（食品科学专业论文）乙烯对番茄果实风味、香气成分生物合成的调控作用研究.pdf

摘要 本文以乙烯台成受阻的转反义a c s | l | 茄和野生型番茄果实为试材，研究乙烯与番茄风味合 成的关系。通过s p m e g c 分析方法研究了两种番茄果实的风味差异；并深入探讨了乙烯对番茄 果实香气成分合成的调控机制。研究结果为如何改善番茄的风味品质奠定了理论基础，为确保在 通过抑制乙烯合成延长货架寿命的同时又不影响风味的合成提供理论指导。 比较分析转反义a c s 番茄和野生型番茄果实在成熟过程中糖酸的含量变化，得出：抑制乙 烯生物合成并未影响呈甜味的糖组分含量；乙烯调控番茄果实成熟过程中呈酸味物质的苹果酸和 柠檬酸的含量。 通过条件优化试验，建立了s p m e g c 分析番茄香气成分的最佳方法：采用c w d v b 型号的 s p m e 萃取头，萃取香气成分的时间为2 5m i n ，萃取温度为4 0 样品量为6 克。 采用顶空s p m e g c 方法分析转反义a c s 番茄和野生型番茄果实在果实成熟过程中主要香 气成分的含量变化，以及乙烯处理后香气成分含量水平的变化，发现乙烯对不同来源的香气成分 合成具有不同的影响。( 1 ) 脂肪酸米源的香气成分：随着番茄果实的成熟，香气成分不断生成， 抑制乙烯台成可以不同程度的减少脂肪酸来源的己醛、己醇和3 顺一己烯醇的合成，但是乙烯不 影响以亚麻酸为合成前体的3 1 顿一己烯醛和2 反一己烯醛的生物合成量；( 2 ) 色素来源的香气成分： 抑制乙烯合成可以不同程度的减少6 一甲基一5 一庚烯一2 一酮、6 一甲基一5 一庚烯2 一醇、牦牛 儿基乙酮的合成，却可以增加b 一紫罗酮的合成：( 3 ) 其它来源的香气成分：抑制乙烯合成可以 不同程度的减少氨基酸来源的苯乙醛和2 一苯基乙醇合成，但是分析认为除了乙烯外，还有其它 的调控机制存在。对沉香醇、丁子香酚和甲基水杨酸分析表明，它们在果实成熟过程中的合成受 到乙烯以外的其它调控机制影响。 进一步研究乙烯对脂肪酸米源的香气成分合成调控机制，发现乙烯对它们的调控机制较为复 杂。即有对合成前体物质脂肪酸的合成调节，又在不同程度上调控香气合成途径上的酶活性，同 时还认为除了乙烯外，还有其它因素影响着香气物质的合成。 研究乙烯与色素来源香气成分之间的关系发现，乙烯调控番茄红素的生物合成，而番茄红素 就是6 一甲基5 一庚烯一2 一酮和6 甲基一5 一庚烯一2 一醇的直接合成前体物质，不是牦牛儿 基乙酮的直接前体物质。 分析两种番茄果实中的氨基酸含量，确定除了羟脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸和酪氨酸外，其它 的氨基酸合成都受乙烯的调控，而果实中氨基酸的合成量是影响氨基酸来源的香气成分生物合成 的重要影响因素之一。 关键词：番茄，乙烯，风味，香气，s p m e g c a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , w i l dt y p et o m a t o ( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u ml ，e v l i c h u n ) a n di t st r a n s g a n i c a n t i s e n s el e a c s 2l i n ew i t hs u p p r e s s e de t h y l e n eb i o s y n t h e s i sw e r eu s e dt oe l u c i d a t et h e r o l eo f e t h y l e n ei nt h ep r o d u c t i o no ff l a v o rc o m p o u n d si nt o m a t of r u i t t h ed i f f e r e n c e so ff l a v o rc o m p o u n d s c o n t e n t sb e t w e e nw i l dt y p et o m a t oa n dt r a n s g e n i ct o m a t of r u i tw e r es t u d i e du s i n gs o l i d p h a s e m i c r o e x t r a c t i o n ( s p m e ) m e t h o dc o m b i n e dw i t hg a sc h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i s m e c h a n i s m so fe t h y l e n e p r o d u c t i o ni n v o l v e di nr e g u l a t i o no ff r u i ta r o m ap r o d u c t i o nw e r ef u r t h e rs t u d i e d r e s u l t sf r o mo u r s t u d i e sw i l lp r o v i d et h e o r e t i c a li n f o r m a t i o no nh o wt oi m p r o v et h ef l a v o rq u a l i t yo ft o m a t of r u i t ，a n d p r o v i d ep r a c t i c a li n f o r m a t i o no nh o wt op r o l o n gt h es h e l fl i f eo ft o m a t of r u i tw i t h o u ti m p a c to nt h e f l a v o rq u a l i t y c h a n g e si ns u g a r sa n da c i d sc o n t e n t so fb o t ht r a n s g e n i ca n dw i l dt y p et o m a t of r u i t sd u r i n gf r u i t r i p e n i n g w e r e i n v e s t i g a t e d i ts u g g e s t s t h a t c h a n g e s o fi n d i v i d u a l s u g a r s c o n t e n t s i s e t h y l e n e i n d e p e n d e n ta n dt h em e t a b o l i s mo f c i t r i ca c i da n dm a l i ca c i da r eu n d e re t h y l e n er e g u l a t i o n t h eo p t i m i z e ds p m em e t h o dw a se s t a b l i s h e dt oa n a l y z et h ea r o m av o l a t i l e si nt o m a t of r u i t t h e o p t i m u m r e s u l t sw e r eh e a d s p a c ee x t r a c t i o nw i t hc w d v bs p m ef i b e ra t4 0 f o r2 5m i nf r o m6g r a m s a m p l e s h e a d s p a c ea n a l y s i so fv o l a t i l e ss h o w e dt h ec h a n g e si nv o l a t i l e sc o n t e n t sd u r i n gf r u i t 邱e n i n go f b o t ht o m a t of r u i t st r e a t e dw i t ho rw i t h o u te x t e m a le t h y l e n e i td e m o n s t r a t e st h a tt h e r ea l ev a r i o u s r e g u l a t i o np a t t e r no fe t h y l e n eo nv o l a t i l ep r o f i l e si nt o m a t of r u i t ，( 1 ) l i p i d - d e r i v e dv o l a t i l ec o m p o u n d s ： t h ea b i l i t yt os y n t h e s i z ev o l a t i l e sw a sf o u n dt oi n c r e a s ed u r i n gf r u i tr i p e n i n gi nw i l dt y p ef r u i t t h e p r o d u c t i o no fh e x a n a l ，h e x a n o l a n dc s 3 一h e x e n o lw a si n h i b i t i e d b ys u p p r e s s i o n o fe t h y l e n e b i o s y n t h e s i s w h e r e a s n or e m a r k a b l ed i f f e r e n c e sw e r eo b s e r v e di nt h ec o n c e n t r a t i o n so fc i s 一3 - h e x a n a l a n d t r a n s 2 h e x a n a l ( 2 ) c a r o t e n o i d r e l a t e dv o l a t i l e c o m p o u n d s ：t h ep r o d u c t i o n o f 6 - m e t h y l 一5 - h e p t e n - 2 一o n e ，6 - m e t h y l 一5 一h e p t e n 一2 - o la n dg e r a n y l a c e t o n ew a sd e c r e a s e db ys u p p r e s s i o no f e t h y l e n eb i o s y n t h e s i si nt o m a t of r u i t ，w h i l et h ep r o d u c t i o no fb - i o n o n ew a si n c r e a s e d ( 3 ) o t h e rv o l a t i l e c o m p o u n d s ：t h ec o n t e n t so f2 - p h e n y l e t h a n o l a n dp h e n y l a c e t a l d e h y d ew h i c hw e r ed e r i v e df r o m p h e n y l a c e t a l d e h y d ew e r ea f f e c t e db ye t h y l e n ea n do t h e rr e g u l a t o r yf a c t o r s l i n a l o o l ，e u g e n o la n d m e t h y ls a l i c y l a t ec o m p o u n d sw e r eu n a f f e c t e db ye t h y l e n e t h er e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fe t h y l e n eo nt h ep r o d u c t i o no fl i p i d - d e r i v e dv o l a t i l e si sc o m p l i c a t e d ， e t h y l e n er e g u l a t e sf a t t ya c i d ss y n t h e s i si n t o m a t of r u i t ，a n da f f e c t ss o m ee n z y m ea c t i v i t i e si nt h e v o l a t i l eb i o s y n t h e s i sp a t h w a y f u r t h e r m o r e ，t h e r em a yh a v eo t h e ru n k n o w nr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo n t h ep r o d u c t i o no f l i p i d d e r i v e dv o l a t i l e s s t u d i e so nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ne t h y l e n e ，c a r o t e n o i d sa n dc a r t e n o i d - m l a t e dv o l a t i l es h o w e d t h a t l y c o p e n er e g u l a t e d b ye t h y l e n e i st h e p r e c u r s o r o f 6 - m e t h y l - 5 - h e p t e n - 2 一o n e ， 6 - m e t h y l 一5 - h e p t e n - 2 一o l ，b u tn o tt h ep r e c u r s o ro f g e r a n y l a c e t o n e i i a m i l l oa c i d s ，w i t ht h ee x c e p t i o no f h y d r o x y p r o l i n e ，t h r e o n i n e ，a l a n i n ea n dt y r o s i n e ，a r ea f f e c t e db y e t h y l e n ei i lt o m a t of r u i t a m i n oa c i dc o n t e n t sa r eo n eo f k e yf a c t o r st h a ti m p a c tt h ep r o d u c t i o no f a m i n o a c i d - r e l a t e da r o m av o l a t i l e si nt o m a t of r u i t k e yw o r d s ：t o m a t o ，e t h y l e n e ，f l a v or ，a r o m av o l a t i l e ，s p m e g c i i 插图和附表清单 图 1 图1 1 乙烯的生物合成及调控2 2 图1 2 番茄中乙烯感受与信号转导4 3 图1 3 脂类降解产生的番茄果实c 6 香气成分生物合成途径9 4 图1 4 类胡萝h 素降解产生的番茄果实香气成分生物合成途径1 0 5 图1 5 以氨基酸为前体生成香气成分的一般途径1 1 6 图2 - l 野生型( w t ) 与转基因( a c s ) 番茄果实在成熟过程中的乙烯释放量1 9 7 图2 - 2 野生型( w t ) 与转基因( a c s ) 番茄果实在成熟过程中的呼吸强度1 9 8 图2 - 3 野生型( w t ) 与转基因( a c s ) 番茄果实在成熟过程中果实硬度的变化2 0 9 图2 - 4 野生型( w t ) 与转基因( a c s ) 番茄果实在成熟过程中可溶性固形物的变化2 1 1 0 图2 5 野生型( w t ) 与转基因( a c s ) 番茄果实在成熟过程中可滴定酸的变化2 2 1 1 图3 - 1s p m e 装置图2 6 1 2 图3 - 2 番茄的香气成分的总离子色谱图2 8 1 3 图3 - 3p a 萃取头吸附番茄香气成分的气相色谱图2 9 1 4 图3 4c w d v b 萃取头吸附番茄香气成分的气相色谱图3 0 1 5 图3 5 萃取时间对香气成分萃取效果的影响3 0 1 6 图3 6 样品量对香气成分萃取效果的影响3 1 1 7 图3 7 萃取温度对香气成分萃取效果的影响3 2 1 8 图4 - 1 番茄果实芳香成分标准样品气相色谱图3 9 1 9 图4 - 2 乙烯处理后野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实中脂肪酸来源的香气成分含 量。“4 4 2 0 圈4 - 3 乙烯处理后野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实中类削萝b 素来源的香气成分 含量4 5 2 1 图4 4 乙烯处理后野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实中其它米源的香气成分含 量4 6 2 2 图5 - 1 脂肪酸标准样品图谱5 7 2 3 图5 2 野生型( w t ) 和转反义a cs ( a cs ) 番茄果实中油酸和亚麻酸含 量5 8 2 4 图5 3 野生型( w t ) 雨i 转反义a c s ( a cs ) 番茄果实中死油酸与亚麻酸含量比 例”5 9 2 5 图5 _ 4 外源乙烯处理的野生型( 、v t ) 和转反义a c s ( a c s ) ：番茄果实中亚油酸与亚麻酸含量比 例5 9 2 6 图5 - 5 野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实成熟过程中l o x 活性变化6 0 2 7 图5 - 6 外源乙烯处理的野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 前茄果实中l o x 活性变 化一6 0 2 8 图5 7 野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实成熟过程中h p l 活性变化6 1 2 9 图5 8 外源乙烯处理的野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实中h p l 活性变 化6 2 3 0 图5 - 9 野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实成熟过程中a d h 活性变化6 2 3 1 图5 - 10 外源乙烯处理的野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实中a d h 活性变 化- 一6 3 3 2 图5 - 1 1l o x c , h p l , a d h 2 基因片段的p c r 结果6 4 3 3 图5 1 2l o x c 基因片段测序结果同源性比较6 4 3 4 图5 - 1 3 珈，基因片段测序结果厨源性比较6 5 3 5 图5 1 4a d h 2 基因片段测序结果同源性比较6 6 3 6 图5 1 5l o x c , 印ta d h 2 基因的r t - p c r 分析6 7 3 7 图5 1 6 油酸在转反义a c s ( a c s ) 和普通丽春番茄( w t ) 浆中的生物转化6 9 3 8 图5 1 7 亚麻酸在转反义a c s ( a c s ) f l 普通丽春番茄( w t ) 浆中的生物转化6 9 3 9 图5 1 8 己醛在转反义a c s ( a c s ) 和普通丽春番茄( w t ) 浆中的生物转化7 0 4 0 图5 1 93 顺一己烯醛在转反义a c s ( a c s ) 和普通丽春番茄( w t ) 浆中的生物转化7 1 4 1 图5 2 0 己醛在转反义a c s ( a c s ) 1 1 普通丽春番茄( w t ) 果实圆片中生物转化为己醇7 2 4 2 图5 2 13 顺一己烯醛在转反义a c s ( a c s ) 和普通丽春番茄( w t ) 果实圆片中生物转化) j 3j l n - - 己烯醇7 2 4 3 图6 - 1 转反义a c s 番茄( a c s ) 和普通丽春番茄( w t ) 成熟过程中番茄红索含量的变化7 6 4 4 图6 - 2 番茄红素在转反义a c s ( a c s ) n 普通丽春番茄( w t ) 浆中生物转化为6 一甲基一5 一 庚烯一2 酮7 7 4 5 图6 3 番茄红素在转反义a c s ( a c s ) 和酱通丽春番茄( w t ) 果实圆片中的生物转化7 8 表 4 6 表1 1 番茄主要的香气成分来源6 4 7 表1 - 2 浓度1 n m 的番茄香气成分及其香气阈值和香气值( 在水中) 7 4 8 表2 - 1 野生型( 、v t ) 与转基因( a c s ) 番茄果实在成熟过程中糖组分含量变化2 1 4 9 表2 - 2 野生型( w t ) 与转基i 司( a c s ) 番茄果实在成熟过程中柠檬酸、苹果酸和琥珀酸含量变 化2 3 5 0 表2 3 野生型( w t ) 与转基因( a c s ) 番茄果实在成熟过程中草酸和富马酸含量变 化2 3 5 1 表3 - 1 番茄香气成分一览表2 8 5 2 表3 - 2s p m e 萃取番茄中芳香成分的正交试验直观分析表3 2 5 3 表3 3 标样的回收率3 3 5 4 表4 - 1 标样的线性范围4 0 5 5 表4 - 2 野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实成熟过程中脂肪酸来源的香气成分( 醛类) 含量一4 1 5 6 表4 3 野生型( w 1 ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实成熟过程中脂肪酸来源的香气成分( 醇类) 含量4 1 5 7 表4 4 野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 岙茄果实成熟过程中类胡萝h 素来源的香气成分( 开 链) 含量4 2 5 8 表4 - 5 野生型m 丌) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实成熟过程中类胡萝h 素来源的香气成分( 环 状) 含量4 2 5 9 表4 - 6 野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实成熟过程中其它来源的香气成分含 量4 3 6 0 表7 1 野生型( w t ) 和转反义a c s ( a c s ) 番茄果实成熟过程中氨基酸的含 量一8 2 a c c a c 0 a c s a d h a m p b s a c 叫d v b c d n a c 1 a b d e p c e b e d t a g c g u s h p l h p l c i p t g l o x m e s m o p s m s o d p a p c r r t - p c r s a m s d s s p m e i r i s x g a l 缩略词表 a b b r e v i a t i o 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e 1 - c a r b o x y l i ca c i d a c co x i d a s e a c cs y n t h a s e a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e a m p i c i l l i n b o v i n es e r u ma l b u m i n c a r b o w a x d i v i n y l b e n z e n e c o m p l e m e n t a r yd n a c e t y l t r i m e t h y la n u n o n i u mb r o m i d e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e e 曲j d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i m n i n et e t r a c e t i ca c i d g a sc h r o m a t o g r a p h y 1 3 - g l u e u r o n i d a s e h y d r o p e r o x i d el y a s e h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h t i s o p r o p y l - b d t h i o g a l a c t o s i d e l i p o x y g e n a s e 2 - f n - m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i ca c i d 3 一 n - m o r p h o l i n o - p r o p a n e s u l f a n i ca c i d m a s s o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a t e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e v e r s e t r a n s e r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n h y d r o x y m e t h y l a m i n om e t h a n e 5 - b r o m 0 4 - c h l o r o 一3 一i n d o l y lb - d g a l a c t o s i d e 1 氨基1 羧基环丙烷 a c c 氧化酶 a c c 合酶 乙醇脱氢酶 氨苄青霉素 牛血清白蛋白 聚乙二醇- - 乙烯苯 互补d n a 溴代十六烷基三甲胺 焦碳酸二乙酯 溴化乙锭 乙二氨四乙酸 气相色谱 1 3 一葡萄糖苷酸酶 氢过氧化物裂解酶 高效液相色谱 异丙基硫代一1 3 d - i a _ l 糖苷 脂氧合酶 2 ( n - 吗啡啉) 乙磺酸 吗啉代丙烷磺酸 质谱 光密度 聚丙烯酸酯 聚合酶链式反应 反转录聚合酶链式反应 s ，腺苷蛋氨酸 十二烷基磺酸钠 吲相微萃取 三羟甲基氨基甲烷 5 ，溴_ 4 氯3 _ 口引哚b - d 一半乳糖 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：岛，鸟 时间： 加口6 年石月刃日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：芝易彳，岩 时间：) 胛6 年舌月如日 导师签名 一 2 k 艮 时间：芦d g 年6 月如日 尹 中国农业大学博士论文 第一章文献综述 第一章文献综述 植物果实的成熟是一个复杂的发育调控过程，其中果色、果质、风味、香味和营养成分等都 随着成熟过程而变化，这些变化是基因有序表达并与环境相互作用的结果。根据果实成熟过程 中有无呼吸跃变峰的出现，果实被分成呼吸跃变型和非跃变型两大类。前者在果实成熟过程中 会出现一个呼吸高峰，同时伴随着乙烯含量的急剧增加：后者在果实成熟过程中无呼吸高峰出现， 乙烯含量一直保持在很低的水平上。乙烯作为重要的植物激素，在跃变型果实成熟衰老过程中发 挥着重要的作用，被认为是果实成熟衰老的启动因子，它调控着番茄、蜜瓜、香蕉等呼吸跃变型 果实的正常成熟，当乙烯生物合成受到抑制，这类果实的成熟过程便会减慢甚至无法正常成熟 【2 ，3 ，4 t ”。大量的试验结果一致表明，乙烯影响许多成熟基因的转录和翻泽，几乎能促进各种跃变型 果实的成熟和衰老” 。 1 1 乙烯生物合成和信号传导研究进展 乙烯是通过调节基因表达来调控植物成熟的植物激素。随着过去十年的分子生物学的发展 在探讨乙烯生物合成和乙烯信号传导途径方面取得了相当可观的进展9 。 1 1 1 乙烯生物合成 高等植物中的乙烯生物合成途径已经十分清楚1 。在植物体内，乙烯生物合成途径如图卜1 所示，乙烯最基本的前体物质蛋氨酸( 又叫甲硫氢酸) ，在腺苷蛋氨酸合成酶的作用下，蛋氨酸 转化成s 一腺苷蛋氨酸( s a m ) ，s a m 在a c c 合成酶的催化下，转化成1 一氨基一1 一羧基环 丙烷( a c c ) 和甲硫基腺苷( m t a ) ，a c c 在a c c 氧化酶的作用下，最终转化成乙烯。而m t a 通过另一循环合成新的蛋氨酸，以维持乙烯合成对底物蛋氨酸的需求”，”1 。 1 1 1 1s a m 合成酶 s a m 合成酶是生物代谢过程中一种十分重要的化合物，动物和微生物中有关s - d v l 基因调 控的研究开展较早，对植物中该酶及其基因的研究相对较晚，但进展很快，已经从大麦、番茄、 划草等十多种植物中克隆出了s a m 合成酶基因。s a m 合成酶基因属于管家基因，研究表明其 m r n a 水平与乙烯生物合成水平没有明显关系，原因在于s a m 只有部分用于合成a c c 来产 生乙烯它主要是用于其他生物反应，如作为甲基供体参加甲基化反应，用于多胺生物合成等 1 1 1 , 1 4 ，因此s a m 酶在乙烯生物合成中不属于关键酶。 中国农业大学博士论文 第一章文献综述 1 1 1 2a c c 合成酶 a c c 是乙烯台成的直接前体，a c c 台成酶( a c s ) 是乙烯生物合成途径的关键酶，在调 节乙烯生成中起关键作用。它在植物组织中的分布非常j 。泛，但是含量极低，最早是在成熟的番 茄果实中发现的【l 。a c s 的活性在不同植物类型、同一植物的不同组织中存在很大的差异，几 乎所有的植物中都存在多种a c s 同工酶。a c c 合成酶基因是一个基因家族，每个基因具有不同 的表达模式【13 ”1 “” 。目前在番茄中至少发现了9 个a c c 合成酶基因( l e a c s l a ，l e a c s l b , l e a c s 2 7 ) 15 , 1 8 , 1 9 其中6 个基因受生长素的调控。其它植物中a c c 合成酶基因克隆也有报道， 如苹果、柠檬、黄瓜和柑橘等 2 0 , 2 1 , 2 2 】。由于番茄果实是研究乙烯生物合成和信号传导的模式材料， 所以针对番茄中a c s 基因的研究显得尤为重要。 图1 1 乙烯的生物合成及调控 f i g1 - 1b i o s y t h e s i sp a t h w a ya n dr e g u l a t i o no f e t h y l e n e 【2 3 植物中a c c 合成酶受到不同发育阶段、外界环境和激素信号所调控。l e a c s i b 、l e a c s 5 在 番茄果实组织中不表达1 ：l e a c s 2 和l e a c s 4 在番茄果实成熟过程中特异性表达【1 6 , 2 5 , 2 6 , 2 7 , 2 8 ： 2 中国农业大学博士论文第一章文献综述 l e a c s l a 和l e a c s 6 在番茄果实成熟之前就开始表达”“。通过分析乙烯信号传导阻断的番茄突 变体中a c s 基因家族的表达模式，我们可以确定受乙烯调控的a c s 基因。 | | ! 茄突变体为研究乙 烯的作用机理提供了非常便利的条件。，突变体由于在乙烯受体结合区域发生了突变，导致编 码蛋白不能结合乙烯 2 9 , 3 0 1 。成熟抑制突变体( t i n ) 番茄果实是因为r i n 转录因子发生了突变，果实 不能完成乙烯生物合成的自我催化过程，不能将乙烯信号传递给下游的成熟基因，阻止了番茄果 实成熟相关基因的表达【3 l 】。对i 和砌突变体果实研究表明l e a c s 2 基因表达需要乙烯，而 l e a c s i a 和l e a c s 4 的表达则不受乙烯调控【l q 。b a r r y 等人认为l e a c s l a 和l e a c s 6 在绿熟期 番茄果实中负责系统i 的合成【l6 1 ，系统i 乙烯在果实发育过程中继续发挥作用，直到果实开始转 色、有能力自体成熟为止。在系统i 乙烯和系统i i 乙烯合成的过渡时期，即果实转色期，l e , , 4 c s l a 表达量开始增加，l e a c s 4 被激活口”。此时番茄果实成熟过程中系统i i 的乙烯合成开始启动，并 由l e a c s 2 基因的表达所维持。若反义抑制l e a c s 2 基因，则既能调控上游l e a c s 4 的活性，又 能使得乙烯的合成下降为对照果实的o 1 左右，导致果实的不成熟表型，如番茄红素积累显著减 少、硬度保持时间延长、呼吸速率下降、香气水平下降等j 。 1 1 1 3a c c 氧化酶 a c c 氧化酶( a c o ) 是催化乙烯生物合成的最后一个酶，它以抗坏血酸和氧作为辅基，以 f e 2 + 和c o ：作为辅助因子，将a c c 氧化成乙烯。一般认为a c o 不是乙烯生成的限速酶，其酶 活性只是一个基本要素【1 “。但是研究表明，a c o 活性对乙烯合成也有重要的调控作用i j 。在 跃变型果实出现跃变之前用外源乙烯处理番茄果实，a c o 酶活性优先增加，然后是a c s 的活性 增加，这说明a c o 活性在控制乙烯的生物合成途径中也发挥着重要作用1 3 。分析a c o 基因家 族在番茄不同组织和不同的发育阶段的表达模式，进一步证实了该基因家族对番茄果实成熟过程 中乙烯的生物合成起着重要的调控作用【3 洲m 】。不同种植物a c o 基因的同源性比a c s 高，一 般在蛋白质水平上的同源性都在8 0 以上。第一个被鉴定的a c o 基因是通过反义表达当时功能 不明确的p t o m l 3 基因得到的 3 q 。h a m i l t o n 等人将p t o m l 3c d n a 以反义基因的形式转入番茄， 结果抑制了a c o 的酶活性和植株的乙烯生物合成量【1 q 。在酵母中p t o m l 3 基因的表达实验进一 步说明了a c o 在乙烯合成中的作用，酵母中该基因编码的蛋白质能催化a c c 形成乙烯。 m r n a 表达模式显示，除了p t o m l 3 基因外，番茄中还发现有与受伤、花器发育、叶片和花朵衰 老及果实成熟相关的其他a c o 基因”，2 4 挪3 “。果实的不同发育阶段每个基因的表达量在翻译水 平上受到严格的控制口”。果实刚开始成熟时，首先表达的是l e a c 0 1 基因，l e a c 0 3 的表达量 非常少。大部分果实着色时l e a c 0 1 的表达达到高峰，然后又降落到刚开始的水平，而l e a c 0 3 只是在刚开始成熟时进行瞬间的表达，接着就马上消失。因此，乙烯合成的第一步是a c o 的体 内台成，产生的乙烯诱导了a c c 合成酶基因的表达，然后导致乙烯的大量合成。 1 1 2 乙烯信号转导 乙烯是通过其特定的信号转导途径来调控单子叶和双子叶植物的许多生长发育过程【4 “。人们 中国农业大学博士论文第一章文献综述 对于乙烯信号转导途径的研究，主要得益于利用分子遗传学手段对拟南芥中乙烯三重反应突变体 的研究，它们为乙烯受体因子的鉴定以及许多信号转导途径中的元件分离鉴定提供了有效的工 具。黑暗中生长的拟南芥及其它双子叶植物幼苗，在乙烯存在的条件下会出现三个典型的表型变 化，称作“三重反应”。这些变化包括下胚轴的辐射膨胀，增加顶钩弯曲，抑制下胚轴和根细胞 的延伸【4 1 1 4 “。拟南芥乙烯受体家族包括e t r l 、e r s l 、e t r 2 、e i n 4 和e r s 2 五个家族成员，根 据结构的相似性可以分为两个亚家族，即e t r i 亚家族和e t r 2 亚家族【4 ”。在番茄中也至少克隆 了六个乙烯受体，l e e t r l ，l e e t r 2 t 4 4 一”，n r 3 0 , 4 6 ，l e e r t 4 , l e e t r 5 4 ”，和l e e t r 6 4 ”。 图1 2 番茄中乙烯感受与信号转导 f i g1 2 e t h y l e n ep e r c e p t i o na n ds i g n a lt r a n s d u e f i o ni nt o m a t o h 9 】 乙烯只有通过与乙烯受体蛋白结台才能参与乙烯信号转导途径，研究发现，乙烯受体与细菌 的双组分受体同源1 。细菌中每一个双组分系统是由两种不同的蛋白质组成：感受蛋白和分离的 4 中国农业大学博士论文第章文献综述 反应调节蛋白，两者一起调节作用，允许细菌对不同的环境刺激条件作出反应”“。感受蛋白具有 两个区域：细胞外的传入区和细胞质的组氨酸激酶结构域，当传入区接受外界信号时，组氨酸激 酶结构域内的一个组氨酸残基可发生自身磷酸化作用。反应调节蛋白由一个接受器和一个具有转 录激活作用的输出区组成。接受器区有一个保守的天冬氨酸残基，上述自我磷酸化后的磷酸基团 可通过一个独立的蛋白转给此天冬氨酸残基，而接受器区的磷酸化状态可通过输出区影响下游的 反应。而乙烯与乙烯受体结合则需要铜离子的参与p “。乙烯的存在瞬时增强了体外多肽的磷酸化 作用，通过受体的磷酸化作用乙烯信号传递到下游组件p 。番茄乙烯受体家族各成员之间存在不 同的表达模式：l e e t r l 和l e e t r 2 在番茄各个时期和不同组织中组成型表达，n r 和上扭豫4 在果 实成熟，衰老和脱落组织中表达增强 4 6 , 5 4 。l e e t r 5 在番茄果实，花中表达并且受外界病体物刺激 表达增强【5 ”。在没有乙烯存在的条件一f ，e t r l 蛋白以二聚体的形式存在，受体保持活性状态对 乙烯信号转导起负凋控作用。当乙烯和受体结合以后，磷酸化作用使得二聚体乙烯受体蛋白成为 单体，促进乙烯信号转导途径9 ”。在某些情况下，乙烯受体的表达是乙烯诱导的，增加受体水平 可以降低植物对乙烯的敏感性，这些结果进一步阐明乙烯受体的负调控模型”。下游调控m 基因 对乙烯的信号转导和成熟并没有明显的作用效果，但是却提高了l e e t r 4 基因表达水平，说明 l e e t r 4 并【i n r 基因在表达模式上存在互补作用，即三葩豫4 基因表达增强能弥补转基因所引起的n r 基因表达减少 5 4 1 。相反，以n r 突变体为材料的，转基因植株能正常成熟，说明，乙烯受体 不是番茄果实成熟过程中所必须的，进一步的证实了乙烯信号转导途径中的受体抑制假说9 ”。越 来越多的证据表明，l e e t r 4 能产生超敏感的番茄品种，从而加速番茄的成熟p q 。 近年来，除了乙烯受体基因之外，乙烯信号转导途径中的一些其它元件也得到了逐步深入的 研究。c t r l 在乙烯信号转导途径中位于受体e