（食品科学专业论文）高纯度茄尼醇的制备及应用研究.pdf

摘要 摘要 茄尼醇是一种不饱和的九聚异戊二烯醇，属四倍半萜烯醇。茄尼醇作为重 要的医药中间体主要应用于合成辅酶q i o 、维生素k 2 及治疗心血管疾病及抗肿 瘤、抗溃疡等药物，具有较高的应用价值。但茄尼醇要用于合成辅酶q l o ，其纯 度须高于9 0 。 茄尼醇主要是以烟叶为原料进行制备。我国是烟草生产大国，资源丰富， 以烟草为原料生产纯度9 0 以上的茄尼醇，进而合成辅酶q l o 、维生素k 2 等高 附加值产品，具有较高的经济价值。 本论文主要对烟叶浸膏的提取和皂化、茄尼醇的合成、提取、分离和纯化 进行研究，确定茄尼醇的提取工艺及最佳操作条件和参数，制备高纯度茄尼醇， 并探讨茄尼醇合成辅酶q l o 的适合方法和实验。 采用溶剂提取法和超临界c 0 2 萃取法提取烟叶浸膏。溶剂法最佳工艺条件： 以石油醚为提取溶剂，提取温度6 0 ，提取时间6 h ，液固比值为9 ( m u g ) ，提 取次数为2 次，烟叶浸膏得率1 5 3 2 ，其茄尼醇含量为7 3 l 。超临界c 0 2 萃 取法的最佳萃取工艺条件：萃耿压力2 0 m p a ，萃取温度6 0 ，萃取时间2 h ，c 0 2 流量5 5 k g h ，夹带剂为9 5 乙醇，夹带剂用量按料液比1 ：1 5 ( g m l ) 力h , k ，烟叶 浸膏得率7 6 2 ，其茄尼醇含量为9 3 8 。结果表明溶剂提取法提取茄尼醇得率 一 向。 以烟叶浸膏为原料，采用皂化，溶剂分离，柱层析纯化制备高纯度茄尼醇。 对烟叶浸膏皂化生成茄尼醇，在最佳皂化条件下，皂化产物茄尼醇含量1 6 8 5 ； 对皂化产物进行溶剂分离，用水9 5 乙醇按体积比6 ：l 配比洗脱皂脚，经石油 醚萃取，萃取产物茄尼醇含量为3 6 3 0 。该方法可省去脱蜡操作，节约成本。 石油醚萃取产物经甲醇分离得到黄色的晶体，该分离产物茄尼醇含量达到 7 6 0 8 。该方法使用单一溶剂，操作简单，提取率高，溶剂便于回收利用。分 离产物再经柱层析分离，最终产品茄尼醇含量达到9 4 8 5 ，茄尼醇总收率为 6 8 2 0 。 初步探讨了用茄尼醇合成辅酶q 1 0 的方法，制定了侧链延伸法和侧链引入法 合成辅酶q l o 方案，并对癸异戊二烯醇的合成进行初步试验。 关键词：茄尼醇；辅酶q l o ；提取；分离：合成 a b s t r a c t a b s t r a c t s o l a n e s o l ，ap o l y i s o p r e n o i da l c o h o l ，w h i c hi sa ni m p o r t a n tp h a r m a c e u t i c a l i n t e r m e d i a t em a i n l yb e i n ga p p l i e ds y n t h e s i so fc o e n z y m eq l0a n dv i t a m i nk 2a n dt h e d r u gf o rc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s ea n da n t i t u m o rd r u ga n da n t i - u l c e rd r u ge t c ，h a sh i g h a p p l i c a t i o nv a lu e b u t ，i ti si m p o r t a n ti np r a c t i c a l a p p l i c a t i o no fs y n t h e s i so f c o e n z y m eq 10t h a tt h ec o n t e n to fs o l a n e s o lr e a c h e sa b o v e9 0 c h i n a ，w h i c ht h e r ea r el o t so ft o b a c c op l a n t i n ga r e a ，h a sa l r e a d yb e c o m et h e s e c o n dm a j o rt o b a c c op l a n t i n gc o u n t r y t h em o s ta p p l i c a t i o na n dc o m m e r c i a lv a l u ei s s y n t h e s i so fc o e n z y m eq l ow i ms o l a n e s 0 1 t h i sd i s s e r t a t i o nm a i n l yc o n c e m e dt o b a c c oe x t r a c ta n ds y n t h e s i sa n ds e p a r a t i o n a n dp u r i t yo fs o l a n e s o lt og a i nh i g hp u r i t ys o l a n e s o l ，t od e t e r m i n et h eo p t i m u m e x t r a c t i o np r o c e s sa n do p e r a t i o np a r a m e t e r so fs o l a n e s o la n dd e s i g nt h es c h e m ea n d e x p e r i m e n to fs y n t h e s i so fc o e n z y m eq i o o r g a n i cs o l v e n ta n ds u p e r c r i t i c a lc 0 2w e r ea d o p t e dt o e x t r a c ts o l a n e s o lo f t o b a c c o i na c c o r d i n gt ot h eo r t h o r h o m b i ce x p e r i m e n ta n dv a r i a n c ea n a l y s i s ，t h e o p t i m a lt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w sf o rp r o c e s s i n go r g a n i cs o l v e n t e x t r a c t i o na tal a b o r a t o r ys c a l e ：e x t r a c t i o ns o l v e n tw a sp e t r o l e u me t h e r ，e x t r a c t i o n t e m p e r a t u r ew a s6 0 c ，e x t r a c t i o nt i m ew a s6 h ；l i q u i d - s o l i dr a t i ow a s9 ( m l g ) ，t h e n u m b e ro fe x t r a c t i o ns t a g ew a s2 ，t h ee x t r a c t i o nr a t eo fp ew a s15 3 2 ，t h ec o n t e n t o ft h es o l a n e s o lw a s7 31 i na c c o r d i n gt ot h eo r t h o r h o m b i ce x p e r i m e n ta n d v a r i a n c ea n a l y s i s ，t h eo p t i m a lt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w sf o rp r o c e s s i n g s u p e r c r i t i c a lc 0 2e x t r a c t i o na tal a b o r a t o r ys c a l e ：e x t r a c t i n gp r e s s u r ew a s2 0 o m p a , e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r ew a s6 0 。c ，e x t r a c t i n gt i m ew a s2 h ，c 0 2f l o wr a t e55 k g h ， e n t r a i n e rw a s9 5 e t h a n o l ，t h ea m o u n to fe n t r a i n e rw a s1 ：1 5 ( g m l ) ，a d d i t i o n m e t h o d so fe n t r a i n e rw a sd i r e c ta d d i t i o n ，t h ee x t r a c t i o nr a t eo fs ew a s7 6 2 ，t h e c o n t e n to ft h es o l a n e s o lw a s9 38 t h er e s u l t ss h o w e dt h a t o r g a n i cs o l v e n t e x t r a c t i o nw a se f f e c t s a p o n i f i c a t i o na n ds o l v e n ts e p a r a t i o na n dc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw e r ea d o p t e d t os e p a r a t eh i g hp u r i t ys o l a n e s 0 1 t h ec o n t e n to fs o l a n e s o lw a s16 8 5 a tt h eo p t i m a l i i a b s t r a c t s a p o n i f i c a t i o nr e a c t i o nc o n d i t i o n s w a t e r ：9 5 e t h a n o l = 6 ：1 ( v v ) w a sa d o p t e dt o w a s hs o a ps t o c k , a n dt oe x t r a c ts o l a n e s o lw i t hp e t r o l e u me t h e r , t h ec o n t e n to f s o l a n e s o lw a s3 6 3 0 t h i sm e t h o dc o u l do m i td e w a x i n gp r o c e d u r e sa n ds a v ec o s t m e t h a n o lw a sa d a p t e dt os e p a r a t ee x t r a c t i o np r o d u c to fp e t r o l e u me t h e r , t h ec o n t e n t o fs o l a n e s o lw a s7 6 0 8 ，t h em e t h o dw o u l db ee f f e c ta n ds i m p l e ，a n ds o l v e n t r e c o v e r yw o u l db ef a v o r a b l et o o b ys e p a r a t i o no fc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , t h et o t a l y i e l do fp r o d u c tw a s6 8 2 0 ，t h ec o n t e n to fs o l a n e s o lw a s9 4 8 5 i nt h ep r o d u c t s p r e l i m i n a r ys t u d yo ns y n t h e s i so fc o e n z y m eq 1 0a n ds y n t h e s i so fc o e n z y m eq 1 0 o fe s t a b l i s h m e n tw i t hs i d ec h a i ne x t e n s i o nm e t h o da n ds i d ec h a i nd i r e c ti n t r o d u c e d m e t h o d p r e l i m i n a r yt e s to fs y n t h e s i so fd e c a p r e n 0 1 k e yw o r d s ：s o l a n e s o l ；c o e n z y m eq 1 0 ；e x t r a c t i o n ；s e p a r a t i o n ；s y n t h e s i s ； i i i 缩略语注释 缩略语注释 r p h p l c r e v e r s e dp h a s eh i 曲p e 墒肌a n c el i q u i d 反相高效液相色谱h 。1 反相高效液相色谱 c h r o m a t o g r a p h y t l ct h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y p ep e t r o l e u me t h e re x t r a c to ft o b a c c o 薄层层析色谱 烟叶石油醚提取物 s e s u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d ee x t r a c to f t o b a c c o 烟叶超临界c 0 2 提取物 c l cc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y柱层析色谱 p e sp e t r o l e u me t h e re x t r a c to f t o b a c c oo fs a p o n i f i c a t i o n 烟叶石油醚提取物皂化产物 s e s s u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d ee x t r a c to f t o b a c c oo fs a p o n i f i c a t i o n v i i 烟叶超临界c 0 2 提取 物皂化产物 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：黎讥乙 签字日期：1 口，留年j 2 月彤日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：镣孰p 签字日期：2 ，昭年l 卫月6e l 导师签名：亍饫彬 签字日期：少，罾年1 2 月t e l 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 引言 茄尼醇是一种不饱和的九聚异戊二烯醇【1 1 ，属四倍半萜烯醇，英文名称为 s o l a n e s o l 。分子式为c 4 5 h 7 4 0 ，分子量6 3 1 0 7 ，熔点为4 1 5 - 4 2 50 c 。 丫沙p 1 入丫小p 1 丫八伴洲 图1 1 茄尼醇的分子结构 f i g 1 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fs o l a n e s 0 1 茄尼醇最早于1 9 5 6 年由r o w l a n d 等【2 1 从烟叶中分离得到，最初认为茄尼醇 是由十个异戊二烯单元构成，后来研究证明【1 1 茄尼醇是由九个异戊二烯单元构 成，是四倍半萜醇，其结构见图1 1 。 茄尼醇一般存在于高等植物、哺乳动物和微生物中，主要存在于茄科植物 中，如烟叶、马铃薯叶和桑叶等，其在烟叶中的含量可高达干重的3 t 3 1 。 1 2 茄尼醇 1 2 1 茄尼醇的基本性质 茄尼醇纯品为白色粉末或蜡状固体，通常因含有少量杂质而呈淡黄色。茄 尼醇易溶于乙醚、丙酮、烃类等有机溶剂而不溶于水，其对紫外光呈非选择性 吸收，无旋光活性【4 】。值得特别注意的是化工合成的茄尼醇包含顺式和反式两种 结构，天然的茄尼醇只含有反式结构【5 1 。茄尼醇的稳定性较差，不仅接触酸碱 容易发生化学变化，而且有时在室温下就会分解，因此需冷冻保存。茄尼醇以 游离态和酯型结合态存在，游离态主要存在植物细胞的线粒体内，而结合态茄 尼醇主要以有机酸类物质结合成酯的形式存在，主要存在于植物细胞壁中【3 ，4 j 。 据报道：烟叶采摘一段时间后，游离态的茄尼醇含量逐渐增多，而结合态的茄 尼醇含量逐渐减少【6 j 。 1 2 2 茄尼醇在合成方面的应用 茄尼醇分子结构中含有多个非共轭双键，可作为一个功能基团在生物活性 第l 章绪论 物质的合成中应用，是一种重要的合成中间体【7 1 ，主要用于合成辅酶q 1 0 、维生素 k 2 等。随着对茄尼醇研究的深入，茄尼醇的应用也越来越广泛，其主要有以下 几个方面。 1 2 2 1 合成泛醌类化合物 茄尼醇可以作为异戊二烯单元用于合成泛醌类物质 8 q 0 1 ，如辅酶q l o ( 图 1 2 ) 和维生素k 2 ( 图1 3 ) 。 o r r r = c h 3 0c o e n z y m e q l o 图1 2 辅酶q l o 的分子结构 f i g 1 2m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fc o e n z y m eq i 0 o v i t a m i nk 2 图1 3 维生素k 2 的分子结构 f i g 1 3m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fv i t a m i nk 2 辅酶q ，o 是组织细胞内具有重要作用的活性酶，在细胞线粒体呼吸链即电子 传递系统中起递氢体作用。它还是细胞代谓 和细胞呼吸的激活剂，具有抗自由 基的能力，并能增加人体非特异性免疫功能。 辅酶q 1 0 是一种泛醌类化合物，在室温下呈橙黄色结晶物，其熔点是4 9 ， 无臭无味。因具有长的类异戊二烯侧链，因此易溶于氯仿、苯、四氯化碳，溶 于丙酮、石油醚及乙醚，微溶于乙醇，不溶于水和甲醇。辅酶q l o 最早发现于 2 0 世纪4 0 年代，1 9 5 7 年美国f r e d e r i c kc r a n e 和其合作者从牛心、老鼠肝脏中提 2 第1 章绪论 取出该物质，并根据其生物化学性质，把它命名为辅酶q ( c o e n z y m eq ) 1 1 1 。 同年英国的m o r t o n 教授【1 2 】从维生素a 缺陷的小鼠肝脏中也得到了这种化合物， 根据这个化合物的结构特点命名为泛醌( u b i q u i n o n e ) 。辅酶q l o 具有抗氧化和 清除自由机作用，增强免疫调节作用，稳定生物膜作用，以及对呼吸系统的作 用【l2 1 。辅酶q i o 在临床医学上的应用主要是对心血管疾病的治疗，研究表明辅酶 q l o 对治疗帕金森氏病、乳房癌、前列腺癌、胰癌和结肠癌也有一定效果。辅酶 q l o 在功能食品和化妆品方面也得到广泛应用。近年来国内外文献表明4 。，辅酶 q l o 在延缓衰老和提高免疫力方面有着不可替代的作用和广阔的应用前景。 维生素k 2 具有促进凝血、改善动脉硬化的作用【1 5 , 1 6 】。维生素k 与骨骼的新 陈代谢有关，其中维生素k 2 作用最显著。1 9 9 5 年日本首次将维生素k 2 作为治 疗骨质疏松药物进行应用。我国已进入老龄化社会，骨质疏松症发病率较高， 维生素k 2 既可作为一种营养物，又可以作为骨代谢调整物质应用于日常生活和 医疗保健中。 1 2 2 2 合成治疗肿瘤药物 o h l c h 2 甲( c h 2 ) 2 n c h 2 r m e i r = - 一c h 2 c h 一9 c h 广h i m e i ir=h 图1 4n 茄尼基n ，n 双( 3 ，4 二甲氧基苯) 乙二胺 f i g1 4m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f n s o l a n e s y l - n ，n b i s ( 3 ，4 一d i m e t h o x y b e n z y l ) e t h y l e n e d i a m i n e 1 9 9 0 年s u z u k i 掣1 7 1 以茄尼醇合a n 茄尼基n ，n 双( 3 ，4 二甲氧基苯) 乙二胺 i n s o l a n e s y l n ，n - b i s ( 3 ，4 d i m e t h o x y b e n z y l ) e t h y l e n e d i a m i n e ( 图1 4i ) ，体外试验 证明该化合物具有抗肿瘤的作用，与其它抗肿瘤药物合用可以增加活性。而另 一种不含茄尼醇结构单元的化合物( 图1 4i i ) 则没有显示出抗肿瘤的作用。 2 0 0 3 - - 一2 0 0 5 年，王超杰等【1 9 之1 1 也以茄尼醇为中间体合成了不同衍生物，并 进行了抗肿瘤活性的研究。次年赵瑾等【1 8 1 以茄尼醇和茄尼基胺为载体，顺丁烯 3 第1 章绪论 二酸和邻苯二甲酸为连接链，氮芥为药效基团，设计合成了4 种茄尼基氮芥衍 生物，并对5 种癌细胞模型进行了初步体外抗肿瘤活性进行评价。结果表明以 茄尼醇为载体，顺丁烯二酸为连接链的氮芥衍生物对5 种癌细胞模型均呈正抑 制作用。 1 2 2 3 合成抗溃疡药物 1 9 7 9 年t a h a r a 等【2 2 1 发明专利指出，茄尼醇卤化物与丙二酸二乙酯 ( e t 0 2 c ) 2 c h 2 反应，再经过酯化可制得抗溃疡药物。 1 2 2 4 合成治疗心脑血管病药物 1 9 8 7 年t a w a r a 等【2 3 】专利报道了苯甲酸异戊二烯酯类物质( i s o p r e n y l b e n z o a t e s ) ( 图1 5 ) 具有很高的抑制胆固醇升高的作用，并用茄尼醇与 p - 0 2 n c 6 i - 1 4 c o c i 反应，生成s o l a n e s y lp - n i t r o b e n z o a t e 。与氯苯丁酯( c l o f i b r a t e ) 具 有相同的抑制甘油三酯和胆固醇的合成，而防止血栓形成的作用。 h 图1 5 苯甲酸异戊二烯酯类化合物分子结构 f i g1 5m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fi s o p r e n y lb e n z o a t e s 1 2 2 5 合成抗艾滋病病毒药物 1 9 8 9 年，y a m a m o t o 等合成了聚( 异戊烯) 苯硫酸盐( 图1 6 ) ，体外实验发 现其具有很强的抑制反转录酶活性的作用，可以用于a i d s 的治疗。 r 2 0 r 1 - - s 0 3 n a h r 2 = s i m e 2 c m e 3 图1 6 聚( 异戊烯) 苯硫酸盐分子结构 f i g1 6m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fp o l y ( p r e n y l ) p h e n y ls u l f a t e s 4 第l 章绪论 1 2 3 茄尼醇的检测方法 茄尼醇的检测方法主要有：薄层色谱法、气相色谱法、库仑滴定法、液相 色谱法等。 1 2 3 1 薄层色谱法 薄层色谱法主要运用于制备茄尼醇过程的定性分析2 5 1 ，有文献报道 2 6 , 2 7 1 薄 层色谱扫描法也被用来测定茄尼醇的含量。李烈等1 2 6 1 用薄层扫描法测定茄尼醇 的含量，以双波长锯齿扫描，正己烷：乙酸乙酯：乙酸( 4 ：l ：0 5 ，v v v ) 为展开 剂，显色剂为香草醛浓硫酸溶液。于华忠等【2 7 】同样用薄层扫描法测定茄尼醇含 量，以硅胶g 为薄层吸附剂，石油醚：乙酸乙酯( 4 ：1 ，v v ) 为展开剂，香草醛硫 酸乙醇液为显色剂。薄层色谱法用于茄尼醇的定性分析是方便而快捷的，而通 过扫描法用于茄尼醇的定量则处理步骤较多，测量误差大。 1 2 3 2 气相色谱法 茄尼醇沸点大于3 0 0 。c ，所以需要耐高温的色谱柱或样品经衍生化处理才能 进行气相色谱分析，这样使得气相色谱应用受到限制。在国外还是有文献报道 气相色谱法运用于茄尼醇含量测定。s h e e n 2 8 1 等用气相色谱测定了茄尼醇的含 量。s a k a k i 等用c h 2 c 1 2 提取烟叶中茄尼醇，用c h 3 s i 溶解，游离态的茄尼醇可 以直接测定，化合态的茄尼醇用2m o l l k o h 的m e o h 溶液皂化后也可以用气 相色谱进行分析。 1 2 3 3 液相色谱法 由于液相色谱法的操作简单，重现性好且具有良好的精密度和准确性，因 此该方法是目前常用的一种定量方法。正相液相色谱法和反相色谱法都可用于 测定茄尼醇含量。赵瑾等【2 9 】用h p l c 采用正相柱测定了烟叶中茄尼醇的含量， 所用流动相为正己烷异丙醚一乙酸乙酯混合溶液，柱温在3 0 。c 时，分离测定一个 样品只需约1 0 m i n 。孙心齐等【3 0 对h p l c 方法作了改进，用紫外检测器代替示差 折光检测器，选定维生素d 为内标物，改变了现有的外标法定量法。由于h p l c 采用正相柱经常会导致柱子被污染，所以现在越来越多用反相柱来进行测定 3 1 - 3 4 1 。李春英等以乙腈甲醇为流动相，同时测定烟叶中茄尼醇和辅酶q l o 的 含量。李烈等【3 1 】以甲醇乙腈四氢呋喃为流动相，用反相高效液相色谱蒸发光 散射检测法测定烟叶中茄尼醇的含量。 1 2 3 4 库仑滴定法 5 第1 章绪论 库仑滴定法的检测以茄尼醇分子中含有9 个异戊二烯单元与b r 2 起加成反应 为原理。刘快之等【3 5 】以l m o l l k b r 的7 8 醋酸溶液为递质，运用库仑滴定法测 定烟叶提取物中的茄尼醇含量。由于库仑滴定法实验步骤比较繁琐，测量误差 有时也较大。 1 2 4 茄尼醇的粗制方法 1 2 4 1 溶剂提取法 有效成分的提取是天然产物分离的第一步。常用的提取方法是溶剂提取法。 在提取植物组织中有效成分时，影响提取效果的因素主要有以下三个方面：原 料条件，提取液条件和操作条件。原料条件包括原料成分，固体原料颗粒大小 等影响因素；提取液条件包括提取溶剂的组成，提取溶剂的浓度等；操作条件 包括料液比、提取温度、提取时间和提取次数等。 有效成分的提取过程的机理是十分复杂的，其基本原理实际是一个传质过 程，即有效成分从固体原料向液体溶剂的传质过程【3 6 】。提取过程主要分为以下 三步：( 1 ) 提取溶剂向固体原料的扩散、渗透和固体内部的湿润；( 2 ) 固体原 料内部的有效成分的溶解；( 3 ) 有效成分从固体原料内部向固液界面和溶剂中 的扩散。一般提取溶剂的渗透和有效成分的溶解进行较快37 1 ，第三步是决定有 效成分提取效率的关键。有效成分从固体原料内部向固液界面的扩散是一种分 子扩散形式的传质过程，其扩散速度取决于膜两侧浓度差。可表示为： d m l ：ka1(ccc10 1 ) = 1 i l 一 d r 。 式中：m l 一经细胞膜扩散的物质的量；k l 传质速率系数，与扩散系数、膜 孔隙率、正反方向扩散比值、毛细孔长度等因素有关；c o 一可溶性物质在细胞 膜内的浓度；c l 一可溶性物质在细胞膜外的浓度；a l 一细胞膜的面积，与物质 的种类和温度有关。 有效成分从固体颗粒表面向溶剂传质过程可表示为： d m 2 ：k 2 a ，c c a 2 ( 1 2 1 一= 2 ll d t 。 式中：m 2 一经颗粒向溶剂扩散的可溶性物质的量；k 2 一传质速率系数；c 2 一可溶性物质在溶剂的浓度；a 厂一固液两相的接触面积。 溶剂提取法的最大特点是设备投资少，易于工业化，缺点是三废排放大， 6 第1 章绪论 溶剂消耗量大，存在有机溶剂残留。 目前，采用溶剂提取法的工艺比较多。早期国外生产茄尼醇是用正己烷或 甲醇为抽提溶剂，加热搅拌，抽提2 - - - , 3 次，此法提取率虽高但存在溶剂价格较 贵或产出率低。近年岑波【3 引、姚文【3 9 】等人相继提出了p e 溶剂和s o t 溶剂体系。 p e 溶剂价廉易得，与正己烷相比茄尼醇提取率和溶剂回收率也较高。 游离态和结合态的茄尼醇都是极性较弱的物质，存在于植物细胞线粒体内 和细胞壁上，原料条件的复杂性对提取造成了一些困难。因些，提取溶剂的选 择和操作条件的设定十分重要。 1 2 4 2 超临界c 0 2 萃取法 超临界流体萃取技术是七十年代末才兴起的一种分离技术。1 9 7 8 年在西德 埃森举行全世界第一次“超临界气体萃取”的专题讨论会后，超临界流体萃取技术 被广泛应用于化学、石油、食品、医药、保健品等领域，在各国受到普遍重视， 在我国也己被列为九五期间国家重点开发的高科技项目1 4 0 】。 超临界流体萃取的基本原理是稳定的纯物质都有固定的临界点，包括临界 压力p 。、临界温度t c 和临界密度p 。当物质所处的温度高于临界温度，压力大 于临界压力时，我们就说该物质处于超临界状态。在此状态下，温度和压力的 微小变化就会引起流体密度的很大变化。密度越高，对物质的溶解能力越高。 利用超临界流体( s u p e r c r i t i c a lf l u i d ，s c f ) 的这种密度变化特性，通过控制适当的 操作条件，在高密度条件( 低温、高压) 下，将待分离组分萃取出来，然后改变操 作条件( 稍微提高温度或降低压力) ，将待分离组分析出，而使有效成分得以分离。 s c f 在密度上接近液体，是气体的数百倍，溶解能力强，粘度又接近于气体， 扩散系数又比液体大1 0 0 倍，渗透性好，因此能够更快地完成传质过程，实现 高效的分离过程1 4 。 7 第1 章绪论 表1 1 部分超临界流体溶剂及其临界性质1 4 2 l t a b l e1 1 s u p e r c r i t i c a lf l u i ds o l v e n ta n dc r i t i c a lp r o p e r t i e s 临界点数据 化合物名称化学式沸点 临界温度临界压力临界密度 t c o cp c m p a p ( g c m 2 ) 二氧化碳c 0 2 7 8 53 1 0 67 3 90 4 4 8 氨n h 3 3 3 41 3 2 31 1 2 80 2 4 0 甲烷c h 4 1 6 4 08 3 04 60 1 6 0 乙烷 c 2 h 6 8 8 o3 2 44 8 90 2 0 3 丙烷c a h 8 4 4 59 74 2 60 2 2 0 n j 1 烷c 4 h 1 0 0 51 5 2 o3 8 00 2 2 8 乙烯c 2 h 4 1 0 3 79 55 0 70 2 3 0 甲醇c h 3 0 h 6 4 72 4 0 57 9 90 2 7 2 乙醇c h 3 c h 2 0 h 7 8 22 4 3 46 3 80 2 7 6 水 h 2 0 l o o3 7 4 22 2 00 3 4 4 与其它超临界流体相比，c 0 2 更适合于食品、医药行业的萃取剂。它的溶解 能力强，选择性好，临界温度低，可以在接近室温下完成整个分离过程，因此 特别适于热敏性和化学性质不稳定的天然产物的分离。c 0 2 无毒、惰性、价廉、 挥发性强，可以很容易与任一溶质分离，不会残留在萃取物和剩余物料之中， 还可防止氧化，抑制细菌生长，其临界压力适中，技术工艺简单，操作方便【4 引。 目前工业上主要采用溶液提取的方式提取得到烟叶浸膏，但从各方面考虑 还存在诸多不足之处，如三废排放量大，溶剂消耗量大以及后续分离困难等。 因此，有必要在提取方法上有所改进，寻找简便有效的提取、分离方法，为充 分利用烟叶资源及工业化寻找新思路。 超临界c 0 2 萃取技术的出现，为茄尼醇的制备提供了一种新方法。初步实 验结果显示，超临界c 0 2 萃取物相对溶剂提取法提取物有如下特点：茄尼醇含 量有提高，无溶剂残留，相对较低的提取温度，对茄尼醇有较好保护作用。 张歆等m 1 用超临界c 0 2 萃取烟叶中茄尼醇，发现在萃取过程中时间是最主 要的因素，并通过正交实验得到了提取茄尼醇的最佳工艺条件，以体积分数9 0 乙醇为夹带剂，萃取压力3 5 m p a ，萃取温度为5 0 、解析温度为4 0 ，萃取3 h ， 8 第l 章绪论 产品茄尼醇质量分数能达4 0 1 4 。 超临界c 0 2 萃取茄尼醇的工艺固然有诸多优点，但是综合有关超临界c 0 2 技术提取茄尼醇的报道来看，存在萃取率低，造成原材料、能源、人力的浪费。 本论文将针对超临界c 0 2 萃取工艺存在的问题开展实验，以期有所改进。 1 2 5 茄尼醇的精制方法 1 2 5 1 结晶法 结晶法是从含复杂组分的天然产物中获取高纯度有效成分的方法，也是提 纯天然产物有效成分的最常用方法之一。其关键是选择合适的溶剂，确定溶剂 用量、结晶温度和时间就可获得纯度较高的产品。重结晶在工业上易于产业化， 投资发备成本也低，缺点是得率较低。孙心齐【4 5 】等采用重结晶法提纯茄尼醇， 但是该工艺提纯的茄尼醇含量较低，只有7 5 ，达不到合成要求，且操作步骤 多。王琼等【4 6 】使用两级萃取结晶装置分离提纯茄尼醇，一次性可将茄尼醇的含 量从1 5 1 7 提高到6 0 。此方法减少了溶剂用量，简化了工艺过程，但茄 尼醇含量也较低，达不到合成的要求，因此还需进一步的研究。 1 2 5 2 柱色谱法 色谱技术被广泛应用于天然产物分离，也是从复杂混合物中获取高纯物质 的常用手段。经典柱色谱法属于吸附色谱的范畴，是常用方法之一，一般采用 极性固体吸附剂如硅胶、氧化铝等作固定相。当样品分子进入色谱体系，溶质 保留和分离选择性决定于：( 1 ) 溶质和溶剂分子对吸附剂表面吸附活性点的竞 争；( 2 ) 溶质分子的各种官能团和吸附剂表面上相应吸附中心间的特殊作用， 它包括偶极和诱导作用、氢键以及电荷迁移或形成兀络合物；( 3 ) 流动相溶剂 对样品的溶解能力。 硅胶是最常用的吸附剂。硅胶的吸附作用是因其表面具有很多硅醇基团， 通过硅原子上o h 基团与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而产生的。硅胶 的吸附能力与其含水量有关，含水多的硅胶中大部分羟基与水分子形成氢键， 而不能与溶质成分形成氢键，从而减少了对溶质分子的吸附能力，硅胶加热到 1 0 0 以上时能失去水分而增加吸附能力。 茄尼醇最早由r o w l a n d 2 分离获得，以主要采用硅胶柱层析初分离和氧化 铝柱层析再分离的方法得到茄尼醇。目前国内对茄尼醇的纯化也多采用各种色 谱技术。孟祥晶等 4 7 】使用液相制备色谱和模拟移动床色谱相结合生产纯品茄尼 9 第1 章绪论 醇。王栋良等 4 8 】研究了大孔吸附树脂分离纯化茄尼醇的工艺。而分离纯化茄尼 醇运用较多的是吸附硅胶柱色谱。s c h o l t z h a u e r 4 9 采用硅胶柱层析获得烟草中的 成分研究茄尼醇的热裂解。h a s s a m 5 0 采用经硅胶色谱分离从经过培养后的烟草 中提取制备u 1 4 c 茄尼醇，进一步经正相h p l c 纯化得到标记的u 1 4 c 茄尼醇。 r 本专利采用硅胶柱层析从蚕沙和桑叶 5 1 及马铃薯叶中【5 2 分离茄尼醇。夏薇 等 5 3 采用对废次烟叶浸膏经皂化、硅胶柱层析分离和结晶，得到茄尼醇。 利用柱层析分离能达到纯化目的。由于制备型液相色谱是高压设备，成本 高，产出率低，而很难运用于工业生产；大孔树脂则由于会洗脱出杂质成分而 利用价值不高，硅胶柱层析法也存在工业化困难，不过只要在上样前对样品足 够的预处理，减少层析柱分离负担，该分离方法还是有一定价值。本论文采用 了结晶与硅胶柱层析相结合的方法分离纯化茄尼醇，以期达到较好的纯化效果， 为进一步放大试验起指导作用。 1 3 茄尼醇的研究进展与市场状况 1 3 1 茄尼醇的研究进展 1 9 5 6 年r l r o w l a n d t 2 】等人首先从烟草中分离得到茄尼醇，最初认为茄尼 醇是由十个异戊二烯单元构成。 1 9 5 9 年e r i c k s o n 1 】等人研究证实了茄尼醇分子结构，由九个异戊二烯单元 构成。 后来发现茄尼醇一般存在于高等植物、哺乳动物和微生物中的一种萜烯类 化合物，主要存在于茄科植物中，如烟叶、马铃薯叶和桑叶，其在烟叶中的含 量可以高达干重的3 1 3 1 。 1 9 5 7 年e c r a n e 1 2 】从牛心肌的线粒体中发现辅酶q l o 。辅酶q l o 具有改善心 肌代谢障碍的作用，是细胞内产生能量所必不可少的辅酶助因子。辅酶q 1 0 为非 特异性免疫增强剂，参与细胞代谢和细胞呼吸过程。辅酶q l o 临床具有抗冠心病， 增加心输出量，抗心律失常，降压等作用。随着医学研究的不断深入，近年来 人们对辅酶q l o 的药理作用又有许多新的发现，如补充内源性辅酶以保护心肌、 清除自由基、维持钙离子信道的完整性、改善线粒体呼吸功能等。 1 9 5 9 年r r u e g g 5 j 等人报导了利用茄尼醇合成辅酶q l o 的路线，并得到产物。 日本是世界上最早开发辅酶q l o 并产业化的国家。首先日本成功地从烟叶中 1 0 第l 章绪论 提取茄尼醇，进而以茄尼醇为原料合成制造出辅酶q l o 并工业化，其茄尼醇精制 和辅酶q 1 0 合成工艺被严格保密。后来，日本又开发出微生物发酵法生产方法。 目前，日本辅酶q i o 的产量位居世界首位，全球9 0 的辅酶q l o 均产自日本，全 世界数十亿美元的市场被其垄断。日本协和制药、日本日清制药和日本清渊化 工是辅酶q 1 0 主要生产企业，这三家企业在产量上占有绝对优势，并且都具有自 己的核心技术，享有自主知识产权，因而获得了高额利润。 国外在茄尼醇精制以及辅酶q l o 生产工艺已经很为成熟，且在一些关键技术 上申请了多项专利。我国要利用国内烟草资源优势，必须形成自己的知识产权， 才能在市场竞争上取得优势。 我国从2 0 世纪9 0 年代初才开始茄尼醇的工业化生产，主要是把废次烟叶 经溶剂提取得到烟草浸膏。 张德玉【5 4 】发明了一种新型的茄尼醇制备工艺，用6 0 - - 8 0 的工业正己烷 作为提取溶剂，所得到粗品茄尼醇含量约1 8 。 姚文等【3 3 1 通过研究发现s o t 溶剂体系萃取茄尼醇的能力比正己烷高1 4 1 5 ，s o t 溶剂不但提高了茄尼醇的回收率，还提供了回收溶剂中精油的新方 法。 岑波等【3 4 】用价廉易得的p e 溶剂代替现有生产上常用的正己烷溶剂。 y a n gz h a o q i z h e nd u 5 5 】运用低速逆流色谱从烟叶中分离食品级茄尼醇，所 得茄尼醇含量达到2 6 8 。 h u a y i n gz h o u 。c h u n z h a ol i u 5 6 】运用微波辅助萃取法从烟叶中提取茄尼 醇，从而找到一个新的提取茄尼醇的方法。 我国多个省市先后建立了若干茄尼醇粗品生产厂( 茄尼醇质量分数在1 7 以 下) 。大多数国内茄尼醇粗品生产企业将产品销售至日本( 目前市场价格每吨7 万9 万元人民币) ，由日本企业进一步精制茄尼醇用于辅酶q l o 的合成。 预计在今后的几年中，国内高纯度茄尼醇的需求量将以每年1 5 - - - - 2 0 的速 度上升，经济效益显著，市场规模大。由于具有较高的经济效益，我国高纯度 茄尼醇的研究也越来越多。 夏薇掣5 3 】利用皂化后的废次烟叶浸膏( 2 0 ) 经过硅胶柱色谱层析后可以获 得含量大于9 0 的茄尼醇。 马震吲利用粗品茄尼醇( 含量5 0 7 0 ) ，通过柱层析可以得到含量为9 6 的纯品茄尼醇。 第1 章绪论 薛华欣等【58 】使用高效液相制备色谱柱或中压硅胶填充柱，可获得纯度高达 9 8 5 的茄尼醇纯品。 胥克亮【5 9 】用纯度不低于7 0 的茄尼醇提取物，采用凝胶渗透色谱法，去掉 与茄尼醇分子量不同的杂质，浓缩，冷却后即得纯度大于9 5 的茄尼醇精品。 d e s o n gt a n g ，l i nz h a n g 6 0 1 把烟叶经石油醚加热回流提取，再经硅胶柱层析 得到含量8 3 的茄尼醇。 据报道，我国多个省市近年也开始投产高纯度茄尼醇，然而投产后发现由 于技术不过关，导致有的企业亏损或者最终放弃。 精制茄尼醇的目的是为得到合成辅酶q l o 的原料，进而合成辅酶q l o 。辅