（食品科学专业论文）宇佐美曲霉产菊粉酶及其酶学特性研究.pdf

i 三蕴表堂殛堂焦硷主 摘要 燃料乙醇已成为当今研究的热点，但目前燃料乙醇无法与汽油竞 争，主要是价格过高，降低成本是研究燃料乙醇的关键。菊芋的主要 成分是菊粉，在菊粉酶的作用下水解为果糖，是微生物发酵生产乙醇 的良好糖源。菊芋易种植，利用菊芋为原料发酵生产乙醇，可以降低 发酵生产乙醇的成本。由于微生物菊粉酶在发酵生产乙醇中起到很重 要的作用，因此筛选高产菌株、提高水解菊粉酶的酶活力有着非常重 要的意义。 从本实验室保存的五株能产菊粉酶的菌种中进行筛选，选取了产 酶活力最高的宇佐美曲霉进行了进一步的研究。论文的主要研究结果 如下： 1 采用单因素试验、p l a c k e t t - b u r m a n 设计和响应面法优化了培养 基组成。单因素试验结果表明，菊芋汁、蛋白胨和( n h 4 2 h p 0 4 是影响 宇佐美曲霉产菊粉酶的主要因素；响应面分析进一步优化的菊芋汁、 蛋白胨和( n h 4 ) 2 h p 0 4 拘最适浓度分别为1 1 7 2 8y l 、2 2 1 4g j l 、 3 9 4 9 l 。研究结果表明，优化的菊粉酶液体发酵培养基组成为：蛋白 胨2 2 1 4 9 l 、菊芋汁1 1 7 2 8 9 l 、( n - 4 ) 2 i - i p 0 43 9 4g l 、n a c l 5 0g l 、 m g s 0 4 0 5 0g l 、m n s 0 4 0 1 0g l ；发酵的最佳p h 值为6 5 、发酵温度为 2 8 、装液量为5 0 m l 3 0 0 m l 。 2 对菊粉酶初提液的基本酶学性质进行了研究。该酶最适温度为 6 0 ，最适p h 值为6 0 ；该酶4 0 6 0 。c 保温1 h 能保持8 0 的酶活力， 在p h 值3 0 彳0 的范围内常温放置1 h 能保持8 0 以上的酶活力；菊粉 酶的米氏常数为：k m = 8 3 7 7 m g m l ，最大反应速度为： v m a x = 5 5 2 m g m l m i n 。同时也研究了浓度均为1 0m m o l l 的不同种 盗蕴盘茔殛堂焦逾塞 金属离子对菊粉酶酶活力的影响。结果表明，n a + 和m n 2 + 对菊粉酶的酶 活力有一定的激活作用；c u 2 + 对菊粉酶的酶活力基本没影响；f e 2 + 和 m 9 2 + 对菊粉酶的酶活力有一定的抑制作用。 3 将菊粉酶初提液进行纯化，先通过( n h 4 ) 2 s 0 4 分级沉淀、 d e a e c e l l u l o s e 离子交换色谱、s e p h a d e x g 1 0 0 凝胶过滤色谱等分离纯 化后，采用s d s p a g e 分析，结果显示有五个蛋白区带。其中第一条 蛋白区带不具有酶活性，可能是杂蛋白；其余四个蛋白区带均具有酶 活性，提示菊粉酶可能为一组同工酶。 4 对宇佐美曲霉发酵菊芋进行了研究。通过单因素试验和正交试 验，得出宇佐美曲霉发酵菊芋产还原糖的优化培养基组成为：1 1 0 菊 芋汁、0 3 k h 2 p 0 4 、0 4 m g s 0 4 。 关键词：字佐美曲霉，菊粉酶，分离纯化，酶学性质 汪苤盘堂须堂焦诠主 a b s t r a c t r 1 1 圮f u e le t h a n o li sb e c o m i n gt h er e s e a r c hf o c u st o d a y h o w e v e r d u e t ot h eh i g hp r i c e ，f u e le t h a n o lh a sn oc o m p e t i t i o nw i t ht h em i n e r a lf u e la t p r e s e n t ，s or e d u c i n gt h ep r o d u c t i o nc o s ti st h ek e yo ft h ef u e le t h a n o l r e s e a r c h j e r u s a l e ma r t i c h o k ei san e wa l t e r n a t i v et og r a i nc r o pw h i c hc a l l r e d u c et h ep r o d u c t i o nc o s to ft h ef u e le t h a n o lr e s e a r c h j e r u s a l e ma r t i c h o k e m a i n l yc o n t a i n si n u l i nt h a ti sc o m p o s e do fl i n e a rc h a i n so fd - f i m c t o s eu n i t s w h i c hc a nb ee a s i l yh y d r o l y z e db ym i c r o b i a li n u l i n a s ei n t of r u c t o s e i ti s v e r yi m p o r t a n tt os c r e e no u ti n u l i n a s e - p r o d u c i n gs t r a i nw i t hh i g he n z y m e a c t i v i t yi nr e s e a r c h i n gf u e le t h a n o lp r o d u c t i o n as t r a i no fa s p e r g i u u su s a m i iw i t ht h eh i g h e s te n z y m a t i ca c t i v i t i e sw a s o b t a i n e d 丘o mf i v es t r a i n sa f t e rf u r t h e rs c r e e n i n g a s p e r g i l l u su s a m 豇w a s s e l e c t e df o rf u r t h e rr e s e a c h t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s 1 t h ee f f e c t so fn u t r i e n t sa n do t h e rc u l t u r a lc o n d i t i o n a so ni n u l i n a s e a c t i v i t yf z o ma s p e r g i l l u su s a m i iw a ss t u d i e s t oo p t i m i z et h eo p t i m a l c o n d i t i o n s ，e x p e r i m e n td e s i g ne m p l o y e ds i n # ef a c t o r , p l a c k e t t b u r m a n d e s i g n ( p b ) a n dr e s p o n s e s u r f a c e m e t h o d o l o g y ( r s m ) t h r e ef a c t o r s ， j e r u s a l e ma r t i c h o k e j u i c e ，p e p t o n ea n d ( n h 4 ) 2 h p 0 4 ，s i g n i f i c a n t l y i m p r o v i n gt h ei n u l i n a s ea c t i v i t i e s ，w e r es c r e e n e df o rf u r t h e ri n v e s t i g a t i o n b yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) ，am a t h e m a t i c a lm o d e lw a s d e v e l o p e d t os h o wt h e s i g n i f i c a n t e f f e c to fe a c hf a c t o ra n dt h e i r i n t e r a c t i o n so nt h ei n u l i n a s ea c t i v i t i e s ，a n dt h eo p t i m u mm e d i a c o m p o s i t i o n f o rt h ei n u l i n a s ea c t i v i t i e sb ya s p e r g i l l u su s a m 豇i ns h a k i n gf l a s kc u l t u r e w a s 倒l ) ：j e r u s a l e ma r t i c h o k ej u i c e l1 7 2 8 ，p e p t o n e 2 2 1 4 ，( n h 4 ) 2 i - i p 0 4 3 9 4 ，n a c l5 0 ，m g s 0 4o 5 0 ，m n s 0 40 1 0 ，i n i t i a lp h6 5 ，5 0 m la t2 8 u n d e ra b o v ec o n d i t i o n s ，t h eh i g h e s ti n u l i n a s ea c t i v i t i e sb ya s p e r g i l l u s u s a m i iw a sa c h i e v e d m 江蕴太堂翻鲎焦论支 2 p r o p e r t i e so ft h ec r u d ei n u l i n a s ew e r ea l s os t u d i e d t h eo p t i m a l r e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n d p i - io fi n u l i n a s ew e r e6 0 ca n d6 0r e s p e c t i v e l y w i t h i np h 3 0 7 0a n da t4 0 - 4 ，0 c t h ee n z y m ew a ss t a b l ea n dm a i n t a i n e d h i g he n z y m e w i t h i n u l i n a s s u b s t r a t e k i n = 8 3 7 7 m g r a l , v m a x = 5 5 2 m g m l 。r a i n t h em e t a li o n s h a v ed i f f e r e n te f f e e mo nt h e i n u l i n a s ea c t i v i t y t h ee f f e c t so ni n u l i n a s eo fc u ”w a sn e g l i g i b l e w h e r e a s n a + a n dm n 2 e x h t o i t e dp o s i t i v ee f f e c t s0 1 1t h ei n u l i n a s ea c t i v i t y ；f e “a n d m g + i n h i b i t e da c t i v i t yt od i f f e r e n td e g r e e 3t h ec r u d ei n u l i n a s ep r e p a r a t i o nw a sp u r i f i e di nas e q u e n c eo f o p e r a t i o ni n c l u d i n gd e c o l o r a t i o nb ya m m o n i u ms u l f a t ef r a c t i o n a t i o n , d i a l y s i s ，i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo nd e a e - c e l l u l o s ea n dc o l u m n c h r o m a t o g r a p h yw i t hs e p h a d e x g 一1 0 0 o ns d s p a g et h e p u r i f i e d e n z y m eh a sf i v ep r o t e i nb a n d s t h ef i r s tp r o t e i nb a n dh a dn o tt h ee n z y m e a c t i v i t y , s oi tw a sn o ti n u l i a s e o t h e rp r o t e i nb a n d sh a dt h ee n z y m e a c t i v i t i e s t h er e s u l tw a ss h o w e dt h a tt h e ym i g h tb ei n u l i n a s ei s o z y m e s 4 t h er e d u c i n gs u g a r sp r o d u c t i o nl i o mj e r u s a l e ma r t i c h o k eb y a s p e r g i l l u su s a m i iw a ss t u d i e d a f t e rb o ms i n g l ef a c t o ra n dm u l t i f a c t o r o r t h o g o n a ld e s i g nt e s t , t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ef o t m d ：1 1 0 j e r u s a l e m a r t i c h o k ej u i c e ，0 3 k i - 1 2 p 0 4 、o 4 m g s 0 4 k e yw o r d s ：a s p e r g t t l u su s a m 豇，h u l i n a s e ，p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n i v 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部 内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密函 学位论文作者签名：劲溻：务 刎年月口日 指导教师签名：量买 z 。司年6 凡 d j 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：魏铺：务 日期：年 月日 江蕴盘生殖士翌焦逾支 第一章绪论 1 1 菊粉及菊粉酶的概述 菊粉皿u l i n ) ，又名菊糖，是果糖( f r u c t o s e ) 以1 3 - 2 ，1 - 糖苷键相连而成的直链多糖， 在其还原端有一个葡萄糖基，菊粉的分子式表示为g f b 。其中g 为终端葡萄糖单 位，f 代表果糖分子，n 则代表果糖单位数。菊粉的聚合度为2 6 0 ，分子量在 3 5 0 0 5 5 0 0 之州1 】。它是一种储备性多糖类物质，广泛存在于一些菊科植物中， 如菊芋( 亦称洋姜) 、菊苣、大丽花、牛蒡等。不同的植物来源、收获季节、气候与 土壤条件以及生产加工过程，对菊粉平均分子量和聚合度都会产生影响。 菊粉作为除淀粉外的一种能量储备物质存在于许多植物中，同时，它还用于 保持植物体内渗透压的平衡。菊粉易溶且分子的聚合度能够变化，植物可以在不 改变总糖含量的条件下通过调节液泡内菊粉分子的聚合度来调节细胞的渗透压。 在寒冷或干旱的地区，植物可以通过内切菊粉酶将大分子菊粉水解为小分子的果 糖链，维持渗透压的平衡，从而减少不利的气候条件对细胞的影响 2 1 。这使得同 一植物在不同的生长时期菊粉的含量和聚合度都存在着差异。 菊粉酶( i n u a n a s e ) 是能够水解b 2 ，1 - d 果聚糖果糖苷键的一类水解酶，学名为 争2 ，1 d 果聚糖酶，又称p 果糖苷酶、p 果聚糖水解酶，争2 ，1 一d - 果聚糖水解酶 但c 3 2 1 ) t 3 1 。 1 2 菊粉酶的来源和分类 1 2 1 菊粉酶的来源 菊粉酶的来源广泛，自然界中的植物、土壤和水中及动物消化道中的许多微 生物都含有菊粉酶。由于微生物具有广泛的生物合成功能和较高的产量【4 l ，因此， 以微生物菊粉酶作为生物催化剂比来自植物或动物原料的制剂具有更多的优势。 另外，微生物菊粉酶在水解菊粉商业开发中起到了非常重要的作用【5 l 。微生物来源 的菊粉酶种类多，热稳定性好，适于发酵生产。据不完全统计，产菊粉酶的有丝 状真菌1 7 个属4 0 余种，酵母菌1 0 个属2 0 余种，细菌1 2 个属1 0 余种。其中产酶性能 较好的，酵母菌有：脆壁克鲁维氏酵母( k l u y v e r o m y c e s f r a g i l i s ) 、马克斯克鲁维氏酵 盗蕴盘堂殛鲎焦论塞 f f | ( k l u y v e r o m y c e sm a r x i a n u s ) 、德巴利酵母( d e b a r o m yc e s c a n t a r e l l 0 等，其菊粉酶多 为胞内酶或与细胞壁相结合；丝状真菌有：青霉( e e n i c i l l i u m s p p ) 、黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 等，其菊粉酶多为胞外酶嗍；细菌主要有枯草芽孢杆菌伽硎协s u b a u s ) ，产 酶以胞外酶为主f 7 棚。目前还有不少学者仍在致力于筛选新的产酶菌种，并对现有 菌种进行改造，以得到高酶活、热稳定性好的生产菌株。 1 2 2 菊粉酶的分类 菊粉酶有以下三种不同的分类方法。 1 2 2 1菊粉酶按照作用方式分为内切型菊粉酶和外切型菊粉酶 内切型菊粉酶随机地断开菊粉链内部的糖苷键，水解产物主要为低聚果糖； 外切型菊粉酶作用于菊粉链的非还原性末端的糖苷键，逐一水解释放出果糖，主 要产物为果糖。通常用i s 的大小来区分内切型菊粉酶和外切型菊粉酶。也有用 a = ( k c a t k m ) i ( k c a t k m ) s 来区分内切酶和外切酶。对于具有内切、外切菊粉酶活 性的粗酶液，通常测其对2 的菊粉溶液的活性和2 蔗糖溶液的活性( s ) ，计算 出i s 值，一般认为当i s 大于1 0 时，表现为内切酶活性；i ，s 小于l o 时，表现为 外切酶活性。 1 2 2 2 根据菊粉酶在微生物体内主要分布 由于菊粉酶在微生物体内主要分布细胞内、细胞壁和细胞外，分别称为胞内 酶、胞壁结合酶和胞外酶，它们的比例主要受菌种、碳源、温度和p h 的影响： ( 1 ) 随着温度的升高胞外酶比例下降，而其他两种酶比例上升； ( 2 ) 以菊粉或蔗糖为碳源培养微生物时，前者胞外酶比例高于后者，其他两 种酶则相反； ( 3 ) 胞外酶主要由真菌合成，细胞壁结合酶主要产自酵母； ( 4 ) 适当的p h 使细胞壁通透性增大，提高了胞外酶比例，其他两种酶比例 下降。 1 2 2 3 根据来源菊粉酶可以分为微生物菊粉酶和植物菊粉酶 微生物来源的菊粉酶种类多，热稳定性好，适于发酵生产。据不完全统计， 产菊粉酶的有丝状真菌1 7 个属4 0 余种；酵母菌1 0 个属2 0 余种，细菌1 2 个属1 0 余种。 植物菊粉酶主要来自于菊科植物中，从菊芋根、菊苣根、大丽花根或大蒜中 2 汪蕴盘堂殛堂焦逾塞 都能提取到菊粉酶。但植物中的菊粉酶含量很低，不能应用于工业酶制剂生产。 1 3 菊粉酶的应用 1 3 1 利用菊粉酶生产高果糖浆的应用 外切菊粉酶水解菊粉可以得到高纯度果糖。菊粉果糖是一种天然营养甜味剂， 因其甜度高( 甜度为蔗糖的1 8 倍，为山梨醇的1 5 倍) 和热值低而成为优秀的甜味 剂和低热值食品原料，适宜于高血脂、高血压及肥胖病患者服用，特别适于糖尿 病患者服用。作为强化甜味剂，已越来越受到国内外的重视与欢迎。 果糖尤其是高果糖浆( 玎隅) 有着优越的物理、化学性能：( 1 ) 由于甜度高可以 减少添加量，进而降低烘焙食品体积；( 2 ) 更高的饱和溶解度和更低的黏度使其生 产应用更为便利；( 3 ) 低的淀粉糊精凝固温度使食品在烘焙早期易于定型，缩短 烘焙时间；( 4 ) 更高的渗透压和更好的保湿性能能够延长软质食品货架期；( 5 ) 在面包加工中，除了提供甜昧外，果糖还是良好的酵母可发酵碳源；( 6 ) 更低的 冰点有利于冰冻食品在低温下保持不变形；( 7 ) 较强的抗结晶能力有利于保持冰 冻食品质地光滑，减少颗粒状物质的形成；( 8 ) 是果味饮料和糕点的首选甜味剂， 无须调味；( 9 ) 能够强化西点调料风味；( 1 0 ) 由于不易于结晶，是甜点优良配料 与甜味剂。 关于利用菊粉酶降解菊粉制备h f s 的应用研究较多。由于果糖甜度高，风味好， 热值低，不易造成龋齿，糖尿病患者也可利用，所以被广泛用于食品和医药工业。 另外，由于高果糖浆价格低廉，味甜、爽口，渗透压高，保藏效果好，所以已 成为美、日等国的主要甜味剂【9 】。以前，生产高果糖浆的方法步骤多，转化率低， 工艺复杂，成本高，色素重，副产物多，分离精制难。年代，美国、法国、比 利时、加拿大等国的科学家开始研究菊粉酶酶法制果糖，其工艺简单，转化率高， 产物纯，果糖产量高，可直接生产超高果葡糖浆。 1 3 2 利用菊粉酶生产低聚果糖的应用 内切菊粉酶水解菊粉可以得到高纯度低聚果糖。p s e u d o m o n s s p i 勾切菊粉酶水 解菊粉，底物浓度y 9 5 0 9 l ，反应4 8 h 后低聚果糖产率最大7 5 6 ，产物从d t r 2 到d p 7 ， 以d p 2 和d p 3 为主。固定化内切菊粉酶在最佳条件：底物浓度5 0 9 l , 反应液流速 1 2 m l _ h ，在5 5 c 下运转1 5 d ，低聚糖产率达到8 3 【l o l 。 3 盗蕴盘鲎纽堂焦硷塞 低聚果糖有以下的作用：抑制肠内沙门氏杆菌和大肠杆菌的生长，促进肠胃 功能，减少肠内腐败物质，改变大便性状，防止便秘，增加维生素的合成量，提 高动物免疫功能；促进体内双歧杆菌的增殖，建立双歧杆菌的优势种群；促进微 量元素铁、钙的吸收利用；保护动物肝脏，促进营养转化，是一种功能性饲料添 加剂，又被称为原生素( p p e ) 。 1 3 3 利用菊粉酶生产酒精的应用 利用菊粉酶生产酒精，国外对此报道很多。如用k 丘a g i l i s 或k m a r x i a n u s 直 接发酵菊粉生产酒精，几乎能完全将菊粉发酵成酒精。发酵粗菊芋提取液，不须 加其它营养物质，2 5 h 内酒精产量8 7 8 1 1 1 1 。 1 3 4 在其它方面的应用 菊粉酶还可直接发酵菊粉制备各种产品，如可制备丙酮丁醇，用于诊断肾脏 疾病，控制血糖升高。利用菊粉酶直接发酵菊粉，制作功能性食品和饲料添加剂 将有巨大的生产开发潜力。 1 4 菊粉酶研究现状及存在的问题 1 4 1 菊粉酶研究现状 当前，国内外的研究集中在以下几个方面。 1 4 1 ，1 菊粉酶酶活的测定 目前菊粉酶活力及酶活力在定义上还不统一，一般定义为：以菊粉为底物， 每m i l l 转化生成l t t m o l 还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。而且酶活力一般都 很低。虽然有研究表明可以通过一些黑曲霉的生化突变得到高效的菌种来提高菊 粉酶酶活力【3 】。 不同的人通过不同的条件所得到的菊粉酶酶活力也有很大的不同，从0 5 到 1 2 7 u ，m l 。k a l i le ta 1 用马克斯克鲁维酵母运用全因子设计方法得到最优培养条 件，获得了最高的菊粉酶酶活1 2 7u m l ，比以前的高6 倍【1 2 1 。由于菊粉酶酶活力的 测定是在不同的试验条件下，又不可能在同一的条件，可比性的意义不太大嘲。目 前主要测定酶活力的方法有以下几种。 ( 1 ) 外切型菊粉酶酶活用d n s 法测定，反应体系包括l 的菊粉( w v ) ( 用0 1 4 鎏苤盘堂殛圭茎焦硷塞 m o l l 、p h 5 o m c v a i n e 缓冲液配制1 和粗酶液在5 0 水浴中反应2 0 n l i n ，在5 5 0 n m 处 测吸光值。水解物中还原糖的含量以果糖为标准的【3 l 。 ( 2 ) q u a n gd n g i l y 锄等人用0 2 mp h 6 5 的磷酸缓冲液o 7 5 m l ，5 蔗糖溶液 1 5 m l 以及0 6 5 m l 蒸馏水先在5 0 c 水浴中保温1 0 m i n ，后加入0 1 m l 经适当稀释的 酶液，在水浴中继续反应1 5 m i n 后，放到聚乙二醇4 0 0 沸水浴1 0 m i n 终止反应。冷却 后用s o m o g y i n e l s o n 法在5 2 0 n m 处测吸光值，还原糖的含量以葡萄糖为标准的【1 3 1 。 ( 3 ) 取l m 【膊液和9 m i 2 菊粉( 用0 1 m p h 4 5 醋酸缓冲液配制的) 放在5 0 c 水浴中，生成果糖的量用d n s 法测赳1 4 1 。 ( 4 ) 分别取2 m l o 2 的菊粉和0 0 1 mp h 4 6 的醋酸缓冲液，再取o 5 m 隘适当 稀释的酶液，一起放到5 0 c 水浴中保温2 0 r a i n 。之后放入沸水浴l o m i n 使酶失活。 离心分离上述反应体系，以果糖为标准用d n s 法测定生成还原糖的量【堋。 ( 5 ) 取0 0 2 5 m l 酶液和1 0 r o l l 的菊粉或0 8 蔗糖或0 8 棉子糖( 用5 0 r a m p i - 1 5 0 柠檬酸磷酸缓冲液配制) ，放到4 0 水浴中，每隔一段时间( 0 - - 3 0 m i n ) 取 出1 m l 测其还原糖的量【1 6 1 。 ( 6 ) 用n e l s o n 法测菊粉酶酶活力，取0 1 m l 经适当稀释的酶液和0 9 m l 2 5 m m 菊粉( 用5 0 m mp h 5 5 醋酸钠缓冲液配制) ，该体系放到6 0 水浴中1 h 后测定还原糖 的量【1 7 1 。 ( 7 ) 彭英云等人用3 ，5 一二硝基水杨酸( d n s ) 法：取0 2 m l 粮酶液加入5 m l 2 底 物( 菊糖或蔗糖，用0 2 m o l l 、p h 4 5 的醋酸缓冲液配制) ，5 0 c 下反应3 0 r a i n ( 在水解 曲线的线性范围内) ，沸水浴5 m i n 使酶失活，测定水解物中还原糖含量。在相同条 件下，以加入失活的酶液作对照嗍。 ( 8 ) u l m a ( 1 9 8 7 ) 报道的方法是，取5 0 儿适当稀释的酶液，加入4 5 0 p l 5 的菊 粉( 0 1 m o lp h 4 。5 的醋酸缓冲液配制) ，6 0 c 保温l o m i n ，沸水浴s m i ，灭活终止反 应( 在完全相同的条件下灭活酶底物对照) ，快速冷却后，用s o m o g y i - n c l n 嗽测 定还原槲1 9 1 。 ( 9 ) 谢秋宏等( 1 9 9 9 ) 将已培养好的培养液离心分离，上清液作为粗酶液， 取一定量的粗酶液，用0 1 m o lp h 3 2 的醋酸缓冲液适当稀释，取0 5 m l 稀释液加 4 5 m l 5 菊粉液混合，5 0 c 3 0 m i n 沸水浴煮l o m i n 终止酶活，用塞氏比色法测还原 糖量1 2 0 1 。 5 婆蒸盘茔题士茔焦逾支 ( 1 0 ) p e s s o n ir a b 等人把发酵液经过过滤，滤液经适当稀释后取l m l 加入 4 m l 2 菊糖( 用0 2 m o l l ，p h 4 5 醋酸缓冲液配制) ，5 0 下反应3 0 m i n ，再取0 5 m l 反应液，加入1 5 m l 水和1 5 m l 3 , 5 二硝基水杨酸试剂，沸水浴加热5 m i n 后，定容 至2 5 m l ，5 7 5 n m 下测定吸光度，并计算反应生成的还原糖量【5 l 。 1 4 1 2 筛选高酶活、稳定性好的菌株 有很多微生物都能产生菊粉酶的，如马克斯克鲁维酵母k l u y v e r o m y c e s m a r x i a n u s1 4 】，黑曲霉a s p e r g i l l u s ， 葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u s ，x a n t h o m o n a s 以及 p s e u d o m o n a s 1 5 - 6 1 据不完全统计，产菊粉酶的丝状真菌有1 7 个属4 0 余种，酵母菌 有1 0 个属2 0 余种，细菌有1 2 个属1 0 余种用。 1 9 9 8 年曾有报道，从嗜超高温细菌海栖热袍菌( t h e r m o t o g am a r i t i m a ) 中分离 到具有转化酶和菊粉酶活性的外切型b - d o f f a s e ，其最适活性温度为9 0 - 9 5 ，在 8 0 c ，p h 7 ，保温5 h ，可保持8 5 的酶活，是目前报道的最耐热的菊粉酶 5 1 。 s h a r m a 研究从菊苣根部的土壤中分离出青霉菌，这些菌种经过n t g u v 和 e t b r - u v 处理，经过突变后，有些菌株会产生i s 很高的菊粉酶。结果表明在产菊粉 酶的微生物在经过诱导有机突变的物质处理后，其菊粉酶酶活有所提耐2 。 w e i ，w 舜j k l u y v e r o m y e e as p y _ 8 5 运用了响应面分析法得到了最优的培养基。 在菊芋汁，尿素，牛肉膏，玉米浆的浓度分别为8 0 ，2 0 ，0 2 ，4 0 在3 0 c 发酵2 4 h 会得到最大的酶活力5 9 5 u m l 的菌种阎。 1 4 1 3 产酶发酵条件及菊粉酶纯化的研究 ( 1 ) 不同条件对微生物产菊粉酶的影响 碳源的影响 有人研究发现产菊粉酶的微生物可以利用菊粉，蔗糖，果糖，乳糖，棉子糖， 木糖，麦芽糖作为碳源翻。 p e s s o a 等人研究了以菊粉作为主要的碳源的马克斯克鲁维酵母，比用蔗糖，果 糖，乳糖，棉子糖，蔗糖，麦芽糖，淀粉作为碳源产菊粉酶酶活力高。用葡萄糖， 果糖，蔗糖作为碳源其酶活力分别减少了4 6 ，5 8 ，7 1 1 2 3 1 。 p o o r n av 等人经过研究发现黑曲霉产菊粉酶最好的碳源是菊粉【1 5 l 。f o n t a n a 等 人用菊粉的衍生物己酸化菊粉和胆固醇菊粉作碳源，发现己酸化菊粉是最好的诱 导物，其酶活力比用菊粉作诱导物提高t 4 9 - 8 6 倍。这可能是由于己酸化菊粉不 6 婆蕴盘鲎殛鲎焦逾塞 仅是更有效的诱导物，而且菊粉上的羟基被酯化后连接上的脂肪链有表面活性剂 的作用，使得诱导物更易聚集在细胞壁上，从而改变了细胞壁的穿透能力，增加 了对诱导物的吸收例。 氮源的影响 有机氮源中，蛋白胨和玉米浆作氮源普遍使产酶量提高，而脲和酵母膏影响 不大闭。酵母膏是最适合产菊粉酶的微生物的有机氮源之一，尽管其含有不利于 产菊粉酶的铵离子旧。在无机氮源中，普遍以o 珊4 ) 2 m 0 4 和n h h 2 p 0 4 作氮源的产 酶量最高，呷4 ) 2 s 0 4 、n i - 1 4 c i 、n h i n 伤和k n 0 3 也能促进产酶量的提高。 温度的影响 c a z e t t a 等人厍l y e a s tkm 柏【i 觚惦v 札b u l g a d c u s 在酵母提取物上培养产菊粉酶， 发现培养温度既不影响其生长，对其产酶也没影响嗍。但有人研究发现马克斯克 鲁维酵母最佳产酶温度为5 5 聊。 p h 的影响 c a z e t t a 等人用y e a s tk m a t x i a n u sv a t b u l g a r i c u s 在酵母提取物上培养产菊粉酶， 最适宜的培养p h 为3 5 1 2 0 。还有人研究发现马克斯克鲁维酵母最佳产酶p h 为4 5 吲。 金属离子的影响 不少学者还研究了金属离子对菊粉酶活性的影响，发现重金属离子如c u 2 * 、 a 矿、h g + 等对菊粉酶活性有明显抑制作用，有时a g + 甚至会完全抑制酶活，而c 0 2 + 、 一、m 孑+ 等有一定激活作用。b a “、c a 2 + 对a l t e r n a r i aa l t e r n a t a 酶活力有促进作 用，而c u 2 + 、h 尹、f e 3 + 对其有抑制作用阅。有人研究发现f e j “能使马克斯克鲁维 酵母的酶活力提高4 1 9 7 ，但m 矿+ 对其产酶能力有很明显的抑制作用吲。 超声波的影响 把发酵3 6 h 的圈吵嗍y c 酷竹唧如经过温和的超声波( 2 0k h z ，1 0w ) 2 a h ，结 果表明其酶活力提高一倍多，最佳产酶温度为3 2 ，最佳产酶p h 为6 5 - 7 0 ，并且 发现经过超声波处理对其细胞并没有损坏例。 搅拌速度，通风量以及剪应压力的影响 b e m a r d o 等人从搅拌速度，通风量以及叶轮的类型作为一系列搅拌因素对马克 斯克鲁维酵母产酶能力进行研究，运用了2 2 因子试验设计和响应面分析方法。结果 表明混合条件对马克斯克鲁维酵母产酶能力影响很大，而通气量对其影响不太大。 7 窿蕴太堂殛士茎焦途塞 另外，结果还表明当叶轮的刀片为斜面，转速为4 5 0 r p m ，通气量为1 0 v v m 时会得 到最好的酶活力1 7 0 i ，m i ，。马克斯克鲁维酵母产生菊粉酶过程中最大的剪应压力 应大约为0 2 2 p a ，因为过高的压力会使马克斯克鲁维酵母细胞致死率升高，影响其 酶的产生。剪应压力对其它的微生物也会产生同样的影响已经得到证实了1 1 4 1 。 ( 2 ) 菊粉酶的纯化 菊粉酶的纯化步骤一般分为：硫酸铵沉淀、离子交换层析及凝胶过滤色谱等【1 1 。 s u 1 1k a n g 等人用发酵液的上清液中加入浓度为4 0 硫酸铵后在4 c 时进行离心分 离，离心所得的上清液再加浓度为8 0 硫酸铵沉淀。沉淀物在4 时用5 0m m 、 p h 7 5t r i s - h c i 缓冲液进行溶解和透析，然后在室温下进行酶的纯化。用不同浓 度( 0 0 5 m ) n a c l 进行线性梯度，内切酶先洗出，外切酶后洗出闭。张国青等人用 毛壳霉( c h a e t o m i u ms p ) c 3 4 发酵液经硫酸铵分级沉淀、d e a e - 纤维素1 1 离子交 换层析、q 2 s e p h a r o s ef a s tf l o w 离子交换层析、s e p h a c r y ls 2 0 0 凝胶过滤、p h e n o l s e p h a r o 1 mh p 疏水层析，得到电泳纯的内切菊粉酶组分，纯化倍数为3 0 8 倍，活 力回收率为7 7 1 3 1 】。于宏伟等人用黑曲霉( a s p e r g i l l u 8 n i g e r ) u y 2 菊粉酶经超滤 浓缩，硫酸铵分级盐析，d e a e - 纤维素离子交换层析，s e p h a d e x g - 1 0 0 凝胶过滤， 提纯得到单一组分，经电泳鉴定达到电泳纯。测定比活力为2 2 0 5 u m g , 提纯倍数 为7 7 1 嗍。有些微生物菊粉酶不宜用硫酸铵沉淀，如l 【m a r x i a n u sv a rb u l g a r i c u s 菊粉酶用硫酸铵沉淀易失活，最好用丙酮、乙醇沉淀或冷冻干燥【3 3 l 。 1 4 1 4 进行诱变育种以得到高产突变株以及去阻遏的突变株 印度的v i s w a n a t h a n 和k u l k a m l 用紫外光照射一株酶活力为1 2 0 u ，m l 的黑曲 霉野生菌株，其突变株酶活力提高了3 倍多，达到3 7 4 u m l 甜i 。由于菊粉酶的合 成受其产物的阻遏，所以在生产中会影响到菊粉酶的产量，降低生产效率。采用 去阻遏的突变株可很好的解决这个问题。b a j o n 用e m s ( e t h y l m e t h a n c s u i f o n a t e ，乙 基甲烷磺酸盐) 处理毕赤氏酵母( 阢 细即枷d 叼咖) 菌体，再用2 - 脱氧葡萄糖选择， 获得了去阻遏的突变株【切。 1 4 1 5 分离提取菊粉酶的c d n a 片段，分析e d n a 顺序，进而推导出氨基酸顺序 从分子角度研究其反应中心、必需基团，以便进一步用蛋白质工程和基因工 程技术改造菊粉酶。现已有从马克斯克鲁维氏酵母、海栖热袍菌、枯草芽孢杆菌 等中得到的外切型菊粉酶的c d n a ，以及从产紫青霉( p p u r p u r o g e m a n ) 、黑曲霉等 8 江蕴盘生殖堂焦硷支 中碍到的内切型菊粉酶c d n a ，并对其序列进行了分析，发现这些酶的c d n a 序 列推导出的氨基酸序列中均存在一段保守序列一弘果糖苷酶基序 ( b - f r u c t o s i d a s e m o t i 0 ，而且同样的序列也存在于酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的转化酶以及枯草芽孢杆菌的果聚糖酶中。在果聚糖酶和菊粉酶中该基序中的一 个基团是完全一致的，有学者预测此基团就是催化基团【1 4 l 。b - 果糖苷酶基序及其 周围的序列是高度保守的网。 1 4 1 6 克隆并高效表达菊粉酶基因，构建基因工程菌 e r i c h 等人将枯草芽孢杆菌的菊粉酶基因转入大肠杆菌中【3 l ，而b r e v n o v a 等将 马克斯克鲁维氏酵母的菊粉酶基因转入酿酒酵母。1 9 9 8 年有人将嗜超高温细菌一 海栖热袍菌的菊粉酶基因转入大肠杆菌阻c o l o 中。关于菊粉酶的分子生物学研究 始于如年代，但至今具有生产意义的工程菌株尚未构建成功。 菊粉外切酶分子生物学研究始于9 0 年代l a l o u x 首次构建菊粉酶基因文库，是从 k l u y v e r o m y c e sm a r x i a n u s 酵母中克隆出外切菊粉酶基因i n u i ，o r f 长度1 6 6 s h , ，编 码5 5 5 个a a ，分子量为5 9 6 7 2 d a ，前1 6 个a a 为信号肽序列阳。 y t s u j i m o t o 等人研究的外切型菊粉酶基因编码是从嗜热g c o b a c i i l u s s t c a r o t h e r m o p h i l u s ( b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u a ) k p1 2 8 9 在4 l 和6 9 培养得到的。 i n u a 基 编码4 9 3 个氨基酸，长度1 4 8 2 b p ，分子量5 6 7 4 4 d a ，和p s e u d o m o n a s m u c i d o l e n se x o - i n u l i n a s e ，b a c i l l u ss u b t i l i sl e v a n a s e , p a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a ( b a c i l l u s p o l y m y x a ) 等外切型菊粉酶非常相似，表明属于糖基水解酶3 2 系列。结果表明表现 其酶活性是单体 3 5 1 。k c i n u l 基因编码是眦l u y v e r o m y c e sc i c e r i s p o r u ac b s 4 8 5 7 菌 种得到的，k c i n u i 的0 i u p 长度1 6 6 y o p ，编码5 5 5 个a a ，前2 3 个为信号肽 3 6 1 。 h y u n - j uk w o n 等人研究t b a c i l l u sp o l y m y x am g l 2 1 的外切型菊粉酶的基因编 码，有1 4 5 5 个核苷酸，编码4 8 5 个a a ，分子量为5 5 5 2 2 d a l 3 7 1 。 1 4 1 。7 新技术的采用 目前报道最多的是采用固定化酶或细胞等技术对菊粉酶生产果糖、果葡糖浆、 低聚果糖、乙醇等进行细致的工艺和生产应用研究。曾做过用戊二醛固定1 2 j ，及用 d e a e - c c l l u - l o s e ( z 氨乙基纤维素) 吸附脆壁克鲁维氏酵母发酵菊芋提取液的研 究p o l 。