（食品科学专业论文）黄芩诱导型Bax基因工程细胞株的构建.pdf

黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 摘要 高等植物作为一种非常重要的自然资源，不仅可以给人类提供食 品、纤维等原料，而且含有的许多化学成份可作为调味料、着色剂，以 及药物成份等。尽管植物是一种可再生资源，但随着人们需求量的日益 增加以及不合理的开采利用，一些植物资源目前已远远不能满足人类的 需求。由于细胞具有全能性，因此细胞培养技术便为我们获取植物中有 用的次生代谢产物提供了一种可替代方法。经过大量的实验研究，目前 一些植物次生产物如紫草素( s h i k o n i n ) 、黄连素( b e r b e r i n e ) 等已经 能够采用大规模细胞培养技术获取，但是到目前为止可进行产业化应用 的细胞培养产物数量有限。其中一个重要的原因就是培养细胞中目的产 物含量较低，因此提高培养细胞的代谢产物含量已成为决定细胞培养技 术能否实现产业化应用的关键因素。从分子水平上研究探讨提高植物培 养细胞中目的代谢产物含量的技术和理论是目前国内外的研究热点。 b a x 基因是动物细胞凋亡基因b c 一2 家族中的一员，其主要作用是 启动细胞的凋亡进程，触发细胞过敏反应。由于植物细胞中防御性次生 代谢产物增加是细胞过敏反应的典型特征之一，因此我们预测b a x 基因 可以促进植物细胞中次生代谢产物的合成积累。本研究将从 p g il d a b a x 中扩增到的b a xc d n a 克隆置于质粒p e r 8 中雌二醇诱导 型启动子的下游，得到了p e r b a x 。然后在农杆菌e h a l 0 5 的介导下 将b a x 导入到由黄芩幼茎诱导获得的愈伤组织中。在潮霉素含量为 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 2 0 m g l 的培养基上选择培养3 0 天后，获得了转化细胞。经过p c r 及w e s t e r nb l o t t i n g 检测后证明b a x 已经整合到了黄芩染色体基因 组上，并且在诱导剂雌二醇存在的情况下能够稳定表达。随后我们利 用得到的转基因细胞建立了转基因悬浮细胞系。为了观察b a x 基因调 控下黄芩细胞凋亡情况，又分别将转基因黄芩细胞和野生型细胞置于 雌二醇浓度5 0 pm 的培养基上培养3 天后提取d n a ，电泳后观察到了 转基因黄芩细胞d n a 出现梯带降解情况。细胞核形态学观察同时表 明，经雌二醇处理的转基因黄芩悬浮细胞细胞核出现皱缩、细胞膜破 裂等凋亡特征。试验结果证实，小鼠b a x 基因不仅可以在黄芩细胞中 稳定表达并且能够触发黄芩细胞凋亡。本研究获得了稳定的黄芩诱导 型b a x 基因工程细胞系，为进一步研究探讨b a x 基因对黄芩细胞次生 代谢的调控作用及分子机制提供了必不可少的实验材料。有关b a x 基 因对转基因黄芩细胞次生代谢的调控及其分子机制等方面的研究工 作目前正在进行中。 关键词黄芩，次生代谢，b a x 基因，雌二醇，细胞凋亡 i i 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 c o n s t r u c t i o no fi n d u c i b l eb a xt r a n s g e n i c c e l l so fs c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i s g e o r g i a b s t r a c t h i 。g h e rp l a n t s c o n s t i t u t eo n eo fo u rm o s ti m p o r t a n tn a t u r a l r e s o u r c e s ，w h i c hp r o v i d en o to n l yf o o d s t u f f s ，f i b e r s ，a n dw o o d s ，b u t a l s om a n y c h e m i c a l s ，s u c ha sf l a v o r i n g s ，d y e s ，a n dp h a r m a c e u t i c a l s a l t h o u g hp l a n t sa r er e n e w a b l er e s o u r c e s ，s o m es p e c i e s a r eb e c o m i n g m o r ed i f f i c u l tt oo b t a i ni ns u f f i c i e n ta m o u n t st om e e ti n c r e a s i n g d e m a n d s p l a n tc e l lc u l t u r e so f r e rp r o m i s i n ga l t e r n a t i v e sf o rt h e p r o d u c t i o no f t h eu s e f u ls e c o n d a r ym e t a b o l i t e sb e c a u s e t o t i p o t e n c y e n a b l e s p l a n tc e l l st op r o d u c e t h ec h e m i c a l si nv i t r o a f t e re x t e n s i v e e m p i r i c a lt r i a l s ，s o m em e t a b o l i t e s a r en o wb e i n g p r o d u c e db y l a r g e s c a l ec e l lc u l t u r e ，e g s h i k o n i na n db e r b e r i n e ，b u tt h en u m b e r s o fc o m p o u n d st h a ta r e p r o d u c i b l ec o m m e r c i a l l yb y c e l lc u l t u r e t e c h n o l o g y a r es t i l lv e r yf e w o n eo ft h em a i nl i m i t a t i o n si st h ei o w p r o d u c t i v i t yo f t h ed e s i r e d c o m p o u n d s m o l e c u l a re n g i n e e r i n go f s e c o n d a r ym e t a b o l i t e sh a st h ep o t e n t i a lt oi n c r e a s ep r o d u c t i v i t y a n d i m p r o v ep r o d u c tc o m p o s i t i o n a p o p t o s i s ( o rp r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，p c d ) i sas u i c i d e p r o c e d u r er e g u l a t e ds t r i c t l yb yg e n e si np l a n t sa n da n i m a l s i n p l a n t s ，h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n ( h r ) i sa c t i v a t e dd u r i n gp c d ， a n dt h es y s t e mr e s i s t a n c ei so b t a i n e d b y t h ea c t i v a t i o no fs o m e s e c o n dm e t a b o l i cp a t h w a y s ，w h i c hi m p l i e st h a tt h es e c o n d a r y m e t a b o l i t e p r o d u c t i v i t y o fp l a n tc e l l sc o u l db e i r e p r o v e db y t r i g g e r i n gp c d b a xi s a na n i m a lp r o a p o p t o t i cg e n eo fb c l - 2 f a m i l y i nt h i sw o r k ，am o u s e b a xw a si s o l a t e df r o m p g i l d a b a x a n dt h eb a xc d n aw a sc l o n e dd o w n s t r e a mo fa l l e s t r a d i o l i n d u c i b l e p r o m o t e r i n p e r8 w h i c hr e s u l t e di n p e r - b a x p r i m a r yc a l l u s i n d u c e df r o mt h e y o u n g s t e mo fs c u t e l l a r i a 1 1 1 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 b a i c a l e n s i sg e o r g ig r o w i n gi nz h e j i a n gp r o v i n c ew a si n f e c t e d b ya g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n ss t a i ne h a l 0 5c a r r y i n gp e r b a x i n f e c t e dc a l l iw e r es e l e c t e do nt h em e d i u m c o n t a i n i n g h y g r o m y c i n ( 2 0n a g l ) a f t e r 3m o n t h so f s e l e c t i o n ，t h e t r a n s f o r m e dc e l l sw e r eo b t a i n e d p c ra n a l y s i sc o n f i r m e dt h a tt h e b a xg e n eh a sb e e ni n t e g r a t e di n t ot h ec h r o m o s o m a ld n ao ft h e t r a n s g e n i cc e l l s s u s p e n s i o nt r a n s g e n i c c e l ll i n eo fs c u t e l l a r i a b a i c a l e n s i s g e o r g iw a se s t a b l i s h e df r o mt h et r a n s f o r m e dc a l l u s w e s t e r n b l o w i n ga n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tm a m m a l i a nb a xg e n e e x p r e s s i o n w a sh i g h l yi n d u c e db v17 一p e s t r a d i 0 1 e s t r a d i o l i n d u c e db a x g e n ee x p r e s s i o ni nad o s e d e p e n d e n tm a n n e r a f t e r4 8 h 仃e a t m e n tw i t h5 0umo f17 一b e s t r a d i 0 1 n u c l e u s c o n d e n s a t i o na n dd n a1 a d d e rw e r eo b s e r v e d w h i c hi n d i c a t e d t i l a t a p o p t o s i s o c c u r r e di ns c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i s g e o r g i s u s p e n s i o nc e l l s j 殇h s 。o u rr e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h em a m m a l i a n b a xg e n ec o u l df u n c t i o n p r o p e r l y i ns c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i s g e o r g i c e l l s t a k e nt o g e t h e r , i nt h i sw o r k ，a na n i m a lp r o a p o p t o t i cg e n e b a xw a si s o l a t e df o r mp g i l d a - b a x a n dan e wv e c t o rp e r - b a x c o n m i n i n g a l le s t r a d i o li n d u c i b l e p r o m o t e rw a sf o r m e d t h e t r a n s g e n i c b a xc a l l u so fs c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i s g e o r g fw a s o b t a i n e dv i a a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s , a n das t a b l e s u s p e n s i o nt r a n s g e n i cc e l l l i n eo f s c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i sg e o r g i w a se s t a b l i s h e d b a x g e n e f r o mm a m m a l i a nc e l l sc o u l db e e x p r e s s e d a n df u n c t i o n e di ns c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i s g e o r g i s u s p e n s i o nc e i l s t h ee f f e c to f m a m m a l i a nb a xo nt h es e c o n d a r y m e t a b o l i t e b i o s y n t h e s i s o fs c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i s g e o r g i s u s p e n s i o n c e i l si ss t i l lu n d e r i n v e s t i g a t i n g k e y w o r d ss c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i s g e o r g i , s e c o n d a r ym e t a b o l i s m ， b a x ，a p o p t o s i s 黄芩诱导型b a ) 【基因工程细胞株的构建 本研究的意义及目的 我国具有许多种珍贵的药用植物资源，经过几千年的实践证明 这些药用植物中的有效成份在疾病的治疗与防治方面具有重要的作 用。但是由于有些植物天然资源有限，其生长条件又比较苛刻，加 之目前生态环境的破坏使得部分植物资源日益匮乏，药用植物中有 效成份含量较少，而传统的获得有效药用成份的方法需要消耗大量 的天然植物资源，因而使植物次生物质的供需矛盾以及次生物质生 产与天然植物资源可持续发展之间的矛盾日益突出。利用植物细胞 培养技术生产具有重要经济价值的天然植物次生代谢产物为解决中 药可持续发展问题提供了一条新的途径。植物细胞培养的基础是细 胞的“全能性理论”，即每一个植物细胞中都含有整株植物的全套基 因。因此，每一个植物细胞就象一个微型工厂，可以生产出整株植 物所能产生的各种物质。与传统的利用整株植物为原料进行分离提 取获得天然次生代谢产物的方法相比，植物细胞培养技术具有不依 赖和消耗天然植物资源；不受气候、病虫害等不利环境因素的影响； 不占用耕地；可以在人为的控制条件下进行工厂化生产；免除各种 化学及生物污染，产品质量可靠等优点。由于植物细胞培养技术具 有上述独特的优点，因此受到了国内外研究者的广泛重视，被视为 解决植物天然活性物质供需矛盾的一种新型生物技术。在经历了多 年的研究攻关后，植物细胞培养技术已经取得了可喜的进步。例如 在植物细胞培养技术和培养条件的研究方面都已经取得了重大进 1 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 步。然而在经历了多年的研究攻关后，目前能够进行产业化应用的 植物细胞种类为数不多，只有紫草、人参等少数几种细胞培养技术 进入了产业化应用阶段。多年的研究结果表明，制约植物细胞培养 技术产业化应用的主要因素之一是植物培养细胞中目标次生代谢产 物的低产问题。长久以来国内外研究者曾试图通过优化培养条件、 筛选高产细胞株等方法来解决植物细胞次生代谢产物的低产问题【l 】， 然而大量的试验研究结果表明，通过上述途径无法从根本上解决植 物细胞的低产问题。最近几年，随着基因工程等现代生物技术的发 展，人们试图利用分子调控手段来干预植物细胞的次生代谢，如采 用关键酶基因调控技术、转录因子调控技术等从分子水平上解决植 物细胞次生代谢产物的低产问题。目前该领域研究非常活跃，并已 经成为现代生物技术领域中的一个研究热点。但是由于植物细胞次 生代谢途径十分复杂，并且在细胞内还存在着反馈抑制等调节机制， 使得上述技术在离体植物细胞中的应用受到了很大限制。因此，从 分子水平上研究探讨植物细胞次生代谢的新型调控技术具有重要的 理论和实践意义。 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 是普遍存在于动植物中的一种受凋亡基 因调控的主动死亡方式。在对植物细胞凋亡的研究中，发现存在一 种特殊的过敏反应( h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n ，h r ) 现象，其特征 之一是细胞中的防御性次生代谢系统被激活，从而使防御性次生代 谢产物，如植物抗毒素( p h y t o a l e x i n ) 的合成加强2 【3 1 。由于黄芩素 等具有重要药用价值的次生代谢物本身就是植物细胞中的防御性次 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 生代谢产物，而凋亡基因可以触发细胞的过敏反应，因此我们预测 凋亡基因可以作为一种调控基因，激活黄芩细胞中防御性次生代谢 途径，促进黄芩素等药用成份的合成。然而目前利用凋亡基因对植 物细胞中次生物质合成进行调控的研究进展很慢，尚未见到有关利 用凋亡基因促进植物细胞中次生物质含量的研究报道。造成这一现 象的主要原因是目前尚未从药用植物细胞中克隆到合适的细胞凋亡 基因，使相关的研究工作无法深入进行。 近年来，动物细胞凋亡的研究进展很快，目前已经从动物细胞中 克隆到了一系列凋亡促进基因和凋亡抑制基因。 b a x ( b c l 一2 一a s s o c i a t e dxp r o t e i n ) 基因是动物细胞凋亡基因b c l 一2 家族中的一员，其主要作用是启动细胞的凋亡进程，触发细胞过敏反 应。本研究计划将动物细胞b a x 基因导入到黄芩细胞中，通过控制其 表达来激活黄芩细胞中防御性次生代谢途径，以期促进黄芩素药用成 份的合成。考虑到凋亡基因的组成型表达可能影响植物细胞的早期生 长，因此我们计划将b a x 基因构建成诱导型表达载体。希望通过对b a x 基因的表达进行精密调控减少凋亡基因对细胞生长的不利影响，同时 也为研究b a x 基因对黄芩细胞次生代谢的调控及其分子机制提供方 便。 本实验的主要内容包括： 一、黄芩愈伤组织诱导与培养 二、p e r b a x 表达载体的构建 三、黄芩愈伤组织的遗传转化及转化细胞的筛选、分子检测 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 四、转基因黄芩悬浮细胞系的建立 五、b a x 基因诱导表达诱发黄芩细胞凋亡情况的研究 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 第一章引言 第一节植物代谢的分子调控研究进展 在植物细胞次生代谢分子调控研究领域中，目前主要有两种基本策略 一、关键酶基因调控技术 将次生代谢途径中的关键酶基因克隆，重组后导入到植物细胞中，通过提 高次生代谢途径中关键酶的数量和活性，增加代谢强度，提高次生代谢物质的 产量 4 】。这一策略的基本特点是对整条代谢途径中的个别限速步骤进行局部调 控，使用这一策略虽然对提高细胞中次生代谢物质的产量有一定的效果，但也 存在许多不足：( 1 ) 由于植物细胞中次生代谢反应步骤较多，不同的代谢途径 之间相互交叉形成复杂的次生代谢网络，因此仅仅依靠增加代谢途径中一两个 功能基因的表达水平往往对产物的代谢流量增加作用效果有限【5 【6 1 。虽然可以通 过反义核酸等技术将一些不需要的分支途径切断，但是由于植物细胞内部存在 着反馈抑制等多种生化调节机制，因此细胞中的次生产物，尤其是对细胞具有 一定毒性的防御性次生代谢产物的含量难以显著提高。而且关键酶基因工程调 控技术只对细胞中代谢途径的个别反应步骤进行调控，难以从根本上解决培养 细胞中次生代谢产物含量低的问题；( 2 ) 利用这一策略对植物细胞中次生代谢 物质的合成进行调控的前提条件是要已经清楚掌握次生物质合成的代谢途径。 然而目前对许多药用植物次生物质的代谢途径尚不完全清楚，因而对这一类代 谢途径关键酶基因克隆的难度十分大。 二、利用转录因子基因对植物细胞代谢途径进行调控 转录因子是能够调节生物体内多个功能基因表达水平的一类调控基因【2 】。 虽然转录因子基因的编码产物不是代谢途径中的某一具体的酶，但它能够提高 整条代谢途径中所有酶蛋白基因的表达水平，因此对产物代谢流量的增加作用 效果非常显著，被认为是植物次生代谢的一种新的分子调控策略【3 】。然而以转 录因子基因作为调控基因对植物细胞的次生代谢进行调控也存在着一些不足之 处。例如，转录因子基因的作用比较单一，不同植物次生代谢产物的合成往往 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 需要不同的转录因子基因进行调控，而且通常情况下往往需要两种或两种以上 不同的转录因子基因共同作用才能有效提高代谢流量。并且尚未发现能够促进 黄芩细胞中有效成份合成的转录因子，因而制约了该项技术在黄芩细胞代谢工 程中的应用。因此，研究对黄芩细胞有效成份合成具有促进作用的新型调控基 因，具有重要的理论和实践意义。 三、利用凋亡基因从分子水平上触发植物细胞的过敏反应( h r ) 促进次生物质的合成 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 是普遍存在于动植物中的一种受基因调控的主动死亡方 式在对植物细胞凋亡的研究中，发现存在一种特殊的过敏反应( h y p e r s e n s i t i v e r e a c t i o n ，h r ) 现象，其特征之一是细胞中的防御性次生代谢系统被激活，从而使 防御性次生代谢产物，如植物抗毒素c p l l y t o a l e x i n ) 的合成加强【2 】【3 1 。而凋亡基因可 以触发细胞的过敏反应( h r ) ，因此我们预测凋亡基因可以作为一种调控基因， 激活黄芩细胞中防御性次生代谢途径，促进此黄芩素等的合成。目前，国内外尚 未见到利用凋亡基因对植物细胞的次生代谢进行调控，促进次生物质产量的研究 报道，因此，本项研究具有一定的创新性。 第二节植物细胞凋亡研究进展 植物细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 又称程序性细胞死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ， p c d ) 是一种生理性的细胞死亡过程，在植物发育或与环境的相互作用过程中植 物体的一些已完成使命或不需要的细胞被选择性的消除过程1 7 】【8 】。p c d 在细胞和 组织的内环境稳定、功能的专一性，组织成形，以及疾病方面发挥着重要的作 用。在植物中，p c d 对于植物组织及器官功能的发挥，以及营养的有效分配和 再生，抵御不良环境或病原微生物的入侵方面起着重要作用。大多数高等生物 发育过程中的p c d 依赖于胞质变动、生长因子或者激素的作用【9 】，其中有许多的 信号转导途径参与。 一、植物细胞凋亡过程中的特点 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 植物细胞凋亡过程中有许多典型性的特征，包括m 】- 【”】：( 1 ) 核d n a 的降 解，某些特异的d n a 降解酶的活性增高及活化，d n a 电泳出现梯带形结果；是 否有d n a 梯带的出现是评价细胞是否有凋亡产生的一个重要标准；( 2 ) 细胞皱 缩，细胞质凝集，细胞骨架紊乱，内质网起泡，并与细胞膜融合；( 3 ) 出现离子 渗漏；( 4 ) 细胞壁得到修饰；( 5 ) 凋亡启动过程中有新蛋白质的合成，凋亡进 行过程中蛋白质的降解；( 6 ) 存在细胞凋亡的负调控基因；( 7 ) 出现37 o l i 端t u n e l 阳性，( 即末端脱氧核苷酸转移酶介导的d u t p 切口末端标记阳性) ；( 8 ) 出现超敏反应( h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n ，h r ) ，合成某些抗菌化合物；系统 抗病体系得到活化。 二、植物细胞凋亡的种类 ( 一) 、植物发育过程中的细胞凋亡 凋亡常常发生在衰老的叶片和花瓣中、以及萌发的种子组织( 如胚柄、糊 粉层) 中、一些雌雄异株的原始生殖器官中、根冠中，正在形成通气组织的皮 层中。 1 、根冠细胞的程序化死亡 根冠细胞形成于分裂时的原始细胞，由许多的胞薄壁组织构成，并不断地 被新的细胞所替代，向根末梢扩展【1 5 】【1 6 】。根冠细胞在种子萌发和幼苗的成长过 程中保护着根尖的分裂增殖，在其生长过程中会有大量的根冠细胞死亡。w a n g 等1 7 墚用t u n e l 分析和h o e c h s t3 3 3 4 2 对洋葱根冠细胞研究后发现，在其发育 过程中大量死亡的根冠细胞呈t u n e l 阳性，且其核d n a 出现皱缩、不规则现象。 这说明在根冠细胞的大量死亡过程中p c d 参与其中。c o n c e t t a 掣”1 在玉米根冠 细胞的发育过程中检测到了d n al a d d e r ，且t u n e i 。检测呈阳性，说明在玉米根 冠细胞的发育过程中存在p c d 。 2 、维管组织( tr a c h e a r ye ie m e n t s ，t e s ) 细胞的程序化死亡 维管束细胞是维管植物( 如芦苇、莲藕等) 木质部独特的细胞组成，它由 一系列圆形、螺旋形、凹陷形的具有较厚细胞壁的细胞构成。维管植物的木质 部专门用于维生素与水分传输，韧皮部则负责传输养分，如糖类。木质部因其 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 木质成分的坚韧，从而给维管植物提供机械支持。此外t e s 经离体培养可形成 多种细胞，如韧皮软组织细胞、根部皮层细胞、枝条的木髓细胞、块茎的薄壁 组织细胞、叶肉或叶的表皮细胞等，当t e s 细胞成熟后其细胞核与细胞内容物 会失去形成空的死细胞，这些空的死细胞组成其它器官或者管胞【l9 1 。有证据表 明t e s 细胞分化成熟的最后阶段呈现典型的程序性细胞死亡特征。k e i s u k e o b a r a 等【2 0 】用激光共聚焦( c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s o p y ) 显微镜观察 到了经染色后的百日草( z i n n i a ) t e s 细胞死亡并形成维管组织的整个过程， 该过程中其细胞核凝聚、浓缩，并逐渐降解，呈现出了典型的p c d 特征。 3 、胚细胞胎( s o m a t i ce m b r y o g e n e s is ) 发生过程中的细胞凋亡 一些植物品种的细胞培养物可以诱导生成胚细胞胎，由于其具有可再生为 整抹植株的能力因此常常作为基因枪转化植物细胞时的材料【2 ”。在其悬浮培养 物中，这些全能细胞分裂成成对细胞，在每对细胞中，一个停止合成d n a 而死 亡，另一个则形成胚；在一些死去的细胞中，细胞质形成一些小的被膜包裹的 颗粒，这表明其死亡过程可能有p c d 过程的参与2 2 1 。此外m c c a b e 等【2 3 】发现在 这些细胞中出现了d n a 37 0 h 积聚现象，这表明了这些细胞的死亡具有p c d 特 征。l a d a 掣“】通过对挪威云杉胚胎细胞发育过程研究后发现，该过程包括两个 阶段，第一个阶段是前胚细胞的增生阶段( p r o l i f e r a t i n gp r o e m b r y o g e n n i c m a s s e s ，p e m s ) ，第二阶段为胚细胞发育完成阶段( e n c o m p a s s e sd e v e l o p m e n t o f s o m a t i ce m b r y o s ) ；在从p e m s 阶段向第二阶段的过渡过程中，以及胚细胞的成 形过程中呈现出了典型的p c d 特征，且在p e m s 阶段以及胚细胞的成形过程中的 程序性细胞死亡彼此间是耦合的，它们都涉及到植物生长素和分裂素的消耗。 4 、衰老( s e n e s c e n c e ) 过程中的程序化细胞死亡 衰老是植物某些器官生长、发育过程的最后阶段，伴随着营养成份的再分 配，衰老阶段的出现标志着碳和氮营养元素由同化分解向异化分解的转变；同 时衰老是受基因调控的，在特定器官中到一定阶段“衰老基因”开始启动、表达； 衰老也需要许多内、外信号的传导，和一些蛋白的合成，这一过程受到植物体 自身严格的调节【2 5 】 2 6 】。这方面的研究主要集中在对一些植物品种的叶片或花瓣 衰老情况的研究，jc a o 掣2 7 1 对e u c o m m i au l m o i d e s o li v 四月至十一月的叶片 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 研究后发现这一时期内：( 1 ) 叶肉细胞细胞核从九月到十一月逐渐降解；( 2 ) 从八月份开始细胞核t u n e l 检测阳性；( 3 ) 九月到十月出现d n al a d d e r 现象； ( 4 ) 产生c a ”依赖型的d n a s e 。这说明程序性细胞死亡与叶片的自然衰老过程 是同步的。y a nx u 掣2 8 】研究了矮牵牛花花瓣细胞衰老时的蛋白质情况、r n a 表 达水平、r n a s e 活性以及膜的完整性后发现，在花瓣的衰老过程中出现了如d n a 片段化等程序性死亡特征。s i m o n 等【2 9 】研究了花椰菜花瓣和拟楠芥叶片采摘后 和自然衰老过程，花椰菜花瓣在采摘后4 8 h 出现d n al a d d e r 。拟楠芥叶片采摘 后和自然衰老过程中t u n e l 检测均为阳性，且也伴随有d n al a d d e r 。有一些研 究人员已经克隆到了与衰老有关的基因，分离到参与其中的蛋白质，目前对动 物的衰老研究的比较深入，对植物的衰老研究也日渐深入。 ( 二) 、与环境相互作用过程中的凋亡 1 、环境中低氧( h y p o x i a ) 导致的凋亡 高等植物是需氧有机体，在缺氧或氧的浓度过低时会出现死亡，在受到这种 胁迫时植物体常常会形成通气组织。在玉米根部细胞中，低氧会造成程序性死 亡，此外低氧这种环境胁迫会刺激细胞中乙烯的累积，而乙烯的积累又会激活 磷酸肌醇和c d + 参与的信号转导过程3 0 1 ，并最终导致通气组织的形成【3 l 】。 2 、植物一病原体相互作用过程中的凋亡 本世纪5 0 年代由f l o r 所提出的“基因对基因学说”( g e n e f o r g e n e t h e o r y ) 也阐明了植物抗病原侵染的遗传学特点。该学说认为对应于寄主方面的 每一个决定抗病性的基因，病原物方面也存在一个决定致病性的基因。反之， 对应于病原物方面的每一个决定致病性的基因，寄主方面也存在一个决定抗病 性的基因。任何一方的有关基因都只有在另一方相对应的基因作用下才能被鉴 别出来。 植物在受到病原体进攻时会出现超敏反应，产生防御反应生成一些防御性 的次生代谢产物。在出现超敏反应后，相关部位细胞能够识别病原体的进攻， 并迅速启动凋亡程序，在受到病原体进攻的部位形成一个坏死区域以阻止病原 体的迸一步扩散和增殖【3 2 】。这一过程是在r 基因( r e s i s t a n c eg e n e s ) 的调控 9 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 下进行的，r 基因编码产物r 蛋白能够特异性地识别病原体a v r 基因编码产物， 同时它也作为一种信号传导物质激发下游防御反应的启动 3 3 1 。 目前烟草已经成为人们研究超敏反应的一种模式植物， rm i t t l e r 等 3 4 通过研究烟草花叶病毒感染后的材料后发现，在超敏反应过程中烟草细胞胞质 浓缩，d n a 断裂成5 0 k b 的片段，呈现出了典型的p c d 特征；进一步研究后人们 发现在烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 中含有n 基因，n 基因编码产物是一种胞内 蛋白，该蛋白含有n 末端核苷酸结合区域莉e 末端亮氨酸重复区域 3 5 】_ 3 7 】，将该 基因导入其它品系的烟草后使得受体植株具有了抵抗大多数烟草花叶病毒毒株 的能力，相比之下，缺少该基因的n i c o t i a n at a b a c u m 品系中烟草花叶病毒出 现扩散。这说明烟草细胞的超敏反应是受到基因调控的，当然在h r 诱导的凋亡 过程中有许多的信号转导途径被激活。 并不是只有在受到病原体进攻时植物才会有h r 反应的症状出现， c h r i s t o p h e 等【3 9 】将哺乳动物b a x 基因导入烟草细胞后也观察到了类似超敏反应 的症状，这也说明植物细胞凋亡与动物细胞凋亡可能存在一些相似的调节机制。 三、植物细胞凋亡的机制 尽管已经有充分的证据表明在植物发育和与环境的相互作用过程中存在 着凋亡，但凋亡过程是怎样进行的，其信号转导情况如何等等目前仍不是很清 楚。 越来越多的研究证明，活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 在病原 体诱导的的细胞凋亡过程中起着重要作用，如0 2 一和h ：0 。就是超敏反应过程中细 胞凋亡的主要介导因素，这在拟南芥、大豆、烟草中都得到了证实。拟南芥i s d l 突变体表现为植株对死亡细胞的调控能力弱，一旦细胞死亡就无法控制死亡扩 散，其过氧化物的积累与病斑形成密切相关。然而，某些植物具有解除0 。一和h 2 0 。 毒性的机制，使之能够抑制细胞凋亡。细胞质抗坏血酸过氧化物酶( c a p x ) 是解除 h 2 0 。毒性的关键酶，在病毒诱导烟草细胞凋亡的实验中发现，c a p x 的表达在翻译 过程中受到抑制，因此细胞去除也o 。的能力降低，h 。o 。积累引起细胞凋亡【舯1 。h 。o 。 在莴苣叶片t e s 中累积，当豌豆叶片衰老时h 2 0 。及0 。一也会出现累积现象，h ：0 2 及o 。一合成酶水平也得到提高h 1 】【4 2 】，因此r o s 在凋亡启动过程中可能起着重要作 用。在r o s 对p c d 的调控过程中n 0 作为一种重要的信号转导分子【4 3 1 与其协同作 黄芩诱导型b a x 基因工程细胞株的构建 用共同诱使细胞凋亡，m a r i ac o n c e t t ad ep i n t o 等1 研究后发现当n o 浓度提 高后并不能导致植物次生代谢关键酶一苯丙氨酸解氨酶( p a l 酶) 活性的提高， 也不能诱导细胞的凋亡，而诱使抗坏血酸盐( a s c o r b a t e ，a s c ) 和谷胱苷肽 ( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 代谢略有改变：而当提高r o s 含量后会诱使a s c 、g s h 发 生氧化还原反应，但在较低浓度下仍不能影响p a l 酶活性且不能诱使细胞凋亡； 当二者含量同时提高后却能够使细胞发生程序性死亡，并能提高p a l 酶活性激 活植物的次生防御系统。这说明r o s 和n 0 的协同作用使细胞的抗氧化能力降低， 且有可能n o 只是作为其中的一个信号转导因素，而并未直接参与诱导p c d 发生， a s c 、g s h 是否参与了p c d 的信号转导还有待研究。但是在向拟楠芥悬浮培养 物中添加n o 供体提高n o 浓度后诱使细胞发生了程序性死亡，而不依赖于r o s ， 同时鸟苷酸环化酶( g u a n y l a t ec y c l a s e ) 催化产物c g m p 也是p c d 的必须条件1 4 5 1 ， r o s 如h 2 0 。能够诱使拟楠芥悬浮培养细胞凋亡【4 6 。这些事实说明在有些情况下 r o s 的作用结果是与n 0 协同作用产生的，但r o s 和n o 的合成水平与含量在一 定情况下影响着各自功能的发挥。在r o s 诱发凋亡的机制中一系列特异性的r o s 清除酶如超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 、抗坏血酸过氧化物酶 ( a s c o r b a t ep e r o x i d a s e ，a p x ) 以及过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 也影响着p c d 过程中的信号转导，如在玉米中c a t 的合成水平影响着细胞对冷逆境的敏感程 度，c a t l ，c a t 2 ，c a t 3 在烟草属植物中的不同器官、不同情况下各自发挥着作用 【4 7 】 4 8 l 。 乙烯在高等植物叶、花的衰老、果实成熟等过程中起着重要调控作用。最 近的研究显示，乙烯在植物p c d 中也起重要作用。在烟草细胞中当乙烯合成酶 ( 卜a m i n o c y c l o p r o p a n e 一卜c a r b o x y l i ca c i d 氧化酶) 失活后烟草叶片细胞衰 老会延迟，当用乙烯拮抗物硫代硫酸银处理马铃薯悬浮细胞后也能够阻断喜树 碱诱导的细胞凋亡【4 9 】；在野生型番茄中h 5 2 基因能够抑制因病原感染而造成的 p c d 扩散，而当利用反义失活技术抑制h 5 2 基因以后，番茄叶片细胞中会呈现 自发不受控制的死亡现象，h 5 2 基因表达的细胞中乙烯和水杨酸会过量积聚， 且病原菌再生减缓 50 1 。而乙烯能够引起c a 2 + 的积聚并能改变蛋白质磷酸化的作 用形式【5 ”，因此乙烯诱导的c a “的再分配可能是植物p c d 激活的一种机制。但 是当用乙烯拈抗物2 ，5 一降冰片二烯处理对乙烯不敏感的拟楠芥和烟草后仍能 黄芩诱导型b a n 基闲工程细胞株的构建 够激活其防御性反应，并发生p c d 5 2 1 ，这又说明乙烯可能也参与了其它p c d 信 号转导途径。 四、动、植物细胞凋亡的比较 目前对动物细胞的凋亡机制研究的较植物细胞凋亡深入，二者在凋亡的特 点如核d n a 的降解，出现d n al a d d e r ，凋亡的机制等方面存在着许多的共性。 人们已经从哺乳动物中分离到了与凋亡相关的一系列基因。g a l l o i s 等f 5 3 从拟南芥中克隆到了2 个与动物d a d l ( d e f e n d e ra g a i n s ta p o p t o t i cd e a t h l ) 和b i l ( b a x i n h i b i t o r 一1 ) 蛋白结构和功能非常相似的p c d 抑制蛋白编码基因。 拟南芥d a d l 能抑制仓鼠t s b n 7 突变体细胞的凋亡，植物d a d l 相似蛋白也同样 能达到这一效果。经s o u t h e r n 、n o r t h e r n 杂交检测及基因组信息分析表明 a t d a d l 是拟南芥所特有的，同时序列分析显示该基因与脊椎动物的d a d l 的同 源性为4 9 ，与线虫( c e l e g a n s ) 的同源性为4 6 ，而该线虫基因与人类相关基因 的同源性为6 1 ，且它们具有相似的二级结构。这说明高等植物与动物细胞凋亡 存在一定的保守性。h r a v i n d 等研究发现部分动物和植物的p c d 相关蛋白含有 多个保守的结构域( d o m a i n s ) ，如t n f r 、a pa t p a s e 、c d k ( 依赖细胞周期蛋白的 激酶) 、c k i ( c d k 抑制子) 和c a p a s e ( 一种半胱氨酸蛋白酶) 5 4 1 。杨征等利用 s o u t h e r n 杂交确证了玉米和水稻中均含有动物中抑制细胞凋亡的重要基因r a s 的同源序列【5 “。将动物凋亡抑制基因b c l x l 和c e d 一9 导入烟草细胞，两基因过 量表达后能明显提高转基因植株的抗盐、抗冻等抗逆境能力，如转基因植株后 代光照培养时能够在0 2mn a c l 或1 0 t 的低温条件下存活，而野生型植株却 不能，此外转基因烟草叶片具有更强的芽再生能力，在主干末端能够生出强壮 的根【“1 。c h r i s t o p h e 等p 9 1 将动物细胞凋亡相关基因b a x 在t m v 病毒载体携带下 导入烟草中，当它在烟草中表