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嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的特性及其对面包品质的影响 摘要 本课题以大豆分离蛋白为原料，以面包为研究对象，用嗜酸乳杆菌发酵大豆分 离蛋白，并将改性后的大豆分离蛋白应用于面包制作工艺中。主要研究结果如下： ( 1 ) 通过用嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白，以总酸度为考察指标，得到发酵的 最优工艺条件为：大豆分离蛋白7 ，葡萄糖5 ，发酵温度3 9 。c ，发酵时间5 6 h ， 接种量为1 ，此时发酵液酸度为7 6 9 k g 。 ( 2 ) 与未发酵过的大豆分离蛋白( s p i ) 相比，经嗜酸乳杆菌发酵后制得的改 性大豆分离蛋白( m s p i ) 的溶解性提高了7 左右、吸油率提高了8 左右；m s p i 的极性氨基酸含量增加了1 0 5 2 ；m s p i 的表面微观形态变得粗糙，a 螺旋结构在 二级结构中所占比例减少，并且二硫键暴露出来。 ( 3 ) 酸度不同的m s p i 对面包的感官品质影响不大。添加m s p i 对面包体积有 不利影响，面包有明显的酸味，但是可以适当提高面包的水分量。大豆分离蛋白可 以延缓面包老化的速度，在相同的添加量下，m s p i 对面包老化的延缓效果优于s p i 。 m s p i 可以延缓面包老化的速度，并且随m s p i 添加量的增加，面包硬度变大；但随 着放置时间的延长，添加m s p i 的面包硬度增加缓慢，添加量越大，面包硬化速度 越慢。 ( 4 ) m s p i 可以改善面团的吸水性，面团吸水率与m s p i 的添加量成正比；m s p i 的加入可以延长面团形成时间和稳定时间，使面团筋力增强。m s p i 添加量越大，面 团弱化度越小，强度越大，越稳定。在m s p i 添加量为2 时，面团筋力较好，继续 增大添加量时，筋力会有所下降。m s p i 的添加可以增加面团的延伸度，即可以加强 面筋网络的膨胀能力，改善面团的流散性。 关键词：大豆分离蛋白；嗜酸乳杆菌；发酵；面包 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 a b s t r a c t t h ea i mo ft h i ss t u d yw a st od e v e l o pak i n do fs o yp r o t e i np o w d e rs p e c i a l l yu s e di n b r e a d s o yp r o t e i ni s o l a t ew a sf e r m e n t e db yl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s t h ep r i n c i p a l f i n d i n g sw e n ta sf o l l o w s ： ( 1 ) t h er e s u l ts h o w e dt h a t7 s p ia d d e d5 g l u c o s e ，i n o c u l a t i o nr a t i ow a s1 ，a n d f e r m e n t a t i o nt i m ew a s5 6ha t3 9 a tl a s t t h ea c i d i t yo fy o g u r tr e a c h e d 7 6 9 k g ( 2 ) c o m p a r e dw i t h u n f e r m e n t e ds p i ，t h e s o l u b i l i t y o fm o d i f i e ds p i ( m s p i ) f e r m e n t e db yl a e t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sh a sb e e ni m p r o v e da b o u t7 o i la b s o r p t i o n8 a n dt h ec o n t e n to fp o l a ra m i n oa c i d s10 5 2 ：t h es u r f a c em o r p h o l o g yo fm s p ib e c a m e r o u g h ；i nt h es e c o n d a r ys t r u c t u r e ，t h er a t i oo fq h e l i xs t r u c t u r ew a sr e d u c e d ，a n dt h e d i s u l f i d eb o n dw a se x p o s e d ( 3 ) t h ee f f e c to fs e n s o r yq u a l i t yo fb r e a da d d e dm s p ii nd i f f e r e n ta c i d i t yw a sv e r y l i t t l e b r e a da d d e dm s p ih a v ea d v e r s ee f f e c t so nb r e a dv o l u m e ，b r e a dt u m e ds o u r o b v i o u s l y , b u ty o uc a ni n c r e a s et h ew a t e rv o l u m eo ft h eb r e a da p p r o p r i a t e l y s o yp r o t e i n i s o l a t ec a nd e l a yt h es p e e do fa g i n go fb r e a d ，a d dt h es a m ea m o u n to f , t h ee f f e c to nd e l a y t h ea g i n go ft h eb r e a db ym s p ii sb e t t e rt h a ns p i m s p id e l a yt h es p e e do fa g i n go fb r e a d ， a n da d dw i t ht h ei n c r e a s ei nt h en u m b e ro fm s p i ，t h eh a r d n e s so fb r e a dw a se n h a n c e d ； b u tw i t ht h ee x t e n s i o no fs t o r a g et i m e ，t h eh a r d n e s so ft h eb r e a dc h a n g e ss l o w l yw h e n m s p l w a sa d d e d ，a n dm o r eo ft h ea d d i t i v ea m o u n t ，m o r es l o w l yh a r d e n e db r e a d ( 4 ) m s p ic a ni m p r o v et h ew a t e ra b s o r p t i o no fw h e a td o u g h ，m s p ih a dap o s i t i v e c o r r e l a t i o no nw a t e ra b s o r p t i o n ；w h e a td o u g ha d d e dm s p ic a ne x t e n dt h ed o u g h d e v e l o p m e n tt i m ea n ds t a b i l i t yo ft i m et oa l l o wt h ed o u g ht os t r e n g t h e ng l u t e n a d dm s p i l a r g e r , t h es m a l l e rt h ed e g r e eo fw e a k e n i n go fd o u g hs t r e n g t h ，t h ed o u g hw i l lm o r es t a b l e i t s a d d i n g2 i nt h em s p i t h ed o u g hg l u t e nb e t t e r , c o n t i n u et oa d dt h ea m o u n to f i n c r e a s e ，t h ed o u g hg l u t e nd e c r e a s e dt h ee x t e n s i o no fc a p a c i t yo fd o u g hc a nb ee n h a n c e d w h e na d d i n gm s p it oi m p r o v et h ec i r c u l a t i o no fd o u g h k e yw o r d s ：s o yp r o t e i ni s o l a t e ；l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ；f e r m e n t ；b r e a d i l 嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的特性及其对面包品质的影响 i i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密舀 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我- n 工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名： 副传 时间： 沙口歹年多月罗日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专荆等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文侍者签名：叫佳 导师签名： 潘& 岛己 铭怵沙川 擀吼1 “月7 日 注：请将本发商接装订住何论文的扉页和f 1 采之问 嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的特性及其对面包品质的影响 1 研究的目的和意义 第一章前言 面包一直是受人们喜爱的一类食品，尤其在西方国家，面包几乎成了食物和粮 食的代名词，在人们的生活中占据极其重要的地位。面包具有独特的风味、多样的 造型，并且营养丰富。随着科技的进步，消费的需求，面包的品种、风味越发丰富 多彩，真正成为食品行业中引人注目的亮点。 面包是以面粉为主要原料，配以糖、油、蛋等辅料，加入酵母和水调制成面团， 经发酵、烘烤制成的食品。在欧美大部分国家，面包是人们日常生活中的主食；而 在中国，虽然面包在饮食上占有一席之地，但仅仅作为早餐或者旅游食品、方便食 品。人们喜欢以甜的面包作为点心，但以面包为主食替代米饭、面条和馒头，在短 期内不会被人们接受。随着人们饮食观念的不断成熟，越来越多的人把价值的尺度 投向了食品安全和有益健康这方面来。由于小麦蛋白的氨基酸组成不平衡，赖氨酸 含量较低，并且面包在空气中很容易失水、老化，极易降低原有的风味和口感，因 此，在面包中强化营养以及改善面包的品质特性，成为面包工业化发展中最迫切的 问题。 大豆蛋白应用于食品工业在我国已有2 0 0 0 多年的历史。大豆蛋白含有丰富的蛋 白质，尤其是赖氨酸含量较高，还含有多种营养成分，将大豆蛋白添加到面包中， 可以起到氨基酸互补作用。国外研究者很早就开始将大豆蛋白添加到面包中，用来 强化蛋白质。还有的学者利用大豆蛋白的持水性、吸油性、溶解性、乳化性等功能 特性，以改善面包的品质特性。近年来，大豆分离蛋白因其蛋白质含量高，功能特 性好，成为人们的研究热点。然而将其改性并添加到面包中的研究还比较欠缺，尚 未见到有关方面的报道。 本文以发酵法对大豆分离蛋白进行改性，优化发酵大豆分离蛋白的工艺参数， 并将改性后的大豆蛋白添加到面包中，研究其对面包品质的影响，为面包品质改良 和大豆分离蛋白的进一步应用提供理论依据。 华中农业大学2 0 0 9 届硕十学位论文 2 国内外研究进展 2 1 大豆蛋白概述 大豆中的蛋白质是指存在于大豆中的诸多蛋白质的总称，它不是单指某一种蛋 白质。一般情况下，大豆中蛋白质的含量高达4 0 左右，其中有8 0 - - 8 8 是可溶 的，在大豆制品的加工中主要利用的就是这一类蛋白质。组成大豆蛋白的氨基酸有 1 8 种之多，其中含有8 种必需氨基酸，且比例比较合理，氨基酸含量与动物蛋白类 似，特别是赖氨酸含量可以与动物蛋白相媲美。可见，大豆蛋白的营养价值极高。 大豆蛋白的营养价值，很早就为我国人民所认识。但在一些发达国家，虽然其 食用历史短，发展速度却是惊人的。美国从2 0 世纪4 0 年代起开始生产大豆蛋白食 品，1 9 7 1 年就加工成比较完善的人造肉。传统的大豆蛋白食品生产历史虽然悠久， 但经历2 0 0 0 多年却无多大变化。而在近几十年内，由于大豆蛋白的营养保健性及其 经济性被人们充分认识，也由于现代科学技术在大豆蛋白食品的生产中发挥了作用， 创造出了更加适合人们口味的新品种，从而开创了大豆蛋白食品生产的现代化。 大豆蛋白还具有较好的生物活性。例如：大豆蛋白能与肠内胆固醇类相结合， 从而妨碍固醇类的再吸收，并促进肠内胆固醇排出体外。有研究表明，食用大豆蛋 白后，血清中胆固醇浓度降低9 3 。由于胆固醇浓度每降低1 ，患心脏病的危险 性就降低2 - - 3 ，因此可以认为，食用大豆蛋白可使患心血管疾病的危险性降低 1 8 - - - , 2 8 。1 9 9 8 年1 0 月2 6 日，美国食品医药管理局( f d a ) 在华盛顿召开记者 招待会，确认摄取大豆蛋白与降低忠心脏病危险性呈正相关，并可在含大豆蛋白食 品的标签上标明健康标志；大豆中的大豆异黄酮可抑制骨骼再吸收，促进骨骼健康。 因此常食大豆食品对防止骨质疏松非常有益；大豆蛋白中的1 1 s 球蛋白和7 s 球蛋白 中含有3 个可抑制血管紧张肽原酶活性的短肽片段，而血管紧张肽原酶对稳定血液 循环和血压起着重要作用，因此，大豆蛋白还具有一定的抗高血压功能。 大豆蛋白在加工过程中也具备独特的性能。大豆蛋白具有较好的乳化性，可以 促进脂肪乳状液的形成及稳定，因此可以应用于肉制品，酱类，汤料，糕点中；利 用大豆蛋白的持水性，吸油性，可以改善肉制品和焙烤制品的品质特性；而其凝胶 性、粘弹性和粘附性可以应用于肉制品、乳酪等食品加工中；大豆蛋白还具有较好 的起泡性和分散性，可以用于奶油，蛋糕，乳制品中。 2 嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的特性及其对亟包品质的影响 正是因为大豆蛋白的这些优点，人们越来越关注更加合理有效的利用大豆蛋白。 目前，大豆分离蛋白、大豆组织蛋白、大豆浓缩蛋白等大豆蛋白产品因各自的功能 特性和营养成分的差异，已经广泛的应用于食品工业。其中，大豆分离蛋白成为近 几年科研学者们关注的热点。如何进一步提高大豆分离蛋白的营养特性和功能特性， 逐渐成为人们的研究热点。 因此，大力开发现代大豆蛋白食品，一方面增加了大豆蛋白的附加价值，有效 地利用了资源，另一方面对于那些过多地食用动物蛋白的人来说，增加植物性蛋白 的食用比例更有利于人体健康，能预防多种疾病，尤其是能预防心脏疾患。我国人 口饮食结构中，蛋白质供应明显偏低。而当前我国每人每年平均占有粮食只有3 2 5 k g 左右，我们不可能沿循世界发达国家解决蛋白供应的路子，只能根据国情，充分开 发利用植物蛋白资源，将植物蛋白与动物蛋白相结合，调整膳食营养结构的路子。 我国大豆资源十分丰富，大力进行现代大豆蛋白食品的生产与宣传，是提高我国人 民蛋白质食用水平的一个重要途径。 2 2 大豆蛋白改性方法概述 蛋白质是由大量氨基酸组成的高分子化合物，但是与其他高分子化合物不同， 由于其具有高级立体结构，所以呈现出各种各样的功能特性。为了充分发挥蛋白质 的功能特性，通常有必要在某种程度上保持蛋白质高级结构的稳定性。但是，在某 些因素的作用下，蛋白质二级以上的立体结构遭到破坏，其理化特性、功能特性和 生物学特性将发生变化，这种现象称为蛋白质的变性( 王凤翼等，2 0 0 4 ) 。大豆蛋白 的改性就是通过改变蛋白质的一个或几个理化性能，达到加强或改善蛋白质的功能 性的目的。同时抑制酶的活性或除去有害物质，达到除去异味和提高营养利用率的 目的。其实质就是改变大豆蛋白的分子结构，进而改变其理化性质，达到功能性质 改变的结果( 郭永和张春红，2 0 0 3 ) 。影响蛋白质变性的因素很多，例如加热、冷冻、 加压、磁场、电场、声场、机械作用( 超微粉碎、挤压等) 、低剂量辐射及添加小分 子双亲物质等物理因素以及酸、碱、盐类、有机溶剂、重金属等化学因素。对蛋白 质进行改性的方法目前主要有三种：物理改性、化学改性以及生物学改性。 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 2 2 1 物理改性 蛋白质的物理改性是指通过加热、冷冻、加压、磁场、电场、声场、机械作用 ( 超微粉碎、挤压等) 、低剂量辐射及添a n d , 分子双亲物质等物理手段来改善蛋白质 的功能特性、提高营养价值的方法。物理改性方法一般只改变蛋白质的高级结构和 分子间的聚集方式，一般不涉及蛋白质的一级结构( 华欲飞，2 0 0 1 ) 。物理方法是目 前蛋白质改性中常用的方法，它比较安全、可靠，具有费用低、作用时间短以及对 产品营养性质影响较小等特性。 g a l a z k a 等综述了高压处理对大豆蛋白的影响，研究表明高压处理可导致大豆蛋 白质的降解、变性和絮凝反应，可有效地改善大豆蛋白的凝胶和凝结性能，和热致 凝胶相比，高静压形成的大豆蛋白凝胶可在低粘度保持其柔滑的质地和弹性 ( g a l a z k ae ta 1 2 0 0 0 ) 。m o l i n a 研究了高压处理对大豆分离蛋白( s p i ) 以及其组分 乳化性能的影响，结果显示4 0 0m p a 的压力使s p i 的7 s 球蛋白解离为部分或全部变 性的单体，l l s 六聚体的多肽链的伸展导致絮凝( m o l i n ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 涂宗财等研究了超高压均质对大豆分离蛋白功能特性的影响及动态超高压微射 流对大豆分离蛋白起泡性、凝胶性的影响，结果表明动态超高压均质能使溶解性、 乳化性、起泡性、凝胶性有不同程度的提高( 涂宗财等，2 0 0 6 a ；涂宗财等，2 0 0 6 b ) 。 朱建华等用超声在不同时间、不同功率下处理s p i ，结果表明，超声处理后s p i 的溶 解性、起泡性、乳化性和凝胶性都有明显的提高( 朱建华等，2 0 0 4 ) 张春红等利用 热处理对s p i 进行改性，试验结果表明：在8 5 热烘处理1 0 m i n ，高温黏度、耐热 性和凝胶性最大，保水性最佳( 张春红等，2 0 0 4 ) 。 张春红和王欣研究了微波处理对大豆分离蛋白某些功能性的影响，结果表明：微 波处理对s p i 的溶解性、乳化性、乳化稳定性影响显著。微波处理的最佳条件为：微 波功率6 0 0 w ，反应时间2 m i n ，料液比为1 ：1 1 ，p h 值为1 0 。改性后s p i 的溶解性、 乳化性和乳化稳定性分别比对照提高3 2 15 、5 8 8 7 和5 6 5 4 ( 张春红和王欣， 2 0 0 8 ) 。 宋臻善和熊犍研究了超声辐射对大豆分离蛋白膜性能的影响。结果表明，超声 辐射对膜性能有明显的改善作用。经超声辐射处理2 m i n 可以显著提高膜的抗拉强 度，相对于对照样提高了6 4 0 8 ( p s 0 0 5 ) ；同时也明显降低了膜的水蒸汽透过系 数，相对于对照样降低了2 5 7 0 ( p 5 0 0 5 ) 。经超声处理后的膜机械强度和阻湿性 4 嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的特性及其对面包品质的影响 能均得到了提高，同时具有均匀透明的外观( 宋臻善和熊犍，2 0 0 7 ) 。陈莹等将挤压 过程用于蛋白质改性，使大豆浓缩蛋白经过挤压组织化处理后成为一种具有一定组 织特性的功能蛋白质。实验结果表明：大豆浓缩蛋白在挤压组织化过程中，发生了 二硫键交换反应，但并未形成异肽链，蛋白质的相对分子质量也无变化( 陈莹等， 1 9 9 4 ) 。 2 2 2 化学改性 蛋白质的化学改性是指采用化学方法改变蛋白质的结构、静电荷和疏水基团。 蛋白质的化学改性方法主要包括磷酸化改性、酸碱处理、酰基化改性、去酰胺改性、 糖基化改性、烷基化改性等。在众多的化学修饰方法中，磷酸化蛋白是很有前途的 用于改善食物蛋白功能性质的方法。化学改性常常会引起蛋白质基本结构( 初级结 构) 的改变，具有反应简单、应用广泛、效果显著的特点。 田少君等采用三氯氧磷对大豆分离蛋白进行磷酸化改性，测定了改性前后，大 豆分离蛋白的水溶性，水溶液的粘度，以及凝胶性，发现大豆分离蛋白的功能特性 有了很大的改善。改性后大豆分离蛋白的等电点由4 5 漂移到了3 0 左右。用3 1 p 核 磁共振谱，证实了三氯氧磷与大豆分离蛋白反应的实质主要是赖氨酸及精氨酸残基 进行氨基磷酯化反应( 田少君，2 0 0 3 ) 。 b a r m a n 将醋酸酐引入到大豆蛋白质结构的氨基酸中即成为乙酰化大豆蛋白，其 等电点向较低p h 值转变，在p h 4 5 p h 7 0 范围内溶解性提高，粘度、起泡性均有 所改善，而凝聚性降低。但乙酰化的酰化程度不能过度，否则会降低大豆蛋白的功 能性质( b a r m a n , 1 9 9 7 ) 。 蛋白质与多羰基化合物共价可增加蛋白质的功能性( 溶解性等) ，在希夫氏碱还 原下，单糖或低聚糖与一氨基酸发生美拉德反应，生成新的糖蛋白。同样半乳糖 甘露聚糖与大豆蛋白经过美拉德反应形成结合体，其在整个p h 下都有良好的溶解 性，而且热稳定性及乳化性也有所提高。另外，发生美拉德反应的大豆蛋白溶液的 抗氧化能力也大大改善，长时间放置不会变质腐败。此外大豆蛋白还可与其它碳水 化合物结合，如：大豆蛋白引入5 , - , 1 1 个棕榈酸分子后，其乳化性和起泡性均可提 高( 管军军和周瑞宝，2 0 0 1 ) 。 糖基化改性被认为是安全性较高且具有巨大潜在应用价值的化学改性方法。大 豆分离蛋白( s p i ) 与多种亲水胶体如k _ 卡拉胶、瓜尔豆胶、赤槐豆胶、魔芋胶、 5 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 甘露胶、阿拉伯胶的美拉德反应产物也具有良好的乳化活性和热稳定性，既保留了 蛋白质的表面活性，而且还具有多糖的亲水性能，因而可作为“绿色”乳化剂和稳定 剂使用( 齐军茹，2 0 0 4 ) 。 共价连接氨基酸是一种提高蛋白质营养价值和功能性质的方法。利用异肽键的 形成可以将外源氨基酸导入蛋白质中。将蛋氨酸或半胱氨酸与蛋白质共价连接，所 形成的异肽可被肠道氨肽酶水解。因此这种结合可用于蛋白质氨基酸富集，从而缓 解大豆蛋白中含硫氨基酸相对偏低的矛盾，也可防止氨基发生美拉德反应( 孙鹏， 2 0 0 5 ) 。 巯基和二硫键是决定蛋白质功能性质的主要基团。硫醇化使蛋白质分子间乃至 分子内的二硫键断裂，亚基伸展，疏水基暴露。经亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和半胱氨 酸处理后大豆蛋白的分散指数( p d i ) 和氮溶解指数( n s i ) 增大。亚硫酸钠和脲共 同处理大豆分离蛋白，其溶解性和表面活性均得到提高。亚硫酸和溴酸钾共同作用 可降低大豆蛋白的粘度。此外，用阴离子交换树脂除去大豆球蛋白中的肌醇六磷酸， 可减少钙离子等矿质元素的束缚量，提高它们的生物有效利用性( 李川，2 0 0 0 ) 。 去酰胺就是通过羰基中的o 和h + 发生质子化作用，导致氨释放，大豆蛋白富 含谷氨酰胺和天冬酰胺残基，可以用磷酸盐进行去酰胺反应。吴向明等研究了磷酸 盐对大豆分离蛋白进行去酰胺改性的影响，结果表明改性后大豆蛋白的等电点随去 酰胺程度的增加，向低p h 值移动，大豆蛋白的功能性质均有不同程度的提高和改 善( 吴向明等，1 9 9 6 ) 。 2 2 3 生物学改性 通过酶部分降解蛋白质，增加其分子内或分子间交联或连接特殊功能基团，可 以改变蛋白质的功能性质，提高营养价值。由于酶水解不产生消旋作用，也不破坏 氨基酸，反应条件温和，产品纯度高，催化反应具有反应时间短，反应效率高，产 物易分离等特点，因此受到国内外广大科学家的重视。并且，和化学改性相比，酶 法改性具有专一性强、毒副作用小等优点，因而成为目前最主要的改性手段。酶法 改性通常是蛋白酶的有限水解。酶法改性的程度取决于所用的酶、处理的时间以及 人们所需要的功能性质( 孙鹏，2 0 0 5 ) 。 大豆蛋白经水解后，其功能特点可明显改变，由于水解生成的肽及氨基酸易被 人体消化吸收，因此可用于病人、老年人及儿童食用。大豆肽是大豆蛋白经酶促水 6 嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的特性及其对面包品质的影响 解后形成的一定分子量范围的多肽混合物。大豆肽除具有大豆蛋白所具备的优点外， 还具有低黏度、抗凝胶形成性，而且在体内消化吸收快，不会产生过敏反应等优点。 此外还具有促进脂肪代谢、降血压、增强体能等生理活性( 刘大川和钟方旭，1 9 9 8 ； 宋俊梅等，2 0 0 2 ) 。 大豆蛋白水解的肽及氨基酸混合物食入人体后，具有降低胆固醇的作用，亦有 利于肠道内的乳酸菌、双歧杆菌的生长( a d e rn i s s e n , 1 9 7 6 ) ，同时水解产物因其呈 味，可作调味液增强剂加到酱油、豆酱及蚝油等汤料中( c u p t a , 1 9 8 2 ) ，另外氨基酸 的强力渗透力能很快渗入皮肤角质层，与皮肤上皮细胞结合，促使皮肤光泽、滋润 和富有弹性，因而可添加到膏、乳液等化妆品及含有氨基酸的清凉饮料中，口感淡 爽，浓度低而不腻口。 通过胰酶( 包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶) 限制性水解大豆分离蛋白( s p i ) ， 可提高s p i 的表面疏水性、改善其乳化性和溶解性。这种水解后的s p i 可用作食品 乳化剂。如调咖啡用的人造奶油、蛋黄酱和肉品。而用胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等 疏水专一性蛋白酶水解大豆蛋白，可降低大豆蛋白水解物的苦味( c a l d e r o ne ta 1 。 2 0 0 0 ) 。 何昕等人通过试验确定酸性蛋白酶彳s3 3 5 0 水解豆饼粉的较佳预处理条件为： 加5 的h c l 和9 0 。c ，3 5 h ；酶水解的较佳条件是p h 为3 0 ，加热温度为4 5 ，加 酶量为6 0 0 0u g ，水解时间为9 h ；并进一步改进工艺，7 0 目筛过筛，在5 0r m i n 转 速下连续搅拌，加入氯化钙的浓度为2 x 1 0 一m o l l ，可使水解度达到7 0 左右，氨基 酸态氮含量达到0 9 9 1 0 0 m l ( 何听等，2 0 0 2 ) 。 周利亘等人以大豆分离蛋白为原料，经蛋白酶酶解、分离、提纯制得大豆多肽。 试验采用复合酶解法结合正交试验分析。确定大豆蛋白复合酶解的最佳工艺条件为： 三酶复合蛋白酶( 由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶以l ：2 ：7 的比例复合而 成) 、底物浓度4 、p h 7 0 、酶解时间9 h 、大豆蛋白酶水解度( d h ) 8 4 4 0 ( 周利 亘等，2 0 0 5 ) 。 丛建民等人采用物理方法与酶解技术相结合水解大豆分离蛋白制备大豆肽。确 定了大豆肽的制备工艺参数，即：温度为5 5 ，p h 为8 5 ，底物浓度为3 ，酶与 底物比为6 ，水解时间为1 h ，此条件下水解度( d h ) 为9 2 2 7 ，并分析了各工艺 参数对水解效果的影响；微波处理能提高水解度( d h ) 和氮溶解指数( n s i ) 5 以 上( 丛建民等，2 0 0 3 ) 。 7 华中农业人学2 0 0 9 届硕上学位论文 目前微生物蛋白酶有a l c a l a s e ，枯草杆菌1 3 8 9 ，黑曲酶3 3 5 0 等分离产生的酶。 环状芽胞杆菌分离出来的肽谷氨酰胺酶，能快速水解大豆蛋白中谷氨酰胺中的酰胺 基，而整个蛋白质不受影响，蛋白质的溶解性、乳化性和起泡性也大有改进，但气 泡稳定性未见改变。蛋白酶a l c a l a s e 作用于大豆分离蛋白，水解度小于6 时，产物 乳化性随其溶解性增加而改善。唐传核等人用转谷氨酰胺酶( m t g a s e ) 催化大豆 1 1 s 球蛋白。紫外光谱结果显示m t g a s e 催化大豆酸沉蛋白( s a p p ) 导致它的多肽 链的侧链结构发生了变化，而荧光光谱显示m t g a s e 催化导致s a p p 的疏水区域暴 露出来，而且还经历一个空间结构重排的过程，红外光谱显示这种聚合作用还导致 多肽链的二级结构发生较大的变化，即一部分的b 折叠二级结构转变为0 1 螺旋或无 规卷皓( 唐传核等，2 0 0 4 ) 。 梁金钟等利用微生物液态发酵法生产大豆蛋白活性肽，得到了发酵的最适p h 为6 8 7 0 ，最适温度为3 6 ，并对7 种絮凝剂的絮凝效果和过滤效果进行了比较， 其中壳聚糖的絮凝效果较好，并得出壳聚糖优化后的最佳工艺条件是：p h 4 0 ，絮凝 剂添加浓度1 5 0 m g l ，温度3 5 ( 梁金钟等，2 0 0 8 ) 。 吴斌秀对用嗜酸乳杆菌发酵大豆蛋白粉的最佳配方、生产工艺进行研究，结果 表明：以1 0 大豆蛋白粉，添加5 葡萄糖和0 0 4 酵母抽提物，接种量为7 ，在发 酵温度为3 9 。c 下发酵4 8 h 5 6 h ，总酸度可达到1 0 m g g 以上，活菌数可达到4 3 1 0 9 c f u m l ，乳酸含量可以达到于0 5 5 9 1 0 0 9 ( 吴斌秀，2 0 0 8 ) 。 2 3 大豆蛋白在面包中的应用 一般而言，大豆蛋白对面包的烘焙品质有一定的副作用，普通的大豆蛋白加入 面制品中，因其弱化了面筋网络结构，会恶化面团的流变学特性与焙烤品质，但经 改性的大豆蛋白粉，因其结构和功能发生了变化，在面包中的应用效果较好。 国外许多学者都论述了如何在面包中强化蛋白质。w o r k i n g 早在1 9 2 8 年就已经 发现，添加磷脂能够制作用牛奶和全麦粉改进营养价值的面包( w o r k i n g ，1 9 2 8 ) 。 f l e m i n g 论述了添加几种不同的植物蛋白对面包焙烤性能的影响( f l e m i n g ， 1 9 7 7 ) 。 r y a n 等通过测定二硫键和电泳的方法探讨了大豆蛋白与小麦蛋白的相互作用( r y a n , 2 0 0 2 ) 。国内最近也有在馒头、面包中添加大豆蛋白、花生蛋白的研究，但相关报道 很少，特别是在大豆蛋白对面包的抗老化及如何消除大豆蛋白对面包的不利影响方 面几乎没有报道。 嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的特性及其对面包品质的影响 在面包中添加大豆蛋白7 5 以下时，面包感官变化不大，大于7 5 时对面包 影响较大；大豆制品的添加可以增大面包的吸水率，同时延缓面包的老化；硬脂酰 乳酸钙( c s l ) 、硬脂酰乳酸钠( s s l ) 、分子蒸馏单甘脂( d m g ) 的添加可以消除 大豆制品对面包的不良作用，添加量为0 5 。大豆制品中的蛋白质作为一种来源丰 富的优质植物蛋白，添加到面包中可以起到强化蛋白质的作用，而且大豆制品中的 全脂豆粉含有脂肪氧合酶，也能改善面包的品质。复配适当的改良剂，同时改进大 豆面包制作工艺，大豆蛋白有望成为面粉强化蛋白质的首选( 刘彬等，2 0 0 5 ) 。 余兵等经研究认为添加大豆蛋白可以增强面包的保水性，并增加了蛋白质和氨 基酸的含量，提高了面包的营养品质；普通大豆蛋白的添加对面包的品质有不良影 响，具体表现在比容下降、口感发粘、芯色加深等。改性后的面包专用大豆蛋白粉 ( m s p f ) ，在8 的添加范围内，对面包品质几乎没有影响。对面包而言，并非大豆 蛋白的蛋白质含量越高越好。本研究中的两种高蛋白含量产品即大豆浓缩蛋白 ( s p c ) 和s p i ，其使用效果明显不如大豆蛋白粉( s p f ) ，更不如m s p f ，具体表现 在比容降低、口感发粘、风味变差等( 余兵等，2 0 0 3 ) 。 董海洲等人的研究表明，添加适量的全脂大豆粉( 4 ) ，对改善面包的营养品 质和感官品质均有明显作用，可使被处理面包产品中的蛋白质、脂肪、必需氨基酸 和矿物质元素含量增高，面包体积增大，质地松软，产热量( 碳水化合物) 下降， 风味良好，营养增补效果明显；但若全脂大豆粉的添加量过大( 8 1 2 ) ，则会 影响面包的焙烤和感官品质，使面包的体积缩小，表皮增厚，色泽加深，质地变硬， 在生产中应予以注意( 董海洲和郭承东，1 9 9 8 ) 。 添加大豆蛋白粉后，面包中的蛋白质含量及钙、磷、钾的含量均增加，而脂肪 和碳水化合物的含量降低，使面包的营养结构更趋合理。添加脱脂豆粉可显著改善 面包蛋白质的品质，提高面包的营养价值( 李里特和刘志胜，1 9 9 9 ) 。脱脂大豆粉可 减少面包水分的散失，降低淀粉分子由非晶体结构向晶体结构转化的程度，改善面 包贮藏的稳定性。与a 。淀粉酶相似，其用量不能过大，否则有豆腥味，影响面包品 质。脱脂大豆粉对抑制面包老化的效果较好，当添加量达到面粉用量的1 时，面包 的品质趋于平缓，因此，添加量可取1 ( 杜荣茂，2 0 0 5 ) 。 刘长海等将大豆粉添加到面包中，从感官评定结果看，当大豆粉添加量为3 5 时面包的表皮色泽、形状、口感均优，当添加量超过5 时，面包表皮色泽逐渐 加深，表皮变硬，失去光泽，较粗糙；从切面可以观察到，气孔大，不均匀，大孔 9 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 洞和坚实部分较多；添加量到8 时，面包开始出现豆腥味。实验表明，在普通条件 下添加大豆粉的最适范围是3 5 ( 刘长海，2 0 0 3 ) 。 潘秋琴研究了大豆蛋白对面包品质的影响，试验结果表明，添加5 的脱脂大豆 蛋白粉，不仅提高了面包的营养价值，而且提高了面包的吸水率，对面包的老化有 一定的防护作用，同时可提高面包的货架期( 潘秋琴，2 0 0 5 ) 。 3 本论文研究的主要内容 1 9 9 7 年我国推出了“大豆行动计划”，提倡开发新型大豆食品，以期改善膳食结 构，提高营养水平。大豆含蛋白质4 0 左右，其氨基酸组成除蛋氨酸含量较少外， 人体所需的8 种氨基酸齐备，与小麦搭配，能起到营养互补的作用，提高营养价值 ( 蒋建平等，2 0 0 0 ) 。一般而言，大豆蛋白对面包的烘焙品质有一定的副作用，普通 的大豆蛋白加入面制品中，因其弱化了面筋网络结构，会恶化面团的流变学特性与 焙烤品质，但经改性的大豆蛋白，因其结构和功能发生了变化，在面包中的应用效 果较好。 综上所述，本课题以大豆分离蛋白为原料，以面包为研究对象，用嗜酸乳杆菌 发酵大豆分离蛋白，并将大豆分离蛋白应用于面包制作工艺中。 主要开展了以下三方面的研究： ( 1 ) 嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的工艺研究 用嗜酸乳杆菌来发酵大豆分离蛋白，对其生产工艺进行研究，以总酸度值作为 判断终点，确定一个最佳的发酵培养基配方和工艺条件，以改善大豆分离蛋白的功 能特性，为扩大大豆分离蛋白的研究方向提供了思路。 ( 2 ) 改性大豆分离蛋白的理化性质结构表征 通过对理化指标和结构表征的初步测定，考察发酵对大豆分离蛋白结构及功能 性质的影响。 ( 3 ) 大豆分离蛋白在面包中的应用 通过对面包感官品质的鉴定和理化指标的考察，比较了普通大豆分离蛋白和改 性后的大豆分离蛋白对面包品质的影响；并将改性的大豆分离蛋白以不同的添加量 加入面粉中，观察其对面团流变学特性的影响。 1 0 嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的特性及其对面包品质的影响 第二章嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的工艺研究 大豆分离蛋白因具有较高的营养价值和独特的功能特性，已经被广泛应用于食 品工业。发酵法是通过微生物的生化代谢反应将大豆球蛋白转化为小分子大豆蛋白 活性肽，通过控制微生物的代谢和发酵条件可生产不同氨基酸排序和分子量不同的 肽( 程丽和梁金钟，2 0 0 4 ) 。在发酵过程中，产生的游离氨基酸被微生物再次吸收利 用，对微生物的代谢不会产生反馈抑制。而且通过微生物的代谢作用，对氨基酸和 小肽进行移接、重排和分泌，对某些肽的苦味基团进行修饰和重组，可去除大豆肽 苦味，并赋予大豆肽一些生物活性功能，克服了酶解法生产大豆多肽的缺点( 梁金 钟等，2 0 0 8 ) 。 国内外已有一些学者进行过相关研究。赵毅等通过研究添加大豆蛋白水解物对 保加利亚乳杆菌培养过程中体系的酸度、粘度、细菌生长量的影响，验证了大豆蛋 白水解产物对保加利亚乳杆菌增殖的促进作用( 赵毅等，2 0 0 0 ) ；杜林等研究了嗜酸 乳杆菌在豆乳中的生长情况，实验表明嗜酸乳杆菌能够在豆乳中良好生长( 杜林和 马敬婷，2 0 0 5 ) ；周中凯采用乳酸菌发酵法提取大豆蛋白，大豆蛋白质的提取率为 8 7 4 6 ，并将发酵产物应用到冰淇淋和蛋糕中( 周中凯，1 9 9 7 ) ：吴斌秀对用嗜酸乳 杆菌发酵大豆蛋白粉的最佳配方、生产工艺进行研究，结果表明：发酵液中总酸度 可达到1 0m g g 以上，活菌数可达到4 3 x 1 0 9 c f u m l ，乳酸含量可以达到0 5 5 e d l o og ( 吴斌秀，2 0 0 8 ) 。 因此，本实验选择用嗜酸乳杆菌来发酵大豆分离蛋白，对其生产工艺进行研究， 以总酸度值作为判断终点，确定一个最佳的发酵培养基配方和工艺条件，以改善大 豆分离蛋白的功能特性，为扩大大豆分离蛋白的研究方向提供了思路。 1 材料与方法 1 1 材料 嗜酸乳杆菌 大豆分离蛋白 大豆油食品级 酵母浸膏 本实验室保藏 山东临邑禹王植物蛋白有限公司 嘉里粮油( 深圳) 有限公司 宜兴市江山生物制剂有限公司 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 牛肉膏 蛋白胨 1 2 设备 北京鸿润宝顺生物制品有限公司 山东淄博启迪生物制品公司 双人单面净化工作台 s w - c j 2 d 苏州净化设备有限公司 真空干燥箱d z f 6 0 5 0上海精宏实验设备有限公司 集热式恒温加热磁力搅拌器d f 1 0 1s 郑州长城科工贸有限公司 立式压力蒸汽灭菌器筒0 1 j 2 0 0 3 - 0 4上海东亚压力容器制造有限公司 电热恒温培养箱d h 4 0 0 0 0 b天津市泰斯特仪器有限公司 酸度计410a+thermo e l e c t r o nc o r p o r a t i o n 冷冻干燥机 a l p h a1 - 4 l dc h r i s t 1 3 试剂 盐酸 氢氧化钠 邻苯二甲酸氢钾 无水乙醚 无水碳酸钠 浓硫酸 硫酸铜 硫酸钾 硫酸铵 硼酸 甲基橙 甲基红 溴甲酚绿 酚酞 1 2 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 天津市北方天医化学试剂厂 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 r r r r r r r r r r s s s s a a a a a a a a a a b b b b 嗜酸乳杆菌发酵大豆分离蛋白的特性及其对面包品质的影响 1 4 实验方法 1 4 1 发酵工艺流程 原料一称量、配料一培养基灭菌一接$ 中- - - , 3 7 。c 静置培养4 8 h 一灭菌 按培养基配方准确称量大豆分离蛋白、葡萄糖、酵母浸膏和蒸馏水于2 5 0 m l 三 角瓶内，塞紧瓶塞，于1 2 1 灭菌3 0 r a i n ，冷却后，在无菌操作台接种，于3 7 。c 静 置培养4 8 h 左右，取出于1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 1 4 2 培养基配方 发酵培养基配方：大豆分离蛋白5 、葡萄糖5 、酵母浸膏0 5 、蒸馏水8 9 5 。 菌种活化培养基配方：酵母浸膏l g 、牛肉膏2 9 、蛋白胨2 9 、葡萄糖2 昏蒸馏 水2 0 0 m l 。用盐酸和氯化钠调整p h 6 5 。 1 4 3 单因素试验和正交试验 1 4 3 1 单因素试验 由于乳酸菌可以利用大豆蛋白进行增殖( 赵毅等，2 0 0 0 ) ，因此，本实验以总 酸度为考察指标，对大豆分离蛋白、葡萄糖、酵母浸膏的添加量以及发酵温度、发 酵时间5 个因素分别进行单因素实验，接种量为1 。基本发酵工艺参数为：大豆分 离蛋白粉5 、葡萄糖5 、酵母浸膏0 5 ，发酵温度3 7 。c ，发酵时间为4 8 h 。在其 他条件不变的情况下，选取大豆分离蛋白1 、3 、5 、7 、9 ，葡萄糖1 、3 、 5 、7 、9 ，酵母浸膏0 0 3 、0 0 4 、0 0 5 、0 0 6 、0 0 7 ，发酵温度3 5 、 3 7 、3 9 、4 1 ，发酵时间4 8 h 、5 2 h 、5 6 h 、6 0 h 、6 4 h 。 1 4 3 2 正交试验 根据单因素试验的结果，设计4 因素3 水平的正交试验l 9 ( 3 4 ) ，因素水平见表 2 1 。 华中农业大学2 0 0 9 届硕上学位论文 1 4 4 总酸的测定 滴定法：g b t1 2 4 5 6 2 0 0 8