（食品科学专业论文）血红蛋白多肽螯合铁的制备及其抗贫血功能研究.pdf

a b s t r a c t s t u d y o np r e p a r a t i o no fh a e m o g l o b i n p o l y p e p t i d e - i r o n a n di t sa n t i a n a e m i af h n c t i o n c a n d i d a t e ：z h e n gj i o n g a d v i s e r ：p r o f e s s o rk a nj i a n q u a n a s s o c i a t ep r o f e s s o rw a n g x u e r o n g a b s t r a c t t h e 他a 聆a b m l d a mp r o t e i n sa n d 锄i n oa c i di nt h ep o r c i i l eb l o o da n di t sn u t r i e n tv a l u ei sh i g h h a e m o g l o b i i li sa ni m p o r t a n ti i l g m d i ti i lt 1 1 ep o r c i i l eb l o o d ，w h i c hi sm o r et l l a n7 5 o ft o t a l p r o t e i i l i i lt l l ep o r c i l l eb l o o da n dn l o r et h 觚9 0 o ft o t a lb l o o dc o r p 璐c l ep r o t e i n h d nd e f i c i t 锄e i i l i ai so 舱o fm er s tc o m m o na 鹏1 1 1 i 粥i i l 廿l ew o r l d ，a 1 1 di sa l s o 锄i n 巾o r t a l l t9 1 0 b a ln u 仃i t i o n d e i e i l td i s e 勰e n ep o l ”印t i d e 一的ni san o v e lb i o a c t i v e 拍nw i ms t i m u l a t i v e l 船sa i l dh i g h b i o a v a j l a b i l 咄w l l i c hc a i lb ea b s o r t 埘d n c t l yb ym em t e s t i i l a lc e l l s t h c r e f 0 坨h 嬲n o g l o b i n p o l y p e p t i d ei s9 0 t t e i l 舶m 毹s hp o r c i n eb 1 0 0 d ；吐l e n ，b a s e d0 nt l l ec h e l a t i i l gr e s p 伽- s eb e 觚e 铋 m o l y s i t e 觚dh a e m o g l o b i np o l y p 印t i d e ，p 0 1 ) ，p e p t i d e i r o nc 姐b ep r o c e s s e d ，锄di t s 龃t i 一锄e r n j a r 髓u l t sw e r e 弱l os t u d i e di i lt l l i sp a p c r 1 1 把r e s u l t ss h o w e d 舔f o l l o w s ： 1 t h ef b s hp o r c i i l eb 1 0 0 di su s e d 鹊r m t e r i a li nt l l e s e a r c h i i lt l l ep 唧狮t i o np r o c e s so f l l 乏b 即g l o b i np o l y p e p t i d e ，t h ec o n d i t i o n so ft 1 1 ed i s c o l o u r a t i o n ，d e s a l i n a t i o na n du l 伽l 仃a t i o n 柚di t s s e m o 巧e v a l u a t ew e 他d i s c u s s e d t h e 代辄l t si n d i c a t e dm a t ：( 1 ) t h e 叩t i i i l u mp 缸锄e t e i - so ft 1 1 e d i s c o l o u r a t i o np r o c e s sa r ea c t i v a 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n 0 u sc h l 嘶d ew e r es t u d j e d ， 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中己加了 标注。 学位论文作签字日期：妒陴多月箩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：酗不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作 签字日期： 导师签名： 夕 日 签字日期：渺莎年多月p 日 文献综述 第1 章文献综述 1 1 猪血的概述 目前，我国年出栏生猪约5 亿头，是世界上猪出栏数最多的国家，由屠宰生猪而产生的副 产物猪血大约有1 5 0 万吨，资源相当的丰富【l 】。猪血的营养价值很高，素有“液态肉”之称。猪 血中含有大量的蛋白质和丰富的氨基酸，包括人体所必需的8 种氨基酸在内的1 8 种氨基酸，特 别是赖氨酸、亮氨酸含量丰富。此外，还含有适量矿物质、维生素、激素、酶和其它一些生 物活性物质。据测定，每1 0 0 9 猪血中含有蛋白质1 9 9 、脂肪o 4 9 、碳水化合物0 6 9 、矿物质o 5 9 【2 】o 虽然我们给予猪血很高的评价，认为猪血具有较高的营养保健作用，但是由于受诸多因 素的限制，对猪血的利用还很不完善，致使人量宝贵的猪血资源浪费，并且造成环境污染。 2 0 世纪7 0 年代以前利用量很少，主要作为食用，加：l ：成传统血豆腐、血肠，另有极少部分用 作饲用血粉，绝大部分血液作为废弃物放掉。7 0 年代末期和8 0 年代初期，国家开始重视猪血 的综合作用，对其作为重点课题进行攻关，相继开发研究出一些猪血产品。特别是近几年来， 猪血的利用取得很大进展，相继出现了许多重大科研成果，使猪血利用的经济效益和社会效 益大幅度提高。尤其是作为畜禽饲料、营养补荆、血红素、血卟啉衍生物、超氧化物歧化酶、 氨基酸营养液等项目，达到了国际先进水平p 卜【4 】。 1 2 血红蛋白的简介 1 2 1 血红蛋白的分子结构 猪血细胞中以红细胞为主，红细胞的蛋白质含量达3 8 ，占全血蛋白总量的7 5 以上。 研究表明，红细胞经溶血后可得血红蛋白【5 1 ，血红蛋白是一种结合蛋白质，其蛋白质部分称为 珠蛋白，属组蛋白类，其辅基是血红素，含有二价铁，其局部结构如图1 1 所示。血红蛋向分 子具有四级结构，由四个弧基组成，每个亚基是具有三级结构的多肽键，并含有一个血红素。 在四个弧基中，两个称伐链，其氮基酸组成和排列顺序是彼此相同的，每个键有1 4 1 个氨基 酸。另两个鲞也彼此相同，称p 链，由1 4 6 个氨基酸组成。0 【链分子量为1 5 1 2 6 ，b 链分子 量为1 5 8 6 6 ，| j 5 i i 条q 链和两条b 链再加四个血红素，则得血红蛋白的分子造为6 4 4 5 0 【6 】。 血红素是由4 个吡咯分子生成1 个卟啉环，再与1 个铁原子结合组成。卟啉环的四个氮 原子位于同一平面上，其中两个氮原子与铁原子以共价键结合，另外两个氮原子贝u 以配位键 结合。血红素e 的铁原子以配位键与珠蛋白分子上的组氨酸残基中咪唑环e 的氮原予相结含， 以复合蛋白质的形式存在丁机体之中。铁原子的配位数是6 ，因此还有一个配位键能连接其它 原子【丌。 两南人学硕七学位论文 m m 图卜1血红蛋白的局部结构图 f i g 1 一l t h ep a nc o 曲g u 枷o f l l a e i l l o g l o b i n 1 2 2 血红蛋白的功能特性 血红蛋白是溶解性极好的一种蛋白质，具有强乳化能力，并能形成稳定的泡沫。研究表 明，当血红蛋白的浓度低于o 3 l o o m i ，时，只有较低的乳化能力( 约4 3 ) ，当球蛋白浓度 从0 3 9 1 0 0 m i ，上升到0 4 8 1 0 0 m i ，时，乳化能力急剧上升，此后义持续稳定在8 2 左右。在 起泡稳定性方面，血红蛋白在1 8 1 0 0 l t l l 的浓度时，具有最强的起泡能力，起泡体积达1 8 3 i i l l ， 而鸡蛋清的最大起泡能力仅为1 1 8 m l 【引。目前，血红蛋白的乳化性和起泡性在食品加工中应用 广泛，特别是在肉制品生产中添加血红蛋白后，产品的保水性、切片性、弹性、粒度、产品 率等均有大幅度提高。 1 3 血红蛋白多肽制备方法的研究现状 血红蛋白经水解后，降解成不同链长的小分子肽类化合物，这些小分子再经过脱色、分 离纯化即得到血红蛋白多肽，血红蛋白水解的方法有两种：化学法、酶法【9 】。 1 3 1 水解方法的选择 1 3 1 1 化学法水解 化学水解有酸水解和碱水解两种。化学水解方法简单，价格便宜，水解效率高，但存在 着以。卜诸多缺陷： ( 1 ) 卫生安全问题，许多化学试剂不可能在食品生产上大量应用。 ( 2 ) 营养成分的损失，降低了蛋白质的生物化学价值。 ( 3 ) 水解程度不易控制，不能按规定的水解度进行水解，反应条件剧烈，副反应较多。 ( 4 ) 化学水解的产品具有焦糊味道，将严重影响产品的风味。 因此，对于血红蛋白多肽的生产，一般很少应用化学水解法。 2 文献综述 1 3 1 2 酶法水解 相对而言，酶法水解的反应条件温和，副反应少，不破坏氨基酸。酶法水解要求实验设 备简单，操作安全，无溶剂污染，投资少；同时，酶水解的水解程度可以控制，特别是利用 不同酶的特异性，得到不同水解物和各种多肽产品。用于水解蛋白质的酶按来源分主要有以 下三种类型： ( 1 ) 动物来源的蛋白酶，如胃蛋白酶、胰蛋向酶等； ( 2 ) 植物性蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等； ( 3 ) 微生物蛋白酶，如来源于枯草杆菌、枯草芽胞杆菌、地农芽胞杆菌、黑曲霉、毛 霉、青霉等产生的酶。 动植物蛋白酶虽有一定优势，但来源少，价格昂贵，一般仅限于实验室研究工作，不适 于工业化生产。随着生物技术的进步，微生物产酶技术日趋成熟，加之微生物蛋白酶价格便 宜，来源广泛，是一种比较理想的酶来源。 m a n j i nh l 等【1 川人依次用外肽酶f l a v o u 田仰e 和内肽酶e s p e r a 水解猪血红蛋白，得到富 含铁血红素的低相对分质子量的小肽，再用截流分子量1 2 一1 4 k d a l 的膜时，血红素和肽的比 率达到2 5 4 之多。杨炜掣1 用高温蛋白酶w f l 4 6 制备猪血水解蛋白，蛋白质得率在1 0 以上。 张华山【1 2 1 分别用a s l 3 9 8 中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对猪血蛋白进行水 解，结果表明a s l 3 9 8 中性蛋白酶对猪血蛋白的水解能力最强。于美娟掣”1 比较了单一酶和复 合酶水解鲜猪血的酶解效果，并确定了最适水解工艺条件，结果表明，复合法酶解鲜猪血水 解效果最好。 1 3 2 血红蛋白水解液的脱色方法研究 1 3 2 1 物理脱色法 血红蛋白酶解液的物理脱色是在含有蛋白质、脂肪的介质中，用微粒乳化脱色，在各种 物理因素如负压、压力下均质化、超声波处理等作用下降低脂肪乳剂中血红蛋白颜色的方法。 1 9 7 3 年，s i i l i m i t s k a y a 等人利用凝固的乳蛋白来隐藏血红素。1 9 7 5 年，z a y 弱等人采用超声处理 的脂肪乳化剂来达到隐色。在国外物理脱色方法推广比较普遍，是因为其儿乎可完全保存和 避免分解蛋白质、维生素、酶等，高度易吸收的砸铁血红素保存下来，其制品安全可靠，可 作为2 0 以下的代肉品【1 4 j 。但此方法也有其缺点：脂肪用量大，制品具有一定的颜色，不易保 存和运输，乳化剂不稳定时产品易被氧化而发生颜色变化。 1 3 2 2 有机溶剂萃取法 血红蛋白酶解液中血红蛋白的血红素是以非共价键与珠蛋白肽键相连。酶解液中的血红 素有游离态和结合态两种，游离和结合的血红素之间存在着动态平衡，酸性条件下可使平衡 3 两南人学硕 ：。位论文 向分解方向移动。一般的方法是将血红蚩白酸解后川有机溶剂萃取分离。常用的有机溶剂有 丙酮、2 - 厂i 弱、丁酮、乙醇等。1 9 7 3 年，t y b o r 等人利用含抗坏血酸的酸性血红蛋白溶液( p h = 4 ) ， 通入0 2 ，使血红蛋白转化为胆绿蛋白，然后用酸性丙酮抽提。但这类方法需要大量的丙酮， 每提取l k g 珠蛋白至少需要5 0 l 丙酮。张炜煜等【”】采h j 氯仿为溶剂，猪血粉与乙醇进行酯化反 应，得血红素二乙酯，过滤分离，达到脱色的目的。有机溶剂提取血红素是现阶段应用最多 的一种方法。有机溶剂脱色其优点是工艺设备较简单，一般厂家易于满足；缺点是需要大量 的有机溶液，血液蛋白的溶剂残留也难以处理，不利于综合利用。 1 3 2 3 吸附脱色法 该法是利用吸附剂吸附血红蛋白酶解液中血红素使其与珠蛋白分离而达到脱色的目的。 活性碳是一种常用的吸附剂，还有海藻酸钠，二氧化锰、硅藻七等。s a t o 采用c m c ( 羧甲基 纤维素) 层析柱吸附血红素，但1 9 c m c 只得到7 0 m g 脱色球蛋白。a u t 0 使用可溶性c m c 来拆 分牛血红蛋白，利用c m c 稀释液加入溶血的红细胞中，结合生成c m c 血红素复合物，经离心 沉淀分离，其成本大大低于层析柱，但其缺点是脱色球蛋白中仍然有0 7 铁存在，即大约还 有2 0 的血红素铁没有被拆分，而且a o t o 使用的是纯净血红蛋白，未对鲜血的体系作深入研究。 杨严俊1 6 1 经筛选确定了粗血红蛋白拆分剂c m s ( 羧甲基淀粉) ，其脱色效果优于c m c ，脱色 球蛋白的功能性实验证实其有良好的起泡性，可代替鸡蛋清作为食品的起泡剂，氨基酸分析 显示其赖氨酸和组氨酸的含量较高，可作为婴儿的营养强化剂。姜鹭等17 】采用a a s 型吸附树 脂代替传统的活性炭，对猪血粉水解液进行脱色。其实验证明：a a s 树脂具有优异的吸附性 能，但对含香氨基酸吸附少，而且再生性能好，使用周期长，再生方法简便，在脱色过程中 氨基酸损失量与活性炭比，总损失由3 8 降低到5 6 。 1 3 2 4 综合脱色法 采用单一的脱色方法其效果不是很理想，随着现代分析技术和分离加工设备的发展，多 种脱色方法结合起来应用将是血液脱色制备产品的发展趋势。马美湖等馆1 利用酸性丙酮和过 氧化氢结合起来进行脱色处理，得到食用血粉蛋白质含量高达7 0 1 ，血红素纯度含量达 7 3 7 5 ，其中含铁鼙达9 两种产品。王君等在提取氯化血红素新工艺中，在定程度上采 用超声波技术。这不仅得率高，生产周期短，而且在生产中不采用氯和吡啶，有着比单独使 用酸性丙酮生产j 二艺不可比拟的优点。 1 3 2 5 其它脱色法 此外，还有氧化脱色法、胶原蛋白脱色法、表面活性剂脱色法等血红蛋白水解液的脱色 方法。 4 文献综述 1 3 3 血红蛋白多肽的分离纯化 血红蛋白水解成多肽后，还需要进一步的分离纯化。目前，多肽分离纯化方法有盐析法、 超滤法、层析法和电泳法等【2 叭。而在实际应用中，常常采用上述几种方法的组合对特定多肽 类物质进行分离纯化。李艳伟等【2 i 】利用s 印h a d e xg 2 5 凝胶层析、阳离子交换层析、超滤除盐 及高压液相色谱等方法分离纯化猪血胰蛋白酶水解液，得到的目标产物是一种在高压液相色 谱水平上的纯品，相对分子质量人约为3 0 0 0 的小肽。方俊等吲选用优良菌株a 3 2 发酵新鲜猪血 制得猪血多肽，再将发酵液用0 0 5 u m 的陶瓷膜微滤和m r l 0 0 0 超滤膜超滤、喷雾干燥分离获得 血红蛋白多肽，并测得多肽的相对分子质量分布为8 5 0 5 0 0 0 k d a l 。 1 4 血红蛋白多肽生理活性及其开发利用的现状 1 4 1 血红蛋白多肽的生理活研究 由蛋白质酶解获得的活性肽，是功能性食品研究最活跃的领域之一。研究发现，食物蛋 白质的酶解物的一些小分子肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，同时具有防病、治 病、调节人体生理机能的功效，因而人们有可能从食品蛋白质中生产满足人们特定需求的活 性肽。国内外的研究者从食品蛋白质的酶解物中发现了一些小分子肽，包括抗高血压肽、免 疫调： 了j 汰、抗血栓肽、抗菌肽、抗癌肽等。 以血红蛋白为蛋白源的生物活性肽的研究在日本起步比较早。1 9 9 1 年，划冽曾报道过 在血红蛋白的b 链中含有抑制a c e 活性的氨基酸系列( 3 4 3 9 氨基酸残基) 。1 9 9 6 年，l z u e 等【2 4 】 酶解以猪血为原料制备的血红蛋白得到了4 种具有抑制a c e 活性，降血压的活性肽，他们分别 p h e - g i n - l y s v a l - v a l - a l a ，p h e g l n - l y s - v a l - v a l a l a g l y ，p h e g l n l y s v a l v a l - a l a l y s 和 g l y l y s l y s v a l k u g l i l 。这4 种肽对a c e 活性的抑制率( i c 5 0 ) 分别为：5 8 、7 4 、2 1 、1 9 呷l ， 自发性高血压小鼠在口服其中两种多肽半小时后，血压从1 7 2 士5 m m h g 降至1 5 0 士6 m m h g 。 k y o i c l l i 等f 2 5 】从血红蛋白酶解物中得到抑制血清中甘油三脂水平提高的四肽：v a l v a l t y r _ p m ， 可以有效缓解心血管疾病以及肥胖症。1 9 9 7 年，z h a o 等2 q 从血红蛋白中得到了具有的降血脂 作用的鸦片状活性多肽w - h e m o r p h i n 7 和lw h e m o 神i n 一7 。 近年来，也有我国学者对血红蚩向水解液的生物活性分进行了探讨，余奕珂等【27 】测定了 珠蛋白水解液对血管紧张素i 转换酶( a c e ) 的抑制活性、对血红细胞的凝集活性和对植物的诱 抗活性。结果显示：富含小分子肽的珠蛋白水解液在水解度为1 2 6 时，对a c e 的抑制率最高； 在显微镜卜观察水解液对血红细胞有一定的凝集作用：在5 0 0 m g ，l 的浓度下对植物的诱抗活性 j j 5 0 m g l 的壳寡糖相当。所以，珠蛋白的胃蛋白酶水解液具有很好的7 e 物活性，为猪血在制 约、食品以及绿色农药方面的利川提供了必要的理论支持。 5 西南人学硕七学位论文 1 4 2 血红蛋白多肽的开发利用研究 近年来，许多发达国家己开发出多种用于病人和特殊生理需要人群的活性肽类保健与功 能食品，而我国对活性肽类和蛋白水解物的研究相对滞后，有关方面的研究才刚刚起步。目 前，日本、欧美等国家已经利用血红蛋白生产出了不同类型的多肽类食品，如酸性多肽饮料、 多肽强化奶粉等2 8 1 。该多肽类食品具有易消化吸收的特点，尤其可以作为下列几种人群的蛋 白营养源： ( 1 ) 患消化道疾病的人。膳食中的蛋白质，其消化吸收要经过一个复杂的过程，所以 对一些患有特殊消化器官疾病的人，最好能食用直接吸收的肽类食品。 ( 2 ) 食物过敏性患者。食物过敏患者轻则引起皮肤疹，重则会危及生命，研究表明，多 肽在预防和治疗某些食物过敏性方面的作用有较好的效果。 ( 3 ) 老年人。由于老年人发病率较高，要保持组织器官中氨基酸的平衡，必须要摄入更 多的蛋白质。但是，老年人的消化吸收系统的功能又在减弱，所以不能靠摄入过多的食品来 增加蛋白质的摄入量，而是应该食用富含蛋白的专门化老年食品，这种食品以液体较好，并 且氮源以易消化吸收的多肽为适宜。 ( 4 ) 运动员。由于肽的吸收特点，它是运动营养中的很好氨源。在膳食或饮料中强化碳 水化合物和蛋白质，比只强化碳水化合物对于增加肌肉中的糖原贮存更有效。在美国，含蛋 白质水解物的产品已应用于运动员的膳食，并取得良好的效果。 ( 5 ) 控制体重者。食用低能且含有足量的蛋白质的食品，如用具有高生物价的多肽来配 制低能饮料，这样就可在保持身体氮平衡的前提下，主要通过脂肪损失来减少体重。此外， 蛋白水解物强化膳食还有助于减少食欲。 1 5 铁螯合盐的研究现状 科学研究和生产实践都已证明，某些氨基酸和小分子多肽可以促进铁的吸收和利用。 a d e l i a 等【2 9 1 研究发现氨基酸和多肽与铁在小肠中可形成可溶的氨基酸或多肽的螯合物，氨基酸 和多肽螯合铁的形成增加了铁在肠腔中的溶解度，或者氨基酸起着铁离子的载体作用，因此 氨基酸和多肽促进了铁的吸收。随后世界各地许多研究机构便纷纷开展了氨基酸或多肽螯合 铁的研究。 1 5 1 铁在人体中的生理作用 铁是人和动物体所必须的微量元素之一，制造血红素、肌红蛋白和细胞色素都必须依赖 铁。正常人体内铁的含量为3 5 9 ，约占体质量的o 0 0 4 。人体内的铁都与蛋白质结合，无游 离态。铁是血红蛋白、肌红蛋白和许多酶的构成成分，成人体内的总铁量中7 2 o 的铁结合在 能携带氧分子的血红蛋白和运铁蛋白( 血浆) 中，以血液形式流经全身；3 以肌红蛋白的形式 存在，又叫功能铁；其余则为储备铁，以铁蛋白和含铁血黄素的形式存在于肝、脾、骨髓、 6 文献综述 骨骼肌、肠粘膜、肾等组织中。铁在体内可反复利川，健康成人每日只需吸收1 o m g 以上的铁 即可满足机体需要。 1 5 1 1 造血和输纠3 0 1 铁对人体健康的重要性，首先在于它是血红蛋白的一个必不可少的部分，在造血过程中 是必需的元素之一，参与氧的转运、交换和组织呼吸过程。 红细胞是氧的载体，它的重要成分是血红蛋白。血红蛋白是由一分子珠蛋白和四分子亚 铁血红素构成，氧与铁血红蛋白结合成氧合血红蛋白，血液中的氧绝人部分是以这种形式 运输的。而细胞色素酶类中的铁极易与氰( c n 一) 结合，酶的活性立即被抑制，使体内氧化中断 造成组织缺氧，当血中弧铁血红蛋白增至5 0 m g m l 以上时，会出现口唇、指端紫绀现象。 人体内，在氧分压力高的地方，氧分子能够把血红素的分子结构中的水分子置换下来， 从而与血红蛋白结合生成氧合血红蛋白；在氧分压力低的地方，氧合血红蛋白可以再把氧气 放出来。肌红蛋白是一种含血红素的蛋白质，因此它也含有铁，主要存在于肌肉细胞里，这 些细胞非常需要氧气。在氧分压低的地方，肌红细胞与氧分子结合的能力比血红蛋白强，这 样，与血红蛋白结合的氧气就可以由血红蛋向传递给肌红蛋白。 1 5 1 2 重要酶和蛋白的组成成分【3 1 】 铁也是构成机体内许多代谢酶的活性成分，如：铁硫蛋白、细胞色素、细胞色素氧化酶、 过氧化物酶等；铁与某些酶的活性有密切的关系，如乙酰辅酶a ，琥珀酸脱氢酶、黄嘌呤氧化 酶，细胞色素还原酶，在细胞生物氧化过样中发挥着重要作用。现代研究证明铁与能量代 谢密切相关，冈为= 羧循环中有一半以上的酶和冈子含铁或者只有铁存在时才能发挥其生化 作用，完成生理功能：铁还影响动物体内的蛋闩质合成和免疫机能。 1 5 2 铁螯合盐的国外研究现状 2 0 世纪6 0 年代，国外学者通过一系列研究，提出了铁的吸收转运机制，他们认为在动物 的肠腔内，不论是f 分+ 还是f e ”，都必须与内源或外源配位体结合形成络合物，再以此彤式吸 收并进一步转运，而氨基酸和多肽就是这掣鬯配侮体中较合适的。以后，许多研究者研究了氨 基酸对铁吸收的影响，进一步证实了这一铁吸收理论。可见，氨基酸和多肽螫合铁是铁吸收 的原始模式之一+ 1 3 2 l 。 7 0 年代 剜，最先由美国a l b i o n 实验气i 以动植物蛋白和铁元素为原料合成了蛋白铁 ( k o np r o t e i n 蕊e ) 的复合物，由此开始r 氩l 。睃螯含物的研究和开发。近年来在英【目和美 国，对氨基酸螯合铁做为铁营养强化剂虑l jj ：食品中的研究逐渐增多。2 0 0 1 年，g a r c i a 等1 3 3 】 研究r p h 仇政变对什氨酸螯合铁溶解度的粉l 咄结果表明，p h 从2 改变到6 ，什氨酸整合铁的 溶解度没有人的，芝化，基本上是1 0 0 溶解2 0 0 2 年，k a m rp 卅也报导了甘氦酸螯台铁作为铁 强化列舀斜二如j q t 的应用。 7 两南人学硕士学位论文 1 5 3 铁螯合盐的国内研究现状 在我国，8 0 年代中期开始研究微量元素氨基酸螯合物，并在氨基酸螯合铁方面已取得很 大进展。在氨基酸螯合铁的制备的研究方面，杨文炳等在9 0 年代初报道了用酸解豆饼得到的 复合氨基酸液与硫酸距铁螯合制备复合氨基酸螯合铁【3 5 1 。秦卫东掣3 6 1 在此基础上，研究了用 脱脂豆粕酶解成复合氨基酸液，与亚铁盐螯合制备复合氨基酸螯合铁的1 ：艺。结果表明：豆 粕酶解的最佳条件为加酶量( 复合蛋白酶) 为4 、同液比为1 ：2 4 、p h 值为8 o 、酶解时间为1 6 小时；复合氨基酸亚铁螯合的最佳条件为反应温度2 5 ，反应时间3 0 i t l i n ，p h _ 6 o ，氨基酸与 亚铁盐的配体摩尔比为2 ：l 。林萍【37 】等以氯化亚铁和甘氨酸为原料，研究了甘氨酸螯合铁的 合成一r 艺条件。结果表明，p h 值、配位比以及抗氧化剂用量对产品组成和得率有很大影响；并 确定了螯合的最适条件为：p h 值为5 5 、配位比为4 ：1 。此外，徐海青等【3 8 】介绍了以鸡羽毛为原 料，用盐酸水解，然后与铁盐络合制备氨基酸铁螫合物的方法。 除了各种氨基酸制备螯合铁外，某些小分子多肽也可以制得螯合铁。王稳航等【3 9 1 以酪蛋 白为原料，通过木瓜蛋白酶水解，并经超滤分离得到多肽，与氯化亚铁进行螯合，制得了酪 蛋白酶解多肽铁，并研究了其性质。酶解酪蛋白制备多肽的最佳上艺条件为：酪蛋白浓度为 1 0 ，木瓜蛋白酶量为l ，p h 值为6 1 ，反应温度4 5 ，水解时间为4 h ；酶解多肽相对分子质 量大部分集中于3 5 k d a l 1 0 k d a l ，占7 1 0 8 。张亚丽等m 利用豆粕的1 3 9 8 中性蛋白酶水解液作 为多肽的来源，对食品营养强化剂多肽络合亚铁的合成工艺条件进行了初步研究，确定合适 的配合反应条件为配位体摩尔比为2 ：l ，p h 为6 5 ，产品络合率达到9 0 以上，并用化学方法 及红外光谱法鉴定了产品。 在应用方面，陈洁等【4 l 】人用硫酸铁复配复合氨基酸进行了大鼠的喂养试验，研究表明， 复合氨基酸能够显著促进铁的吸收。周桂莲【4 2 肄比较了硫酸亚铁、甘氨酸铁及赖氨酸铁的生物 学效价，结果显示，甘氨酸铁和赖氨酸铁的生物学效价比硫酸亚铁高1 1 8 5 和2 4 3 。靳雅笙【4 3 l 等以缺铁大鼠为模型研究了甘氨酸弧铁改善营养性贫血的效果，结果表明，补充甘氨酸亚铁显 著改善大鼠生长，补充组的终体重和净增重显著高于低铁对照组：甘氨酸亚铁显著升高贫血大 鼠的血红蛋白水平，而红细胞内游离原卟啉水平显著降低，补充甘氨酸亚铁组的脾脏铁含量和 总铁含量均显著高于低铁对照组，并且与相同剂量的乳酸亚铁相比没有显著差异。 1 6 研究目的及意义 贫血是由于血液中红血球数量太少，血红素不足而引起的一种常见病。根据引起贫血的 原因可将之分为障碍性贫血、溶血性贫血、地中海贫血和缺铁性贫血等。缺铁性贫血是指体 内贮存铁不足，影响血红蛋白合成所引起的一种小细胞、低色素性贫血，是世界各地贫血中 最常见的一种，也是重要的全球性营养缺乏病之一。据w h o 报告，全世界约有1 0 3 0 的 人群有不同程度的缺铁，在发展中国家可能高达5 0 以上，其中成年男子约占l o ，妇女约 占2 0 ，孕妇和儿童约占4 0 6 0 l 州。我国各地的流行病学调查结果也大致如此。 g 文献综述 目前，缺铁性贫血的防治主要通过服川补铁剂来实现。见的补铁剂有硫酸哑铁、氯化亚 铁、葡萄糖酸弧铁、乳酸砸铁等，这些补铁剂虽然铁含量高，但是由于它们在体内的利用率 较低，并且存在不同程度的金属铁锈味和胃肠道刺激。研究表明，多肽螯合铁是一种新型的 生物态铁，可以直接被肠粘膜细胞吸收，不产生消化道刺激，生物利用率高，是理想的补铁 剂。因此，本实验利用猪血制备出血红蛋白多肽螯合铁，对于缺铁性贫血的防治具有重大作 用。 我国许多屠宰场对牲畜屠宰后流出的血液主要用于制作菜肴、血粉、血肠和血酱油等， 产品附加值低，还有相当一部分血液直接排入环境，既浪费了宝贵的蛋白质资源，又严重污 染了周围的环境。因此，利用动物血液制备多肽铁对提高猪血的附加值，对猪血的利用走上 工业化开发道路和保护生态环境有着重要的意义。 1 7 研究内容 ( 1 ) 血红蛋白多肽的制备 以新鲜猪血为原料，经过酶解、分离、脱色、脱盐、超滤、浓缩等工艺制得了4 个不同分 子量段的血红蛋白多肽。在制各血红蛋白多肽过程中，探讨了脱色、除盐、超滤等工艺的条 件参数，并对制备的血红蛋白多肽进行了感官评价。 ( 2 ) 血红蛋白多肽螯合铁的制备及其成分分析 选用前面制得的血红蛋白多肽为原料，先筛选出了适合制各多肽螯合铁的铁盐，然后采 用内络盐的制备方法，研究血红蛋白多肽与氯化亚铁反应制备多肽铁盐的工艺条件，选出最 佳的螯合_ t 艺，并对产物的组成成分进行了初步探讨。 ( 3 ) 血红蛋白多肽铁的抗贫血功能研究 以w i s t a r 品系初断乳大鼠通过低铁饲料喂养，辅以每周尾静脉放血的方法，建立大鼠缺铁 贫血模型，然后研究了多肽螯合铁对改善大鼠缺铁性贫血的效果，并与葡萄糖酸亚铁和氯化 亚铁进行了对比。 9 第2 章血红货白多肽的制备 第2 章血红蛋白多肽的制备 血红蛋白多肽是猪血中的血红蛋白经酶解、分离、脱色、脱盐、超滤、浓缩等 ：艺精制 得剑的小分子多肽混合物。血红蛋白多肽不仅具有易溶解、低粘度、抗凝胶形成等良好的功 能特性，而且具有降血压、降血脂、抗衰老、提高免疫力、缓解心i 血管疾病以及肥胖症等重 要的生理活性m l ，是一种非常有前途的功能性食品原料。所以，利用现代高新技术对猪血中 的血红蛋白多肽进行制备、分离、纯化，并对其功能和生理活性进行系统化的研究，使血蛋 白多肽成为新一代的蛋白营养素和多功能的生理活性物质，并以此为突破口，加强对猪血深 加j ：的研究，开发新产品，提高猪血的附加值，这对猪血的利用走上i ：业化开发道路和保护 生态环境有着重要的意义。 本文以新鲜猪血为原料，经过酶解、分离、脱色、除盐、超滤、浓缩等工艺制各了血红 蛋白多肽，并探讨了脱色、除盐、超滤等工艺的条件，以期为猪血的深度开发提供实验数据。 2 1 实验材料 2 1 1 原料与试剂 新鲜猪血 2 7 0 9 碱性蛋白酶 粉末活性炭 柠檬酸钠 三氯乙酸 苯乙烯系离子交换树脂 其它为实验室常规试剂 2 1 2 设备与仪器 杯式超滤器及超滤膜 7 5 2 型紫外分光光度计 h h 2 璎数显恒温水浴锅 p h s 3 c 型酸度计 特制玻璃层析柱 b t 10 0 b 型恒流泵 e s j l2 0 4 型电子分析天平 r e 5 2 9 8 型旋转蒸发仪 微犁实验窀喷雾干燥机 其它为实验室常用设备 荣昌屠宰场 广西南宁庞博生物科技有限公司2 0 万u 江苏溧阳竹溪活性炭有限公司 天津大茂化学试剂厂 成都市科龙化f ：厂 国药集团化学试剂有限公司 上海摩速科学器材有限公司 上海精密科学仪器有限公司 金坛市富华仪器有限公司 成都世纪方舟科技仪器仃限公司 上海沪两分析仪器厂 上海沪两分析仪器j ” 沈阳龙腾电子囱限公司 上海砸荣生化仪器厂 济南奥诺能沥渖 技仃限公i d 两南人学硕+ 。学佗论文 2 2 实验方法 2 2 1 血红蛋白多肽制备的基本工艺流程 下层沉淀( 可提取血红素铁) 猪血一血红蛋白一酶解一终止反应一离心 上层清液( 多肽、氨基酸) 一脱色_ + 抽滤_ 除盐一超滤_ 浓缩- 喷雾干燥 2 2 2 血红蛋白的提取f 4 5 】 新鲜卫生猪血加o 5 的柠檬酸钠抗凝，用干净纱布过滤除纤，再在3 0 0 0 凼【l i n 下离心1 5 m i n ， 弃上清液，沉淀物用生理盐水清洗，然后同样转速离心1 5 l i l i n ，弃去上清液，重复洗涤两次。 然后加入3 倍体积的蒸馏水，搅拌下溶胀破壁，避光条件下6 0 加热3 0m i i l ，以3 0 0 ，m i n 离心 1 5m i l l ，去除变性的杂蛋白等，得到血红蛋白溶液，经冷冻干燥备用。 2 2 3 酶解单元操作【1 3 1 将分离提取的血红蛋白加水溶解，置于恒温水浴锅中，调节至所需温度，加入适量的2 7 0 9 碱性蜇白酶，刚6 m 0 1 l 氢氧化钠调节酶解液的p h 至晟适p h 酶解。酶解过程中用搅拌器连续搅 拌，并不断加入6 m o l l 氢氧化钠，以维持p h 值的变化在规定的如0 5 的范围内，酶解完成后， 用6 m o l lh c l 调p h 值至4 5 ，并升温至9 0 维持2 0 m i i l ，对酶进行灭活以终止反应，然后迅速 冷却至室温，在4 0 0 侃m i n 卜离心2 0 m i i l ，倒出上清液，记录总体积。 酶解条纠：底物浓度4 0 、p h = l o 5 、酶解温度4 5 、酶浓度4 0 0 0 u 儋、酶解时间6 h 。 2 2 4 血红蛋白多肽液脱色工艺条件的优化 将离心后的上清液j l j 粉末活性炭进行脱色处理，以脱色率、多肽损失率为指标，考察活 性炭川量、p h 值、温度、时间对脱色效果的影响。首先进行单因素实验，再通过止交实验确 定最佳l 艺参数。 2 2 4 1 活性炭用量对脱色效果的影响 将终止反应五 的血红蛋白水解液，在4 0 0 0 r 加m 下离心2 0 m i l l ，收集上清液。墩1 0 0 m l 上清 液，将p h 调至4 o ，分别加入1 0 、1 5 、2 o 、2 5 、3 0 的活性炭，在5 0 的温度f 分别脱色2 o h ，脱色过利中用搅拌器不断搅拌，使活性炭均匀吸附。脱色完成后用真空泵进 行抽滤，得剑脱f 皂= f i 分别取l o m l 脱色液，明蒸馏水定容剑l o o m i ，测 | ；其吸光值利多肽氮 含量，计算出脱也串、多肽损失率。重复ii 次，呶算术平均值。以脱色率、多肷损火警为指 1 2 第2 章血红蛋白多肽的制各 标，探讨活性炭用量对脱色效果的影响。 2 2 4 2p h 值对脱色效果的影响 将终止反应后的血红蛋白水解液，在4 0 0 0 r ，m i n 下离心2 0 m i n ，收集上清液。取1 0 0 m l 上清 液，其p h 分别调节为3 、4 、5 、6 、7 ，加入2 0 的活性炭，在5 0 的温度下分别脱色2 0 h ，脱 色过程中用搅拌器不断搅拌，使活性炭均匀吸附。脱色完成后，用真空泵进行抽滤，得到脱 色液，分别取l o n l l 脱色液，用蒸馏水定容到1 0 0 1 1 1 l ，测得其吸光值和多肽氮含量，计算出脱 色率、多肽损失率。重复三次，取算术平均值。以脱色率、多肽损失率为指标，探讨p h 值对 脱色效果的影响。 2 2 4 3 温度对脱色效果的影响 将终止反应后的血红蛋白水解液，在4 0 0 0 r r i l i i l 下离心2 0 i t l i n ，收集上清液。取1 0 0 i l ：l l 上清 液，加入2 o 的活性炭，p h 为4 o 下，分别在3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 的温度下脱色2 o h ， 脱色过程中用搅拌器不断搅拌，使活性炭均匀吸附。脱色完成后，用真空泵进行抽滤，得到 脱色液，分别取l0 1 1 1 l 脱色液，用蒸馏水定容到1 0 0 n l l ，测得其吸光值和多肽氮含量，计算出 脱色率、多肽损失率。重复三次，取算术平均值。以脱色率、多肽损失率为指标，探讨温度 对脱色效果的影响。 2 2 4 4 时间对脱色效果的影响 将终止反应后的血红蛋白水解液，在4 0 0 0 r r 血下离心2 0 i n i n ，收集上清液。取1 0 0 r i l l 上清 液，加入2 o 的活性炭，在p h 为4 0 、5 0 的温度下分别脱色0 5 h 、1 o h 、1 5 l l 、2 0 h 、2 5 h 。 脱色过程中用搅拌器不断搅拌，使活性炭均匀吸附。脱色完成后，用真空泵进行抽滤，得到 脱色液，分别取1 0 r i l l 脱色液，用蒸馏水定容到l o o m i ，测得其吸光值和多肽氮含量，计算出 脱色率、多肽损失率。重复三次，取算术平均值。以脱色率、多肽损失率为指标，探讨时间 对脱色效果的影响。 2 2 4 5 最佳脱色工艺条件的确定 采用正交试验设计，确定最佳脱色条件。 2 2 5 血红蛋白多肽液的离子交换树脂除盐处理 因为水解过程中，需要不断加入4 m o l l 的n a o h 以维持反虑的p h 值。反应终止时，加入 4 m 0 1 ，l 的h c l 来灭酶，由此会产生较多的盐分，需要进行除盐处理。实验中取1 0 0 0 i l ：l l 脱色后 的多肽液，通过恒流泵进样，在室温下分别通过强酸型阿1 离子交换树脂、弱碱型阴离子交换 树脂进行柱层析脱除盐分。j h 恒流泵调节进样速度，使多肽液的进样速度分别为l b 、仆、2 b v l l 、 3 b v h ，收集流出液，测定多肽和灰分。重复三次，取算术平均值。以多肽损失率和除盐率为 1 3 曲南人硕十学位论文 指标，探讨了血红蛋白多肽液除盐处理的最佳流速。 2 2 6 血红蛋白多肽液超滤条件的优化选择实验 2 2 6 1 操作压力对膜透过速率的影响 在室温条件下，取3 0 0 m l 除盐后的血红蛋白多肽液，用截留分子量为1 0 k d a l 的超滤膜进行 超滤分离，分别在0 0 5 、0 1 0 、0 1 5 、o 2 0 、0 2 5 m p a 五种不同压力下，测定膜的透过速率。重 复三次，取算术平均值。 2 2 6 2 温度对膜透过速率的影响 在操作压力为o 1 5 砌p a 下，取3 0 0 i i l l 除盐后的血红蛋白多肽液，用截留分子量为1 0 l ( d a l 的 超滤膜进行超滤分离，分别在2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0 五种不同温度下，测定膜的透过速率。 重复三次，取算术平均值。 2 2 7 不同分子量段的血红蛋白多肽的分离 在最佳的超滤条件下，将血红蛋白多肽液经相对分子质量为l o k d a l 的超滤膜截留分离，保 留浓缩液；其透过液再经相对分子质量为5 k d a l 的超滤膜截留分离，保留浓缩液；其透过液再 经相