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阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 摘要 阿维菌素类药物( a v e r m e c t i n s ，a v m s ) 是由链霉菌产生的一组大环内酯类物 质，常用的有阿维菌素( a v e r m e c t i n ，a v m ) 和伊维菌素( i v e r m e c t i n ，m ) ，因其 具有作用机制独特、安全性高等特点，作为抗寄生虫药剂和杀虫杀螨剂被广泛应 用在农业中。a v m 作为农药，会随雨水流入水体；作为兽药，大部分以原型从 粪便中排出，进而污染水体；近几年来由于养殖密度增大、环境恶化等原因，水 生生物体内的寄生虫发病频率也随之增多，a v m s 还作为鱼类抗寄生虫药剂，在 国内外水产养殖中用来控制鱼虱病等寄生虫疾病，应用越来越广泛。然而，a v m s 在水产养殖中的应用及其水体污染也导致其在水体和水生生物中富集的风险增 加，不仅对消费者的健康构成潜在威胁，而且对我国水产品的国际贸易也造成不 利影响。而目前国内外对水产品中a v m s 多残留检测方法及a v m s 在水生生物体 内的药代动力学研究较少，因此有必要建立水生生物如鲈鱼组织和海水中a v m s 的测定方法，并对其在鲈鱼体内的富集消除规律进行研究。 本论文首先建立了适合鲈鱼肌肉、鳃、肝脏、血液组织和海水中的a v m 和 m 的高效液相色谱荧光检测法。鲈鱼各组织样品首先利用乙腈提取，正己烷 脱脂，无水硫酸钠脱水，并经碱性氧化铝柱净化( 肝脏经碱性氧化铝柱和c18 柱 净化) ，蒸干，最后用n 甲基咪唑和三氟乙酸酐进行衍生化，滤膜过滤后上机分 析。而海水样品则用与水不溶的乙酸乙酯提取，经无水硫酸钠脱水，蒸干，以 n 甲基咪唑和三氟乙酸酐进行衍生化后上机分析。色谱柱采用e c l i p s ex d b c 1 8 反相色谱柱，荧光检测器激发波长3 6 5 n m ，发射波长4 7 5 n m 。本方法鲈鱼肌肉、 鳃组织中a v m 的检测限为0 5 1 x g k g ，i v m 的检测限为l l g k g ；血液、肝脏组织 中a v m 的检测限为l l x g k g ，m 的检测限为2 1 x g k g 。鲈鱼各组织平均回收率 a v m 均在8 0 1 - 9 0 0 之间，i v m 则在7 3 9 8 5 5 之间。海水中a v m 和i v m 的检测限分别为0 0 2 5 “g l 、o 0 5 肛g l 。在0 2 r t g l 、l l x g l 和4 “g l 添加浓度水 平，a v m 和i v m 的平均回收率分别为9 5 1 9 6 5 和8 8 7 9 3 9 。 其次，以a v m 作为a v m s 的代表物，采用半静态法研究了a v m 对鲈鱼的 急性毒性。实验结果表明，鲈鱼对a v m 较为敏感，其9 6 h 半致死浓度l c 5 0 为 v 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 5 2 3 2 4 肛g l ，9 5 可信区间为4 8 2 6 0 p g l - 5 6 3 8 8 p g l ，安全浓度s c 为0 5 2 3p g l 。 a v m 对鲈鱼的安全浓度范围较窄，确定给药剂量时必须严格加以控制。因此本 论文以0 5 “g l 的药物添加浓度作为鲈鱼药浴a v m 的给药剂量。 最后，采用药浴的方式研究了a v m 在鲈鱼肌肉、肝脏、鳃和血液组织中的 富集和消除规律。药浴浓度为0 5 肛g l ，富集实验持续2 0 天，随后进行消除实验， 持续4 0 天。通过对药代动力学参数分析可知，a v m 均能在鲈鱼的肌肉、肝脏、 鳃和血液组织中富集，但不同组织对a v m 的富集能力不同，a v m 在肝脏中的 蓄积能力比较强，而在肌肉中的蓄积能力比较弱。肝脏中a v m 最高浓度c m 麟 可达8 7 3 6 士0 8 8 肛g k g ，药时曲线下面积a u c 肝脏为1 2 9 7 7 7 3 士1 2 2 4 9 鹇h l ，而肌 肉c m 舣仅为7 7 4 ：t = 0 0 8 p g k g ，a u c 肌肉仅为2 1 0 5 7 5 士2 7 7 6 烬。h l ，肌肉、鳃、肝 脏、血液对a v m 的消除半衰期分别为6 9 天、9 5 天、8 2 天和1 0 7 天。由于影 响水生生物药代动力学的因素较多，同种药物在不同水生生物体内的药代动力学 参数有很大差异。因此，建议在1 5 1 8 。c 给药条件下连续药浴2 0 天，休药期为 4 0 天。 关键词：阿维菌素；伊维菌素；鲈鱼；残留检测；富集；消除 v i 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 s t u d yo nt h e a c c u m u l a t i o na n de l i m i n a t i o no f a v e r m e c t i ni np e r c hl j a p o n i c u s a b s t r a c t a v e r m e c t i n s ，ak i n do f16 - m e m b e r e dm a c r o c y c l i cl a c t o n e s ，p r o d u c e db yas o i l a c t i n o m y c e t es t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s , a r ew i d e l yu s e df o rm i t i c i d ea n di n s e c t i c i d ei n a g r i c u l t u r ef o rt h e i re f f e c t i v ee f f o r t h o w e v e r , w h e t h e ru s e df o rp e s t i c i d eo rv e t e r i n a r y d r u g ，t h e ya l lm i g h tp o l l u t et h ew a t e rb e c a u s et h e yw i l lb et r a n s f e r r e di n t oa q u a t i c e n v i r o n m e n t 1 1 1 ed r u g sa l s oh a v eb e e nw i d e l yu s e df o rp e s t i s i d e ，s u c ha ss e a l i c ei n a q u i c u l t u r e ，w h i c he n h a n c et h ep o l l u t i o no fw a t e r t h e r e f o r e ，t h ed r u g sw i l lt h r e a tt h e e o m s u m e r s h e a l t ha n dt h ea q u a t i ce c o n o m yw h e nt h e ya r ed i s c h a r g e dt ow a t e ro r u s e do na q u a t i ca n i m a l sw h i c hw i l la c c u m u l a t ei nt h e s eo r g a n i s m s i ti si m p o r t a n tt o s t u d yt h ed e t e c t i o nm e t h o d so fa v m si ns e a w a t e ra n da q u a t i ca n i m a l s ，s u c ha sp e r c h l a t e o l a b r a x j a p o n i c u s ，a n dr e s e a r c ht h ea c c u m u l a t i o na n de l i m i n a t i o nr u l e so fa v m s i nt h et i s s u e so fp e r c h i nt h i sp a p e r ，t h em e t h o d sf o rd e t e c t i n ga v ma n di v mi nt h et i s s u e so fp e r c hl j a p o n i c u sa n di nt h es e a w a t e rb yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) 谢t hf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nh a v eb e e nd e v e l o p e d i nt h i sm e t h o d ，t h es a m p l e so f p e r c ha r ee x t r a c t e d 谢t l la c e t o n i t r i l ef i r s t l y ，d e g r e a s e db yh e x a n ea n dd e h y d r a t eb y a n h y d r o u ss o d i u ms u l p h a t e ，a n dt h e nc l e a n e du pu s i n gs o l i dp h a s ee x t r a c t i o no n a l u m i n a b ，f o l l o w e db yd e r i v a t i z a t i o n 州t ht r i f l u o r o a c e t i ca n h y d r i d ea n d n - m e t h y l i m i d a z o l e ；s a m p l e so fs e a w a t e ra r ee x t r a c t e dw i t l le t h y la c e t a t ew h i c hi sn o t d i s s o l v ei nw a t e r , t h e nd e h y d r a t e db ya n h y d r o u ss o d i u ms u l p h a t e ，v a p o r i z e db yn 2 ， a n df o l l o w e db yd e r i v a t i z a t i o nw i t l lt r i f l u o r o a c e t i ca n h y d r i d ea n dn - m e t h y l i m i d a z o l e t h e n ，t h ee x t r a c t sa r ea n a l y z e db yt h eh p l cs y s t e m s 谢t l la ne c l i p s ex d b c 18 r p c o l u m na n daf l u o r e s c e n c ed e t e c t o rw i t hh x3 6 5 n ma n dh m4 7 5 n m ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ed e t e c t i o nl i m i to fa v mi nm u s c l ea n dg i l lb o t ha r eo 5 1 x g k g ， a n dt h a to f ma r e1 t g k g ；w h i l et h a to fa v mi nb l o o da n dl i v e ra l elp g k g ， c o m p a r e d 、析t i lt h a to fi v ma r e2 i r t g k g t h ea v e r a g er e c o v e r i e so fa v ma n di v m i n v t l 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 t h et i s s u e so fp e r c ha r e8 0 1 o - - 9 0 o a n d 7 3 9 0 o - - , 8 5 5 ，r e s p e c t i v e l y a n d t h e d e t e c t i o nl i m i to ft h e s et w oc h e m i c a l si ns e a w a t e ra r e0 0 2 5i x g l 0 0 5 i t g la n dt h e a v e r a g er e c o v e r i e sa r e9 5 1 9 6 5 a n d8 8 7 0 o - - - 9 3 9 ，r e s p e c t i v e l y t h e n ，t h et o x i c i t yo fa v mo np e r c hh a sb e e ns t u d i e d 、j ，i t l ls e m i - s t a t i cm e t h o di n t h i s p a p e r i ti sf o u n dt h a t ，t h ep e r c hi ss e n s i t i v et oa v m ，a n dm e d i a n 1 e t h a l c o n c e n t r a t i o ni n9 6 hi s 5 2 3 2 4 p g l t h es a f e - c o n c e n t r a t i o n o fa v e r m e c t i ni s 0 5 2 3 p g la n dt h es a f ec o n c e n t r a t i o ns c o p eo fa v mt op e r c hi sn a r r o w , s ot h ed o s a g e m u s tb ec o n t r o l l e ds t r i c t l y t h e r e f o r e ，0 5 i - t g li su s e df o rt h ef i n a lc o n c e n t r a t i o n f i n a l l y , t h ea c c u m u l a t i o na n de l i m i n a t i o nr u l e so fa v m i nt h et i s s u e s ，s u c ha s m u s c l e ，l i v e r , b l o o da n dg i l lo fp e r c h ，h a v eb e e ns t u d i e d t h ee x p e r i m e n ti sd i v i d e d i n t ot w op r o c e s s e sa n dt o t a l l yl a s t sf o r6 0d a y s t h ef i r s to n ei se x p o s u r ep r o c e s s ， d u r i n gw h i c ht h ep e r c ha r ee x p o s e dt o0 5 r t g lo fa v ma n dl a s t sf o r2 0d a y s t h e nt h e p e r c ha r et r a n s f e r r e di n t of r e s hs e a w a t e rf o re l i m i n a t i o np r o c e s sf o r4 0d a y s t h e r e s u l ts h o w s ，a v mc a na c c u m u l a t ei nt h em u s c l e ，l i v e r , g i l la n db l o o do fp e r c h ，b u t t h ee n r i c h m e n tc a p a c i t yo fe a c ht i s s u ei sd i f f e r e n t t h ee n r i c h m e n tc a p a c i t yo fa v m i sc o m p a r a t i v e l ys t r o n g e ri nt h el i v e r , b u tr e l a t i v e l yw e a k e ri nm u s c l e t h ec m 舣o f l i v e rc a nr e a c ht o8 7 3 6 - a ：0 8 8 i t g k g ，a n da u c m ei s l 2 9 7 7 7 3 4 - 1 2 2 4 9p g h l ，w h e r e a s t h ec m 既o fm u s c l ei s 7 7 4 士0 0 8 i t g k ga n da u c 肌肉i so n l y2 1 0 5 7 5 + 2 7 7 6 腭h l h a l f - t i m ee l i m i n a t i o no fa v mi nt h em u s c l e ，g i l l ，l i v e ra n db l o o do f p e r c ha r e6 9 d a y s ， 9 5 d a y s ，8 2 d a y sa n d10 7 d a y s b e c a u s em a n yf a c t o r sa f f e c tr e s i d u e so fa q u a t i c a n i m a l s ，p h a r m a c o k i n e t i cp a r a m e t e r so ft h es a m ed r u gi nd i f f e r e n ta q u a t i ca n i m a l sa r e v e r yd i f f e r e n t i nt h i sc o n d i t i o n s ，w h e nt h et e m p e r a t u r ei s15 c - 18 c ，o f f - p e r i o do f 4 0d a y si sa d v i s e d k e y w o r d s ：a v e r m e e t i n ；i v e r m e e t i n ；p e r c hlj a p o n i c u s ；r e s i d u ed e t e c t i o n ； a c c u m u l a t i o n ；e l i m i n a t i o n v i 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 蕉；垫塑直墓丝霞蔓缱型壹盟的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：卿网榜签字日期：矾年么月彩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 琊确陟 导师签字： 签字日期：獭年占月g 日 签字日期：年 月 日 i v 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 0 前言 阿维菌素类药物( a v e r m e e t i n s ，a v m s ) 是由链霉菌产生的一组大环内酯类物 质，首先由日本北里研究所的研究人员于1 9 7 5 年从静冈县土样中的一种链霉菌 s t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s 分离得到。随后，美国m e r c k 公司从该菌发酵菌丝中提 取出了一组由8 个结构相近同系物组成的混合天然产物，并将其命名为阿维菌素 ( a v e r m e c t i n ，简称a v m ) 。该公司于1 9 8 1 年实现了a v m 的产业化，并逐渐应用 在农牧业和卫生方面。因a v m 对寄生于动物体内的线虫和节肢动物有极强的驱 杀作用，可将用药剂量由m g k g 级降到p g k g 级，并具有作用机制独特、安全性 高等特点，因此该类药物首先被作为一种抗寄生虫药剂被应用到牲畜的寄生虫防 治中，之后又作为一种杀虫杀螨剂应用到农业害虫防治中。阿维菌素制剂为广谱 高效抗寄生虫药物，不但在国内外畜牧业中长期使用，而且在治疗鱼虱病方面疗 效显著，已应用在国内外水产养殖中。但是水生生物特别是无脊椎动物对a v m s 极为敏感，而且a v m s 对水生生物的毒性数据不够充分，水产品中a v m s 的多 残留检测研究还较少，在很大程度上制约着a v m s 在水产养殖中的安全应用，也 为水产品质量安全及对外贸易埋下了隐患。因此必须进一步加强水生生物中 a v m s 的多残留检测及药代动力学研究，这对我国水产养殖业的安全持续发展、 渔业环境保护标准与法规的制定、水产品对外贸易，具有十分重要的意义。 0 1 阿维菌素类药物简介 0 1 1 族内药物简介 a v m 是由天然发酵组分a v mb 1 。和b i b 组成的混合物，b i 。t 8 0 ，b i b 2 0 ， 它是一组由8 个结构相近的同系物组成的十六元大环内酯混合物。此大环中含有 1 个二糖( 齐墩果糖) 所生成的苷( c 1 3 ) ，还含有2 个六元环的螺缩酮醇系( c 1 丁2 8 ) 和六氢苯并呋喃环系( c 2 c 8 ) 。根据c 5 位上取代基的不同，c 2 2 和c 2 3 之间单双键 的差异及c 2 6 位上取代基的不同，分别用a 、b 、1 、2 和a 、b 的组合来表示，由 此确定了a l a 、a l b 、a 2 a 、a 2 b 、b i 。、b i b 、b 2 a 、b 2 b 等8 个同系物。由于组分a 、 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 b 的活性极其相似，所以很难将两者进行分离。在a v m 的原始菌株发酵产物中， b 系列产量比a 系列多，在a 、b2 个系列中，组分a 的量要远远大于组分b ，例 如b l 中，a 8 0 ，b 2 0 ，其中，产量最多的为b l a 、b l b 、a 2 。由于a v m 毒 性大，稳定性差，寻找其替代品的研究工作方兴未艾1 。伊维菌素( i v e r m e c t i n ， i v m ) 是在a v m 的基础上利用w i l k i n s o n 催化剂对c 2 2 和c 2 3 之间的双键选择 性还原而得到的二氢化产物，即2 2 ，2 3 d i h y d r o a v e r m e c t i nb l ，m 较a v m 具 有较高的安全性，且对某些外寄生虫的杀虫效果较a v m 有所提高。莫西菌素 ( m o x i d e c t i n ，m o x ) 是在a v m 、i v m 的基础上发展起来的，它的化学结构特点 在于c 2 3 位引入n o c h 2 基因，c 1 3 位上少一个二糖基等，但比a v m 和m 具 有更高的驱虫活性和长效、安全等特性，而且还在极低剂量下就有杀体内外寄生 虫的功能。1 9 9 3 年，p f i z e r 公司合成了多拉菌素( d o r a m e c t i n ，d o r ) ，它是利用 突变生物合成方法在a v mc 2 5 位连接上环已烷基，即得到2 5 c y c l o h e x y l a v e r m e c t i nb 1 ( 即2 5 环已烷a v m b l a ) 。d o r 与m 相比，其清除率较低，生物 半衰期较长及a u c 较高乜1 。虽然a v m 、m 和d o r 在防治寄生虫方面发挥了 巨大作用，但是由于这些药物在奶中残留量高，因而禁止用于泌乳期动物。埃伯 利诺菌素( e p r i n o m e c t i n ，e p ) 是在4 ”位上引入- n h c o c h 3 基，它也是由b l 。和b i b 组成( b z a 9 0 ，b l b 9 9 ； c 18 柱：5 0 0 m g ，3 m l ，s u p e l c o ； 碱性氧化铝柱：l g ，3 m l ，s u p e l c o ； 衍生化试剂：a 液为n 甲基咪唑- 无水乙腈( 1 ：1 ) ，b 液为三氟乙酸酐- 无水乙腈 ( 1 ：2 ) 。 1 1 3 色谱条件 色谱柱：e c l i p s ex d b c 1 8 色谱柱，5 岬，2 5 0 m m x 4 6 m m ( 美国a g i l e n t 公司) ； 流动相：1 0 0 甲醇； 流速：1 0 m l m i n ： 进样量：2 0 l x l ； 检测器：荧光检测器，激发波长3 6 5 n m ，发射波长4 7 5 n m 。 1 1 4 方法建立 1 1 4 1 衍生化时间的确立及优化 取1 l a g m l 的a v m 和i v m 混合标准工作液1 0 0 “l ，5 0 下氮气吹干，加入 1 0 0 “l 衍生化试剂a 液，1 5 0 p l 衍生化试剂b 液，涡漩1 0 s ，密封，常温下分别 避光反应0 5 m i n 、l m i n 、5 m i n 、10 m i n 、15 m i n 、2 5 m i n 、4 0 m i n ，以a v m 和i v m 2 1 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 相应衍生化产物的响应值对不同时间点做曲线，确立衍生化反应最优时间。 1 1 4 2 鲈鱼组织样品提取 1 1 4 2 1 提取和净化 本实验的提取方法是在参照美国农业部c l g a v r 0 2 乜3 1 、行业标准s n 0 6 5 0 1 9 9 7 枷、国家标准g b t2 0 7 4 8 2 0 0 6 及莫云蜘、d i s e r e n s 蛆1 、张启迪1 和 侯晓林h 钉等研究方法的基础上加以改进的。 将鲈鱼暴露于含a v m 和m 的海水中一定时间后，分离其肌肉、肝脏、鳃 及血液组织，其中肌肉、肝脏和鳃组织经组织匀浆机匀浆制成鱼糜，血液组织以 4 0 0 0 r m i n 转速离心，取上清液。然后称取5 9 匀浆好的鲈鱼肌肉和鳃组织( 肝脏 组织为2 5 9 ，血液离心后用移液器准确量取2 5 9 _ l ：层液体) ，置于5 0 m l 离心管中， 加入1 5 m l 乙腈，涡漩l m i n ，超声提取2 0 m i n ，4 0 0 0 r m i n 离心5 m i i l ，取出上清液， 再加入2 0 m l 正己烷，充分涡漩，4 0 0 0 r r a i n 离, t 二, 5 m i n ，取乙腈层。沉淀物用1 0 m l 乙腈重复提取一次，上清液加入正己烷中，充分涡漩，离心后，合并乙腈层。将 乙腈层依次过无水硫酸钠柱和碱性氧化铝柱( 碱性氧化铝柱预先用1 0 m l 乙腈活 化和平衡) ，收集滤液。待滤液流至将尽，用6 m l 乙腈冲洗离心管壁，加至碱性 氧化铝柱( 肝脏样品经碱性氧化铝柱和c 1 8 柱净化) ，吹干，合并滤液于鸡心瓶中， 4 5 减压浓缩至干。用2 m l 乙腈溶解残余物，涡漩0 5 m i n ，转移至5 m l 玻璃离心 管，再用l m l 乙腈冲洗鸡心瓶，合并至5 m l 玻璃离心管，5 0 氮气吹干。 1 1 4 2 2 衍生化 上述离心管中加入1 0 0 肛l 衍生化试剂a ，涡漩1 0 s ，再加入1 5 0 l l 衍生化试剂b ， 涡漩1 0 s ，密封，常温下避光反应1 5 m i n ，用甲醇定容至l m l ，过0 4 5 p m 滤膜，进 h p l c 分析。 1 1 5 标准溶液的配制及标准曲线的绘制 1 1 5 11 0 0 p g m l 标准储备液的配制 分别称取适量a v m 和i v m 标准品，溶解于甲醇，配制成1 0 0 1 上g m l 的标准储 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 备液，在4 避光保存。 1 1 5 2l t t g m l 混合标准工作液的配制 用移液管分别精密量取1 m l l 0 0 t t g m l 标准储备液，用甲醇定容至l o o l n l ，配 制成1t t g m l 混合标准工作液。 1 1 5 3 标准曲线的绘制 分别量取上述混合标准工作液，吹干，衍生化，定容，配制成1 、5 、1 0 、2 0 、 5 0 、1 0 0 、2 0 0 p g l 的标准溶液。液相色谱测定，以各组分的衍生化产物色谱峰面 积对浓度作标准曲线，并计算回归方程及相关系数。 1 1 6 回收率及相对标准偏差的测定 取鲈鱼空白组织5 9 ，准确加入合适浓度的标准工作液，制成浓度为l l x g k g - 10 1 上g k g 的添加样品，并按1 2 4 2 项下的提取程序进行操作。以测得量和添加 量之比计算回收率，并计算相对标准偏差。 1 2 结果 1 2 1 衍生化时间的确立 a v m 和i v m 混合标准溶液按照1 2 4 1 处理，经n 甲基咪唑和三氟乙酸酐常温 避光衍生化不同时间，以a v m 和m 相应衍生化产物的响应值对不同时间点做 曲线，见图1 1 。 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 o 5l5l o1 5z 5 4 u 时间( m i n ) 图1 - 1 混合标液衍生化反应时间一峰高关系曲线 m g 1 - 1r e l a t i o n s h i po fd e r i v a t i o nr e a c t i o nt i m ea n dp e a kh e i g h to fm i x e ds t a n d a r d s 从上图可以看出，衍生化反应进行5 m i n 时，反应趋于完全，至j j l 5 m i n 时，衍 生化效果最好，响应值达到最高。衍生化反应5 1 5 m i n ，a v m 和i v m 的5 m i n 、 1 0 m i n 、1 5 m i n 3 点响应值的相对标准偏差均小于1 ，衍生化产物的响应值比较平 稳，效果较好，本研究以1 5 m i n 作为最佳衍生化反应时间。 1 2 2 检测限和标准曲线 空白样品的噪声与对应保留值处衍生化产物的峰面积的比值，以s n 为3 计 算，求得鲈鱼肌肉、鳃组织中a v m 的检测限为0 5 p g k g ，m 的检测限为1 p g k g ： 血液、肝脏组织中a 、，m 的检测限为l p g k g ，i v m 的检测限为2 l 上g k g 。 标准曲线以各组分的浓度对相应的衍生化产物色谱峰面积作图，得到a v m 和i v m 的标准曲线，在1 p 舭o o g l 浓度范围内线性关系良好，其线性回归方 程和相关系数a v m 为：y - - 0 9 8 3 6 x - - 0 6 1 0 7 ，r 2 = 0 9 9 9 7 2 ；i v m 为：y = 0 7 0 8 6 x - - 0 2 9 8 0 ，r 2 = 0 9 9 9 8 0 。标准溶液色谱图见图1 2 。 阳 鲇 弱 蛎 s 已幄鹫 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 j 3 已 桓 鹫 时间( m i n ) 图l - 2 标准溶液色谱图 f 嘻1 - 2c h r o m a t o g r a m so fs t a n d a r ds o l u t i o n 1 2 3 回收率和精密度 通过向空白组织中添加标准溶液，静置3 0 m i n 后按照与样品处理相同的方法 提取测定，进行添加回收率实验，每种药物分低中高3 个添加浓度，每一添加水 平做6 个平行，在各浓度点a v m 和i v m 在肌肉、血液、肝脏和鳃中的平均回收率 见下表，相对标准偏差均小于1 0 。 表1 1 肌肉组织中不同添加浓度的回收率 t a b l e1 - 1t h er e c o v e r i e so f a y ma n di 、刁i nm u s c l ef o r t i f i e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 表l - 2 鳃组织中不同添加浓度的回收率实验数据 t a b l e1 - 2t h er e c o v e r i e so f a v ma n d m i ng i l lf o r t i f i e d 喇恤d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n 表l - 3 血液组织中不同添加浓度的回收率实验数据 t a b l e1 3t h er e c o v e r i e so f a 、嘲a n di v mi nb l o o df o r t i f i e dw i t hd i 腩r e n tc o n c e n t r a t i o n 表1 - 4 肝脏组织中不同添加浓度的回收率实验数据 t a b l e1 - 4t h er e c o v e r i e so f a 垤a n di 、刁hi nl i v e rf o r t i f i e dw i t hd 加k r e n tc o n c e n t r a t i o n 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 1 2 4 样品净化色谱图 鲈鱼的肌肉、鳃、血液和肝脏组织均采用乙腈提取，正己烷去脂；肌肉、鳃 和血液样品均采用碱性氧化铝固相萃取柱进行净化，而肝脏样品则同时采用碱性 氧化铝固相萃取柱和c 1 8 固相萃取柱进行净化，样品净化后的色谱图分别如下所 示： 1 2 4 1 肌肉组织净化色谱图 5 已 幢 磐 -：，50：拿 时间( m i n ) 图l - 3 提取液经碱性氧化铝柱净化后的色谱图 n 蛋l - 3c h r o m a t o g r a m s o fe x t r a c to fm u s c l e c l e a n e du pb ya l u m i n a - bc o l u m n j 3 已 恒 彗 j o 已 褪 髫 i2，4i4： 时间( m i n ) 图1 4 提取液经c 1 8 柱净化后的色谱图 f i g 1 - 4c h r o m a t o g r a m so fe x t r a c to f m u s c l ec l e a n e du pb yc 1 8c o l u m n 时间( m i n ) 图1 - 5 肌肉组织空白样品色谱图 f i g 1 - 5c h r o m a t o g r a m so fc o n t r o ls a m p l e s 肌肉是鱼组织中重要的可食部分，与空白色谱图比较来看，肌肉样品中的杂 质主要对a v m 的测定造成干扰。经碱性氧化铝柱净化的样品，净化效果较好， 杂质峰少且与a v m 及i v m 均能很好的分开，而经c 1 8 柱净化的样品，杂质峰较多， 2 7 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 对a v m 的测定造成干扰。因此，本实验采用碱性氧化铝柱来净化肌肉样品。 1 2 4 2 鳃组织样品色谱图 o 已 幄 鹫 s d 恒 髫 时间( m i n )时间( m 岫 图1 石鳃提取液经碱性氧化铝柱净化后的色谱图图1 7 鲤组织空白样品色谱图 f i g 1 _ 6c h r o m a t o g r a m so fe x t r a c t so fg i n f 喀1 - 7c h r o m a t o g r a m s o fc o n t r o ls a m p l e s c l e a n e du p b ya l u m i n a - bc o l u m nc l e a n e du pb ya l u m i n a - bc o l u m n 鳃是鱼类与水体环境首先接触的组织之一，具有气体交换和解毒功能。而且 有毒物质能够通过鳃富集并传递到鱼类其它组织器官，因此研究鳃组织中a v m 和m 的净化及提取方法具有积极意义。由上图可知，鳃组织样品经提取后采 用碱性氧化铝柱净化同样具有良好的效果。 1 2 4 3 血液组织样品色谱图 j o j 、_ ， 恒 髫 j 一 3 已 握 磐 时间( m i n )时间( m i n ) 图1 血液提取液经碱性氧化铝柱净化后的色谱图图1 - 9 血液组织空白样品色谱图 f 唔1 - 8c h r o m a t o g r a m so fe x t r a c t so fb l o o df i g , 1 - 9c h r o m a t o g r a m so fc o n t r o ls a m p l e s c l e a n e du pb ya l u m i n a - bc o l u m nc l e a n e du pb ya l u m i n a - bc o l u m n 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 血液不但具有富集有毒物质的功能，还可以将有毒物质运输到肝脏等其它器 官。但是血液中含有的成分可能会影响样品净化效果，实验中将血液离心后取血 清部分进行提取并采用碱性氧化铝柱净化，效果良好。 1 2 4 4 肝脏组织样品色谱图 j 3 已 恒 墅 时间( m i n ) 图l l o 肝脏提取液经碱性氧化铝柱 和c 1 8 柱净化后的色谱图 j o 已 恒 磐 时间( m i l l ) 图1 1 1 肝脏组织空白样品色谱图 f 嘻1 - 1 0c h r o m a t o g r a m so fe x t r a c t so f l i v e r f 喀1 - 1 1c h r o m a t o g r a m so fc o n t r o ls a m p l e s c l e a n e du pb ya l u m i n a - ba n dc 1 8c o l u m n sc l e a n e du pb ya l u m i n a - ba n dc 1 8c o l u m n s 肝脏是鱼类中最重要的解毒和毒素富集器官，但肝脏样品中脂肪含量较高， 本实验过程中如果仅采用碱性氧化铝柱对肝脏样品净化，净化效果不明显；但同 时采用碱性氧化铝柱和c 1 8 柱进行两次净化，则取得良好净化效果。因此，本 论文中肝脏样品的检测采用双柱净化。 1 3 讨论 1 3 1 样品前处理 1 3 1 1 样品提取 乙腈、甲醇和乙酸乙酯是药残分析过程中常用的提取溶剂，它们不但对a v m 和i v m 有很好的溶解能力，而且与组织的相溶性也很好，渗透能力强，且乙腈和 甲醇还兼有去除蛋白和部分脂肪的功能，因此本研究分别采用乙腈、乙酸乙酯和 甲醇作为提取溶剂进行比较。结果表明，采用乙腈提取的回收率最高，而采用乙 阿维菌素在鲈鱼组织中的富集消除规律研究 酸乙酯和甲醇提取的回收率偏低。虽然a v m 和m 在甲醇中有较高的溶解性， 但甲醇对样品中基质成分也有较高的溶解性，导致提取液中杂质干扰成分较多。 血液的成分比较复杂，包括血浆、血细胞和血小板等。由于本实验中血液自 然凝固后进行离心，之后取上层液体分析，因而主要分析的为血清中的a v m 和 m 含量，这样可以有效减少血细胞等一些杂质的干扰，提高检测限和灵敏度。 另外，样品提取过程中采用超声的提取方法对目标化合物进行提取，与其他 作者采用的组织匀浆机方法相比较，不但减少提取过程中目标化合物的损失，提 高了回收率，而且还避免了样品间出现交叉污染。 1 3 1 2 样品净化 样品净化是样品前处理步骤中关键的一步，选择固相萃取柱的种类很重要。 d i s e r e n s 等n 8 1 曾使用c 1 8 柱来净化水果和蔬菜中的a v m ，侯晓林等h 鲫选择碱性氧 化铝柱和c 18 柱相结合来净化牛肝脏中e p 、a v m 、d o r 和i v m 。本研究采用碱性 氧化铝柱来净化，且与c18 柱进行比较。经碱性氧化铝柱净化后，提取液蒸干后 的残留物比c 1 8 柱明显减少，且提取液经碱性氧化铝柱的净化速度较c 1 8 柱快， 操作比较简单，但碱性氧化铝柱若洗脱不彻底，会影响回收率，故应采用较多的 乙腈来洗脱。在过碱性氧化铝柱前，预先过无水硫酸钠柱，去除样品中的水分， 可提高净化效果，防止衍生化过程中水分的干扰。 对于肝脏组织，由于肝脏的成分比较复杂，单独采用碱性氧化铝柱或c 1 8 柱 均未能取得良好的净化效果，但如果同时采用碱性氧化铝柱和c 1 8 柱进行净化， 发现肝脏能够得到较好的净化效果。 此