（食品科学专业论文）寄生霉菌的微波效应研究.pdf

霉菌的微波效应研究 摘要 我国大米因霉变引起的损失每年约1 0 0 万吨左右。虽然化学药剂熏蒸和低温、 气调保藏等可以缓解大米霉变，但具有食品安全、污染环境或成本高、效果差等缺 陷。微波防霉具有高效、安全、环保等特点，虽然高强度微波有较好的防霉效果， 但对大米品质影响较大；低强度密度微波能较好的保持大米品质，但作用机理目前 还不清楚。本研究以大米中分离的寄生曲霉为研究对象，采用对大米品质影响不大 的低能量密度微波( 2 4 w g ) 处理霉菌，并以热传导( 水浴) 的加热方式作对照， 研究微波对霉菌致死和残茵特性、霉菌关键酶的分子结构和活性的影响，探讨霉菌 的微波效应，为大米的防霉提供相关技术参数。主要研究结论如下： 1 大米霉菌的分离鉴定。对大米中的霉菌进行分离鉴定，得到黄曲霉 ( a s p e r g i l l u sf l a v u s ) ，产黄青霉( p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m ) ，寄生曲霉( a s p e r g i l l u s p a r a s i t i c u s ) 3 种主要霉菌，其中以寄生曲霉检出率最高。 2 微波对霉菌致死和残菌特性的影响。微波和水浴处理均能降低霉菌的残余菌 数，减缓霉菌的生长速率。微波对霉菌的半致死温度( 5 0 5 5 ) 和致死温度( 7 5 ) 均低于水浴( 半致死温度6 0 6 5 ；致死温度 9 0 ) 。微波对霉菌的抑制效果优于 水浴。 3 霉菌的微波效应。微波和水浴处理均导致胞内核酸渗透率、蛋白质渗透率、 电解质渗透率、c a 2 + 渗透率增大，霉菌菌丝表面出现粗糙和肿胀，脱氢酶活先升高 后降低，d n a 条带亮度减弱。微波对霉菌细胞膜渗透率、脱氢酶活和d n a 损伤的 影响均大于水浴，且随微波处理时间的延长，细胞的损伤程度增大。 4 微波对过氧化氢酶和乳酸脱氢酶结构和活性的影响。微波和水浴处理均能导 致过氧化氢酶和乳酸脱氢酶的a 螺旋和d 折叠向d 转角和无规卷曲结构转化；过氧 化氢酶活和乳酸脱氢酶性巯基含量增加，疏水性增加；酶活降低。热处理对乳酸脱 氢酶的影响大于过氧化氢酶，微波对二种酶的影响大于水浴。微波处理时间对无规 卷曲影响较小，但过长的微波处理时间，会导致疏水性和活性巯基含量上升。 5 微波防霉机理。微波通过降解d n a 分子，改变d n a 和关键酶的高级结构， 破坏细胞膜，增加其通透性，从而干扰或破坏细胞的正常新陈代谢功能，导致霉菌 死亡，残菌生长速率降低。 其中，残菌生长速度减缓与霉菌的电解质增大有密切关系，而死亡与电解质渗 透率、c a 离子渗透率、蛋白质渗透率和d n a 渗透率增加有密切关系。 关键词：霉菌：微波；生长特性；细胞膜通透性；d n a ；生物大分子：灭菌机理 2 0 0 9 届硕士学位论文 a b s t r a c t r i c ei so n eo ft h em a i nf o o dc r o p si nc h i n a , w i t ha l la v e r a g ea n n u a lp r o d u c t i o no f 1 8 2 0m i l l i o nt o n s h o w e v e r , m i l l i o n so fr i c ew a sd a m a g e db yp e s to rm i l d e wd u r i n g s t o r a g e a l t h o u g hc h e m i c a lf u m i g a t i o n a n dc o n v e n t i o n a lm e t h o d ss u c ha sl o w t e m p e r a t u r ea n dc o n t r o l l e da t m o s p h e r ec o u l da c h i e v ec e r t a i ne f f e c t ，t h e yc o u l d r e s u l ti n s o m ee n v i r o n m e n t a lp r o b l e m s ，i n s e c tr e s i s t a n c ea n ds oo n i no r d e rt or e s o l v et h i s p r o b l e m ，a l le f f i c i e n t ，s a f e t y , e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o nm e t h o dw a sr e q u i r e d m i c r o w a v e t r e a t m e n ts h o w sc o n s i d e r a b l ep o t e n t i a lf o rk i l l i n gi n s e c ta n dp r e v e n t i n gm i l d e wi n f o o d t h ec u r r e n ts t u d ys h o w e dt h a tt h em i c r o w a v ew i t hh i g h e n e r g yd e n s i t yc o u l dk i l lm o u l d a n dp e s te f f e c t i v e l y h o w e v e rt h ee f f e c t so fl o we n e r g yd e n s i t ym i c r o w a v eo nm o u l dw a s l i m i t e d i nt h i ss t u d y ，a s p e r g i l l u sp a r a s i t i c u sw e r ei s o l a t e df r o mt h er i c e s u b s e q u e n t l y t h ee f f e c t so fl o w - e n e r g yd e n s i t ym i c r o w a v eo nt h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c s ，c e l l p e r m e a b i l i t y ，d n ao ft h ef u n g u sw e r ei n v e s t i g a t e d t h ee f f e c t so fm i c r o w a v eo nt h e a c t i v i t y a n ds t r u c t u r eo fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e ss u c h a sc a t a l a s ea n dl a c t a t e d e h y d r o g e n a s ew e r es t u d i e d t h ea i mw a st op r o v i d eo p t i m a lp r o c e s s i n gp a r a m e t e r sf o r t h ei n d u s t r i a la p p l i c a t i o no fm i c r o w a v e s t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fr i c em o l d t h r e em o u l d s ，f r o mr i c ep r o c e s s i n ga n d s t o r a g e ，s u c ha sa s p e r g i l l u sf l a v u s , p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m , a s p e r g i l l u sp a r a s i t i cw e r e p r e l i m i n a r ye v a l u a t e db ys h a p ea n dm i c r o s c o p i co b s e r v i n g ，i nw h i c h t h eh i g h e s td e t e c t i o n r a t ew a sa s p e r g i l l u sp a r a s i t i c 2 t h ee f f e c to fm i c r o w a v eo ng r o w t hc h a r a c t e r i s t i c so fm o u l d sw a ss t u d i e d w i t h l o w e n e r g yd e n s i t y m i c r o w a v et r e a t m e n ta n dw a t e r - b a t hh e a t i n g ，r e s i d u a lm o u l d s d e c r e a s e da n dt h eg r o w t hr a t e s s l o w e dd o w n a tt h es a m et i m e ，t h es e m i l e t h a l t e m p e r a t u r e ( 5 0 5 5 ) a n dl e t h a lt e m p e r a t u r e ( 7 5 ) o fm o u l dw i t hm i c r o w a v e t r e a t m e n tw e r el o w e rt h a nt h o s eo ft h ew a t e r - b a t hh e a t i n g ( s e m i l e t h a lt e m p e r a t u r e6 0 6 5 ：l e t h a lt e m p e r a t u r e 9 0 ) t h ei n h i b i t o r ye f f e c t sw i t hm i c r o w a v et r e a t m e n tw a s b e t t e rt h a nw a t e r - b a t hh e a t i n g 3 t h ee f f e c t so fm i c r o w a v eo nm o u l d w i t ht h el o w e n e r g yd e n s i t ym i c r o w a v e t r e a t m e n ta n dw a t e r - b a t hh e a t i n g ，t h en u c l e i ca c i dp e r m e a b i l i t y , p r o t e i np e r m e a b i l i t y , c o n d u c t i v i t y , a s w e l la s t h ec a 2 + p e r m e a b i l i t yi n c r e a s e d ，a n dt h es u r f a c e so fm o u l d b e c a m er o u g h m e a n w h i l es w e l l i n ga p p e a r e d d e h y d r o g e n a s ea c t i v i t yi n c r e a s e df o l l o w e d b yd e c r e a s e a n dt h eb r i g h t n e s so fd n a b a n d sd e c r e a s e d t h ee f f e c t st ot h em o u l dc e l l w i t hm i c r o w a v ew e r em o r eo b v i o u st h a nw a t e r - b a t hh e a t i n g t h ec e l ld a m a g e si n c r e a s e d i i 霉菌的微波效应研究 、衍t he x t e n d i n gm i c r o w a v ep r o c e s s i n gt i m e 4 t h ee f f e c to fm i c r o w a v eo nh y d r o g e np e r o x i d ea n dl a c t a t ed e h y d r o g e n a s e s t r u c t u r ea n da c t i v i t y w i t ht h el o w - e n e r g yd e n s i t ym i c r o w a v et r e a t m e n ta n dw a t e r - b a t h h e a t i n g ，t h ea - h e l i xa n d1 3 - s h e e to fc a t a l a s ea n dl a c t a t ed e h y d r o g e n a s et u r n e di n t op - t u r n a n dr a n d o mc o i l a d d i t i o n a l l y s hr a t i oa n dh y d r o p h o b i ci n d e xo fc a t a l a s ea n dl a c t a t e d e h y d r o g e n a s ei n c r e a s e d ，a n dt h ea c t i v i t yg r a d u a l l yd e c l i n e d 1 1 1 ee 毹c t so fm i c r o w a v e o np r o t e i ns t r u c t u r e sw e r eg r e a t e rt h a nt h ew a t e r - b a t hh e a t i n ga n dt h e r ew e i - en o s i g n i f i c a n te f f e c t so nt h es - t u r na n dr a n d o mc o i l 5 m e c h a n i s mo fm i c r o w a v et r e a t m e n to nm o l d m i c r o w a v et r e a t m e n t sc a u s e dd n a d e g r a d a t i o na n dd a m a g e dt h e s t r u c t u r e so fd n aa n de n z y m e s ，a n di n c r e a s e dt h e p e r m e a b i l i t yo fc e l lm e m b r a n e s 1 1 1 en o r m a lm e t a b o l i cf u n c t i o n so fc e l l sw e r ed i s r u p t e d ， l e a d i n gt of u n g a ld e a t h m e a n w h i l e ，t h eg r o w t hr a t eo fr e s i d u a lb a c t e r i ar e d u c e d n e g r o w t h so fr e s i d u a lb a c t e r i aa r ec l o s e l yr e l a t e dt ot h ec o n d u c t i v i t yi n c r e a s e d ， w h i l et h ec o n d u c t i v i t y , c 一十p e 肌e a b i l i 吼p m t e i np e n e t r a t i o na n dp e n e t r a t i o nr a t eo fd n a w e r ec l o s e l yr e l a t e dt ot l l ed e a t hr a t e k e y w o r d s ：m o u l d ；m i c r o w a v e ；g r o w t hc h a r a c t e r i s t i c s ；m e m b r a n ep e r m e a b i l i t y ；d n a ； b i o m a c r o m o l e c u l e ；s t e r i l i z i n gm e c h a n i s m i i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：胡里时间：2 0 。7 年多月j7 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密，商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：胡翌 导师签名：趣婆嘲 签名帆砂。7 年乡月j ，7 日 签名日期叫年g 月9 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 霉菌的微波效应研究 l 刖吾 大米是我国种植面积最广、产量最大、消费人群最多的粮食品种，年均产量为 1 8 2 0 亿吨( 王静美，2 0 0 0 1 李思恒，2 0 0 1 ) 。长江中下游地区是我国大米的主产区， 其中湖南、湖北、江西、安徽等省的大米产量在当地粮食总产量中所占的比例分别 高达8 9 、6 9 、9 2 和4 6 ，这一地区每年夏季和秋季都特别适合霉菌生长和繁 殖。资料表明，每年我国大米因虫害造成的损失约占总产量的5 ，因霉变造成的损 失约占总产量的2 。因此大米安全储藏问题一直是国内外研究的重要课题，是我国 目前需要迫切解决的问题之一。 1 1 大米中的微生物及常用的防霉方法 1 1 1 大米中的微生物 几十年来，国内外研究者系统地研究了大米的储藏问题( 王鸣岐和文永昌，1 9 6 5 ； 殷蔚申等，1 9 8 1 、1 9 8 3 ) 。研究表明，真菌是粮食中的主要微生物，按其来源分为田 间真菌和储藏真菌。田间真菌在储藏过程中由于环境条件的剧烈变化，大都很快死 亡，一般不会对大米品质造成危害。影响大米品质的主要是储藏真菌，包括构巢曲 霉、紫青霉、青霉、局限曲霉、灰绿曲霉、白曲霉、黄曲霉等。储藏真菌常寄生在 谷壳或皮层上，当粮食水分超过1 4 时，局限曲霉和灰绿曲霉首先开始生长，并从 颖隙、胚部及损伤部位入侵糙米，并迅速扩展到整个谷粒，为黄曲霉和白曲霉等霉 菌的进一步入侵创造条件( 周清澈，1 9 8 2 ；周裔彬和桂祖祥，1 9 9 7 ) 。 霉菌繁殖速度很快，在适宜条件下，几天内就能使粮食带菌量由几千个克增加 到几亿个克。大量菌体生长时的呼吸作用强度比粮食本身大得多，因此霉菌的生长 呼吸是造成粮食发热霉变的主要原因。大米霉变会造成重量损失，降低贮粮食用品 质和营养价值，霉菌在代谢过程中还会产生毒素，并残留于粮食中。研究者在黄变 米中曾分离出岛青霉、桔青霉、黄绿青霉等真菌产生的毒素( 胡兰，2 0 0 1 ) ，这些毒 素均具有强烈的毒性，食用后会严重影响身体健康。 1 1 2 常用的防霉方法 大米防霉处理可以在储藏过程或加工过程进行。大米加工过程中常在抛光处理 时加入涂层剂杀虫、抑菌和预防大米发热霉变，该方法成本较低，目前国内部分企 业开始采用这种方法。储藏过程进行大米防霉主要是通过控制大米的储藏环境或用 化学试剂处理，以达到防霉的目的，包括常规储藏、低温储藏、气调储藏和化学储 藏等方式( 袁素华和陶年顺，1 9 8 6 ) 。 常规储藏一般通过严格控制大米水分达到防霉目的( 卞科，1 9 9 7 ；付达美，1 9 9 9 ) 。 常规储藏的大米，含水量应控制在1 3 左右，但在实际储藏中，由于环境相对湿度 2 0 0 9 届硕士学位论文 较大，大米往往吸湿严重，水分增加，导致霉变，该方法的应用有一定的局限性。 低温储藏是目前大米防霉中最好的方法之一，若将温度维持在1 0 1 5 ，既可保持大 米的良好品质又可防霉( 王若兰等，2 0 0 1 ；袁素华和陶年顺，1 9 9 6 ) 。但大批大米进 行机械制冷及空调式储藏，需要整套制冷设备和冷库，投资大，保管费用高，目前 在我国还不可能大范围采用。气调储藏包括自然缺氧、充二氧化碳、充氮等方法。 一般用塑料膜或其它气密性材料密封粮堆，改变粮堆内气体成分，使粮堆处于低氧、 富氮、高二氧化碳的状态，达到防霉杀虫、安全储藏的目的。妨碍此项技术推广的 主要原因是大米品质的变化和成本问题。化学储藏是在缺氧储藏的基础上，利用低 剂量的磷化氢熏蒸大米，对高水分大米具有良好的防霉效果，可确保大米安全防霉 防虫，是目前高水分大米安全储藏广泛采用的方法。 以上各种防霉技术，均有其优缺点，一般都只能抑制微生物的生长。化学杀菌 剂所带来的环境污染问题、抗药性、药剂残留问题，特别是对食品安全性的危害已 引起了全世界对化学法杀菌除虫的警惕( t a n i e le ta l ，1 9 8 1 ) 。因此，用高效低毒方法 杀菌除虫受到了广泛关注( 严以谨等，1 9 9 3 a 、1 9 9 3 b 、1 9 9 6 ) 。国内外曾将防霉剂的 筛选作为防霉研究重点( 王盛良和陈修定，1 9 9 8 ：王金水等，1 9 9 6 ；魏木山等，2 0 0 2 ； e c k h o f f e ta l ，1 9 8 1 ；l e t ae ta l ，1 9 9 0 ) ，尤其是在自然界中存在的天然防霉剂的筛选上 ( 李倩如等，2 0 0 0 a 、2 0 0 0 b ) ，但到目前为止，还没有找到适合工业化生产的高效低 毒的防霉剂。 1 2 微波的灭菌作用 微波( m i c r o w a v e ) 是指波长约l m l o m m 的电磁波，分为米波、厘米波、毫米 波和亚毫米波四个波段。微波的频率( 3 0 0 m h z - 3 0 0 g h z ) 介于无线电频率( 超短 波) 和远红外线频率( 低频端) 之间，国际上对微波加热的频率范围有统一的规定， 常用的频率有4 3 3 m h z 、9 15 m h z 、2 3 7 5 m h z 、2 4 5 0 m h z 。食品工业所用微波频率多 为9 1 5 姗z 和2 4 5 0 m h z 。其中微波炉多用2 4 5 0 m h z ，食品加工多用9 1 5 m h z ，前者穿 透能力比后者大。食品的微波杀菌开始于上个世纪6 0 年代，8 0 年代后发展较快。与 传统的热力杀菌相比，微波杀菌是一种非电离辐射杀菌，具有穿透力强、节约能源、 加热效率高、适用范围广等特点。微波杀菌便于控制，食品的营养成分及色、香、 味在杀菌后仍接近食物的天然品质，目前主要用于肉、鱼、豆制品、牛乳、水果及 啤酒等食品的杀菌。 微波杀菌现在已经广泛应用于液体食品，如乳制品、果蔬汁饮料、啤酒、调味 品等。微波杀菌具有温度低、速度快的特点，既能杀灭各种细菌，又能防止其贮藏 过程中的霉变。利用微波对牛奶进行杀菌消毒处理，鲜奶在8 2 左右处理数秒钟后， 杂菌和大肠杆菌完全达到卫生标准要求，并能保持牛奶的营养成分和原有风味( 刘 钟炼，1 9 9 8 ) 。用微波对黄酒、酱油等调味品进行杀菌，不仅杀菌效果好，而且成 2 霉菌的微波效应研究 本低于常规杀菌方法。对啤酒采用中高功率微波杀菌后，菌落总数小于1 4 个m l ， 大肠菌群未检出，符合国标g b4 9 2 7 8 5 的要求( 张治良，1 9 9 5 ) 。 采用传统方法对果蔬制品进行杀菌处理，往往造成果蔬制品的风味和口感变差， 尤其是硬度和脆度降低，而微波杀菌由于其快速，低温的特点，可以较好的保持果 蔬的风味( 李清明等，2 0 0 4 ) 。目前像酱菜、紫菜、泡菜、糖水罐头等许多果蔬制 品都有采用微波杀菌的报道。 肉制品的常规杀菌方法是高温杀菌，能耗大，对食品的营养成分和感官评价影 响也较大。国内外已有许多采用微波对肉禽等食品的杀菌实例。国内对软包装酱牛 肉的微波杀菌表明，杀菌效果接近高温杀菌，感官评价也最高；荷兰食品公司将盒 装鱼、肉食品经微波7 2 - 7 5 快速均匀杀菌后，产品能够在0 - 4 c 冷藏柜保存1 8 0 d 。 国外还有用微波对鱼肉、火腿进行杀菌处理( 李清明等，2 0 0 4 ) 。 由于微波有很强的穿透力，因此用微波焙烤蛋糕、面包等食品，可在烘烤的同 时杀死制品内部细菌，防止发霉，延长保鲜期。瑞典采用2 4 5 0 m h z 、8 0 k w 微波面 包杀菌机，每小时加工1 9 9 3 k g 面包片，处理后的面包有原来能保存3 - 一6 d 延长到 3 0 - 6 0 d ( 赵淳锋等，2 0 0 4 ) 。在原粮处理上，国内曾经研制成功连续式粮食微波干 燥机，采用微波技术在对高水分粮食干燥，同时杀菌杀虫( 祖立青，2 0 0 5 ) 。刘巧 瑜等对微波剂量、能耗等对大米霉菌的杀灭效果进行了研究，并对微波处理后霉菌 的生长动力学特性进行了小试和中试研究。结果表明，电耗在0 0 2 3 k w h k g 以上时， 霉菌致死率可达8 0 以上( 刘巧瑜，2 0 0 5 ) 。 1 3 微波灭菌机理研究 早期认为，微波对细菌的作用主要以“热效应 为主，其依据是某些菌经微波 辐照后温度迅速上升，致使微生物大量死亡，而一旦控制温度的升高，微波的灭菌 作用即不明显( m e r v i n ee ta l ，1 9 9 7 ) 。近年的研究则表明微波的生物效应不仅有热效 应，同时还存在非热效应，是热效应和非热效应综合作用的结果( v a r d a x i se ta l ， 1 9 9 7 ) 。 1 3 1 微波热效应 热效应是指进入生物系统的电磁能转化为热能所引起的生物效应，是由分子热 运动产生的效应，表现为生物体的温度逐渐上升。微波由空间直接向生物体辐射， 因生物体内部含有导电程度不等的各种体液、极性生物分子、电解质离子以及非极 性分子等，在微波辐射电磁场的作用下，非极性分子被极化成偶极子，这些被极化 成的偶极子、极性分子、电解质离子等，将由无规律的排列变成沿电场方向的排列， 并随交变电场方向的变动而旋转，可与周围粒子发生碰撞、摩擦；微波频率高，其 交变电场的方向变动很快，这种取向运动使偶极子、体内带电胶体颗粒、电解质离 2 0 0 9 届硕士学位论文 子与周围介质产生快速振荡摩擦而产热。因此微波加热与其他加热方式不同，不是 从外到内传热，而是内外同时受热( 刘秀红，2 0 0 2 ) 。微波能达到的地方，吸收介质 均能吸收微波并很快将微波转化为热能，致使微生物死亡。 用传统的加热方法和2 4 5 0m h z 的微波照射处理大肠杆菌和枯草杆菌芽胞悬液， 微波辐射只有热效应作用于大肠杆菌和枯草杆菌( g o l d b l i t he ta l ，1 9 6 7 ) 。将各种细 菌，放线菌，真菌及抗菌素在有水和无水情况下用2 4 5 0 - 士2 0m h z 的微波进行辐射， 发现微生物仅在有水情况下失活，并且干燥或冻干的有机体甚至在延长辐射时间也 不受影响( v e l aa n dw u ，1 9 7 9 ) ，他们认为微生物仅由热效应致死，而且极有可能不 存在非热效应，且细胞成分( 除了水) 不能吸收足够的能量致死微生物细胞。 采用自动化计算机温控和特殊温度测量系统，用对流干热炉和微波炉处理枯草 杆菌黑色变种的干燥芽胞。监测微波炉的温度发现两种热源的孢子样品表面温度几 乎一致，在干燥微波灭菌过程中非热效应并不重要，微波致死孢子活性的机制仅由 热效应引起( d a v i d ，1 9 8 7 ) 。 国内外研究者通过研究表明微波对微生物的灭菌效果主要是由热效应产生 ( j u a ne ta l ，2 0 0 2 ；y e oe ta l ，1 9 9 9 ；姚开等，1 9 9 9 ；g e d y e ，1 9 9 7 ) 。微波杀灭不锈钢 中金黄色葡萄球菌的热量主要来源于不锈钢媒质的传导，而从微波直接吸收的能量 很小，即细菌并未直接吸收微波，不能得到微波对细菌是否有非热效应的结论( y e o e ta l ，1 9 9 9 ) 。为了评价微波加热灭菌效果，选择好氧性细菌孢子作为生物指示剂以 确定微波是否有非热灭菌效应。用微波对干燥状态的三种细菌孢子辐照，结果均无 细菌孢子被杀灭，实验结果表明：微波对细菌孢子的灭菌效应无非热效应( s a s a k ie t a l ，1 9 9 8 ) 。 1 3 2 微波非热效应 采用微波辐射与水浴加热，分别对指示菌如白色葡萄球菌与枯草杆菌黑色变种 芽胞悬液等作用相同时间，在一定温度条件下，杀灭率差别显著。研究结果表明， 微波杀菌除热效应外，还有非热效应( 李荣芬等，1 9 9 3 ；王绍林等，1 9 9 4 ；吴晖等， 1 9 9 6 ；汪保国等，1 9 9 6 ) 。对干湿状态的细菌进行不同强度及时间的辐照，比较其杀 灭率，并同时与单纯的加热灭菌相对比，发现微波可杀灭干菌，对湿菌的杀灭也强 于单纯的加热灭菌，说明微波对细菌的杀灭除热效应外还有非热效应( 席晓莉等， 2 0 0 0 ；吴道澄等，1 9 9 9 ) 。针对微波杀菌机理的非热效应，出现了不同的解释模型。 从生物物理角度来解释微波的非热灭菌机理较易为大多数人接受( 王绍林， 1 9 9 4 ) ，其主要模型包括： 细胞膜离子通道解释模型。按照该学说，细胞与外界联系而进行的一系列复杂 的生物化学过程是依靠细胞膜上约0 0 3 0 1 0 v 的电位差控制，即膜电位的改变能激 活开放或关闭与外界联系的通道。细菌处于高频率和强电场强度的微波场中，细胞 4 霉菌的微波效应研究 膜电位很可能改变，其正常的生理活动功能亦将改变，以致危及细菌的存活。 蛋白质变性解释模型。该理论指出，微生物由蛋白质、核酸物质和水等极性分 子组成，这些极性分子在高频率、强电场强度的微波场中将随着微波场极性的迅速 改变而引起蛋白质分子团等急剧旋转，往复振动，一方面相互间摩擦，转成热量而 自身升温，另一方面化学键受到破坏而引起蛋白质分子变性，进而破坏微生物正常 生理活动功能，从而达到杀菌的目的。 在研究微波对某些肠道内致病菌的致死效应时，第一次提出存在电磁致死效应 的可能性( p a p a d o u p o u l o ue ta l ，1 9 9 5 ) 。1 9 9 8 年，k o z c m p e l 提出了四种主要理论假 设来解释非热效应：1 、选择性加热理论。微生物选择性吸收电磁波，所以比周围的 液体环境更热而更快就达到灭菌温度。2 、电穿孔现象理论。在电磁场的作用下，在 较弱的细胞膜部分穿孔，引起细胞内物质的泄漏和细胞裂解。3 、细胞膜破裂理论。 穿过细胞膜的电压足够使细胞膜破裂，从而导致细胞死亡。4 、磁场偶联理论。用电 磁场和细胞内重要分子( 如蛋白质和d n a ) 的偶联来解释细胞的裂解。细胞内部物 质在电磁场的作用下破坏，从而导致微生物死亡。 微波处理后的菌悬液中发现了一些细胞内溶物的泄漏，如茚三酮反应呈阳性物 质、嘌呤和嘧啶( k h a l i l ，1 9 8 8 ) 。这就证明t k o z e m p e l 的细胞膜破裂理论和内溶物 泄漏问题。但内溶物的泄漏是否是由电穿孔引起，还有待更进一步研究。 在亚致死处理条件下，研究微波对金黄色葡萄球菌r n a 完整性的影响，结果表 明微波处理对r n a 的破坏作用显著大于传统的加热处理。虽然两种处理都会破坏 1 6 s r n a ，但只有微波处理会对2 3 s r n a 造成破坏。恢复培养以后，传统加热处理以 后恢复正常状态需要1 8 0 m i n 。而微波处理，完全恢复需要2 7 0r a i n ( 其中，1 6 s r n a 需要1 8 0 m i n ，2 3 s r n a 需要2 7 0 m i n ) ( h a n ye ta l ，1 9 8 9 ) 。这就证明t k o z e m p e l 的磁场 偶联理论。 同时有许多研究认为存在非热效应影响细菌的结构和功能( b o h re ta 1 ，2 0 0 0 ； v e l i z a r o ve ta 1 ，1 9 9 9 ；y u ne ta 1 ，2 0 0 8 ) ，不仅是由热效应造成的( m a r c i ne ta 1 2 0 0 7 ) 。 研究水浴加热和微波照射作用金黄色葡萄球菌细胞，发现两种方法对金黄色葡 萄球菌酶活性影响不同。微波辐射作用金黄色葡萄球菌时，只用热效应不能解释菌 内源酶活性变化的现象( d r e y f u s se ta l ，1 9 8 0 ) 。选择酿酒酵母菌和胚芽乳杆菌进行微 波和传统加热的对比试验，研究微波加热对苹果汁里的产孢微生物的破坏作用，研 究发现，在微波条件下微生物破坏明显快于水浴加热( t a j c h a k a v i te ta l ，1 9 9 9 ) 。而对 解剖刀刃上牛结核杆菌和白色念珠菌污染的微波灭菌效应的研究结果表明，微波可 以对这两种细菌污染的解剖刀灭菌，同时他们还进行了初步的机理研究，当用扫描 电子显微镜观察被微波辐照的细菌时，发现细菌经历了一系列变化，暴露时间越长， 这样的改变越大，直至完全破裂。当用别的方法灭菌时，例如干燥加热、高温灭菌 或简单的在沸水中浸入，即使细菌死亡，也未发现形态学的变化( r o s a s p i n ae ta l ， 2 0 0 9 届硕士学位论文 1 9 9 4 ) 。 在真空条件下，使实验环境保持在4 9 - - 6 4 。c ，同时使微波灭菌和水浴加热温度 保持一致，以大肠杆菌为研究对象，比较三个参数：d 值、z 值和活化能( e a ) 。结 果表明，微波对大肠杆菌的破坏明显不同于水浴加热，暗示除了微波的热致死效应， 还有其他因素( y a g h m a e ee ta 1 2 0 0 5 ) 。 微波能够对氢键、疏水键和范德瓦尔斯键产生作用，使其重新分配，从而改变 蛋白质的构象与活性( 李巧玲，2 0 0 1 ) ，这些现象说明微波辐射非热效应的存在，是 微波作用于生物体上产生生物学效应的另一种重要机制。 此外，还有研究者认为，电磁波对化学反应的非热作用导致了对生物体的“非热 效应”( 黄卡玛，1 9 9 6 ) 。根据这一说法，电磁波改变了化学反应的活化能和指前因 子，使得反应呈现加速和减速两种结果。由于生命过程实际上是一个动态的代谢平 衡过程，时刻发生着新陈代谢生物化学反应。因此，电磁波对生化过程的影响将改 变其反应速率和平衡常数，致使这样一种动态的代谢平衡过程发生紊乱，使生物体 的生命受损。非热效应能量不是来自电磁波而是来自于生物体的新陈代谢如a t p 的 合成与分解。 1 3 3 微波辐射对生物细胞的影响 1 3 3 1 微波对细胞表面结构的影响 生物膜是由脂质和蛋白质构成的流动镶嵌膜，细胞膜对细胞的生存和增殖均有 重要作用，膜流动性是细胞膜的基本特征，而膜的流动性与膜的结构、功能、运动 和增殖等密切相关。在微波交变电磁场作用下，细胞膜结构分子被极化、重排、振 荡，导致细胞膜流动性改变，从而引起细胞一连串生化改变。近年来研究表明，微 波辐射可以使神经细胞膜磷脂性质发生改变，改变细胞膜离子通道对离子的通透性 ( o v c h i n n i k o v a ，1 9 9 6 ) 。微波处理能造成微生物细胞壁的剥落或细胞膜的破坏，改 变细胞膜的通透性，造成细胞内物质外渗：微波也可能影响细胞膜电位而破坏微生 物的结构与功能( 周蔚红等，2 0 0 0 ) 。 比较微波处理和巴氏灭菌法对啤酒酵母的影响，经透射电镜放大后拍摄细胞结 构照片，结果显示经微波处理后的细胞各部分结构基本清晰，但在许多细胞中出现 小的裂纹。查阅了所有能找到的电镜图谱和照片，均未发现这种现象，所以可假设 是微波灭菌所产生特殊作用的结果( 王鲁嘉，1 9 9 8 ) 。 比较微波与传统加热对枯草杆菌芽胞结构和分子组分的致死率及影响，采用电 子显微镜观察芽胞结构，发现两种处理对皮层影响不同，传统加热孢子皮层松弛， 大于未处理孢子的1 0 倍；相反，微波辐射处理时间和温度与传统加热相同，孢子的 皮层与未处理孢子相同( c e l a n d r o n ie ta l ，2 0 0 4 ) 。用微波辐射大肠杆菌和枯草芽胞杆 6 霉菌的微波效应研究 菌细胞悬液，作用后用扫描电镜观察发现，大多数大肠杆菌细胞表面严重损伤，而 枯草芽胞杆菌无显著变化( w o oe ta l ，2 0 0 0 ) 。而利用透射电镜观察正常枯草杆菌黑 色变种的超微结构发现，其芽胞外壳清晰，皮质层整齐光滑且呈均匀高电子密度带， 核区电子密度高，均匀且边缘整齐；其繁殖体完整光滑，胞浆处电子密度均匀。微 波处理后的细菌芽胞外壳层次模糊，胞质区电子密度降低，但核区完整( 杨华明等， 1 9 9 5 ) 。 采用微波辐射大肠杆菌和枯草芽胞杆菌细胞悬液，发现活菌数显著减少，且随 着细胞悬液温度上升，细胞的d n a 和蛋白质释放量增加( w o oe ta 1 2 0 0 0 ) 。用荧光 探针检测微波处理后细胞内c a + 浓度的变化，选用二乙酸荧光素( f d a ) 和 f l u o 3 a m 两种荧光染料，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌经微波处理后的酯酶活性及 细胞膜通透性进行研究，结果表明细胞膜通透性的改变与微生物致死率有一定的相 关性，也可能是微波杀菌非热效应的表现之一( 陈卫等，2 0 0 7 ) 。 微波具有影响离子通道的特性，但机制尚不清楚。如微波对n a + 、i o 0 5 判定为变化不显著，p o 0 5 判定为变化显著( 赵思明，2 0 0 5 ) 。 1 6 霉菌的微波效应研究 3 结果与分析 3 1 大米霉菌的分离与鉴定 3 1 1 霉菌的鉴定结果 对发霉大米中的霉菌进行分离、纯化，得到3 种霉菌，分菌落特征和显微观察 两部分进行研究。菌落特征包括：菌落颜色、菌落表面、菌落质地、菌落边缘、菌 落高度、培养基颜色的变化、渗出物和气味的有无共八项指标。显微观察包括：分 生孢子和顶囊的形状、大小；分生孢子梗的长度和表面特征；小梗的着生方式和大 小；分生孢子和子囊孢子的形状、颜色、大小和纹饰等方面。初步鉴定结果见表l 。 表1 霉菌鉴定结果 t a b l e 1r e s u l t so fm o u l do b s e r v i n g 绿食源牌大米，取样3 次。分离到8 0 个霉菌菌落，各种大米霉菌菌落数和检出 率见表2 ，由表2 可以看出，寄生曲霉为优势菌株，与文献调查一致，曲霉属检出 最高( 李新社和陆步诗，2 0 0 0 ) 。 选取寄生曲霉作为本论文的研究对象，研究微波效应。 表2 主要霉菌检出率 t a b l e 2d e t e c t i v er a t eo fm o u l d 1 7 2 0 0 9 届钡士学位论立 3 1 2 霉菌图片 分离霉苗的显微图片如图2 所示 ( g ) 3 号菌足细胞 ( h ) 3 号足细胞 图2 霉菌形态( x 4 0 0 ) f i g 2m o r p h o l o g yo f m o u l d ( x 4 0 0 ) 霉菌的微波效应研究 3 2 微波条件的确定 传统加热方式是利用热传导的原理将热量从被加热物外部传入内部，逐步使物 体中心温度升高，要使中心部位达到所需的温度，需要一定的时间，导热性较差的 物体所需的时间就更长。微波能引起电子、离子移动或偶极子极化产生高频振动， 被加热物本身成为发热体，从而使物料在较短的时间内达到物料内外同时升温。 由于微波加热和传统加热的原理是不同的，物料在两者中温度变化也必定不同。 为了研究霉菌孢子悬液在2 种加热方式下温度的变化差异，分别测定了1 0 0m l 生理 盐水在2 4 w g ，6 0 w g ，9 6 w g 微波剂量下以及6 0 水浴加热条件下的升温曲线， 结果如图3 所示。 由图3 可知，在一定的微波剂量下，生理盐水温度随处理时间延长而升高。微 波剂量越高，温度上升越快。采用线性模型描述温度与处理时间的的关系： t = a b 其中，r 一生理盐水温度，；七一升温速率，s ；t 一微波处理时间，s ； b 初始温度，本试验均为2 5 。 经回归分析，不同微波剂量下生理盐水的升温速率k 及复相关系数r 2 见表3 。 由表3 可知，随微波剂量增大，升温速率增高。较高的微波剂量下方程的显著性下 降，表明微波剂量越高、温度偏离线性模型。而水浴加热是一个热传递过程，随着 温度差的减小温度上升速度逐渐缓慢。由于高微波剂量容易影响物料品质，而选择 2 4 w g 微波剂量既可以与水浴几乎同时达到目的温度，又对物料品质影响不大，因 此