（食品科学专业论文）西兰花籽中硫代葡萄糖苷的分离及抗过敏活性研究.pdf

浙江- t 商大学硕士学位论文 西兰花籽中硫代葡萄糖苷的分离及其抗过敏活性研究 摘要 逆流色谱是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术，它 可以实现连续高效的分离和制备。硫代葡萄糖苷( 简称硫苷) 是广泛 存在于十字花科植物中的含硫次生代谢产物。此类化合物及其降解产 物具有广泛的生物活性，不仅可以抑致细菌和微生物的生长，还具有 很好的抗癌活性。因此，对硫苷的分离提纯及其结构鉴定在食品科学、 生物医学等方面有着重要的实践意义。本论文应用逆流色谱技术分离 西兰花籽中的硫代葡萄糖苷，为硫代葡萄糖苷的分离制备打下技术基 础。 本研究对逆流色谱分离西兰花籽中的硫代葡萄糖苷的溶剂系统 进行了研究，找到了合适的溶剂系统正丁醇乙腈一1 0 硫酸铵溶液( 1 ： o 5 ：2 2 ) 。采用柱容积1 2 0 0m l 的h s c c c d 1 2 0 0 型高速逆流色谱仪 分离粗提物，并经制备高效液相色谱等进一步纯化得到五种硫代葡萄 糖苷单体：( i ) 烯丁基硫苷( i i ) 4 戊烯基硫代葡萄糖苷( i i i ) 3 甲基亚磺酰基正丙基硫代葡萄糖苷( i v ) 4 甲基亚磺酰基正丁基硫代 葡萄糖苷( v ) 7 甲基亚磺酰基正庚基硫代葡萄糖苷。它们的结构经 e s i m s 和1 h n m r 、1 3 c n m r 进行了鉴定。 浙江工商大学硕士学位论文 3 一甲基亚磺酰基正丙基硫代葡萄糖昔 o h l o s o a 4 甲基亚磺酰基正丁基硫代葡萄糖苷 o 浙江工商人学硕十学位论文 入入卜卜! 一： l i l i 、n o i o s 0 3 。 7 甲基亚磺酰基正庚基硫代葡萄糖苷 在l m l 含透明质酸酶( 3 4 6 u m 1 ) 的溶液中添加l m g 化合物i v i i ( i ) 烯丁基硫苷( i i ) 4 戊烯基硫代葡萄糖苷( i i i ) 3 一甲基亚磺酰 基正丙基硫代葡萄糖苷( i v ) 4 甲基亚磺酰基正丁基硫代葡萄糖苷 ( v ) 7 甲基亚磺酰基正庚基硫代葡萄糖苷，( v i ) 烯丙基硫代葡萄糖 苷，( ) 4 甲基亚磺酰基3 丁烯基硫代葡萄糖苷测定它们对透明质酸 酶的抑制试验结果表明： i i v i i i i 。高浓度下的抗过 敏活性以及体内抗过敏活性试验有待于进一步研究。 关键词：硫代葡萄糖苷，逆流色谱，西兰花籽，分离，抗过敏活性 浙江工商大学硕士学位论文 s t u d so nt h ei s o l a t i o nf r o mc a u l i f l o w e rs e e d sa n da n t i a l l e r g i c a c t i t yo fg l u c o s 玳o l a t e s c o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ( c c c ) i sal i q u i d l i q u i dp a r t i t i o n c h r o m a t o g r a p h yt h a tn os o l i dm a t r i xi sr e q u i r e d ，a n dc a nr e a c hh i g h e f f i c i e n ts e p a r a t i o na n dr e c o v e r y g l u c o s i n o l a t e sa r ea n i o n i c ，h y d r o p h i l i c p l a n ts e c o n d a r ym e t a b o l i t e sw h i c ha r eb e i n gr e c i e v e dp a r t i c u l a ri n t e r e s t d u et ot h er o l ei na n t i - c a n c e ra n da n t i b a c t e r i a l so fi s o t h i o c y a n a t e sf r o m g l u c o s i n o l a t e s t h e r e f o r e ，i tw a sv e r yi m p o r t a n tt os e p a r a t ea n di d e n t i f y g l u c o s i n o l a t e sf r o mc r u c i f e r o u sp l a n t s ，w h i c hw o u l db eb e n e f i tt ot h e d e v e l o p m e n to fp r o d u c t si n v o l v i n gg l u c o s i n o l a t e s i nt h ep r e s e n ts t u d y , h i 曲一s p e e d c o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ( h s c c c ) w a sa p p l i e dt o s e p a r a t eg l u c o s i n o l a t e si nt h ec a u l i f l o w e rs e e de x t r a c t ac c cs o l v e n t s y s t e mc o m p o s e d o fb u t a n o l a c e t o n i t r i l e - 10 a m m i a o n i as u l f a t e ( 1 ：0 5 ：2 2 ) w a sf o u n da sa ne x c e l l e n ts o l v e n ts y s t e m t os e p a r a t et h eg l u c o s i n o l a t e si nt h ec r u d ee x t r a c tu s i n gh s c c c - d i2 0 0 w i t ha12 0 0m lc o l u m n ，t h eg l u c o s i n o l a t ec o m p o n e n t sf r o mc c c i v 浙江工商大学硕士学位论文 s e p a r a t i o n sw e r ep u r i f i e db yp r e p a r a t i v eh p l c t oy i e l df i v eg l u c o s i n o l a t e m o n o m e r s ：3 - b u t e n y lg l u c o s i n o l a t e ( i ) ，4 一p e n t e n y lg l u c o s i n o l a t e ( i i ) ， 3 - m e t h y l s u l f i n y l p r o p y lg l u c o s i n o l a t e ( i ) ，4 - m e t h y l s u l f i n y l b u t y l g l u c o s i n o l a t e ( i v ) ，7 - m e t h y l s u l f i n y l h e p t y lg l u c o s i n o l a t e ( v ) ： o h ，、a 一 i o s 0 3 。 g l u c o s i n o l a t e l o s 0 3 g l u c o s i n o l a t e o s 0 3 3 - m e t h y l s u l f i n y l p r o p y lg l u c o s i n o l a t e v 浙江t 商大学硕士学位论文 7 - m e t h y l s u l f i n y l h e p t y lg l u c o s i n o l a t e t h ea n t i - a l l e r g i ca c t i v i t yo fs e v e nc o m p o u n d s ，4 一p e n t e n y lg l u c o n s i n o l a t e ，3 - m e t h y l s u l f i n y l p r o p y lg l u c o n s i n o l a t e ，4 一m e t h y l s u f i n y l b u t y lg l u c o s i n o l a t e ，7 - m e t h y l s u f i n y l h e p t y lg l u c o n s i n o l a t e ，a l l y lg l u c o n s i n o l a t e ，4 一m e t h - y l s u l p h i n y l - - 3 b u t e n y l g l u c o s i n o l a t ew a si n v e s t i g a t e db ym e a s u r i n gt h e i r e f f e c t so nh y a l u r o n i d a s ef r o mb o v i n et e s t i si nv i t r o t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h e a c t i v i t ys t r e n g t hw a si v v i i i i v i i i i v ia t ad o s eo f l m e gm 1 k e y w o r d s ： g l u c o s i n o l a t e s ， c o u n t e r c u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y , c a u l i f l o w e rs e e d ，s e p a r a t i o n ，a n t i a l l e r g i ca c t i v i t y o 浙江工商大学硕十学位论文 符号说明 c c c s r c c c h s c c c t l c h p l c i t c o z t o d c i c n k s f r f p t f e d m s o g r e e s i m s l h - n m r 1 3 c n m r d e p t 13 5 d e p t 9 0 8 p p m 逆流色谱 低速逆流色谱 高速逆流色谱 薄层色谱 高效液相色谱 异硫代氰酸酯 唑烷硫酮 光密度 溶质在固定相中的质量浓度 溶质在流动相中的质量浓度 分配系数 保留率 比移值 聚四氟乙烯 二甲基亚砜 4 甲基亚磺酰基3 丁烯基硫代葡萄糖苷 电子轰击质谱 核磁共振氢谱 核磁共振碳谱 核磁共振d e p t 1 3 5 谱 核磁共振d e p t 一9 0 谱 化学位移 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 签名：盎。至苤亟_ 日期沙。g 年岁月垆日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文 的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：客釜三幺自：) 导师签名： 日期：矽。髟年弓月毕日 浙江t 商大学碗i 学位论义 第一章综述 1 1 西兰花的研究现状 西兰花( b r o c c o l i ) ( b r a s s i c ao l e r a c e a l ) 又称嫩茎花椰菜、青花菜，绿花菜或茎 椰菜，俗称菜花，是花椰菜的一个变种，属 十字花科芸苔属甘蓝种( 见图1 ) ，为一、 二年生宿根草本植物。原产意大利，现在我 网广泛栽培，其营养价值高于一般蔬菜【：1 。 西兰花富含蛋白质、糖、脂肪、多种维生素 和矿物质，营养成分齐全，具有很高的市场 圈 价值，是我国出口蔬菜主要种类之一口j 。日本最近一项研究得出结论：西兰花的 平均营养价值及防病作用远远超出其他蔬菜，名列第一。维生素c 含量眈辣椒高 西兰花中的营养成分，不仅含量高而且十分全面，主要包括蛋白质、碳水化 合物、脂肪、矿物质、维生素c 和胡萝h 素等。据分析，每1 0 0 克新鲜西兰花的 花球中，含蛋白质3 5 4 5 克，是菜花的3 倍、番茄的d 倍。此外，西兰花中矿 物质成分比其他蔬菜更全面，钙，磷、铁、钾、锌、锰等含量都很丰富， 比 同属于十字花科的白菜花高出很多。其次，西兰花的维生素c 含量也明显高于其 他普通蔬菜。而且，西兰花中的维生素种类非常齐全尤其是叶酸的含量丰富， 这也是它营养价值高于一般蔬菜的一个重要原因m 。 1 2 硫代葡萄糖苷的研究概况 硫代葡萄糖甘( g l u c o s i n o l a t e s ，简称硫苷) 是一类化合物的总称，它广泛存在 于十字花科植物的根、茎、叶、果实及种子中的台硫次级代谢产物【”，至今己 发现1 2 0 多种呻】。硫苷本身是一稳定的化舍物，但存芥子酶( m y r o s l n a s e s ) 1 竽在的 条件r 以及没有芥子酶存在而在高温高雎f 都会发生降解反应，生成异硫代氰酸 酯( i t c ) 、硫代氰酸酯、嚼哗烷硫酮( o z t ) 及腈类等降解产物1 7 。8 1 。硫甙与芥子酶 浙江工商大学硕士学位论文 隔离共存于植物体内，当植物的器官受损或对植物加工时它们相互接触导致硫甙 水解。硫甙和它的降解产物都具有活跃的生物化学特性：在食品中赋予产品特殊 的风味，从而影响食物的适口性【9 - 1 2 】；硫甙的降解产物是一种毒素，具有抗营养作用， 食用含硫甙成分较高食物会引起甲状腺肿大【1 3 - ”1 ：硫甙及其降解产物具有较强的 防腐和抗菌作用；硫甙及其降解产物还是化学保护剂，能防止多种癌症发生的危险 【1 睨。硫苷及其降解产物异硫代氰酸酯具有活跃的生物化学特性，尤其是抗癌 活性已受到越来越多国内外学者的关注，并得到了广泛的认同，因此对其深入研 究富有重大的意义，特别值得注意的是生物活性物质萝卜硫素，它是4 - 甲基氧丁 基硫甙的降解产物，是迄今为止发现的最强烈的i i 相酶诱导剂，它能使致癌基因 失去作用f 2 2 1 。 1 2 1 硫代葡萄糖苷的结构及其分类 对硫苷的研究已经2 0 0 多年，1 9 世纪末，g a d a m e r 2 3 】最早提出了硫苷的结构， 他认为侧链r 基团直接连在n 原子，结果这种结构不能很好地解释硫苷的许多 特性。直到1 9 5 6 年，e t t l i n g e r 和l u n d e e n 【2 4 之5 】才用x 射线衍射的方法证明了硫 苷的结构如图1 2 所示。在超过3 0 0 0 种的十字花科植物中的硫代葡萄糖苷都具 有相似的化学结构。基本结构包含一个伊d 含硫葡萄糖，一个磺酸盐醛肟基团和 一个来源于氨基酸的侧链 2 3 - 2 6 】。后来w 嬲e r 和m a r s h 2 7 】又对硫苷的结构作了深入 的解释，认为双键c 原子、o 原子、n 原子、s 原子以及r 基团中的与双键c 原子相连的c 原子共同处在同一平面上，并且c = n 上的立体异构为z 式。由于 众多硫苷具有相同的母核结构，差别仅在于r 基团的不同上，因此可根据r 基 团的不同对硫苷进行分类：脂肪族硫苷( 第一类) 、芳香族硫苷( 第二类) 和吲哚型 硫苷( 第三类) 。表1 列出了硫苷的化学组成和名称。 r 一q i o s 0 3 o h 图1 2 硫代葡萄糖苗的结构 f i g 1 - 2c h e m i c a ls t r u c t u r eo fg l u c o s i n o l a t e s 2 浙江工商人学硕士学位论文 裘1 硫甙的化学组成和名称 类掰序号亿台钫组成 中文幺槔英文名称 名) i 一6 姗c h j ) - x t n = l 一翁 1 4 ( 3 1 ( q b ) q g t b ) (。一x t 船q i 乏m = qj ，五菊 1 5 - 1 9q b zc l l ( q b ) d 2 - - 5 ) a “q 劲z 删tq - i x 2 1 - 2 2q l 乒q a 屯c i b ，。x 【口= l 2 ) 第2 3 - 嚣哺q 。) “q t 0 i 饿a b x t n = nk 玉脚每l 。z 3 l 2 9 - 3 lc l h l | l ( 嘎m x l r = 一饿，一f 班 3 2 - 3 3r c ( o ma 1 曲仔b x ( 融一q k r 4 h s ) 3 ic h ，t q _ l z ，j ( c h0 1 h “c h ：】x 3 3 7 鞠产q 喇c 如期t 珊诩j 烈陋n f 3 争4 1l f a 南) j x 】t q 劲。x f 船1 - 3 ：瑚譬3 - 孵 4 2 似饿对柏嘞x 4 3 - 5 lq b s l a 七1 x 2 - l j ) 鲍c l l ，辩l 霉a h t 矾2 2 x 菇5 5 4 删c h l 。q l o 珊( m 2 ，硝肛2 - - 3 ) 骆匀m 髫伪，删佣2 1 2 捌h3 - - 辩 绺砸口l , s o ( q 1 2 ) g t b x 3 - i i ) 研锶j s d 飘= ( 硝蝣b ) 找 6 s - 柳c l 铩；c ) f a b ) 。铸h 砌 t l l 2 ) 2 2 - 3 j 7 0 7 la “鬟x g b l 。c o ( q b kx i 帖4 - 5 7 2 _ 蔼( 淞j 袋h c f 2 ) 。翎：x 3 - - 气s _ l 鳞 再a l ，蛾饼硼诩2 l 爨 3 睢射a 屯鬟h q b 。a 髑h a 乜j x l 船2 - - 辩 8 2 - 铂伽5 锄灏0 - - 田 8 弘瓣x ( o h 为铝对嬲键 棼9 0 - 鳃琳女 地l j b x 好b 0 为侮埘搠挝， 够3 4 一 鼢 2 一( ；h ，( 酗rx 舛置4 一a l i o h c h q l 卜x 够童矗s 一q l ，1 ) ) ，一锗b 瞄电一x 二嘶2 ( m 铺，秘1 0 哪j x 钾p _ 诩渺一c 棚抓张强一x 冁p - c i 斟卜q 地g t h 伽0 ：, q r b - x 钟- 1 0 4o 嘲5 c * x x q l 力i o “1 - 妨 赛l 循铺，d 妁【矾z ( 1 吖c l l ，卜x l 嘶础，娃x n b q 截如) x 1 0 7 - 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3s t r u c t u r eo fc o m p o u n d10 7 r x r ， r ； l ，o h ，o c h ，；r l = h ，o 绷如o s o a ? ) 曛1 - 4 吲哚类化会物的结构 f i g 1 - 4s t r u c t u r eo fi n d o l eg l u c o s i n o l a t e s 1 2 2 硫代葡萄糖苷的分布 硫代葡萄糖苷作为植物重要的次生代谢产物广泛存在于各种植物中，但以十 字花科植物中的含量最高，种类也最全。所有的十字花科植物都能够合成硫代葡 萄糖苷。硫苷在一些十字花科植物中含量大约占干重的1 ，在某些植物种子 中可达1 0 。但是，硫苷在植物中的含量变化很大，不同品种、同一品种的不同 生长阶段以及同一植株的不同部位含量都存在差别2 9 1 ，如g l u c o r a p h a n i n e 在西兰 花嫩芽中的含量是成熟植株或花的1 0 1 0 0 倍。在十字花科植物中芸苔属植物是 主要的食用蔬菜，包括花椰菜、西兰花、芥菜、甘蓝、芜菁等。硫苷在芸苔属蔬 菜中的含量一般在5 0 呲o o o 蚓g ，西兰花、花椰菜、甘蓝均含有5 6 种以上的 硫苷例。除了十字花科植物外，至少还有5 0 0 种非十字花科双子叶植物含有已发 现的1 2 0 种硫苷的一种或几种。r o d m a n 3 1 】曾列出了各种类型硫苷在各含硫苷植 物中的分布，如表2 所示。从表中可以看出芸苔属植物中含有硫苷的种类最多最 全，其它属植物中只含有少量的一种或几种硫苷。目前我国大面积种植的含硫苷 植物主要是各种芸苔属蔬菜，这也是我国居民摄取硫苷的主要来源【3 0 l 。 表1 - 2 含硫苷的植物种属以及所含硫苛的种类比较 t a b l e1 2t h eg l u c o s i n o l a t et y p e si nt h ep l a n tg e n e r a 4 浙江工商大学硕士学位论文 牛硫苷类型根据r 基团分类：a ，r = c h 3 s ( c h 2 ) n 、c i h s o ( c h 2 ) n 、c h 3 s 如( c h 2 ) n ；b ，r _ 直链饱羽1 烷烃类；c ， r = 支链饱和烷烃类；d ，r _ - 末端双键烷烃类或末端双键醇类；e ，r = 直链或支链饱和醇类if ，r = 直链 酮类；g ，r = 芳香类；h ，r = 苯甲酸酯类：i ，r = 吲哚类；j ，r = 多葡萄糖苷类或其它。 1 2 3 硫代葡萄糖苷的分析方法 硫代葡萄糖苷的分析方法可分为：硫苷总量的测定和单种硫苷的分析。 目前己报道的硫甙总量分析测试方法已很岁3 2 3 3 】：b a s 0 4 重量法 3 4 】、x 一射 线荧光法【3 5 】、葡萄糖试纸法【3 6 1 、葡萄糖比色法【4 5 1 、葡萄糖氧化酶法【3 7 1 、p d c l 2 比色法【3 8 1 、气相色谱法【3 9 1 、高效液相色谱法 4 0 4 1 1 等。硫甙定量分析多用b a s 0 4 重量法、p d c l 2 比色法、液相色谱法。但所有这些定量分析方法皆有误差大、重 现性差的缺点。其原因主要有- - ：1 b a s 0 4 重量法为常量分析方法，而硫甙分析属 微量分析，常量分析的操作误差( 主要为过滤、洗涤、灰化过程中的沉淀损失) 对常 量分析来说微不足道，而对微量分析却显得很大，且这种操作误差难以通过改进操 作而减少。2 p d c l 2 与硫甙显色呈复杂的红棕色，且不同的样品最大吸收峰不同 4 2 1 ， 有的样品甚至无最大吸收峰【4 4 1 ，硫甙含量高时常常有红棕色沉淀或絮状物生成t 3 s 】， 故用任何菜籽样本或黑芥子硫甙酸钾作比色对照均引起较大误差。3 液相色谱法 样品处理过程复杂，有些种类的硫甙如吲哚硫甙在处理过程中已分解或部分分解 4 i , 4 3 】，故用液相色谱法分析的硫甙总量实为“部分总量 【州。 单种硫苷的分析：h p l c 法是国际标准化组织( i s o ) 提出的测定硫苷的两种官 方方法之一。液相方法能对测试能力范同内的硫代葡萄糖营单独精确定量，测定的标准误 筹仅为1 06 t o o l g 【4 6 1 。反相离子对色谱用于带电荷物质的分离是一种比较理想的 5 浙江工商大学硕士学位论文 方法。n u c h a n a r t r a n g k a d i l o k 4 7 】等以四甲基溴化铵为离子对试剂利用反相离子对 色谱成功地实现了对芸苔属粗提样品中硫苷的分离；w e s d 5 9 j 等利用甲醇、水和 醋酸氨组成的流动相体系，在反相c 1 8 柱上成功分离了极性和非极性的硫苷。 1 2 4 硫代葡萄糖苷的抗癌活性 硫代葡萄糖苷的生物活性中最引人注目的是其抗癌活性，而这种抗癌活性是 通过其降解产物异硫代氰酸盐表现出来的。n e s t l e 4 i 】等指出s u l p h o r a p h a i l e 能有 效抑制小鼠乳腺肿瘤的扩散：n a s 仰z z i 【4 9 】等指出丙烯基异硫代氰酸酯能够抑制 癌细胞的形成；z h a n g 和t a l a l a y t 如峙艮道了某些硫苷降解产物可以有效预防肺癌、 结肠癌、肝癌及胃癌的发生。另外还有许多报道对此类物质的抗癌活性进行了研 究。可见此类物质的抗癌活性已得到世界范围内学者的认同，并受到了广泛关注。 i t c 能够防治多种癌症的发生是因为它们能够有效地防止饮食中的多种致癌 物如多环芳烃( p a h s ) 、杂环胺( h a s ) 和亚硝胺所引起的d n a 损伤。其机制包括两 个方面的内容瞄”：抑制i 相还原酶的活性和诱导i i 相酶的产生。通过抑制i 相 还原酶的活性可以阻断致癌物的代谢活化，避免了对d n a 链的损伤。通过诱导 i i 相酶的产生可以增加i i 相酶在机体内的浓度，从而更有效地催化有毒物转化 为亲水物质以从机体内排出。萝卜硫素是迄今为止发现的最强烈的i i 相酶诱导 剂，它能使致癌基因失去作用。i 相酶和i i 相酶都属于生化转移酶，最重要的i 相还原酶是细胞色素p 4 5 0 ，典型的ii 相酶有谷胱甘肽s 一转移酶( g s t ) 、u d p - 一葡 萄糖醛酸基转移酶。另外，高剂量的i t c 也具有基因毒性，可能引起哺乳动物细 胞姐妹染色体交换和染色体失常睛刭，从而引起突变和致癌，应该引起关注。 1 2 5 硫代葡萄糖苷的抗过敏活性 目前，国内外对硫代葡萄糖苻的抗过敏活性的研究尚无报道，本试验对其体外抗过敏活 性进行初探，并对其体外抗过敏活性与硫苷分子结构的关系进行初步探讨。 1 3 逆流色谱技术概述 逆流色谱( c o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y , c c c ) 属液液分离色谱，是上世 纪7 0 年代初由美国国家医学院的y o i c h i r oi t o ( 伊东洋一郎) 在逆流分溶法 ( c o u n t e rc u r r e i l t d i s t 抽u t i o n ) 的基础上研制发明的【5 3 】。逆流色谱分离法是一 6 浙江工商大学硕士学位论文 种基于某一样品在两相互不混溶的溶剂之间实现连续有效分配分离功能的实用 分离技术。c c c 应用的是动态液一液分配原理，使具有不同分配比的样品在处 于动态平衡的两相中不同分配从而得以分离。如今，此项技术已被广泛应用于生 化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料 等领域。 1 3 1c c c 工作原理 h s c c c 是利用了一种特殊的流体力学现象，使两种互不相溶的溶剂相在螺 旋管中单向分布 5 4 - 5 6 1 。h s c c c 工作时，固定相受重力和螺旋管阿基米德螺线运 动所产生的离心力的综合作用，促使固定相移向螺旋管的入端，从而固定相得以 保纠5 n 。同时两相溶剂在螺旋管中充分混合，溶质在两相溶剂中得以分配平衡， 样品就会随着流动相穿过两相对流的整个管柱空间，进而依据样品中各组分在两 相中分配系数的不同而实现分离。 1 3 1 1 液液分配原理 设有0 到n 号共n + 1 个分液漏斗，每个漏斗中加入体积相同的相互平衡的 两相溶剂系统的下相，在0 号分液漏斗内加入量为p 的溶质( 分配系数为k ) ， 并加入和下相同量的上相溶剂，充分振摇达到分配平衡，溶质在两相中的量为： 上相k p ( 1 + k ) ，下相p ( i + k ) 。然后把0 号分液漏斗中的上相转移到1 号分液漏斗， 0 号中加入新的同量上相，同时振摇两只分液漏斗达到分配平衡，则此时0 号和 l 号两只分液漏斗的上下相中溶质量分别为：0 号上相p 列( 1 + k ) z 、0 号下相p ( i + k ) 2 ，l 号上相p k2 ( 1 + k ) 2 、下相p 列( 1 + k ) 2 。各自总质量为p ( i + k ) 和p 耿1 + k ) 。 以此类推，0 号到n 号分液漏斗中溶质量为 n ! ( n r ) ! r ! p k r ( 1 + k ) n 】，当n 足够 大形成高斯分布，极值点为溶质含量最高点。 1 3 2 2 逆流色谱技术原理 1 流体静力平衡体系( h s e s ) 采用一根不动的螺旋管柱，螺旋管可看成多个分配单元，其中保留大量 的固定相。在每个分配单元里，流动的移动相造成两相的特定界面，这是稳 定的逆流色谱体系应具有的条件。 7 浙江工商人学硕上学位论文 若样品溶质由进口端注入，它会在每个分配单元不断经历两相之间的分 配过程，最后由出口端流出，样品的不同组分，会按其相对分配系数的大小 顺序先后分离出来。 2 流体动力平衡体系( h d e s ) 采用一根慢速转动的螺旋管柱，从入口开始直至出口，每一螺旋圈里都 存在体积相近的两相。螺旋管的继续转动会使各个部位的两相互相混合，同 时使整个螺旋管里的两相总体分布保持不变。此时，对管壁亲和性弱的一相 常呈小液滴分布在另一相中。大量的小液滴构成两相间的广阔界面，它们在 减小质点的传递阻力的同时避免层流的产生。因此，从入口注入的样品各组 分在管内各部位的两相中可进行有效的分配和传递，并按其分配系数的差异 而分离。 但流动相流速较快时，会导致固定相流失严重，使这种色谱在实际应用 中受到限制。 3 单向性流体动力学平衡体系( 单向性h d e s ) 单向性h d e s 中螺旋管转速很快，当达到临界转速时，一相将固定占据螺旋 管的首端部分，另一相占据尾端部分。这种分布特性说明，若从首端送入尾端相， 它会穿过首端相而移向螺旋管的尾端；反之亦然。因此，可利用这一分布特性实 现逆流过程。 c c c 基木原理与逆流分溶法相似，在分离过程中，各个组分在两相问不断 进行动态分配并达到瞬间平衡，它就象把通常的溶剂萃取过程成千上万次连续进 行。在多次连续的液液萃取过程中，由于物质各组分在两相间分配系数的不同， 随着流动相的流动，物质最终达到分离。组分的分离依赖于组分在两相问分配系 数k 的大小，k - c l c i l ，其中，c i 为某组分在固定相中的质量浓度；c i l 为该组 分在流动相中的质量浓度。当k = o 时，说明样品完全分配在流动相中，随着流 动相流出，在固定相中没有保留；当k 接近1 时，若柱内固定相与流动相体积 相当，则组分在两相中等量分配。k 值越大，组分的保留时间越长；k 值越小， 组分的保留时间越短。理想的k 值应该在0 6 7 - 1 5 之洲5 引。 1 3 2 逆流色谱技术优点 与液相色谱、纸色谱相比优点： 浙江r t 商大学硕上学位论文 1 、对进样的纯净度要求低，不须特殊处理。对于样品预处理的要求较低， 一般粗提物可以直接进样。另外，对溶剂要求低，无须使用高纯度的色谱溶剂。 2 、其固定相保留值高，柱容量大，超载能力强，样品理论上可1 0 0 回收； 3 、不需要固态载体，排除了固态载体对样品组分的吸附、沾染，使其变性、 失活等不良影响。所以，能避免不可逆吸附造成的溶质色谱峰拖尾现象，特别适 用于分离极性物质和生物活性物质。 4 、逆流色谱不用填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流穿透过程。 所以，能节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗，运行使用的后续投入较低，非常适用 于制备。 5 、应用广泛，进样量大，特别适用于制各级分离。 6 、固定相对于酸碱稳定，没有p h 值限制，有多种溶剂系统可供选择。 7 、设备简单，系统压力低，操作方便，维修方便。 1 3 3 逆流色谱溶剂系统的选择 溶剂系统的选择对于整个逆流分离来说是至关重要的。根据色谱理论，样品 分离的必要条件是合适的分配系数。因为不同的溶剂系统，具有不同的上、下相 之比，其粘度、极性、密度等性质相差甚远，对相同的成分具有不同的溶解、分 配能力，形成分配系数的差异，对分离效果产生不同的影响。在选择合适的溶剂 系统时，应注意符合以下原则【5 9 】： ( 1 ) 溶剂不造成样品的分解和变性； ( 2 ) 为保证固定相的保留值合适，溶剂体系的分层时间小于3 0 s ； ( 3 ) 目标样品在溶剂系统中的分配系数值( k ，即样品在两溶剂相中的溶解度 比值) 在0 5 2 之间； ( 4 ) 上下两相体积大致相等，以免浪费溶剂； ( 5 ) 尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理，易于物质纯化； ( 6 ) 在大量级的分离中，一般能在固定相完全溶解样品的情况下获得最好 分离； ( 7 ) 在分析中，最好用流动相溶解样品； ( 8 ) 固定相能实现足够高的保留。 薄层色谱( t l c ) 是实验室中最常用的检验样品纯度和摸索分离条件的一种方 9 浙江工商大学硕士学位论文 法，它具有方便、快速等特点，并且可以使用各种显色剂，这对于无紫外吸收的 样品尤为重要，因此t l c 可应用在h s c c c 溶剂系统选择溶剂系统的选择。根 据薄层色谱的斑点色度可以观察样品中各组分的含量差别及其在两相溶剂中分 配系数间的差异，由此来判断溶剂系统的适用性，并确定哪一层适宜作流动相。 一般待分离组分h s c c c 分离所使用的溶剂系统，根据经验对其进行筛选和 调整。用4 m l 玻璃瓶配制某一选定的溶剂系统，溶解5 m g 样品，剧烈振荡l m i n 后静止分层，观察其分层时间，剔除分层时间多于3 0 s 的溶剂系统。然后对于分 层时间少于3 0 s 的溶剂系统，用毛细管取近似等量的上下两层溶液于t l c 板上， 待溶剂挥发完后用溶剂系统中的有机层或其它合适的溶剂系统展开，根据样品的 性质，选用适当的显色剂显色，计算r f 值并观察斑点色度，观察各个组分的分 配系数的差异。对筛选的多种溶剂系统进行对比，选择合适的溶剂系统。 分析型逆流色谱仪是进行小量样品快速分离的仪器，它最大的优点是分离时 间短和溶剂用量较少。通过t l c 间接选择溶剂系统后，进一步用分析型c c c 进 行验证，并最终确定制备c c c 的溶剂系统。 目前溶剂体系的选择和优化一般根据实验积累的经验，而没有更充分的理论 依据，但具有实用价值。i t o 根据在螺旋管中行星运动的溶剂流体力学特性将溶 剂分为疏水性、中等疏水性和亲水性体系。在实际操作中，应当是根据实际情况， 参照相关文献专著，分析总结，从需分离的物质的类别出发，多次实验去寻找合 适的溶剂系统。在这个过程中既要改变各组分的比例，又要改变各组分的组成， 然后测定各组分的分配系数及分离因子，最终确定合适的溶剂系统。 1 4 选题背景及意义 癌症是危及人类生命的最严重的疾病之一，据世界卫生组织初步统计，全世 界每年约有1 0 0 0 万人被确诊为癌症患者，死于癌症者约5 0 0 万人。肿瘤已成为 我国居民死亡的第二位因素。研究和控制肿瘤是当今生命科学领域的重大的课 题。医学界和营养界越来越多的人认识到，在癌症的预防和治疗问题上，应将预 防工作列为首位。世界上存在很多天然防癌抗癌物质，其中很多是食品。目前国 际上对从植物中分离出来的硫代葡萄糖苷类物质及其降解产物异硫代氰酸盐物 质的防癌和抗癌的研究非常热门，越来越受到人们的关注。 l o 浙江工商人学硕士学位论文 近年来对硫苷的研究不断深化，其研究也越来越热，很重要的一个原因是 g l s 本身及其降解产物异硫代氰酸盐的抗癌活性。其抗癌方面的研究在前面已 有叙述，并且这种活性已得到世界范围内学者的认同，因此若能将其成功应用于 临床治疗以及营养保健品的开发，将会对人类攻克癌症顽疾、延长人类寿命以及 改善生活水平产生积极而深远的影响。另外，对资源的充分利用也有重要意义。 1 5 西兰花研究中的不足和课题的研究目标及思路 西兰花化学成分中报道最多就是西兰花中的萝卜硫素的分离制备方法，其它 类的硫苷成分报道得不多。而且对萝卜硫素进行制备型分离报道的方法也都不太 成熟，很难实现工业化。因此，进一步提取和分离西兰花籽中的硫苷成分，对其 化学成分进行系统的研究，以及对其有效药用成分开发利用，对寻找新药、开发 医疗保健品及综合利用资源等具有重要的意义。 无论是对硫苷类物质进行深入研究开发还是将来的工业化生产，对其进行提 取分离是首要的工作。本研究的目标是开辟一条应用逆流色谱技术对硫苷实现制 备型分离的新路子，以促进对硫苷和异硫氰酸盐的深入研究，并希望能为将来的 工业化生产打下基础。 本课题的研究思路包含下面的内容： 1 总硫代葡萄糖苷物质高效提取技术研究。 为了保证硫苷不被酶解，必须首先使酶失活，采用高温钝化的方法，效果理 想。然后采用沸腾甲醇对原料进行浸提，对原料连续进行3 次浸提，可以达到使 其中的硫苷大部分溶出的目的。 对甲醇提取物进行脱脂处理。将浓缩得到的膏状提取物以适量水溶解，再以 适量乙酸乙酯对其进行脱脂处理，连续三次。 水相的处理。先旋转蒸发至含水量较少时，再对其进行冷冻干燥，即得粗样 品。 乙酸乙酯相处理。浓缩至膏状，放入冰箱保存，以备后续处理。 2 硫代葡萄糖苷单种物质的连续、快速、高效分离提纯技术研究。 以逆流色谱技术为主，柱层析技术为辅研究分离单种硫代葡萄糖苷物质的技 术条件。 浙江工商人学硕寸：学位论文 对逆流色谱分离进行放大，以实现较大规模的制备分离。 对逆流色谱技术来说，关键在于溶剂系统的选择。查阅资料，不断试验，选 定以正丁醇，乙腈，盐溶液为系统组分，试验不同的比例及盐溶液的有关参数， 找到对硫苷分离较为合适的系统。 3 辅以柱层析及其高效制备液相对其进行纯化。 1 6 本课题的项目来源 本研究是浙江省政府重大招标科技攻关项目，该研究总的目标是从植物中提 取硫代葡萄糖苷类化合物并对其功能产品进行研制。 为了进一步揭示西兰花籽的药理活性的化学物质基础，开发其活性成分，本 论文研究的总目标是分离西兰花籽中的硫苷类化学成分的分离，并对其进行结构 鉴定。 1 2 浙江工商大学硕十学位论文 第二章西兰花籽中硫苷类化合物的提取、分离及其纯化 2 1 西兰花籽中化学成分的提取 2 1 1 材料 2 1 1 1 仪器 电子天平：a y l 2 0 型( s h i m a d z u ，j a p a n ) 。 旋转蒸发仪：r e 一5 2 型旋转蒸发仪( 上海博通) 。 其它仪器：量筒、电炉、水浴锅、冷凝管等。 2 ，1 1 2 试剂 甲醇，乙酸乙酯，水均为分析纯，购自华东医药股份有限公司。 2 1 2 方法 西兰花籽 c a u l i f l o w e rs e e d l o 0 0k g ( 杭州种子公司) 先用甲醇在水浴锅中加热 沸腾灭酶，然后将西兰花籽粉碎，再用甲醇5 0 0 c 浸提两次，每次用甲醇5 0 l 浸 提时间2 小时。提取液减压浓缩至无醇味后，浓缩物( 1 3 0 0 m 1 ) 分散在8 l 蒸馏水 中，用等体积的乙酸乙酯分配萃取，萃取液浓缩回收溶剂。浓缩物冷冻干燥得水 相萃取物7 2 3 9 。过程如下图2 1