（发酵工程专业论文）泰乐菌素高产菌株的选育及其培养条件的优化.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 否 如需保密，解密时间年月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或i , t - 括 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中傲了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：司字 时间：，。5 年月1 8 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存汇 编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名、刁宇 导师签名： 7 玉，寄吏。 签名日期：细；年，月，乎日 签名日期：知衫年，月1 8 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页_ 币i i 目录之间 泰乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 摘要 泰乐菌素是由弗氏链霉菌( s t r e p t o m y c e s f r a d i a e ) 产生的一类十六元大环内酯禽 畜专用抗生素，被国内外广泛用作兽药和饲料添加剂，是国家规划重点发展的兽药 产品。 本文通过对泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌b m b 0 1 2 进行复壮，获得了一株发酵效 价相对较高的菌株a - 4 9 。以菌株a - 4 9 为出发菌株，依次用紫外线氯化锂复合诱变、 硫酸- - 7 酯诱变，链霉素抗性诱变等多种诱变手段对菌株a - 4 9 进行育种工作。筛选 得到一株遗传性状稳定的高产菌株s 2 2 ，其摇瓶发酵效价较出发菌株提高了6 8 。 对高产菌株s - 2 2 进行了发酵条件进行了初步优化。通过研究不同种子培养条件 对菌体生长和发酵的影响，确定了种子的最佳培养条件。对发酵培养基配方进行了 单因子实验，研究了发酵培养基中的碳源、氮源、无机盐等对泰乐菌素发酵的影响。 对发酵培养基主要组成成分进行了正交实验，得到了培养基配方s h l ，从而将泰乐 菌素的发酵效价提高到了1 0 8 8 6 叫g m l 。 为了进一步提高泰乐菌素的发酵效价，采用b p 神经网络结合遗传算法的方法 对发酵培养基中的菜油、鱼粉d 、甜菜碱盐酸盐、组份x 这四种组份进行优化。首 先运用b p 神经网络建立有效的发酵效价预测模型，然后在此基础上采用遗传算法 对上述四种培养基组份进行全局寻优，得到其最佳配比：菜油3 6 9 ，l 、鱼粉d1 8 5 9 l 、 甜菜碱盐酸盐1 s g l 、组份x8 8 9 l ，泰乐菌素发酵效价达到1 2 8 7 8 p ：e , w a ，与模型 预测值的误差为2 0 8 。采用上述方法优化后的培养基使泰乐菌素的发酵效价比采 用正交优化的培养基s h i 提高了1 8 3 。结果表明，运用b p 神经网络结合遗传算 法优化泰乐菌素发酵培养基的方法是行之有效的。 采用单因素实验的方法对接种量、初始培养基p h 、装液量、发酵温度等发酵条 件进行了优化，确定了较适的发酵条件为：灭菌前培养基p h 调至7 2 ，种子液的接 种量为1 2 ，发酵摇瓶的装液量为4 0 m l 5 0 0 m l 三角瓶，2 8 c 培养7 d 。在此优化发 酵培养基和发酵条件下进行摇瓶发酵，泰乐菌素发酵效价达到1 3 2 1 舡g m l 。 关键词：泰乐菌素；菌种选育；发酵培养基b p 神经网络； 遗传算法；优化 器乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 a b s t r a c t t y i o s i n i sac o m m e r c i a l l y - i m p o r t a n t ，1 6 - m e m b e r e dm a c r o l i d ea n t i b i o t i cp r o d u c e db y s t r e p t o m y c e s f r a d i a e i te x c l u s i v e l ya p p l i e d i na n i m a l st oc o n t r o lt h em y c o p l a s m ai n d u c e d d i s e a s e s ，i m p r o v ef e e dc o n v e r s i o ne f f i c i e n c y , a n di n c r e a s ea v e r a g ed a i l yw e i 曲tg a i n as t a b l em u t a t e ds t r a i na - 4 9w a so b t a i n e df r o mt h es p o r e so ft y l o s i np r o d u c e rs t r e p t - o m y c e sf r a d i a eb m b - 0 1 2b yp u r i f i c a t i o n t h es t r a i na - 4 9w a s c h o s e na st h es t a r ts t r a i n f o rm u t a g e n i et r e a t m e n t sw i t hu l t r a v i o l e ti r r a d i a t i o n + l i c l ，d e sa n ds t r e p t o m y c i n r e s i s t a n tr a t i o n a ls c r e e n i n g , a f t e rf i r s ta n ds e c o n ds e l e c t i o n , t h em u t a n ts 2 2w a ss e l e c t e d i ts h o w e db e t t e rg r o w t ha n dy i e l dc h a r a c t e r st h a nt h es t r a i na 4 9 t h et y l o s i ny i e l do ft h e s t r a i ns - 2 2w a s9 1 6 8 p e , m lw h i c hi m p r o v e d6 8 t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mo p t i m i z e de x p e r i m e n tw i t ht h es t r a i ns - 2 2w a so ns h a k i n g f l a s kl e v e l t h ee f f e c t so fc a r b o ns o u r c e s ，n i t r o g e ns o u r c e s ，i n o r g a n i cs a l t s ，w e r es t u d i e d b ym e a n so fs i n g l ef a c t o r t h em e d i u ms h l w a se s t a b l i s h e db yo r t h o n o r m a le x p e r i m e n t t h ep r o d u c t i o no ft y l o s i ni nm e d i u ms h lw a s1 0 8 8 6 p g m 1 b a c k p r o p a g a t i o n ( b p ) n e u r a ln e t w o r ka n dg e n e t i ca l g o r i t h m s ( g a ) w e r ee m p l o y e d t oo p t i m i z et h em e d i u mf o rp r o d u c t i o no ft y l o s i n b pn e u r a ln e t w o r kw a ga p p l i e df o r m o d e l i n gf e r m e n t a t i o nm e d i u mo ft y l o s i u b a s e do nt h em o d e l ，t h ef e r m e n t a t i o nm e d i u m c o m p o s i t i o n sw h i c hi n c l u d e dr a p eo i l 、f i s hm e a ld 、b e t a i n eh y d r o c h l o r i d ea n di n g r e d i e n t x ，w e r eo p t i m i z e db yg a t h eo p t i m i z e dr e s u l tw a s ：r a p eo i l3 6 9 l f i s hm e a ld1 8 5 l b e t a i n eh y d r o c h l o r i d e1 s g l 、i n g r e d i e n tx 8 8 9 lt h ep r o d u c t i o no ft y l o s i ni no p t i m i z e d m e d i u mw a s1 2 8 7 8 p g m 1 w h i c hw a si n c r e a s e db y1 8 3 c o m p a r e dt ot h a ti nm e d i u m s h l t h er e l a t i v ee r r o rb e t w e e nt h ee x p e r i m e n t a lv a l u ea n dt h ep r e d i c t i v ev a l u eo ft y l o s i n p r o d u c t i o nf r o mt h eo p t i m i z e dm e d i u mw a s 2 0 8 t h o s er e s u l t ss h o w e di tw a se f f e c t i v e b yt h em e t h o do fb pn e u r a ln e t w o r ka n dg e n e t i ca l g o r i t h m si no p t i m i z i n gt h em e d i u mf o r p r o d u c t i o no ft y l o s i n t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h es t r a i ns - 2 2w e r es t u d i e db ym e a n so f s i n g l ef a c t o r f r o mt h es h a k e - f l a s k , t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e ：i n i t i a lp h 7 2 ，1 2 i n o c u l u m s ，2 8 1 2 ，4 0 m l 5 0 0 m ls h a k ef l a s k , c u l t u r e7d a y s w i t ht h eo p t h n a l f e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dc o n d i t i o n ，t h e p r o d u c t i v i t y o ft y l o s i nc o u l db eu pt o 1 3 2 1 6 a g m 1 k e yw o r d s t y l o s i n ；b r e e d i n g ：f e r m e n t a t i o nm e d i u m ；b pn e u r a ln e t w o r k t g e n e t i ca l g o r i t h m s ：o p t i m i z a t i o n 2 泰乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 第一章文献综述 1 1 泰乐菌素概述 1 1 1 泰乐菌素的发现与命名 1 9 6 0 年美国礼来药厂h 挑m 等从泰国土壤中分离得到一株弗氏链霉菌( r e p f o m y c e sf r a d i a e ) ，对该弗氏链霉菌发酵液采用溶媒法提纯，并进行一系列理、化性质 鉴别，确定其为一种新的十六环内酯类抗生素，定名为泰乐菌素( t y l o s i n ) 。它与 1 9 5 3 年w a k s m a n 所发现的弗氏链霉菌所产生的新霉g f n e o m y c i n ) ，在理化性质、化 学结构和抗菌性能上完全不同。对其产生菌经系统的鉴定，发现也有不同之处。产 生泰乐菌素的弗氏链霉菌能利用蔗糖，在马铃薯块上不能生长，而产生新霉素的弗 氏菌则相反1 9 6 3 年j e n s e n 等报道吸水链霉( 跏印幼删c 始 y g r o s c d p f c h s ) 产生泰乐菌 素；1 9 7 3 年p a p e 等报道了第三种产生泰乐菌素的链霉菌龟裂链霉菌( s t r e p t o m y c e s r i m o s u s ) 。我国将泰乐菌素又称为泰乐星、泰乐霉素。 1 1 2 泰乐菌素的理化性质 泰乐菌素为白色至浅黄色粉末，无臭、味苦，在甲醇中易溶，在乙醇、丙酮、 氯仿中溶解，在水中微溶，在己烷中几乎不溶。其盐类易溶于水，水溶液在2 5 、 p h 值为5 5 7 5 中可保存3 个月不减效。根据成盐的不同方法可分为磷酸泰乐菌素 和酒石酸泰乐菌素。在0 1 m o l l h c l 溶液中，在2 9 0 n m 处具有最强吸收峰，可采用 分光光度法直接测定。光照对泰乐菌素生物效价无明显变化，但组分降低、加热情 况下生物学效价略有下降，其水溶液中生物学效价稳定，具有吸湿性，但吸湿后生 物学效价无明显变化。 泰乐菌素是大环内酯类抗生素，属聚酮类化合物，此类化合物的特点在于由不 少于1 2 原子构成大环主体，然后连上至少两个糖苷配基，糖苷配基是大环内酯类抗 生素具备生物活性所必须的( l i u & t h o r s o n , 1 9 9 4 ) 。 泰乐菌素含有4 种组分，其中t y l o s i n a 为主要成分，且生物活性最高，其化学 结构见图1 1 。早在上世纪6 0 年代，m o r r i n 等就着手研究t y l o s i n a 的结构，到1 9 7 0 年阐明了t y l o s i n a 的全部结构，随后o m u r a 对泰乐菌素的空间构象加以研究和阐明。 3 泰乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 m y r o s 0 图1 1 泰乐内酯和泰乐菌素a 的结构 f i 9 1 1 s t r u c t u r e so f t y l a c t o n ea n dt y l o s i n a 由图1 1 可知，泰乐菌素a 的主体结构为含有1 6 个原子所形成的环状内酯即： 泰乐内酯( t y l a c t o n e ) ，然后依次连上三个脱氧糖苷配基，三个脱氧糖苷配基的连接 顺序为：碳霉氨基糖( m y c a m i n o s e ) ，5 一脱氧- - d - - 阿洛糖( m y c i n o s e ) ，红霉糖 ( m y c a r o s e ) 。三个脱氧糖苷配基均来自葡萄糖，n 上甲基基团则来自甲硫氨酸( b a l t z e t a l ，1 9 8 3 ) 。 1 1 3 泰乐菌素的生物功效和应用情况 1 1 , 3 1 泰乐菌素的作用机理 泰乐菌素作用机理一般认为是与红霉素等大环内酯类抗生素的作用机理基本相 同。泰乐菌素的主要是抑制病原体蛋白质的合成过程。 蛋白质的合成在核糖体上进行，大致可分为起始、肽链延长和终止三个阶段。 开始时起始因子f 1 f 、2 f 、f 3 、g t p 、蛋白质合成起始物f m c t t r n a f 结合在3 0 s 亚 基m r n a 上，形成3 0 s 合成起始复合体，接着与5 0 s 亚基结合，形成7 0 s 起始复合 物延长肽链时关系到延长因子( e f - t u 、e f - t s 、e f - g ) 和g t p 、 a m i n o a c y l - t r n a - g t p - e f t u 复合体在核糖体a 座上结合形成。肽的转移反应， p c p t i d l y - t r n a 从a 座转座到d 座上。m r n a 的个密码发出引起转座反应的3 个 反应，延长一个氨基酸残基。终了时游离因子限f - 1 、r f - 2 、r f - 3 ) 与m r n a 的终止 密码( u a & u g a ，u a g ) 起作用，肽转移酶将肽与t r n a 切离，肽链形成。 4 泰乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 现有资料表明，所有的大环内酯类抗生素均可不同程度地抑制细菌蛋白质的合 成。大环内酯类抗生素能与细菌核糖体5 0 s 亚单位的2 3 s 核糖体r n a ( 2 3 s r n a ) 上 的特殊靶位及核糖体上的l 1 6 蛋白质结合。而1 6 元环大环内酯类抗生素能抑制肽酰 基的转移反应，从而抑制肽链的延长。最近通过一系列研究提出了比较可信的假说， 即所有大环内酯类化合物能与核糖体5 0 s 亚单位的1 - 2 2 及- , 2 7 蛋白质结合，在肽链延 长阶段能促使肽酰基一t r n a 从核糖体解离，从而抑制蛋白质合成。 1 1 3 2 泰乐菌素的应用特点 1 1 , 3 2 1抗菌谱广 泰乐菌素是一种广谱抗生素，对支原体最具活性，是治疗畜禽支原体疾病的首 选药物。对金黄色葡萄球菌、链球菌、等g + 菌有很强的抗菌活性，并对部分g 菌、 弯曲杆菌、螺旋体、真菌：。球虫有很强的抑制作用( 刘恒，2 0 0 0 ) 。 1 , 1 3 2 2吸收与排泄迅速 泰乐菌素无论经口服或注射均能在较短时间内达到有效抑茵浓度，并且保持 有效抑菌浓度时间长。其吸收量明显大于红霉素和北里霉素，在体内维持时间仅次 于螺旋霉素。停药后迅速经尿和胆汁排出体外。在组织内几乎无残留。 1 1 3 2 3组织穿透力强，体内分布广泛 泰乐菌素具有良好的组织扩散能力，可渗透到所有器官、组织和体液，其分布 量依次为肺、肾、脾、肌肉、血液和胆囊中。鸡气囊中的浓度比血清浓度高近十几 倍，尤其是可通过浆性膜，血脑，血眼和血睾屏障。使得泰乐菌素的临床使用范围 明显扩大。 1 1 3 2 4毒性低、安全范围广 泰乐菌素与其他许多抗生素相比较其显著特点之一是毒性极低或无毒使用安 全，其l d s o 是治疗用量的近5 0 0 倍。史晓g 日( 1 9 9 6 ) 报道：酒石酸泰乐菌素经2 0 天递增 给药，蓄积系数大于5 3 ，说明该药代谢排泄迅速，不易造成蓄积中毒。 1 1 3 2 5促生长作用 泰乐菌素作为饲料添加剂能明显地促进动物生长发育，提高饲料利用率，缩短 饲养周期。长期在鸡饲料中添力n 1 0 磷酸泰乐菌素预混料，可提高增重2 1 一1 5 ， 饲料利用率提高4 5 一1 2 5 在鸡的生长过程中，不引起内脏血液形态和生物化学 成分及结构变化。 1 1 3 2 5 专一性。 5 泰乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 泰乐菌素是动物专用抗生素、避免了人畜共用抗生素易发生的交叉耐药性问题， 因此不会威胁人类健康，符合人畜用药分开的国际潮流。 1 1 3 3 泰乐菌素的应用情况 早在上世纪8 0 年代，美国l i l l y 公司、德国b m 公司、泰国正大集团以及意大 利和瑞士的制药公司就进入中国市场销售t y l o s i n 产品。我国1 9 9 3 年从l i l l y 公司引 进菌种，到目前国内有多家公司生产t y l o s i n ，具有代表性的企业有西安光华、宁夏多 维药业有限公司、齐鲁制药和鲁抗等。2 0 0 3 年，西安亨通光华制药有限公司杨凌生 产基地通过了g m p 现场验收，通过验收的生产线是我国第一条、也是唯一的一条酒 石酸泰乐菌素无菌原料药生产线，此举填补了我国的该项目空白，也使西安亨通光 华制药有限公司成为继美国礼来公司之后世界上第二个可以生产泰乐菌素无菌注射 用原料药的公司。 然而国内在t y l o s i n 的基础与应用研究方面远远滞后于国外，生产菌种( 生产效价 大多在1 0 0 0 0u 以下) 与国际上同类高产菌种( 美国l i l l y 公司的生产效价可以达到1 8 0 0 0 u ) 相比，其生产效价仍有很大差距( 陈文青等，2 0 0 4 ) 。近年来，随着中国空 间技术的发展，西安亨通光华制药有限公司将弗氏链霉菌( s t r e p t o m y c e sf r a d i a e ) 9 9 4 0 s + 2 8 6 连续经“神舟”1 、3 、4 号飞船搭载进行太空诱变育种。复筛后得到4 8 株效价较出发菌株提高2 0 以上的菌株，其中总效价最高达到1 4 9 5 0 # g n l l ( 摇瓶) ，接 近国际先进水平( 方晓梅等，2 0 0 5 ) 。 由于t y l o s i n 对人体的毒性较大，所以一般不用于人体治疗。研究发现，t y l o s i n 在畜禽体内有药物残留，再加之其与红霉素( e r y t h r o m y c i n ) 等人用抗生素的结构有 很大的相似性，所以为避免病原菌对某些人用抗生素产生交叉抗性，欧盟已经于1 9 9 8 年正式立法禁止t y l o s i n 在畜禽养殖中继续应用。 由于世界各国批准使用的抗生素饲料添加剂品种差别甚大，同一种抗生素在不 同的国家禁用与否不尽相同，即使是不同国家都批准使用的同一种抗生素，在其适 用对象、使用剂量、使用期限、产品残留标准等方面亦有所不同。之所以出现这种 情况，原因在于它涉及到各个国家的抗生素生产水平、禽畜饲养水平和经营方向、 人们的生活水平乃至科学技术、文化发展程度等。因此，要想在国际间达成抗生素 类饲料添加剂使用的统一标准，目前仍是有困难的。 1 i 4 泰乐菌素的生物合成研究 6 泰乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 1 1 a 1 泰乐菌素生物合成前体的研究 泰乐菌素a 的结构是由泰乐内酯和糖苷配基两个部分构成，用”c 标记假设的 前体化合物，研究表明泰乐内酯是由5 个丙酸单元，2 个乙酸单元和一个丁酸单元 缩合而成( s e n oe ta 1 ，1 9 7 7 ) 。整个缩合过程与脂肪酸的生物合成过程相似，氨基酸的 分解代谢为泰乐内酯的合成提供了分子结构单元。t h r 是丙酰c o a ，二甲基丁酰c o a 及乙酰c o a 的来源。v a l 、l i e 、m e t 提供三碳结构单位。l e u 和p h e 提供二碳及四碳 结构单位。增加v a l 的分解代谢，可为p r o t y l o n o l i d c 合成提供更多的结构单元，从 而促进t y l o s i n 的合成。1 9 8 0 年g r a y 等研究了谷氨酸钠对y y l o s i n 合成的影响，研 究发现谷氨酸钠显著刺激t y l o s i n 的合成；谷氨酸作为t c r 循环的活力之一，它为 t y l o s i n 生物合成提供所需要的前体，研究还证实葡萄糖对t y l o s i n 的合成有明显的 阻遏作用，导致t y l o s i n 的合成迅速下降。i c e 等曾先后报道v a l 脱氧酶( v d h ) ， a s p 氨基转移酶( a s a t ) 2 乏苏氨酸脱氢酶( t d t ) 与t y l o s i n 合成之间的联系，因为乙 酸、丙酸和丁酸都是构成内酯的单元并由氨基酸转化而来，需要特定的酶参与分解。 事实证明，细胞生长是与a s a t 和柠檬酸合成酶的较高活性相联系，a s a t 的表达 可为t c a 循环提供更多的草酰乙酸，它是连接t c a 循环和进一步代谢的关键酶， 所以它能为t y l o s i n 的合成提供更多的前体，进而促进t y l o s i n 的合成。 在研究中发现，高浓度的n h 4 + 抑制a s a t 、t d t 及v d h 的活性，它能使v a l 分解代谢中的第一个酶( v a l 脱氧酶) 活性降低。n h 4 + 浓度分别在2 5 m m o l l 和 1 0 0 r n m o l 1 时，v d h 的活力分别被抑制5 0 和1 0 0 。l o m m o l i , ( n - m ) 2 s o , 对营养 期并无影响，在分化期2 0 m m o l lq - u h s 0 4 能抑制t y l o s i n 的生物合成，但能刺激 菌体生长。高浓度n h 4 + 可使细胞内脂肪酸组分发生改变，即分支脂肪酸含量明显降 低，泰乐菌素生物合成因此受到强烈抑制( 陈礼仁等，1 9 9 2 ) 。在产生菌菌体中由 v i ) h 存在，这表明在形成甲基丙二酸单酰c o a 和丙酰c o a 的前体一琥珀酸c o a 以及p r o t y l o n o l i d e 时，a 一酮戊二酸具有重要作用( 1e ee ta 1 ，1 9 9 3 ) 。k a n g 等报道 g l u 浓度对转化g i u 为泰乐内酯的各种酶活性具有明显的影响。脂肪酸的分解代谢 产物也为泰乐内酯生物合成提供二碳和四碳结构单元。不饱和脂肪酸由于较易跨越 细胞膜而更有利于t y l o s i n 的合成。 7 泰乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 1 1 4 2 泰乐菌素生物合成的转化机制和一般生化过程 c k l h no l ：哗如妞a ：舯d e l l 0 9 1 t e s 慧m o f l c l a b e l o d 础l o n o o * l b t 图1 2 泰乐菌素的结构与相关的生物活性以及它显著的作用因子 f i 9 1 2s t r u c t u r e so f f o u r c o n s t i t u e n t so f t y i o s i n 泰乐菌素主要是由泰乐菌素a 、去碳霉糖泰乐菌素b 、大霉素c 和雷洛霉素d 四种组分组成( a r i s a w ae ta l , 1 9 9 6 ) 。在t y l o s i n 的发酵产物中，各组分的含量是衡量 t y l o s i n 发酵产品的标准，据国家兽药药典规定，泰乐菌素四种组分的含量必须超过 9 5 ( 结构见图1 2 ) ，其中泰乐菌素a 必须达到8 0 方为合格。1 9 8 4 年，p i j i 等研 究发现，在发酵初期，菌体产泰乐菌素a 为主，随着发酵时间的延长，菌体以产泰 乐菌素c 为主，促进泰乐菌素c 向泰乐菌素a 的关键在于大霉素甲基转移酶的活性。 大霉素甲基转移霉( m a c r o c l nm e t h y l t r a n s f e r a s e ) 的活性受p h 值影响较大，甘士喜 等研究发现，发酵液的p h 值的变化会影响到泰乐菌素组分的转化，通过控制发酵 过程中的p h 值可明显提高t y l o s i n a 的含量；在发酵中期补加豆油可提高组分的转 化率，并且效价也显著提高，这主要归因于脂肪酸可以作为泰乐内酯的合成单元而 被直接利用( 甘士喜等，2 0 0 0 ) 。 t y l o s i n 生物合成过程非常复杂，其泰乐内酯的合成原料是丙酸、乙酸和丁酸， 活化形式为各自c o a 形式，它们在聚酮酶复合体( p o l y k e t i d es y n t h a s e ，p k s ) 的作用 下缩合成泰乐内酯。t y l o s i n 生物合成的生化过程见图1 3 。 器乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 譬一舡 抵一尹 鼍嘶氐舡 怯舡 地s i t f 煳 图1 3 泰乐菌素的生物合成途径 f i g1 3b i o s y n t h e s i so f b l o s i n 泰乐内酯在碳霉氨基糖基转移酶的作用下生成0 m y c a m i n o s y l 。t y l a c t o n e ，然后 0 - m y c a m i n o s y l t y l a c t o n e 在去甲基化酶的作用下生成o m t ，o m t 在5 脱氧d 阿洛 糖基转移酶和红霉塘基转移酶的先后作用下生成去甲基大霉素 ( d e m c t h y l - m a c r o c i n ) ，再在甲基化酶的作用下最终生成t y l o s i n 。然后体内生物合成 相关基因的中断实验发现，t y l o s i n 在体内可能存在着另外一条合成途径( s t c v e ne t a l ，1 9 9 7 ) ，但是目前为止还没有真正阐明。 1 2 抗生素产生菌的选育技术概况 抗生素的工业化生产为实现抗生素的巨大价值提供了有力的支持。然而，对于 一种抗生素的工业化生产，它的产生菌的菌种质量是关键因素，因为这决定着该抗 生素开发和发展的前途。如何改善抗生素产生菌的菌种质量以满足工业化生产的需 要是自从f l e m i n g1 9 2 9 年发现第一个抗生素青霉素以来，人们始终坚持不懈探索的 9 泰乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 问题之一抗生素产生菌的菌种选育技术便是人们多年来围绕这问题不断深入研 究的结果。近年来，随着人们对微生物遗传学方面基础理论研究的日益深入以及基 因工程技术的飞速发展，抗生素产生菌的菌种选育技术可以说是发生了深刻的变化 ( 王付转等，2 0 0 2 ) 。 诱变育种技术包括两个环节：一是以合适的诱变剂处理大量而分散的微生物细 胞悬浮液，在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的变异频率大大提高； 二是设计一种有效的筛选方法淘汰负变株，并把正交株中少数变异幅度最大的具有 优良性状的菌株巧妙地挑选出来。可以说目前工业上所用的高产菌株大部分都是通 过这种方法获得的。目前这种方法在抗生素菌种改良中仍是方便、经济有效的，尤 其适用于对那些遗传背景、生物合成途径还不甚清楚的抗生素产生菌；使用该法可 以阻断不必要的酶活力，起到解除负调控、增加基因剂量的作用，不仅可使抗生素 产量得到提高，而且可能使其利用原材料的成本得到降低。 到目前为止，抗生素产生菌的菌种选育方法主要有：自发突变育种、诱变育种、 原生质体融合和基于基因工程技术的育种方法等。 1 2 1 自发突变育种 不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。这 类突变没有人工参与并非是没有原因的，一般认为自然突变有两种原因引起，即多 因素低剂量效应和互变异构效应。所谓多因素低剂量效应，是指在自然环境中存在 着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射，低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的 诱变物质等作用引起的突变。互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的 瞬间变构，会引起碱基的错配。自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是 菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。为了保证生产 水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的 菌种。 1 2 2 诱变育种 微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱变微生物基因突交，改变遗传结构和 功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且 找出发挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最合适的环境下合成有效产物。 诱变育种和其他育种方法相比，具有速度快、收益大、方法简单等优点，是当前菌 1 0 墨墨望耋蔓兰堡堡塑墨蔓墨基茎矍墨堡箜垡些 种选育的一种主要方法，在生产中使用的十分普遍。常用的诱变育种方法有以下几 种： 1 2 2 1 物理方法 物理方法主要是通过各种强刺激或极端环境使菌种遗传物质产生变异而突变。 它主要包括：紫外线、t 射线、x - 射线、快中子、b 射线、微波、激光、离子注入。 紫外线是一种常规而效果较好的诱变手段，属于非电离辐射它的作用是使物 质分子或原子中的轨道电子从基态跃迁到激发态，紫外光子本身作为能量被物质吸 收。由于其穿透性很弱，所以广泛地用作微生物诱变剂( 房耀维，2 0 0 3 ) 。紫外辐射 诱变的作用机制有很多解释，但较为确定的是紫外辐射使d n a 分子形成嘧啶二聚 体，阻碍碱基正常配对，并可能引起突变或死亡。另外嘧啶二聚体的形成，还会妨 碍双链的解开，因而影响d n a 的复制和转录。利用紫外诱变的方法选育出大量产量 高、活性强的优良微生物菌种。紫外诱变技术是诱变和筛选优良菌株的常规育种方 法。由于其设备简单、诱变效率高、操作安全简便等特点而被广泛应用( 刘桂杰等， 1 9 9 7 ) 。 y 射线、x - 射线、快中子、6 射线是电磁波，能产生电离作用，使被照射物质分 子或原子发生电子跳动，使内层失去或获得电子，从而直接或间接地改变d n a 结构。 其直接效应是脱氧核糖的碱基发生氧化或脱氧核糖的化学键和糖磷酸相连接的化 学键，d n a 的单链或双链键断裂间接效应是电离辐射使水或有机分子产生自由基， 这些自由基与细胞中的溶质分子起作用，发生化学变化，作用于d n a 分子而引起缺 失和损伤。此外，电离辐射还能引起染色体畸变，发生染色体断裂，形成染色体结 构的缺失，易位和倒位等( 向砥等，2 0 0 2 ) 微波是种电磁波，能引起水、蛋白质、核苷酸、脂肪和碳水化合物等极性分 子转动，最终引起d n a 分子结构发生变化，导致遗传变异。另外，微波引起的分子 强烈的热运动所产生的瞬时强烈效应，易引起酶失活，从而引起生理生化变异( 陈 力力等，2 0 0 3 ) 。 激光具有亮度高、光谱纯、可调谐、发散角小等其他光源没有的特点。将激光 束用光学系统加以聚集，当通过细胞时，不破坏细胞壁，却能对细胞核和细胞器进 行操作( 余增亮等，1 9 9 8 ) 。如可去掉细胞壁，进行细胞融合，切割染色体等。6 0 年代末b e r n 等开始用激光微束进行一系列研究，1 9 7 0 年证明激光微柬可诱发染色体 畸变。目前，激光的应用很广泛，效果也较好( 陈五岭等，2 0 0 0 ) ，例：吉林大学 l l 泰乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 用激光处理兽疫链球菌原生质体，筛选到一株高产透明质酸菌株，其产量是原始菌 株的4 5 倍。 1 2 2 2 化学方法 化学诱变剂是一类能和d n a 起作用而改变其结构，并引起d n a 变异的物质。 主要包括烷化剂( 例：甲基磺酸乙脂、硫酸二乙酯、乙烯亚胺) 、叠氮化合物( 例：亚 硝基胍、亚硝基甲基脲) 、亚硝酸等。烷化剂主要是碱基烷化作用，对核酸作用的同 时也作用于碱基、糖键、磷酸键、蛋白质。引起d n a 交联，碱基缺失，染色体畸变， 造成碱基对的转抉或颠换。叠氮化合物在碱性条件下会形成重氮甲烷，它的效应很 可能是c h 2 n 2 对d n a 的烷化作用引起的。主要是引起d n a 链上的g c a t 转换， 另外还可引起小范围切除d n a ，移码突变及g c 对的缺失。亚硝酸是一种脱氨基诱 变剂，作用于微生物时会引起d n a 分子的交联，碱基缺失和碱基对的转换。沈寅初 等用n 甲基n 硝基n 亚硝基胍、氮芥、氯化锂等与紫外线对井冈霉素产生菌进行 联合诱变，并经过最适发酵条件的研究，使其生产水平比原始菌种提高1 0 倍( 施巧 琴等，2 0 0 3 ) 。 化学诱变育种的特点：与物理诱变相比，很多化学诱变剂产生了高比例的点突 变，低比例的d n a 畸变，而物理诱变由于以t 射线和x 射线为代表的电离辐射， 其穿透力较强，易被d n a 吸收，对d n a 结构具有很大的破坏性。化学诱变育种具 体有以下特点：( 1 ) 诱变突变率较高，具有位点特异性；( 2 ) d n a 畸变的比例相对较 少，很少有致死型发生，对处理材料损伤轻；( 3 ) 化学诱变剂有迟效作用，即诱变能 引起生物学损伤和染色体断裂，但并不立即表现和断开；( 4 ) 存在残留药物的后效作 用，反应后对生物损伤大；( 5 ) 由于引起的突变范围广，后代选择需要足够大的群体； ( 6 ) 价格便宜，操作简单，不需要特殊设备。 h 1 2 3 原生质体融合 原生质体融合就是把两个不同亲本菌株的细胞壁，分别经酶解作用去除，而得 到球状的原生质体，然后将两种不同的原生质体置于高渗溶液中，由聚7 , - - 醇( p e g ) 助融，促使两者高度密集发生细胞融合，进而导致基因重组，就可由此再生细胞中 获得杂交重组菌株( 朱春宝等，1 9 8 6 ) 。原生质体融合技术具有许多常规杂交方法 无法比拟的独到之处：由于去除了细胞壁，原生质体膜易于融合，即使没有接合、 转化和转导等遗传系统，也能发生基因组的融合重组；融合没有扳性，相互融合的 1 2 泰乐菌素高产菌株的选育及其发酵条件的优化 是整个胞质与细胞核，使遗传物质的传递更为完善；重组频率高，易于得到杂种； 存在着两株以上亲株同时参与融合并形成融合子的可能；较易打破分类界限，实现 种间或更远缘的基因交流；同基因工程方法相比，不必对试验菌株进行详细的遗传 学研究，也不需要高精尖的仪器设备和昂贵的材料费用等。由于以上优点，迄今， 这项技术不仅在基础研究方面，而且在实际应用上，均取得了引人注目的成绩( 粱 平彦等，1 9 8 2 ) 。随着生物学研究手段的不断创新，该技术的基本实验方法逐步完 善。 1 2 4 分子生物学方法 包括基因重组育种技术和基因工程育种技术。基因重组育种技术采用杂交转化 和转导等遗传方法，经过基因重组获得具有多组合优良性状或多倍体的微生物菌种， 在微生物育种中将占有重要地位。但由于许多重要工业微生物杂交和有性世代等的 机理尚未被揭示，很大程度上妨碍了杂交手段的实际应用。基因工程f 亦称重组d n a 、 基因操作或遗传工程) 是指把某一生物体的遗传物质在体外经限制性内切酶与连接 酶剪接，与一定载体( 质粒、病毒等) 相连接，构成重组d n a 分子，通过一定的方法 转入另一生物体( 受体) 细胞中，使被导入的外源d n a 片段在受体中表达，并稳定遗 传。此方法具有极大的优越性，在很大程度上可以按预定的方向进行育种。从近二 十年来的研究状况看，人们一般是通过基因工程技术对微生物d n a 启动子、决定子、 操纵子、起始或终止密码子、沉默基因、结构基因或高拷贝基因等进行基因水平操 作。 在上述的这些方法中，自发突变效率比较低，进展慢，原生质体融合以及依赖 于抗生素产生菌遗传背景的基因工程技术的育种方法，对技术和设备要求较高，过 程复杂，费用较大，且成功率较低。相对而言，以突变和筛选为中心的诱变育种具 有操作简便，速度快，使用范围广，无需菌株背景知识等优点。诱变育种使用各种 理化因子诱导d n a 突变，通过大量的筛选工作发现理想的突变菌株。不同的诱变因 素分别从亚细胞、分子或基因水平对抗生素产生菌的遗传物质发生作用，通过碱基 置换、移码突变或染色体畸变来改变菌种的特性。但是突变剂大多缺乏特异性的靶 标，导致大多数的突变是有害的，正向突变率低，筛选工作量大。但与其他的育种 方法相比，诱变育种诱发突变结合发酵筛选仍然是最常用最直接有效的菌种选育手 段。 泰乐菌素高产菌株的选育及其发群条件的优化 1 2 5 抗生素产生菌诱变育种的筛选方法 “ 通过诱变处理，在微生物群体中会出现各种突变型的个体，但其中多数是负变 株，正变株所占比例极小，为在短时间内获得好的效果，必须设计和采用效率较高 的筛选方案及筛选方法。目前常用的筛选方法有随机筛选( r a n d o ms e l e c t i o n ) 和推理 选育( r a t i o n a ls e l e c t i o n ) 两种。 随机筛选是抗生素产生菌的育种中一直采用的初筛方法，它是将诱变处理后形 成的各单细胞菌株，不加选择地随机进行发酵并测定其单位产量，从中选出产量最 高者进一步复试。由于各种理化诱变方法所产生的突变是随机的，其突变频率低，只 有1 0 。3 1 0 r 6 ，并且突变株中，多数为负向变异，正突变率低但随机性大，需要进行 大量筛选。如果突变机率很小，为了能够挑选到优良菌株，就必须花费巨大的人力 和时间，这就大大限制了筛选量，影响高产菌株的筛出率。为加快筛选速度而采用 诸如平皿快速检测法、形态变异的利用、计算机技术的应用等多种方法，但是现行方 法仍是工作量大、周期长、随机性大，成本高。 推理选育就是应用己知的生物化学和遗传学原理，根据已知或可能的抗生素生 物合成途径的调控机制和产物的分子结构，设计出一些筛选方法，定向地选出某些 类型的突变株，应用这种方法可以大大减少筛选的盲目性，可提高筛选效率，缩短 筛选周期。理性化筛选目前主要有以下几种方法： 利用营养缺陷型筛选；筛 选负突变株的回复突交株；筛选去磷酸盐调节突变株；筛选二价金属离子抗性 突变株；筛选前体或前体结构类似物抗性突变株；”筛选自身所产的抗生素抗性 突变株等( 涂国全等，2 0 0 0 ) 。这在抗生素的菌种选育中已有较多成功的研究报道( 孙益 等，1 9 9 3 ) 。 1 3 遗传算法及其在发酵工程中的应用 遗传算法( g a ) 是模拟生物在自然环境中的遗传和进化过程而形成的一种自适 应全局优化概率搜索算法。它最早由美国密执安大学的h o l l a n d 教授提出，起源于2 0 世纪6 0 年代对自然和人工自适应系统的研究( h o l l a n d ，1 9 7 5 ) 。b a g