fd i e s t e rw a ss t i l ll o w i no r d e rt of i n dt h es u i t a b l er e a c t i o nm e d i af o rt h e p r o d u c t i o no fd i e s t e r , v a r i o u sc o m b i n a i t i o n so fa b o v es o l v e n t sw e r ei n v e s t i g a t e d ，s e e k i n g t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h eh y d r o p h o b i c i t yo ft h es o l v e n tc o m b i n a i t i o n sa n dt h es e l e c t i v i - t 、，f o rm o n o a n dd i l a u r o y lm a l t o s e i tw a sf o u n dt h a tt h ea c e t o n e n - h e x a n ew a st h eb e s t r e a c t i o ns y s t e mf o rs y n t h e s i z i n gd i l a u r o y lm a l t o s e ，a n dt h ey i e l do fd i l a u r o y lm a l t o s ew a s i n c r e a s e df r o m12 t o6 7 5 b yc h a n g i n gt h es o l v e n tf r o mp u r ea c e t o n et oam i x t u r eo f a c e t o n ea n dn h e x a n e ( 6 0 ：4 0 ) a n db yo p t i m i z i n gb ea m o u n t so fm a l t o s e ，l a u r i ea c i d , m o l e c u l a rs i e v ea n dl i p a s e t h em o n o l a u r o y lm a l t o s ew a sh i g h e ri nt h es o l u b i l i t ya n dh l bv a l u et h a nd i l a u r o y l m a l t o s e t h ef o a m a b i l i t i e s ，f o a ms t a b i l i t i e s ，e m u l s i l y i n ga c t i v i t i e sa n de m u l s i o ns t a b l i t i e so f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fl a u r o y lm a l t o s ew e r ea l s oc o m p a r e d m o n o l a u r o y lm a l t o s eh a d b e t t e rf o a m a b i l i t i e sa n de m u l s i f y i n gp r o p e r t i e s f u r t h e rm o r e ，w h e nm o n o e s t e ra n dd i e s t e r m i x e d ，t h ee m u l s i f y i n gp r o p e r t yw o u l db ei m p r o v e d k e yw o r d s ：l i p a s e - c a t a l y z e d ；s o l v e n tm i x y u r e ；d i l a u r o y lm a l t o s e ；s u r f a c t a n tp r o p e r t i e s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：垫垒日期：2 p 0 7 年，上月彦日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：盘鱼导师签名：i 塾叁 日期：加? 年，2 月3 日 l 引言 1 引言 1 1 酶在非水相催化合成糖酯中的应用 1 1 1 糖酯及其应用 糖酯是具有重要生理活性的一类非离子生物表面活性剂，广泛应用于食品、制药 业和洗涤业。糖类( 碳水化合物) 是具有丰富来源的天然产品，化学稳定性好，易生物降 解，而且是一种可以再生的资源。糖酯即部分酰基化的糖，具有亲水和疏水基团的双亲 分子，故有较好的表面活性剂的特性，而且能被微生物降解而对环境无害【l 】。作为一种 生物功能分子和化工原料，糖酯在食品工业及其相关领域的应用主要包括作为食品乳化 剂和稳定剂【2 1 、润滑剂和分散剂【3 1 、食品质地改良剂【4 1 以及保鲜杀菌剂【5 1 等。此外，糖酯 还可以在医药工业中作为药物辅剂，在化妆品工业中作为化妆品的辅料，增加皮肤的光 润性、滑嫩性、水洗性能，防止油脂沉淀、产品腐败变质、延长产品保存期等。目前商 品化的糖酯是蔗糖酯，应用于工业中的通常是蔗糖单酯及多酯的混合物。麦芽糖酯较蔗 糖酯来说研究得较少，但是实验表明其某些表面性质优于蔗糖酯，在化妆品医药抗菌方 面的应用潜力很大【6 】。图1 是麦芽糖与月桂酸成酯的反应方程式。 麦芽糖 竺竺! 竺! ! + 丙酮，5 0 c 飞、 一、 邢o h o 月桂酸 麦芽糖月桂酸单酯 八v 八0 h o 月桂酸 图l 麦芽糖和月桂酸合成反应方程式 f i g 1r e a c t i o nb e t w e nm a l t o s ea n dl a u r i ca c i d 江南大学硕+ 学位论文 1 1 2 常用于催化合成糖酯的酶 与传统的化学法相比，酶法合成因具有良好的专一性、选择性以及副产物少而受到 广泛重视【j 7 1 。催化糖酯合成的酶主要有脂肪酶、蛋白酶等。脂肪酶是最早用于糖酯类化 合物合成的酶，最为常用的有来源于c a n d i d aa n t a r c t i c a 的游离脂肪酶及固定化脂肪酶、 源于p s e u d o mo n a sc e p a c e a 的脂肪酶、源于c a n d i d ac y l i n d r a c e a 的脂肪酶以及猪胰脂肪 酶。除脂肪酶外，来源于b a c i l l u s s p 的蛋白酶能在极性较强的有机介质如n ，n 二甲基 甲酰胺( d m f ) 、吡啶等溶剂中保持活力，催化糖酯的合成【8 j 。脂肪酶和蛋白酶的催化 活性及选择性不仅与酶源有关，且受底物种类、反应体系性质、环境条件等的影响。常 用于催化糖酯合成的酶之种类及来源如表1 所示一j 。 表1 常用于糖酯合成的酶 t a b l e le n z y m ec o m m o n l yu s e di ne n z y m a t i cs y n t h e s i so fs u g a re s t e r s 脂肪酶在微生物中分布很广，据估计，细菌有2 8 个属、放线菌有4 个属、酵母菌 1 0 个属、其他真菌2 3 个属，共计达6 5 个属的微生物能产生脂肪耐1 0 1 。一些商品化的 脂肪酶及其供应商见表2 【1 1 1 。 表2 几种商品化的脂肪酶 t a b l e 2c o m m e r c i a ll i p a s e sa n dt h e i rs u p p l i e r s 微生物脂肪酶按其催化选择性可分为二大类：第一类无立体选择性，如c a n d i d a s p 9 9 。1 2 5 脂肪酶旧；第二类是立体选择性脂肪酶，如a c i n e t o b a c t e r j u n i i s y - 0 1 脂肪酶、 p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s 脂肪酶【1 4 1 以及c a n d i d ar u g o s a 脂肪酣1 习等。所谓立体选择性是 指一种底物在特定的反应中可能生成两个或两个以上立体异构的产物时，在酶的催化下 二 只有其中一种立体异构体占优势。这类脂肪酶有重要用途，如不对称合成物的动力学拆 2 1 引言 分等。真菌脂肪酶多为胞外酶，较易分离提取又易于培养，所以在酶制剂工业中深受青 睐。在产脂肪酶的真菌当中，来源于青霉菌属的国内外报道比较多，如扩展青霉【l 引， p a u r a n t i o g r i s e u m 2 4 1 ，圆弧青霉【2 5 】，p r e s t r i c t u m 2 1 1 ，产黄青掣2 2 1 ，尸朋e 掰6 e 历一2 3 1 ，橘 青霉【1 9 1 ，p 啪砌口力f 一2 0 】等。然而，同属不同种的以及同种不同菌株来源的脂肪酶的氨基 酸序列相差颇大【1 6 , 1 8 , 2 6 ，酶学性质也存在差异。脂肪酶催化合成糖类衍生物具有高选择 性，高效、反应条件温和等优点，是目前国内外研究的热点。目前糖酯合成研究大多采 用来源荧光假单胞菌和洋葱假单胞菌以及来自c a n d i d ar u g o s a 和c a n d i d ac y l i n d r a c e a 的 脂肪酶。来自r o r y z a e 和m u c o r m i e h e i 的脂肪酶在转酯反应中的应用使得转化率达到了 理论上的最大值2 7 1 。高旭例以n o v o4 3 5 脂肪酶为催化剂，以丙酮为反应溶剂，在连续 反应器中，选择性合成麦芽糖月桂酸单酯，酯化率达到9 3 。t s i t s i m p i k o u 2 9 】等把单糖 固定在硅胶上后再作为底物进行反应，比较了来自于c a n d i d aa n t a r c t i c a 和c a n d i d a r u g o s a 两种脂肪酶催化糖和月桂酸的酯化反应，获得了较好的产率和区域选择性。张念 湘【3 0 j 等考察了7 种脂肪酶的催化活力，研究了酶催化乙酸乙烯酯和单糖反应合成糖酯， 发现来自假单胞菌属的p s l 活力最高，得到较高的转化率。从现有文献来看，来自于 ca n t a r c t i c 的固定化脂肪酶n o v o y z m 4 3 5 因其良好的立体选择性、操作稳定性和催化活 性，被广泛应用于糖酯合成反应中。 1 2 酶促合成糖酯的反应体系 在应用脂肪酶催化糖酯合成研究中，溶剂体系即反应介质需同时满足保持酶的活性 和底物溶解性的要求，而这两者对溶剂的极性要求是矛盾的，因此溶剂的选择具有一定 的限制性。目前应用于酶促合成糖酯的反应体系主要有以下几种： 1 有机溶剂体系 单相有机溶剂体系( m o n o p h a s i co r g a n i cs o l u t i o n ) 是指用与水不互溶的有机溶剂取 代溶剂水( 9 8 ) ，形成固相酶分散在有机溶剂中的单相体系。酶处于这种体系中时， 其表面必须有残余的结构水，才能保证酶的催化活性【3 2 1 。一般有机溶剂中含有小于2 的微量水。常用的有机溶剂有烷烃类、醚、芳香族化合物、卤代烃等。 2 无溶剂体系 无溶剂体系( s o l v e n t f r e es y s t e m ) 不使用有机溶剂，可避免溶剂对酶和产品使用安全 性的影响。“固固”反应体系( s o l i dt os o l i ds y s t e m ) 主要由不溶的反应物和产物组成， 是酶催化糖酯合成反应中一种常用的无溶剂体系【3 3 矧。虽然不容物含量较高，但在无溶 剂体系中，酶促反应实际上仍在液相中进行，因此液相的形成对“固固 反应体系至 关重要【3 5 1 。反应过程中，部分底物首先溶解于液相中，然后在酶的催化下生成产物。由 于液相的体积很小，生成的产物很快从液相中析出，从而推动反应的持续进行m 】。液相 主要通过添加微量的在反应温度条件下呈液态的“助溶剂 形成，它的作用是将糖和酸 制备成均匀的液相体系【3 6 1 。助溶剂一般是水、有机溶剂或水与有机溶剂的混合物。在无 溶剂体系中加入一定量的助溶剂可改善液相的组成，调节液相的体积、粘度、组成和各 组分间的比例及固相在液相中的分散量和分散程度，增加糖的溶解，从而加快反应速度 江南大学硕士学位论文 和提高产率。在反应后期，由于产物的大量析出，混合物固化现象明显，底物与酶之间 的接触受到阻碍，酯化反应速度降低，这时添加助溶剂可明显改善反应速率1 3 引。在固 固体系中，c a o 等用n o v o4 3 5 催化棕榈酸和葡萄糖的酯化时，极性较强的助溶剂可促进 糖的溶解和产物的析出，从而有利于反应的进行【3 4 】。在无溶剂体系中，用丙酮缩糖代替 单糖合成葡萄糖酯和半乳糖酯，可将反应时间缩短至几个小时，降低了成本有利于工业 化生产【9 1 。 3 离子液体 离子液体( i o n i cl i q u i d s ) 是一种在室温或较低温度( 3 的非极性溶剂对酶具有很好的保护作 用，但是对糖的溶解存在很大的限制性，若在某些应用中不得不使用这类溶剂时，就必 须在酶的稳定性与底物的溶解性之间进行权衡 6 q ，此时，“混合溶剂系统或许是一种 最佳的折中方案。 表3 一些常见溶剂的l o g p t a b l e 3 1 0 9 eo fs o m eu s u a lo r g a n i cs o l v e n t s 目前对非水介质中酶促合成糖酯反应的研究主要是在单一有机溶剂中进行的。为使 反应顺利进行，所用的溶剂必须满足两个条件：( 1 ) 具有较高的疏水性，以最大程度地 保留酶的催化活性；( 2 ) 易于溶解底物【4 7 1 。一般的有机溶剂对脂肪酸有较高的溶解度， 但对糖的溶解度较低，使酯化反应受到限制，而且有文献指出，溶解二糖的溶剂对酶有 抑制作用【4 引。用脂肪酶催化麦芽糖和中长碳链脂肪酸反应的难点在于，溶剂体系必须同 时兼顾对底物的溶解作用和对酶的稳定作用，而这两者是有矛盾的。若采用混合溶剂体 系，可以比单一有机溶剂能更好地满足上述两方面的要求，还可以调节酶促酯化反应的 选择性。 不少研究者都做过对糖酯合成的两种甚至三种溶剂的混合溶剂体系的探讨【4 9 】传统溶 剂如醇和酮可以部分溶解糖，单糖在其中能成功反应，但是二糖、低聚糖在这些溶剂中 的溶解度较低。f r a i l c i s c 0 【5 0 】等人尝试了利用混合溶剂体系合成二糖酯。二甲亚砜对二糖 5 江南大学硕士学位论文 具有很好的溶解性，反应前，糖先溶解在少量的二甲亚砜中，然后加到叔戊醇里。由于 反应介质大部分都是叔戊醇，酶的活性较少被抑制。混合溶剂的应用主要是基于一个原 则：以能保持酶活性的溶剂为主溶剂，然后添加一定量的、可以增加底物溶解度的助溶 剂，以确保反应的顺利进行。将两种有机溶剂混合，发现木糖油酸二酯的转化率随着溶 剂极性的下降而增大【4 5 。 1 4 立题背景和意义 由于糖酯无毒、易生物降解及良好的表面活性以及在食品、医药和化妆品等行业广 泛的应用性，糖酯合成技术日益受到研究者的关注。化学法相比，酶作为生物催化剂所 具有反应条件温和及良好的区域和位置选择性，以及明显的立体专一性，可合成高质量 的糖酯，而且酶法合成的糖酯产品纯度高、色泽浅，使用效果优良，还具有特殊的生理 功能，越来越受到人们的重视。 国外对在脂肪酶催化糖酯合成领域，已经对间歇生产中的合成机制、酶的选择性酯 化、水分含量对反应的影响和工艺条件的优化等各个方面有了一定的研究，同时在脂肪 酶催化合成糖酯反应的平衡转化率和产物水分对反应平衡的影响的数学模型方面有所 探索，现有的研究成果较多集中在单糖短链脂肪酸合成糖酯。本实验室团队在此基础上， 对麦芽糖月桂酸酯的连续生产工艺做了初步探索的研究，确定了合成麦芽糖月桂酸单酯 的连续生产工艺，并对麦芽糖月桂酸单酯的一系列理化性质做了初步的研究，但在麦芽 糖月桂酸二酯的合成以及表面性质方面的研究尚未涉及。因此，本研究在以往实验成果 的基础上，进一步探讨有机相酶法合成麦芽糖月桂酸二酯的有效溶剂体系。另一方面， 由于糖分子带有多个亲水性的羟基，单糖酯的h l b 值较高，h l b 值较低的糖酯必然是 多酯( 含二酯) 。因此，要获得h l b 范围较宽的糖酯产品，就必须研究二酯的合成，这 对酯化反应的选择性提出了更高的要求。 1 5 主要研究内容 1 筛选有机相催化合成麦芽糖月桂酸酯的脂肪酶 2 以筛选得到的脂肪酶为生物催化剂，研究溶剂体系对酶催化反应选择性及活性的影 响，筛选出适合麦芽糖月桂酸二酯合成的反应体系，并对其合成工艺进行优化。 3 分离纯化麦芽糖月桂酸单酯及二酯，研究麦芽糖月桂酸单酯、二酯以及单酯与二 酯以一定的比例混合复配后的混合酯的表面活性 6 2 材料与方法 2 实验材料与方法 2 1 材料与试剂 酶制剂：n o v o z y m4 3 5 脂肪酶( 以下简称为n 4 3 5 ) ，诺维信( 中国) 生物技术有限 公司；l v k f 脂肪酶，深圳绿微康生物技术有限公司；c y 脂肪酶，北京中纺化- 1 - _ ：l i p a s e r 脂肪酶，日本g m a n o 公司；n e w l a s ef 3 g 脂肪酶( 以下简称f 3 g ) ，日本g m a n o 公司。 化学制剂：1 1 6 ”分子筛，上海恒业分子筛有限公司；月桂酸，豆蔻酸，棕榈酸， 硬脂酸，皆为化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司：葡萄糖，麦芽糖，氢氧化钠， 丙酮，正己烷，乙腈，叔戊醇，二甲亚砜，三氯甲烷，甲醇，苯，n ，n 二甲基甲酰胺， 无水硫酸钠，t w e e n2 0 ，t w e c n 4 0 ，t w e e n8 0 ，s p a n 2 0 ，s p a n 4 0 ，s p a n6 0 ，s p a n8 0 ， 皆为分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司；麦芽三糖，分析纯，上海晶纯生物科技 有限公司；甲醇，色谱纯，中国医药集团上海化学试剂公司；大豆色拉油，东海粮油有 限公司。 2 2 仪器与设备 s h z 8 8 台式水浴恒温振荡器，江苏太仓实验设备厂；扩口层析柱，上海锦华层析设 备厂；旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；1 0 1 t l 微量进样器，上海医用激光仪器厂；x w - 8 0 型漩涡混合器，上海第一医学院仪器厂；t d l 4 0 b 型台式离心机，上海安亭科学仪器 厂；b s z 1 0 0 自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂；a g i l e n t11 0 0 高效液相色谱系统， 美国安捷伦公司；真空干燥箱，上海精宏实验仪器公司；真空泵，郑州长城仪器设备公 司；磁力搅拌器，广州仪科实验室技术有限公司；h l 一2 s 型恒流泵，上海青浦沪西仪器 厂；c d c a 1 0 0 f 型表面张力仪，英国c a m t e l 公司；f j 2 0 0 型高速均质分散机，上海标 本模型厂。 2 3 实验方法 2 3 1 有机溶剂脱水 将4 a 分子筛于2 5 0 马福炉内活化6 h ，置于干燥器中冷却，在有机溶剂中加入活 化分子筛，浸泡4 8 h 以上备用。 2 3 2 脂肪酶催化合成反应 麦芽糖、月桂酸和3 a1 1 6 分子筛称量至具塞试剂瓶中，加入脂肪酶，在有机溶剂 中水浴振荡反应。 2 3 3 反应液的前处理 反应结束后，将反应液过滤除去分子筛和脂肪酶，旋转蒸发除去溶剂，置于冰箱中 保存待测。 7 江南大学硕士学位论文 2 3 4 反应液的薄层层析检测 薄层板制作：称取一定量的硅胶g ，置于研钵中，加少量去离子水混合研磨均匀。 静置3 0 m i n 后，硅胶凝结成糊状，再加入适量去离子水研磨均匀，形成乳状液。取切割 成6 0 x 1 2 0 m m 的长方形玻璃板做底板，用9 5 的乙醇擦拭干净。将研磨好的硅胶g 乳 状液平铺在玻璃板上，形成薄层板，硅胶厚度约为0 2 5 m m 。水平置于通风处，自然晾 干后，放入1 2 0 烘箱中活化l 小时，冷却置于干燥器中备用。 硅胶板薄层层析检测的操作步骤如下： 点样：采用微量进样器( 1 0 “l ) 进行点状点样。点样位置在薄层板下端o 5 c m 处， 所有的样品点应在同一条水平线上。 展开：将点好样品的硅胶板放入盛有少量展开剂的薄层展开缸中展开，注意展开 缸中展开剂的液面不得超过薄层板点样的起始线，展好后将其取出晾干，使展开剂挥 发完全。展开剂：氯仿甲醇( 4 ：1 ) 。 以上步骤均在室温下进行。 显色：将展开后的薄板先置于暗箱式紫外透射仪中观察，之后将显色剂均匀喷在 薄板上，并在烘箱中加热显色。根据其颜色、比移值( r f ) 是否一致，以及紫外透射仪 下是否有荧光及其颜色、比移值等因素，综合考虑判断，作为各组分定性依据。麦芽 糖酯各斑点呈均匀的黑色。 r f = 原点至斑点中心的距离原点至溶剂前沿的距离( 1 ) 显色剂：5 ( v v ) 硫酸乙醇。 2 3 5 麦芽糖酯的硅胶柱层析 称取一定量的硅胶( 1 0 0 2 0 0 目) 置于烧杯中，加入柱洗脱剂没过硅胶浸泡2 小时。 连续倒入玻璃柱中( 防止分层形成界面) ，装柱期间保持流动相流动，防止气泡产生。 装至硅胶液面离柱口1 0 c m 左右停止。继续保持流动相流动，洗脱2 3 个柱体积之后， 静置平衡2 4 h 之后备用。 酯化反应结束后，将反应液过滤，回收其中的酶和分子筛，滤液经真空旋转蒸发器 蒸干溶剂，用适量无水正己烷溶解后，4 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，沉淀为糖酯混合物。将混 合物用流动相氯仿甲醇( 4 - 1 ) 溶解后上硅胶柱( 硅胶1 0 0 2 0 0 目，1 2 m m x l 0 0 0 m m 玻 璃柱) 分离。流动相流速为1 8 m l h ，1 管1 0 m i n 收集洗脱液。洗脱液经t l c 检测后， 分段收集，展开剂与流动相相同。将收集液真空旋转蒸发除去溶剂，残余物放入真空干 燥箱常温干燥至恒重。 2 3 6 脂肪酶稳定性测定 反应过后，过滤收集脂肪酶，用有机溶剂洗涤2 至3 次，重新置于相同条件的反应 体系进行下一轮反应，测定酯化率，计算相对酶洲5 1 1 。 、 酯化率= ( 酸减少的滴定摩尔数初始酸滴定摩尔数) 1 0 0 ( 2 ) 相对酶活= ( 回收酶反应酯化率首次酶反应酯化率) x 1 0 0 ( 3 ) 8 2 材料与方法 平行测定三次，取平均值。 2 3 7 糖酯的h p l c 分析 将反应液真空旋转蒸发除去溶剂后用色谱纯甲醇溶解，用0 4 5 1 a m 滤膜过滤后，上 样测定。 色谱条件：h p l c ( a g i l e n t11 0 0s e r i e s ，u s a ) ，z o r b a xs b - c 1 8 ( 5 1 t m ，2 5 0 m m x 4 6 m m i d ) 色谱柱，流动相为甲醇：水( 9 0 ：1 0 ，v ) ，流速0 8 m l m i n ，柱温3 0 c ，2 4 2 0 型蒸发光 散射检测器，进样量1 5 i - t l 。 用下式计算酯化率： 单酯酯化率= ( 单酯摩尔数糖摩尔数) x 1 0 0 ( 4 ) 二酯酯化率= ( 二酯摩尔数糖摩尔数) x 1 0 0 ( 5 ) 平行测定三次，取平均值。 2 3 8 脂肪酶残余酶活测定 反应后，从反应液中过滤出脂肪酶和分子筛，用5 0 甲醇冲洗4 次，随后放入真空 干燥箱中干燥2 h 。去除分子筛，加入0 8 9 新分子筛，用干燥后的酶再次进行反应。反 应物为0 5 m m o l 麦芽糖，2 m m 0 1 月桂酸，1 0 m l 丙酮，在5 0 水浴振荡( 1 5 0 r m i n ) 反 应7 2 h 。以同样反应条件下，使用原酶反应得到的产物浓度为标准计算【5 2 1 。 残余酶活= ( 回收酶反应糖酯摩尔数标准反应糖酯摩尔数) x 1 0 0 ( 6 ) 平行测定三次，取平均值。 2 3 9 混合溶剂体系制备 根据两种溶剂的设定配比，量取适量的有机溶剂( 已经分子筛脱水) 。将底物糖预 先加入极性较高的溶剂中振荡溶解，然后将两种溶剂混合形成混合溶剂体系。 2 3 1 0 麦芽糖酯的水溶性测定 配置一系列不同浓度的麦芽糖月桂酸酯的甲醇溶液，在相同的条件下测定其h p l c 峰面积，根据浓度与峰面积来绘制标准曲线。称取一定量的麦芽糖月桂酸酯放入三角瓶 中，5 0 m l 去离子水溶解，放入6 0 水浴中振荡2 h 使其充分溶解达到过饱和，在2 5 静置2 4 h 后，采用h p l c 测定上清液糖酯峰面积。根据标准曲线得出样品浓度。 2 3 1 l 麦芽糖酯的h l b 值测定 溶液配制：n ，n 二甲基甲酰胺苯混合液：n ，n 二甲基甲酰胺：苯= 1 0 0 ：5 ( v v ) ，经 无水硫酸钠脱水。 h l b 值标准曲线的绘制：分别称取各种h l b ( h y d r o p h i l i e - - l i p o p h i l i cb a l a n c e ) 值的 标样0 0 5 9 于2 5 m l 比色试管中，加入n _ n 二甲基甲酰胺苯混合液1 0 m l ，控制温度2 5 士1 ， 比色试管背后放一张3 号字体的白纸，不断摇晃比色试管，由滴定管慢慢滴入蒸馏水， 滴至试管背后3 号字体模糊为终点，记录所耗用的蒸馏水体积，用h l b 值为横坐标，所 9 江南大学硕十学位论文 耗用蒸馏水体积的毫升数为纵坐标，制作标准曲线【5 3 1 。 试样的测定：称取试样0 0 5 9 于5 0 m l 三角锥形瓶中，加入n - n 二甲基甲酰胺苯混 合液1 0 m l ，按上述操作进行，记录所耗用的蒸馏水体积，由标准曲线查得所测试样的 h l b 值。 2 3 1 2 麦芽糖酯起泡能力测定 配置o 1 9 l ，0 2g l ，0 3g l ，0 4g l ，0 5g l 各麦芽糖月桂酸酯溶液，以及将麦 芽糖月桂酸单酯与二酯按照一定比例( 单酯含量分别为5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 ，9 0 ) 复配成0 4g l 的水溶液。向5 0 o m l 精密刻度管中准确加入1 0 o m l 不同浓度的麦芽糖 酯水溶液，记录溶液高度( 凰，m m ) 。高速分散器3 0 0 0 r m i n 处理2 m i n ，立即记录管 中泡沫的高度( 两，m m ) 和液体高度( 飓，m m ) ，静置一定时间间隔( 4 5 m i n ) 记录 泡沫高度( 飓，m m ) 。麦芽糖酯的起泡性和稳定性分别用下式计算。 起泡能力= ( 矶+ i t 2 一h o ) h o x1 0 0 ( 7 ) 起泡稳定性= ( h 3 h i ) x 10 0 ( 8 ) 平行测定三次，取平均值。 2 3 1 3 麦芽糖酯乳化能力测定 配置0 1 9 l ，0 2g l ，o 3g l ，0 4g l ，0 5g l 各麦芽糖月桂酸酯溶液，以及将麦 芽糖月桂酸单酯与二酯按照一定比例( 单酯含量分别为5 0 ，6 0 ，7 0 ，8 0 ，9 0 ) 复配成o 4 l 的水溶液。向5 0 0 m l 精密刻度管中准确加入1 0 0 m l 不同浓度的麦芽糖 酯水溶液和1 0 0 m l 大豆色拉油，用高速均质分散机以6 0 0 0 r m i n 速度将其均质5 m i n 后 立即记录乳化层的高度( | j l l ，m m ) 和乳状液的总高度( h 2 ，m m ) 。乳状液静置4 5 m i n 后1l o o r m i n 离心5 m i n ，记录试管中乳化层的高度( h 3 ，m m ) 和乳状液的总高度( h 4 ， m m ) 。测量时保持环境温度2 5 ( 2 。糖酯的乳化能力和乳化稳定性用下式计算【外5 6 1 。 乳化能力= 仰d h 2 ) x10 0 乳化稳定性= ( h 3 h 4 ) x l0 0 平行测定三次，取平均值。 1 0 ( 9 ) ( 1 0 ) 3 结果与讨论 3 结果与讨论 3 1 脂肪酶的筛选 3 1 1 脂肪酶催化反应时间曲线 不同种类的酶具有不同的分子结构和催化活性中心，对底物的选择性和催化活性 存在很大的差异，因而筛选出对合成麦芽糖月桂酸酯具有高催化活性的脂肪酶是酶催化 反应优化的第一步。 本研究从国内市场购买了5 种在一定条件下具有催化合成酯类化合物活性的商品 脂肪酶进行试验。图2 为这5 种脂肪酶催化麦芽糖月桂酸酯的酯化率时间曲线，即动 力学曲线。从图中可以看出，l v k - f 在整个反应过程中没有麦芽糖月桂酸酯产生，l v k f 是来源于扩展青酶的脂肪酶，利用玉米油转酯反应生产生物柴油有成功应用【5 ，不适于 作为麦芽糖月桂酸酯的催化剂，因此在后续研究中，不再将它用于试验。其他四种酶均 表现出一定的催化能力，其中l i p a s er 、f 3 g 和c y 的最高酯化率都小于4 0 ，n 4 3 5 的 最高酯化率达到7 5 。而且，反应时间已经很长( 1 4 4 h ) ，从曲线的趋势看，n 4 3 5 和 c y 已基本达到平衡，f 3 g 脂肪酶的提升空间也很小，酶l i p a s er 还有上升趋势，但很 难达到n 4 3 5 的水平。显然，n 4 3 5 的催化活性明显高于其它几种酶。 8 0 6 0 永 褂4 0 基 韶 2 0 0 oz 44 8 7 z 9 6l z u 1 4 4 反应时间 1 6 r 一1i p a s er - - o - - f 3 g - - o - - l v k f p c y _ i 卜n 4 3 5 图2 脂肪酶酯化的动力学曲线 f i g2e s t i r i f i c a t i o nk i n e t i c so fl i f a s e s 反应条件：麦芽糖5 0 m m o l l ，月桂酸2 0 0 m m o l l ，脂肪酶2 0 9 l ，分子筛8 0 9 l ，5 0 。c c o n d i t i o n s ：m a l t o s e5 0 m m o l l ，l a u r i ea c i d2 0 0 m m o l l ，l i p a s e2 0 9 l ，m o l e c u l a rs i e v e8 0 叽5 0 。c 3 1 2 脂肪酶添加量的影响 在一定范围内，增加酶的用量可以增加产物的合成能力。图3 为底物量一定时加 酶量对四种脂肪酶催化麦芽糖月桂酸酯的活性的影响。当酶浓度低于3 0 9 l 时，酯化率 随加酶量的增加而增加，但是实际上增加酶用量对这几种酶的催化活性没有太大的影 江南大学硕+ 学位论文 响，在加酶量增至3 0 9 l 之后，四种脂肪酶所达到的酯化率趋向稳定，相比之下n 4 3 5 依然保持着较高的酯化率。 8 0 6 0 术 褂4 0 s 口皿 俺缸 2 0 o 0l o 2 0 3 0 4 0 加酶量( g l ) 1 6 r 一1i p a s er- - 4 3 - - f 3 g 一c y 卜n 4 3 5 图3 脂肪酶添加量对脂肪酶催化活性的影响 f i g3e f f e c to f d o s eo na c t i v i t yo f l i p a s e 反应条件：麦芽糖5 0 m m o l l ，月桂酸2 0 0 m m o l l ，分子筛8 0 9 l ，7 2 h ，5 0 。c c o n d i t i o n s ：m a l t o s e5 0 m m o l l ，l a u r i ca c i d2 0 0 m m o f l ，m o l e c u l a rs i e v e8 0 9 l ，7 2 h ，5 0 。c 3 1 3 脂肪酶的稳定性 本研究中酶的稳定性是指酶在相同反应体系罩可以重复利用的次数，良好的稳定 性可以提高脂肪酶的利用率，降低合成酯的生产成本。测定了四种酶的稳定性，结果见 图4 。 1 0 0 8 0 琶 6 0 恤 攀4 0 侠 罂 2 0 0 0 l2345 使用次数 = - o , - - li p a s er - - o = - f 3 g 一c y+ n 4 3 5 图4 脂肪酶的稳定性 f i g4s t a b i l i t yo fl i p a s e s 反应条件：麦芽糖5 0 m m o f l ，月桂酸2 0 0 m m o l l ，脂肪酶2 0 9 l ，分子筛s o g l ，7 2 h ，5 0 c c o n d i t i o n s ：m a l t o s e5 0 m m o l l ，l a u r i ca c i d2 0 0 m m o l l , l i p a s e2 0 m m o f l , m o l e c u l a rs i e v e8 0 9 l ，7 2 h ，5 0 。c 1 2 3 结果与讨论 从图4 可以看到，在使用一次后，c y 酶的活性下降迅速，第二次使用时酶活仅为 原来的6 0 。l i p a s er 和f 3 g 的稳定性接近，使用三次后，相对酶活在6 0 以上。n 4 3 5 的稳定性最好，使用四次后，相对酶活保持在8 0 左右，重复利用率最高，其原因是 n 4 3 5 是一种固定化酶，固定化使酶活性保持得较好，有利于酶在反应体系中的分散以 及与底物充分的接触。 通过以上对反应动力学、加酶量以及稳定性三方面的考察，n 4 3 5 脂肪酶在各方面 均表现出较明显的相对优势。一些国内外研究【5 8 捌】采用n 4 3 5 作为糖酯合成的催化剂达 到了较满意的效果，因此在后续工作中，以n 4 3 5 脂肪酶为合成麦芽糖月桂酸酯的生物 催化剂。 3 2 混合溶剂体系的选择 3 2 1 单一溶剂对酯化反应的影响 前人研究指出【6 2 】，脂肪酶在水溶液中催化水解反应，只有在微水环境中才催化酯 化反应。所谓微水环境，是指在酶分子周围应含有能维持其催化活性的必需的微量水。 有机溶剂的疏水性可以用溶剂在正辛醇水体系中的分配系数的对数值，即1 0 9 尸值 来衡量畔】。l o g p 值越高，表明溶剂疏水性越强，溶剂不易与水形成氢键，与酶分子争夺 水分子的能力就越小，保留在酶分子表面的水分子就越多，酶活性也就越大。一般地， 在l o g p 值 3 的溶剂如己烷、庚烷畔】中，酶可以保持着较高的活性，比较稳定；而亲水 溶剂与水形成氢键的能力较强，酶结构变得过于“刚硬而失去“柔性”，导致酶活降 低，甚至失活。另一方面，疏水性越强，溶剂对糖分子的溶解度就越低，对酯化反应是 不利的【6 3 1 。因此，溶剂的疏水性对酯化反应至关重要，会在很大程度上影响酶的活性、 选择性和稳定性。本研究考虑了溶剂疏水性、对糖的溶解度、从产物中去除是否容易等 因素，选择了二甲亚砜( d m s o ) 、叔戊醇、丙酮、乙腈、正己烷这几种极性各异的溶 剂进行比较研究。实验得到的麦芽糖溶解度、麦芽糖月桂酸单酯和二酯的酯化率、1 0 9 p 值【6 5 j 和反应后的残余酶活如表4 ： 表4 不同溶剂的l o g p 值、麦芽糖溶解度、麦芽糖月桂酸酯酯化率和反应后残余酶活 t a b l e 4l o g