（食品科学专业论文）高压脉冲电场对乳铁蛋白结构和生物活性功能的影响.pdf

摘要 黼压脉冲电场( p e f ) 是一种非热杀菌技术，它的主要用途在于对热敏性物料的杀菌、酶钝化筹方 面。乳铁蛋白( l f ) 是一种存在予外分泌液( 如乳) 中的具霄生物活眭e 功能的糖蛋白，具有多种生物 活性渤麓，翔增强铁静终递和蔽投、广谱撬莲活性，免疫调繁幸# 用等，讶广泛瘦翔子食晶、医药秽诧妆 品领域。但目前国内外几乎未见p e f 对生物活性蛋白结构和功能影响方丽的研究及报道。因此本课题从 p e f 处理对l f 的生物活性作用出发，研究p e f 对l f 绪拇及生物活性( 挣藏活性和铁结合性毙) 的影噙， 探讨络构与功畿之闻静笑联性，为p e f 对食晶成分的生物 艺学方面的俸用研究攒供理论纂础和实戥指 导。 零论文硪究7 p e f 鲢理对l f 貔诧性震及缝均静影睫。结莱表甥，举弱p e f 龟场强度释黥渖数条穆下 对l f 溶液p h 值纂本无变化但电爵率有小幅卜降。随着电场镁度逐渐增加到3 5k v e m ，蠲二色性( c d ) 谱幽显示q 螺旋构象比例f 降，争拼譬构象比例增加，分子结构变得紧密。分子结构稳定性增强；麓示 舞描蘩热法( d s c ) 显示0 f 变往潞瘦提高，热稳定增强；z e t a 电位带委毫置蝰下降。毽当窀场强度增大 到4 0k v c m 时。甜螺旋构象比例开始上升，分子结构变得松散，z e t a 电位上升，l f 蛋白变性温度略有下 降。墩场强度3 0 k v c m ，当脉 申数从3 3 个增栩多j 2 5 6 个鞋，* 螺旋构象比铡和无瓣卷曲比铡增加，分子 稳定饿降低 分析了不同p e f 处理对l f 铁结合能力的影响。结果显豕电场强度3 0k v c m ，脉冲数2 5 6 个时， 善魏翱对铁结念毙力迅速主秀，鼹襄了3 。s 嵇。当懿场强度达剐3 5k v c m 翼重，l f 戆摇慰锾鳍舍魅力 降低了4 3 ；当达到4 0k v c m 后叉上升至8 7 。而随着处理时间，脉冲宽度的增大，l f 相对铁结合 能力里下降趋势。脉冲频率、流速和剪切效威对l f 铁结合能力影响不大。当处理温度由3 5 井至5 5 ( 2 对，潆鲍铁结会能力最大，可达剿对照群豹1 2 嫠。毽当继续舞溢，l f 锾结合缝力叉帮始下薄。p e f 对l f 铁结合能力的影响和对其结构的影响肖很好的吻合性。 分辑了不屈p e f 处璎对| f 挪壤活性的影响。结鬃显示电场强度，l 、予3 0k v c m 鞋，p e f 对季率铡 e c o l i 薷is t a p h y a u r e u # 的活性影响德小。但甍气电场强麓达到3 5k v e m 时，l f 对其的相对抑菌活性分剐 降为7 6 6 和8 2 ，当达到4 0k v c m 后稍有上升。随着脉冲效的增加，l f 的抑菌能力上升。当脉冲 羲这到2 5 6 个雾孝，f 落滚黠这薄释落斡静藩戆力簸髅。当霪豪 申数继续璞犬， f 捧蓥性又窍下降怒势 脉冲时间、脉冲频率改变对l f 抑蔺活性影响较小。脉冲宽度的增加，l f 抑菌活性呈下降趋势。随着 处理温度的升高，l f 的抑菌活性先上升后下降。p e f 对l f 掷蓝活性的影响和对其结构和铁结合驻力 豹影响窍很好静一致性。 关键键：亳压赋狰电场，巍铗蛋叁，维 每，翔莲活搜t 铁结会馊毙 a b s t r a c t p u l s e de l e c t r i cf i e l d s ( p e 秘i sa ne m e r g i n g 搀。- 蛙接a lp r o c e s s i n gt e c h n o l o g yu s e df o rt h e r m o s e n s i f i v e m a t e r i a l ss t a b i l i z a t i o na n de n z y m ei n a c t i v a t i o n l e c t o f e r r l n ( l f ) i sa ni r o n b i n d i n g 舀y c o p r o t e i np r e s e n ti n e x t e r n a ls e c r e t i o ms u c ha sr a i l l oe s p e c i a l l ye o l a s t n u n s l fh a sv a r i o a sb i o e c t i v ef u n c t i o n ss u c ha s b r o n d - s p e c t r u ma n d 畦c r o b i a la c 蛙v l 娥p r o m o t i o no fi r o nt r a u s f e ra n da b s o r p t i o n , i m m t m o m o d u l a t o r ye f f e c t s , c ta 1 t h e r e f o r e ，i th a sg r e a tp o t e n t i a lt ob e 州d e l y1 1 5 e di nf o o d s , p h a t m e c e n t i c a l s ，a n dc o s t a e t i c s t h e r ea r e l 讯l er e p o r t so f tt h ei n f l u o f p e fo l lb i o e c ：f i v i t yp r o t e i n 。nt h i sp a p e r , t h ei n f l u o n c eo f p e fo nt h es t r u c t u r e a n db i o e c t i v i t y ( a n t i b a c t e r i a le c t i v i t ya n di r o n b i n d i n gc a p a c i t y ) o f l fw e r es t u d i e d o p 6 m a lt m r a m e t o r sw e r e c o n f i r m e dt op r o t e c tt h eb i o a c t i v i t yo fl f ，w h i c hw o u l db eh e l p f u it ou n d e r s t a n dt h eb i o c h e m i c a le f f e c l so f p e ft r e a t m e n to no t h e rf o o di n g r e d i e n t s t h es 仃u c t u r eo f l fi n f l u e n c e db yp e fw a ss t u d i e d t h ep ho f l fs o l u t i o n sh a v en oc h a n g e s b u tal i t t l e d e c r e a s e so f c o n d u c t a n c eu n d e rd i f f e r e n te l e c t r i cf i e l d ss t r e n g t ha n dp u l s ea m o a n lw i t he l e c t r i cf i e l d ss t r e n g t h i n c r e a s e dt o3 5k v c m ，c i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r o s c o p ym e a s u r e m e n t s ( c 劲r e v e a l e dt h a tt h es t n e t o r e p r o p o r t i o n a t eo f a h e l i c a ld e c r e a s e d ，睁s t r u c t u r ee n h a n c e d ，t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eb p a n em o r ec o m p a c t n e s s a n dt h em o l e c u l a rs t a b i l i t yi n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n ge l e c t r i c i t yf i l e d ss t r e n g t h i tw a ss h o w nb yd s ct h 碓 d e n e a u r a t i o nt e m p e r a t u r ee n b a m e da n d 氆e m 潮s t a b i l i t yi n e r e - a s e do f l f a n dt h ez e t ap o t e n t i a lw a sp o s i t i v e a n dai i t t l ed e c r e a s e d b u tw h e nt h ee l e c t r i cf i e l d ss t r e n g t hw a s 幻4 0k v c n t , t h es t m c t n mp r o p o r t i o n a t eo f a - h e l i c a li n c r e a s e d , t h em o l i e e u l a rs t r u c t u r el o o s e na n dt h ez e t ap o t e n t i a l 娃站找罐$ e 玉w h e ne l e c t r i cf i e l d s s t r e n g t hw a st o3 0k v c r a , a n dt h ep u l s ea m o u n ti n c r e a s e df r o m3 3t o2 5 6 t h es t r u c t u r ep r o p o r t i o n a t eo f a - h e l i c a la n du n f o l d e dr a n d o ms t r u e t n r ew a se n h a n c e d , m o l e c u l es t a b i l i t yd e c r e a s e d t h ec h a n g e so f i r o n - b i n d i n gc a p a e i l yo f l fw a ss t u d i e da f t e r 隧w h e ne l e c t r i c 曩e 避ss t r e n g t hw a st o 3 0k v c m , a n dt h ep u l s ea m o u n ti n c r e a s e dt o2 5 6 t h er e l a t i v ei r o n - b i n d i n ge a p e c i t ye n h a n c e da p p a r e = n 1 1 ya n d w a st o3 。8t i m e sc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r 0 1 稚l e l 噩 v ei t o n - b i n d i n gc a p e c i t yd e c r e a s e d4 3 w h f ne l e c t r i c f i e l d ss t r e n g t hw a s3 5k v c m , a n d t h 删幻8 7 瓤4 0k v c m b l i tt h et r e a t o a o n tt i m ea n dp u l s ew i d t h h a dn e g a t i v ee f f e c t so nt h ei r o n b i n d i n gc a p a c i t y w h i j ep u l s ef r e q u e n c y , v e l o e i t yo f f l o wa n ds h e a re f f e c th a d l i t t l ei n f l u e n c eo nt h ei r o n - b i n d i n gc a p a c i t yo f l f 。w h e nt e m p e r a t u r ei n e r e a s e df r o m3 5 船5 5 。& r e l a t i v e i r o n - b i n d i n gc a p e c i t yo fl fw o u l dc o m et o t h ep e a ka t5 5 ，a n di tw o u l dd e c r e a s e da st h et e m p e r a t u r e c o n t i n u e t o e n h a n c e d t h e i n f l u e n c e o f p e f o ns t r u c t u r ea n d i r o n - b i n d i n g c a p e c i t y h a ss i m i l a r c h a n g e s t h ea n t i b a c t e r i a la r 蛙v i t yo fl fa f f e c t e d 蚵d i f f e r e n tp e ft r e a t m e n t s w h e ne l e c t r i c 基e 恣鼬n 鳓l e s s a l a n3 0k v c m , t h e r ew a sl j r t i ec h a n g e si nt h ea e t i v i t yo fl ft oi n h i b i t 属c o l ia n d y t a # 砂a t a e u s b u ta s e l e c t r i c i t yf i e l d ss t r e n g t hw a st o3 5k v e m , t h er e l a t i v ei n h i b i ta c t i v i t yd e c r e a s e d 协7 6 6 a n d8 2 9 钰 r e s p e c t i v e l y a n dt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yh a da 1 钳ei n c r e a s ew h e nt h ee l e c t r i cf i e l d ss t r e n g t he n h a n c e dl o4 0 k v e m 1 1 l ea n t i b a e t e r i a le c t i v 蚵o fl fe n h a n c e da st h ep u l s ea m o u n ti n c r e a s e d , t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t y b e c a m et h eh i g h e s tw h e nt h ep u l s ea m o u n t c a m et o2 5 6 , a n dt h a tw o u l do 囝整ed o w na sp u l s ea m o a n ti n c r e a s e d c h a n g e so fp u l s et i m ea n dp u l s ef r e q u e n c yh a dl i t t l e i n f l u e n c eo nt h ea n t i b a c t e r i a le c t i v i t yo fl f a s 加 i 嘲蹦eo fp u l s ew i d t h , t h ea n t i b a c t e r i a le c t i v i t yo fl fd e c r e a s e d t h ea n t i b a c t e r i a le c t i v 时o fl fw o u l d i n c r e a s ew h e nt h et e m p e r a t u r ee n h a n c e d a n dw h e ni tc a m e 幻ap e a kt h a tw o u l dd e c 摊a s ea st h et e m p e r a t u r e i n c r e a s e d c o m p a r e dw i t ht h ei n f l u e n c eo fp e fs t r u c t u r ea n di r o n b i n d i n ge a p a e i t y , t h ei n f l u e n c eo fp e fo r a n t i b e c t e r i a la e t i v i t yh a sg o o dc o n s i s t e n c y k e y w o r d s ：p u l s e de l e c t r i cf i e l d s ，l a c t o f e r r i n ，s t r u c t u r e ，i r o n - b i n d i n gc a p a c i l y ，a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y h 猿匐性声明 零久声秘掰呈交酶学位论文是本人在导郯指导下进行黪研究王 作及取得的研究成粱。尽我所知，除了文中特别加以橼注和致谢的地 方外，论文中不包禽其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一露工僚的霹悫对零研究麝傲酶强何贡献湾已在论文孛作了臻 确的说明并表示谢意。 签名：平衄 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向溺家有关部门戚视构送交论文的复印件和 磁盘，允诲论文被鲞阕帮借瓣，可激将学位论文懿全都或帮分海容编 入有关数据库进萼亍检索，可以采用影印、缩印或扫描等复铡手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 躲4 毖绺零师躲盟 日期：矛唧年j 月3 。日 第一章绪论 1 1 高滕脉冲电场杀菌技术 第一章绪论 工韭纯戆食菇券营技零蠡诞生戡架，一妻数熟力象簿为主，擞热楚理在杀蓉、键纯酶静瓣嚣重，雹锼 些热敏性的营养索和风味物质受到破坏。为了克服热力杀菌的不足之处，保持食品的新鲜和原味。逝 颦来国内辨出现7 # 热杀菌技术，如超高压( h i g h p r e s s u r e ) 、亮压脉冲电场( p u l s e d e l e c 打i c f i e l d s ，简 称p e f ) 、强磁脎；串、脉冲强毙，超声波、膜分离和活赣包装等技术p l 。其中的p e f 灭菌技术安全无骞， 媳有传递均匀、处理时间短、能耗低，对产品的色、香、昧和营莽成分没有破坏，能保持产晶的新鲜度 # 艘擎特点。 p e f 授术又被称为高强度脉冲电场( h i g h i n t e n s i t y p u l s e d e l e c t r i c f i e l d s ，h p e f ) 或高强魔电场脉冲 ( h i g hi n t e n s i t ye l e c t r i cf i e l dp u l s e s ，h e f p ) 蓉蕴技术，是将高电篷脉冲捧胡于电极间的物糕，以杀灭 物料中的微生耪的一种薪型杀菌接术。其高强度豹电场蹩通遥电容组贮存来自高嚣童流电源静大量畿 馕，然衍以高电压脉冲的形式释放出去所形成的，从而达到破坏微生物细胞膜，杀死微生物的效果。 1 1 1 高聪脉冲耄场杀蘸技术的磷究透震 早在1 9 0 0 年，就宥人尝试使用交流电进行牛奶的杀菠。它是以欺姆加热的形式达到杀菌效祟的，避 一过程被称为“毫缝工序( e l e c t r 。p u r ep r o c e s s ) ”。窀可班杀死结核抒蘩、大脑轷菌赣及辩传统食蕊 热处理有抵抗力的细菌。之艏在二十馓纪二三十年代间，人们将电加热方法用于牛奶的巴氏杀菌，先将 瓣辩嚣臻热戮5 2 燕逶过奄= 蝰建室，2 2 0v 交滤龟爨蠖是戆功率( 1 5k w ) 遁过袋惫极嫠用予流经处璎 巍的牛奶，可将牛奶的温度升高至7 l 。然后稃冷却到2 9 ( 2 进行装瓶或分离奶油f 4 j 二十搬纪五十年代，照祷黥冲功率技术的发展与应用的推广，产生了种液中放电法的灭菌技术。 窃是遥过澄没在液体介质内的电极，快速释藏储能电容上高压电产生的瞬时高压脉冲形成的高压冲穗 波、屯弧光以及电化学反应达到灭菌目的p j 。倪由于此方法会对食品造成电解物污染和导致食品中颗粒 袋分瓦艇，嚣藏仅瓣予痤痰处理辫。 二十世纪六十年代初，p e f 处理被用于细胞研究中对细胞的电击穿、点融合等细胞结构上的破坏方 聪。实验发现，不潮强度静均匀电场慰微生物绷胞的生长有着不同程度的抑制作阕。1 9 6 7 球，s a l e 和 h a m i l t o n 等学者率先研究了商强度直流矩形脉冲电场对酵母菌等多种微生物的杀菌效应1 7 l 。他们发现徽 生物的死亡与其种类有关电场强度羊口作用时间是影响电灭菌效果的两个燎主要因索，并通过实验证明 了产生彖蘩痒蘑懿瓣霏宅群尹耱氇嚣热力学鹣琢因，连藩证明t p e f 技术豹l 热效藏翔。 从上饿纪八十年代开始，p e f 作为一种新型的冷杀菌技术，童受到燕国、德国、法国，加拿大， 嚣班牙、拢剩对，搿兰等发热嚣家豹敢搿，企业移研究单经鳃广泛重褪。尉蕲上在该赣域比较著名的研 究小组：f i h u l s h e g e r 、p o t e l 和n i e m a n n ( 1 9 8 1 1 9 8 3 ) ，s i t z m a n 和g r a h l ( e l c r a c k , e l a t e r i l ) ( 1 9 8 5 1 9 9 6 ) ，d u n n 、 h o f m a n n 和b u n s h n e l l ( 1 9 8 2 - 现在) ，b a r b o s a - c a n o v a s 和s w a n s o n ( 1 9 9 2 - 现在) ，以及z h a n g ( 1 9 9 4 - 现在) 等领导豹磷究小缓。 二十世纪八十年代以后，些研究者对p e f 杀菌机理做了进一步的探讨，并开始了适用予工业生产 豹设备磅究。薅蛋h a m b u r g e ru n i v e r s i t y 、美 w a s h i n g t o ns t a t eu n i v e r s i t y 和麴州m a x w e l ll a b o r a t o r i e s 等， 先后开展了用p e f 对乳制品，柴汁及蛋液等液态食品进彳亍杀菌的课题研究。g f 起了从事食品研究和生产 人员的广溅关注。 至上鬣绝丸十苹代后弱，天功率溅溯工设鑫毒l 造取褥了突破缝於遗震，蘑翦设备开发和菜些产菇 ( 如酸性果汁) 的加t 【：艺均已发展到准工业化阶段。在设备研究和制造方面，俄发俄州立火学z h a n g 领导熬臻究小纽憝覆酝领先地位。该大学已建成一条处理麓力达参1 2 0 0 0l h 豹准王她纯生产线，避移 l 江南大学硕士学位论文 了包括橙汁、苹果汁、酸奶等产品在内的一系列产品的杀菌试验，并取得了良好的成果。该生产线加工 的果汁产品的色泽、风味、营养等质量指标明显好于传统的热杀菌的产品，在常温下保藏3 个月后仍然 具有接近于新鲜果汁的品质i 1 0 。美国食品1 ：艺学家协会( i n s t i t u t e o f f o o d t e c h n o l g i s t s ，i f t ) 在1 9 9 9 年专| j 成立了1 r 热食品加l ：分会非热食品加：，主要是非热杀菌，己成为国际食品科技界最为活跃的 研究领域之一。 从上世纪中期起我国学术期刊上开始出现了有关p e f 在食品保藏中应用的综述，近年来陆续有研 究报道。殷涌光等( 1 9 9 7 ) 报道了p e f 杀灭细菌孢子的效果i l 目，申双贵等( 2 0 0 0 ) 报道了p e f 可以提高 胡萝h 汁出汁率l l ”，史梓男等( 2 0 0 2 ) 报道t p e f 杀灭e n 和过氧化物酶的杀灭效果1 1 。祖国仁等( 2 0 0 4 ) 研究了方波p e f 对食品中常见腐败菌，如枯草芽孢杆菌、灰绿青霉的致死作用【l ”。孙静等( 2 0 0 4 ) 研究 了p e f 对酿酒酵母和大肠杆菌的致死率的影响等等i l q 。可以说，我国在p e f 在食品保藏中应用的研究正 在兴起，并己取得阶段性的进步。总体而言，目前我国对p e f 的研究主要集中在杀菌和灭酶方面。 1 1 2 高压脉冲电场技术杀菌机理 微生物细胞和外环境之间进行着活跃的物质交换，细胞膜的完整性对保证细胞生命活动的正常进行 有着极其重要的作用。p e f 的杀菌作用与p e f 对微生物细胞膜的影响密切相关尽管p e f 对微生物有 明显的杀灭效果，但p e f 杀菌机理仍不清楚目前细胞电穿孔模型( e l e e t r o p o r a t i o n ) 1 1 7 l 和电崩解模型 ( e l e c t r i cb r e a k d o w n ) i i s , l o l 为较多人所接受。 1 1 2 1 细胞膜的电穿孔 电穿孔现象是指细胞暴露在高电压脉冲电场下，细胞膜脂质双层和蛋白质出现暂时失稳，并在细胞 膜上形成小孔的现象电场对微生物细胞膜的影响主要体现在，由于膜受压和膜穿孔，导致膜的通透性 增加。 对细胞膜较为通用的模型认为：细胞膜的厚度大约为7 1 0a m 。细胞膜可等效于一个具有低介电 常数的平板电容器，电介质的厚度约为3m i l l 。细胞膜两表面带有极性相反的自由电荷。在外加电场的 作用下细胞膜压缩并形成小孔。细胞质膜通透性增加，小分子( 如水) 透过细胞膜进入细胞内，由于 细胞内的渗透压高于细胞外，通透性的增加导致细胞吸水，致使细胞的体积膨胀，最后导致细胞膜破裂， 细胞内容物外漏，细胞死亡( 如图1 1 所示) 大多数细胞膜产生穿孔的临界电势在0 7v 1 1v 之间 p 2 0 1 。 蠢始小孔 l 电场 一树入、 袋 承 组囊膨蕨 篡砬曩，内容物井i l l 固望 细童溶解 图1 1 电穿孔导致细胞失活机制【1 1 f i g 1 1m e c h a n i s mo f e l e c t r o p o r a t i o no ni n a c t i v a t i o no f c e l l s 1 1 ： 微生物细胞膜由镶嵌蛋白质的磷脂双分子层构成，它有一定的电荷，具有一定的通透性，也有一定 的强度。微生物的细胞膜可看作是一个注满电解质的电容器，在正常情况下膜电位差v 。很小，在外加 2 第一章绪论 电场的作用下形成跨膜电位差v ，当细胞膜上的电位差达到临界崩解电位差v c 时，细胞膜就开始崩解， 导致细胞膜上孔( 充满电解质) 的形成，进而在膜上产生瞬间放电，使膜分解。 细胞质 儡， v ，c ( ) 一e 黝 囫 一e 幽 ( b )( c )( d ) ( a ) 细胞膜视为等效电容( b ) 细胞膜的挤压 ( c ) 可逆击穿形成微孔( d ) 不可逆形成大孔洞细胞膜破裂 图1 2 电场作用下细胞膜发生可逆和不可逆电崩解的示意 f i g 1 - 2m e c h a n i s mo f e l e c 埘cb r e a k d o w n i n a c t i v a t i o no f c e l l s 当细胞膜上孔的面积占细胞膜的总面积很少时，细胞膜的崩解是可逆的；如果细胞膜长时间地处于 高下临界电场强度的作用处理时，会致使细胞膜大面积的崩解。由可逆变成不可逆，最后导致微生物死 亡【l 。图1 2 所示为电场作用下细胞膜发生的可逆和不可逆崩溃过程的示意。 1 1 2 3 其他模型 其它的杀菌机理假说还有粘弹性模型1 2 1 j 、电解产物效应f ”】和臭氧效应等1 。 粘弹性模型理论强调，一是细菌的细胞膜在杀菌时受到强烈的电场作用而剧烈振荡；二是杀菌时由 于强烈的电场作用，介质中产生等离子体，并且等离子体发生剧烈膨胀，产生强烈的冲击波。冲击波强 度超出细菌细胞的可塑性范围而击碎细菌 电解产物理论认为，在电场作用下，电极附近介质中的电解质发生电解产生阴阳离子。这些阴阳离 子穿过细胞膜与细胞内的生命物质( 如蛋白质、核糖核酸等) 结合而使之变性。该理论的缺陷是难以解 释口h 值变化剧烈的条件下杀菌效果没有显著变化的现象。 臭氧效应理论认为是高压电场作用下产生的臭氧起到了杀菌作用i 2 4 1 尽管p e f 杀菌机理目前尚存在争议，但p e f 杀菌技术已经在食品杀菌、细胞生物、基因工程、生物 技术工程领域引起广泛的关注口船q 。p e f 处理食品既能起到有效杀菌的作用，又能保持食品的新鲜和原 有的色香、味，是非热处理食品系菌技术中目前效果最好、最有应用前景的技术，该技术在一些欧美 国家正走向商业化。 1 1 3p e f 技术应用研究 1 1 3 l 微生物杀灭效果的研究 目前，p e f 技术的应用研究主要集中在微生物的杀灭效果研究上。现已陆续报道既手对几十种与食 品有关的微生物具有良好的杀菌作用i 驯。 在国外，应用p e f 技术使液体介质中的微生物失活已有广泛研究。s a l e ；t 和h a m i l t o n i s l 在食品体系中对 微生物的脉冲效应进行了系统的研究。他们的对象菌有大肠杆菌、溶壁微球菌、藤黄八叠球菌、巨大芽 孢杆菌、枯草杆菌、韦氏梭状芽孢杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母等。介质为中性的n a c i 溶液。应用 的电场强度为5 2 5k v c m ，短三角形脉冲，每个脉冲持续2 2 0 螂，脉冲重复速率为i 1 x s 结果发现 酿酒酵母对脉冲最为敏感，而溶壁微球菌的抵抗力最强，电场使微生物失活而不会使产品发生电解和温 度升高。 3 江南大学硕士学位论文 j a y a r a m 等( 1 9 9 2 年) 应用p e f 技术使短乳杆菌失活，认为细胞失活基本上是由于电场诱使细胞壁 破裂，而不是由于欧姆加热引起的“。d i e t r i c h ( 1 9 9 4 年) 研究了使芽孢杆菌和大肠杆菌失活的可能性， 发现高电场强度和长时间处理可使芽孢失活，这可能是由于电处理过程中形成的电解产物间接杀菌作用 f ”。j a c o b 等( 1 9 9 5 年) 用电脉冲使酵母菌失活，他认为对数生长期啤酒酵母细胞比稳定期对强电场更 为敏感致死效果不是由电解产物导致的，而是电脉冲的作用效果f ”。b a r b o s a 等( 1 9 9 9 年) 用脉冲发 生器产生的高强度p e f 处理大肠杆菌，s t a p h y a u r e u s 、枯草杆菌和德氏乳杆菌时发现，在模型食品如模 拟超滤牛乳中，微生物呈现4 5 个对数周期递减口j 。p a i k 用矩型方脉冲波型的短脉冲( o 0 5s ) 测试p e f 脉冲灭活效果。但将0 im l 培养液放在lm m 空隙透明容器中，使微生物在ls 间隔受) u o 0 5s 的脉冲，发 现处理时间和存活率之间呈指数关系口”。p e f 还可使血液、藻类、细菌以及酵母细胞产生一系列的膜降 解变化1 4 1 吴岗( 1 9 9 8 年) 发现对于食品中常见菌，在相同条件下用p e f 灭菌，存活率由高到低为：霉菌、乳 酸菌、大肠杆菌、酵母菌i j w 。原始菌落数、电场强度、处理时间、温度、脉冲频率、介质电导率等都 会影响其灭菌效果。以上只是在实验条件下的研究结果，还未具体应用到食品工业化生产中 1 1 3 2 液态食品品质影响的研究 目前p e f 在食品中的麻用研究主要集中在液态食品，尤其是果汁和牛奶上与热处理相比，采用p e f 对苹果汁、牛奶( 含2 脂肪) 、全蛋液、豌豆汁进行杀菌后，颜色和粘度比热处理的变化小，但对其它 食品感官特性没有明显影响”7 , 1 8 1 。不仅p e f 处理对未过滤的苹果汁、果浆含量高的桔汁、菠萝汁、天冬 甜素溶液等果汁的感官特性没有影响外，有些果汁经过p e f 处理后比新鲜的果汁风味更好，且货架期有 所增长。 d u n n 等( 1 9 8 7 年) 将沙门氏菌( & d u b l i n ) 接种到均质奶中，采用p e f 处理发现，采用电场强度为 3 6 7 k v e m 的脉冲处理后，立即测定与处理后在7 9 贮藏8 天后测定，均没有检测到沙门氏菌。而 未经p e f 处理的自然存在的样品其细菌数增加到lc f u m l ，以大肠杆菌( e c o l i ) 作为对象菌进行p e f 处 理发现降低3 了个对数周期1 ) “ f e m a n d e z - m o l i n a ( 1 9 9 9 年) 发现采用衰减波，用电场强度为4 0 k v e m 、脉冲数为3 0 个、处理时间 为2 邺的p e f 处理脱脂乳，在4 可贮藏两周；先用8 0 u 6s 热处理再用电场强度为3 0 kv c m 、脉冲数为 3 0 个，处理时间为2i t s 的p e f 处理，处理温度不超过2 8 0 ，货架期可提高到2 2 天p “ z h a n g 等( 2 0 0 1 年) 用方波、矩形波等一些波形处理，证明方波最有效，电场强度为3 2 k v e m 处理 时，总好氧菌数减少3 4 个对数周期，p e f 处理和热处理的果汁在4 c 贮藏货架期均超过5 个月，而且v e 含量更高色泽更好i 1 0 1 。 目前p e f 非热杀菌技术已用于蛋液的工业化生产中，其采用的电场强度为3 4 4 5k v l c m ，物料流 速为3 0 0 0 8 0 0l 巾。传统的蛋品热加工中致使蛋白质在热交换器中发生变性絮凝，给生产中带来很大 问题；而p e f 技术由于在较低的温度下钝化微生物，有效地解决了这个问题。另外在实验室已进行了 对苹果汁，桔子汁、脱脂乳、绿豆饮料、米酒和果酒等流体食品的杀菌研究【”3 3 - 3 6 。 1 1 j j 酶钝化效果的研究 相对而言，有关唧在酶活钝化、蛋白质功能和结构方面的研究比较少。v e g a - m e r c a d o 等1 3 7 , 3 s i 发 现p e f 可以使血浆酶活性降低9 0 。使从牛奶和豆制品中分离出来的蛋白酶活性分别降低6 0 和8 0 m i t t a la n dc r o s s 等( 1 9 9 7 ) 研究发现p e f 处理使脂肪酶、葡萄糖氧化酶和小淀粉酶的酶活都降低 了7 0 8 5 ，过氧化物酶和多酚氧化酶的酶活都降低了3 0 4 0 ，磷酸酯酶的酶活下降了5 ， 而溶解酶和胃蛋白酶的活性增加了p 。y e o m 等( 1 9 9 9 ) 研究发现p e f 处理后蛋白酶的活性下降了4 0 。酶构象也发生了变化( 4 0 l 。 4 第一章绪论 还鸯些研究蠹, 4 2 冁递7p e f 对多酚裁纯酶、瓣薪氧含瓣、遵氧拢耪酶、豢胶孕蘸辩、本蹑嚣 自酶等酶活力的影响。但不同研究者的结果大相径庭，甚至相凰矛盾。史梓男等( 2 0 0 2 年) 等报道了 p e f 杀灭霰c o l i 豹效果和对过氧化物酶( p o d ) 熬影昀i i “。 随着p e f 杀菌设备和应期技术静不断进步国际上对p e f 对食品缓分的影响和安全性简题越来越 芰心，近年来这方面的研究报道有增多的趋势。b a r b o s a - c a n o v a s 等发现 4 3 1 ，p e f 处理不会引起卵球缀 魏脖饔显嶷佳，p e f 处理避f 孽努涛蛋鑫貔热凝胶性毵耩骞下降，餐其它链缝弱显嚣孳二热处建戆蟹涛。 l i 等( 2 0 0 3 ) 报道，在使微生物数目减少5 3 个对数周期的作用荆量下，p e f 对牛奶免疫球鬣白( 1 9 0 ) 的活性和结构的影响不显袭l j ，但p e f 对蛋囟质( 包括酶) 豹缨掏和功熊的影响机理仍然不清楚。 1 2 乳铁蛋白 长期以来，人们主要关淀牛初乳中的免疫球蛋白。但研究发现。牛初乳的奇特擞物活性功能还来源 予其它的组分，其中的乳铁凝白( l a c t o f e r r i n ，简称l f ) 正逐步成为各国研究者关注的热点 l f 又称“襞运镶蛋自( l a 渤t r a n s f e r r i n ) ”，晶律呈红色，蘸露学者称乏为“豇攮臼”。l f 在哺毳动 物的初乳中含量最为丰富，约为lg ，l m j 。其中人乳中l f 浓度最离，其次是乳牛和水牛乳汁。在乳汁中， 瓣约毒7 0 分毒在巍溥孛，箕余3 结合在懿餐自、i g a 分泌冀期骥耱上。舞班f 少部势存巍子唾液、 嗽措等外分泌液中，也存在乎血浆以及嗜中性辍细胞中h “椰j 当机体受到炎症刺激时，由粘液上皮细胞 和中性细胞释放l f i ”。 1 9 9 2 譬召开了箨次夺关0 f 麓国际耩讨会，至今备瓣赣究者都在燕燕讨论l f 韵结构、霞鹱及箕垒 物活性等。日本最早开展了基于l f 的i 临床应用试验。夔国在乳晶工业的杼业报告中己将l f 列为跨僦 鳃食品添搬麴。我鼷近年来也充分意识到了这一熹，己姆。采用转基因技零提高牛瑰孛l f 禽量研究” 项目列入了“十五”国家攻关项目。阉家高技术研究发展8 6 3 计划也在“人乳化”奶产品项嗣中明确攒 出要在牛奶中高效寝达l f 等霾要的乳源营养擞白 1 2 , 1 乳後蛋自的结构 1 2 , 1 。1 羲| 铁蛋塞戆藻奉维稳 乳铁鬣白是一种相对分予质量约为8 0 ，0 0 0 的非血红繁铁结合糖蛋白i 卅。l f 的结构与血清转铁蛋白， 虫装或乳浆孛麓转铁蛋白摄鞠似娜, 5 2 1 ，毽l f 豹铁亲帮能力是它弱豹2 6 0 售。l f 是静碱性蛋自痰，等 电点为8 0 z 0 + 2 1 m , s 5 1 。 b e l a m y ( 1 9 9 2 笨) 等人分析了l f 的氨基酸序列，明确了牛乳中的l f 是幽6 8 9 个瓴基酸组成的l s 6 1 。 一整学者谈为分子审熬璇承像台鐾与宅豹生秘功麓密奶糕关。每个疆分予食有1 5 1 6 个营露耱、5 6 个半乳糖、l o 1 1 个n 一乙酰半乳糖胺、1 个唾液酸，1 个糟藻糖1 5 7 1 。l f 多肽链上附有两条碳水化合物侧 链，碳水化台物含最约为7 2 。l f 中g l u 、a s p 、l e u 和a l a 含量较高唯一禽硫氨基酸为c y s ，终端有一 令a l a 残基q 。 l 点1 2 乳铁蛋白的巅体结构 l f 的商缓结构为由单敢链折叠形成的两个基本对称的旰( n - 时和c - 叶) ，见图1 0 所示。l f 呈无裰 银杏叶并列球形结构，每一叶辑进一步形成两个结构域( 肽链c 端为c l 和c 2 ，n - 端为n 1 和n 2 ) 和一条 裂缝，每砖在疼郭裂缝整有一令铰缕会位点，鬓疆每令搽分子零姥台嚣分子矿耧秀分子瓣o o 产或 h c 0 3 一，如豳1 - 4 所示。其整体尺寸为5 5 r i m 3 5 n m x 3 5 r i m ，f e 离予间隔2 8 4 3n m 垩壹盔兰堡主鲎堡丝苎 图1 3l f 的n - 叶( a ) 和c ，叶( b ) 多肽链折叠的环状结构示意图【删 f 嘻i - 3s c h e m a t i cr e p r e s t a t i o n 醛珏枯( a ) n - l o b ea n df b ) c - l o b e p o l y p e p f i d ec a 1 1f o l d ss h o w i n g t h eo p e nc o n f o r m 硝o n s 毒令铁结合部往壹疆个羲基酸藏基( 两个酪氯酸、一令天冬懿酸帮一个组氨酸) 组戒配使律簦台一 分子f e 如，黼c 0 3 2 - 或h c 0 3 + 结合，舆有稳定锻结合的作用5 例。 图1 4l f 的斑体结构图 f i g 1 - 4s c h e m a t i cc o n f o r m a t i o no f l f 分布于肽链c ，端和n 端的2 个铁结合部位具有不同的特性，n 埔球叶较之c 端球叶更容易结合f e h ， 但c 端瑷l t 与铁继仑更柏车崩l “。戴强，x ，射线愆射分辑发现，轴”结合l f 后 l 起磊者鲍橡象发生变 化，郎铁进入敞于f 的裂隙内部后，两结构域闭合，使”的分子结构更趋紧凑删。 l 。2 2 巍铁蛋鑫熬垒兹活性功能 近年来，科学家们利用分子生物学原理，在实验室究成了对l f 功能的研究，并进行了临床试验， 臻定了宅j i 重天体爨其毒匏七犬珐戆：懿增强铁躲簧递帮吸牧婶矧、广谱抗蕤涯牲“，删，撬氧豫馋翔郾删、 调节机体免疫反应螂、抗病繇作用l 稃l 和抗癌作用叫等。萁中前两项生物活性功能是l f 最为独特的生物 功能。 1 2 2 1 增强铁的传递和吸收 疆戆生彩学翡戆与摄取坪境抖静过程鸯关。p a 涮b 稻越殳等夫握窭了著摄敬垮境铗蕨豹规割， 6 第一章绪论 一共虿鞋分秀三爹过程完袋嘲。靛设嚣境铁硬荻次氯蒸兰乙酸镰( f e n a c 3 ) 形式襻在，柔# 疆