（食品科学专业论文）雄烯二酮高产菌株的诱变育种及发酵性能研究.pdf

雄烯二酮高产菌株的诱变育种及发酵性能研究 摘要 。雄烯二酮( a d ) 是制备甾体激素类药物的重要中间体，可通过微生物选择性 切除植物甾醇侧链制得。微生物法制取a d 具有产品纯度高、生产成本低、周期 短等特点，但也存在菌种转化能力普遍不高，底物甾醇在水中溶解度低等缺点。 针对上述问题，本文通过诱变育种筛选出一株a d 高产突变株分枝杆菌 m y c o b a c t e r i u ms p b d 6 9 6 6 ，显著提高了a d 产量和转化率，并且以有机相一水 相两液相培养系统作为发酵系统，明显提高了甾体底物的投料量。同时，研究 了培养基组成以及发酵条件对转化的影响。 研究的主要结论有； ( 1 ) 采用紫外线诱变、硫酸二乙酯诱变以及两者复合诱变方法对分枝杆菌 m y c o b a c t e r i u ms p b d 6 9 6 进行诱变，筛选得到一株a d 高产突变株分枝杆菌 m y c o b a c t e r i u ms p b d 6 9 6 ，6 ，在甾醇添加量为6 时，a d 浓度最终达到2 - 3 3 l ， a d 转化率为6 1 4 ，比出发菌株提高1 3 5 。连续传代5 次，生产稳定性良好。 ( 2 ) 通过单因素实验和正交实验，确定两相系统中有机相葵花油最佳添加浓 度为2 0 ，水相培养基最佳c 、n 、p 源以及金属离子种类和浓度分别为：糖蜜 6 ，n h 4 n 0 30 3 ，( n h 4 ) 2 h p 0 4o 0 8 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 5g l ，z n s 0 4 7 h 2 00 3 g l ，m g s 0 4 - 7 h 2 00 2 l 。在最佳培养基条件下以及甾醇添加量为6 o 时，a d 转化率达到8 4 o ，比原培养基条件下的转化率提高了2 2 4 。 ( 3 ) 通过单因素实验，确定了摇瓶发酵阶段的最适发酵条件是：液体种子培 养时间6 6 h ，接种量1 2 ，装液量5 0 m l 2 5 0 m l 一- - - 角瓶，摇床转速2 2 0 r p m ，温度 3 0 3 2 ，初始p h 7 5 。 ( 4 ) 在5 l 发酵罐中进行的放大培养试验验证了摇瓶发酵的高转化率。a d 的 转化率随着甾醇添加量的提高而有所降低，但总产量明显提高。甾醇添加量在 8 时，a d 转化率在1 0 8 h 达到最高9 7 。l ，此时产量为4 9 2 9 l ；甾醇添加量在 1 6 9 & 时，a d 转化率在1 2 0 h 达到8 2 1 ，此时产量高达8 3 3 9 l 。因此，适当提高 甾醇的加量从经济角度考虑是可取的。 关键诃：雄烯二酮；植物甾醇：高产菌株；诱变育种；两相系统；发酵性能 m u t a t i o nb r e e d i n ga n df e r m e n t a t i o nr e s e a r c ho f a n d r o s t - 4 - e n e - 3 ，1 7 一d i o n ep r o d u c i n gs t r a i n a b s t r a c t a n d r o s t - 4 一e n e - 3 ，1 7 - d i o n c ( a d ) w a sak e ym i d d l ep r o d u c to fs t e r o lh o r m o n e s a n dc o u l db eo b t a i n e db ys e l e c t i v e l yc l e a v i n gt h es i d e - c h a i no fp h y t o s t e r 0 1 t h e m i c r o b i a lp r o d u c t i o no fa dh a dt h ea d v a n t a g eo fh i g hp u r i t y ，l o wc o s ta n ds h o r t c y c l et i m e ，b u ti tw a sr e s t r i c t e db yt h ec o n v e r s i o na b i l i t yo fm i c r o b e sa n dl o w s o l u b i l i t yo fp h y t o s t e r 0 1 i nt h i se x p e r i m e n t ，am u t a n tw i t hh i g hp r o d u c t i v i t y ， m y c o b a c t e r i u ms p b d - 6 9 6 w a so b t a i n e d ，w i t hw h i c ha do u t p u ta n d t r a n s f o r m a t i o nr a t ei n c r e a s e d 、n o t a b l y b e s i d e s ，a q u e o u s - o r g a n i ct w o - p h a s es y s t e m w a su s e da st h ef e r m e n t a t i o ns y s t e mw h i c hb o o s t e dt h ec o n c e n t r a t i o no fp h y t o s t e r o l s u b s t r a t eg r e a t l y t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tm e d i u mi n g r e d i e n t sa n df e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so nt r a n s f o r m a t i o nw e r ea l s os t u d i e d t h ec o n c l u s i o n so ft h es t u d yw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ea dp r o d u c i n gs t r a i n ，t h em i c r o o r g a n i s m o fm y c o b a c t e r i u ms p b d - 6 9 6w a st r e a t e db yu v ，d e sa n du vc o m b i n e dw i t hd e s am u t a n tw a s o b t a i n e dw h o s ea dt r a n s f o r m a t i o np r o d u c t i v i t yr e a c h e dt o2 3 3 9 1w h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fp h y t o s t e r o lw a s6 a n dt h ec o n v e r s i o nr a t ew a s61 4 w h i c hw a s 1 3 5 h i g h e rt h a nt h a to fi t sp a r e n ts t r a i n h e r e d i t a r ys t a b i l i t yt e s td e m o n s t r a t e d t h a tt h ep r o d u c t i v i t yo fm u t a n ts t r a i nf r o m1s tt 0 5 t hs e r i a lp a s s a g ew a ss t a b l e ( 2 ) t h em e d i u mw a so p t i m i z e db ys i n g e rf a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a l d e s i g no fe x p e r i m e n t t h eo b t a i n e do p t i m a lm e d i u mi n g r e d i e n t sw e r e ：s u n f l o w e r o i l2 0 ，m o l a s s e s6 ，n h 4 n 0 3o 3 ，( n h 4 ) 2 h p 0 4o 0 8 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 5g l ， z n s 0 4 7 h 2 0o 3g l m g s 0 4 7 h 2 00 2g l u n d e rt h eo p t i m a lm e d i u md e t e r m i n e d ， t h ec o n v e r s i o nr a t er e a c h e dt o8 4 o w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e p h y t o s t e r o lw a s6 0 ，w h i c hw a s 2 2 4 h i g h e rt h a nt h eo r i g i n a lm e d i u m ( 3 ) t h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw i t hf l a s kw e r eo p t i m i z e db yu n i f a c t o r e x p e r i m e n t t h eo b t a i n e do p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r e ：i n c u b a t i o nt i m e6 6 h ， i n c u b a t i o n1 2 ，l i q u i dv o l u m e5 0 m l 2 5 0 m lf l a s k ，r o t a t i n gr a t e2 2 0 r p m ，c u l t u r e t e m p e r a t u r e3 0 - 3 2 i n i t i a ip h 7 5 ( 4 ) t h er e s u l to f5 lb i o r e a c t o ri d e n t i f i e dt h eh i g ho u t p u to fs h a k i n gf l a s k s f e r m e n t a t i o n t h ec o n v e r s i o nr a t ew o u l dd e c r e a s ew i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n o fp h y t o s t e r o l ，b u tt h et o t a l o u t p u t w o u l di n c r e a s er e m a r k a b l y w h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fp h y t o s t e r o lw a s8 0 t h ec o n v e r s i o nr a t er e a c h e dt o9 7 1 a t1 0 8 h i i a n dt h eo u t p u tw a s 4 9 2 9 l w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fp h y t o s t e r o lw f s16 。t h e c o n v e r s i o nr a t er e a c h e dt o8 2 1 a t1 2 0 ha n dt h eo u t p u tw a s 8 3 3 9 l i tw a s e c o n o m i c a l l ya c c e p t a b l et oi n c r e a s et h ec o n c e n t r a t i o no f p h y t o s t e r o lp r o p e r l y 。 k e y w o r d s ：a n d r o s t 一4 e n e 3 ，1 7 - d i o n e ；p h y t o s t e r o l ；m y c o b a c t e r i u ms p ；m u t a t i o n b r e e d i n g ；t w o - p h a s es y s t e m ；f e r m e n t a t i o nc a p a b i l i t y i l i 插图清单 图1 1 甾体化合物的结构式1 图1 - 2 甾体化合物的微生物转化反应位点3 图l - 3a d 与a d d 的结构式4 图1 4 胆固醇转化为a d d 与a d 的反应途径”5 图1 5 甾体母核的降解过程6 图2 1t l c 分析图1 9 图2 - 2a d 标品的气相色谱图1 9 图2 - 3a d 含量标准曲线2 0 图2 4 紫外线诱变的致死率曲线。2 1 图2 5 硫酸二乙酯诱变致死率曲线2 1 图2 - 6 复筛结果2 2 图2 7 种子生长曲线2 3 图2 - 8 发酵动力学曲线2 4 图3 - 1 不同有机相种类对发酵的影响2 9 图3 - 2 有机相不同浓度对发酵的影响3 0 图3 3 不同碳源种类对发酵的影响3 0 图3 - 4 碳源不同浓度对发酵的影响3l 图3 5 不同氮源种类对发酵的影响3 1 图3 - 6 氮源n h a n 0 3 不同浓度对发酵的影响3 2 图3 7 不同磷酸盐种类对发酵的影响3 2 图3 - 8 磷源 h 4 h h p 0 4 不同浓度对发酵的影响3 3 图3 - 9f e s 0 4 7 h z o 不同浓度对发酵的影响3 5 图3 1 0z n s 0 4 7 h 2 0 不同浓度对发酵的影响3 5 图3 11m g s 0 4 7 1 0 不同浓度对发酵的影响3 6 图4 1 液体种子培养时间对发酵的影响4 2 图4 2 接种量对发酵的影响4 2 图4 3 装液量对发酵的影响4 3 图4 - 4 转速对发酵的影响4 3 图4 ，5 培养温度对发酵的影响4 4 图4 。6 初始p h 对发酵的影响，4 5 图4 - 75 l 发酵罐中a d 转化率与发酵时间的关系”4 6 图4 - 85 l 发酵罐中a d 浓度与发酵时间的关系4 6 v 表格清单 表1 - 1 工业上重要的甾体药物微生物转化反应3 表2 1 不同诱变条件下平板初筛突变株数量2 2 表2 - 2 突变株生产稳定性考察2 3 表3 1l 9 ( 3 4 ) 正交试验因素水平表2 8 表3 - 2l 1 6 ( 4 5 ) 正交试验因素水平表2 9 表3 - 3l 9 ( 3 4 ) 正交试验设计及试验结果3 3 表3 - 4l 9 ( 3 4 ) 正交试验方差分析表3 4 表3 - 5b ( 3 4 ) 正交试验验证实验结果3 4 表3 - 6l 1 6 ( 4 5 ) 正交试验设计及试验结果3 6 表3 7l 1 6 ( 4 ) 正交试验方差分析表3 7 表3 - 8l 1 6 ( 矿) 正交试验验证实验结果r3 8 表4 1 摇瓶发酵条件优化单因素实验综合验证结果4 5 v m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所 知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外。论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得金噩王些态堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 艄稗唧触蝴桫卜月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金g b 王些左堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权盒筵薹些太 兰! 一可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者躲啼黼跏 导师躲 辩醐：砷年脚( 7 1 3 签字日期：沙f 年归月( 7 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 签字日哆一7 年，。月7 日 矿勺阻、| 电话： 邮编： 致谢 本论文是在我的导师姜绍通教授的悉心指导下完成的。无论是从论文的选 题、试验方案的制定还是论文的修改完稿，姜老师都倾注了大量的心血，给予 了我无微不至的关怀和帮助。姜老师严谨求实的治学作风、对科学的执着追求 以及对人生的深刻理解，都使我受益匪浅。在此向姜老师致以最诚挚的谢意和 最崇高的敬意! 课题论文的完成是对我近三年研究生所学知识和技能的一个大总结，更是 对以前知识的巩固和提升，不仅使我的动手能力得到了很大提高，也使我的创 新思维得到了很好发展。感谢校、院、系领导和实验室的老师们为我们营造了 一个的浓厚的学术氛围和良好的实验环境，也为我们今后的工作和学习打下了 坚实的基础。 感谢潘丽军教授、郑志副教授、罗水忠老师、扬英老师、操丽丽老师、李 兴江老师、陈晓燕老师给了我许多指导和帮助。此外，学姐张婵婵、同学赵俊 平、梁铁艳等及本科生崔福强在实验过程中给予了我不少启发或协助，也向他 们表示感谢。同时感谢挚友张倩同学以及实验室的刘兰花、张轶、章炳谊、陈 晓辉、蒋连平同学，两年多年共同的学习生活，我从他们身上学到了很多。 感谢我的家人，他们的支持和鼓励，使我能够顺利完成这篇硕士论文，这 里谨向他们致以最衷心的感谢! 两年多年的研究生生活是我人生最宝贵的财富，再次感谢所有关心和帮助 我的领导、师长、家人、同学及朋友们! 作者：胡锦艳 2 0 0 7 年1 2 月1 9 日 第一章引言 一! ，舍萨h 3 c h。一32c弓6,25ch 舒 i 广”x “ 1 1 1 2 嚣议? 2 3 一弋 ：，博嵫6h 。 1 1 2 甾体激素类药物的分类及功能 自二十世纪5 0 年代以来，随着甾体化学的迅速发展，甾体激素类药物己逐 渐成为医药领域的重要门类，在临床上的应用日益广泛。在世界范围内其产量 仅次于抗生素，为第二大类药物。 甾体激素类药物主要分为三大类【2 】： ( 1 ) 肾上腺皮质激素( a d r e n n o c o r t i c o s t e r o d s ) ，简称皮质激素，包括盐皮 质激素和糖皮质激素两类。盐皮质激素( m i n e r a l o c o r t i c o i d s ) 在体内主要影响水盐 代谢，主要药物有醛固酮( a l d o s t e r o n e ) ，临床上主要应用于治疗阿狄森氏内分 泌疾病。糖皮质激素( g l u c o c o r t i c o i d s ) ，主要生理作用是影响糖、蛋白质、脂肪 和水盐代谢，主要有可的松( c o r s t i s o n e ) ，泼泥松( p r e d n i s o n e ) 、地塞米松 ( d e x a m e t h a s o n e ) 、倍他米松( b e t a m e t h a s o n e ) 等，其主要功效为抗炎、抗毒、抗 过敏、免疫抑制，对风湿性、类风湿性关节炎、红斑狼疮等胶原性疾病有明显 的治疗作用。 ( 2 ) 性激素( s e xh o r m o n e ) ，包括雌激素、孕激素和雄激素。雌激素 ( e s t r o g e n s ) 主要有雌酮( o e s t r o n e ) ，雌三醇( e s t r i 0 1 ) 等，孕激素( p r o g e s t o e n s ) 主要 有孕酮( p r o g e s t e r o n e ) ，临床上常用于治疗妇科疾病，骨质疏松等。雄激素 ( a n d r o g e n s ) 主要有睾酮( t e s t o s t e r o n e ) ，临床上主要用于两性性机能不全所致的 疾病，还可用于治疗贫血、消耗性疾病以及促进骨折和伤口的愈合等。 ( 3 ) 蛋白同化激素( a n a b o l i cs t e r o i d s ) ：主要有1 7 0 一甲基去氢睾丸素( 1 7 a m e t h y l d e h y d r o t e s t o s t e r o n e ) 、苯丙酸诺龙( n a n d r o l o n e p h y l p r o p i o n a t e ) 等，主要用 于蛋白质合成不足和分解增加的治疗，如营养不良、严重烧伤、恶性肿瘤、手 术后恢复期过长、慢性消耗性疾病以及长期大剂量使用糖皮质激素引起的负氮 平衡等。 1 1 3 甾体激素类药物的制各方法 1 1 3 1 传统方法 甾体药物的结构比较复杂，若用全合成方法进行制备，常常由于反应步骤 较多，不甚经济，因此，甾体药物的生产极大部分都是利用己具有甾体骨架的 天然产物进行结构改造而成。胆酸、薯蓣皂甙元、海柯皂甙元和惕告皂甙元等 都是制造甾体药物的原料。其中，从薯蓣皂甙元中提取薯蓣皂素作为合成甾体 药物原料，在相当长的一段时期内占据着主导地位( 约占7 0 ) ，我国大多以薯蓣 皂素为原料i j - - 6 1 。 1 1 。3 2 微生物制法 随着甾体医药工业对薯蓣皂素的需求日增，薯蓣资源日渐枯竭，急需新方 法来代替传统的生产方式。1 9 5 2 年，美国u p j o h n 公司的p e t e r s o n 和m u r r a y 首先发 现少根根霉( r h i z o p u sa r r h i z u s ) ，以后又发现黑根霉( r h i z o p u sn i g r i c a n s ) 能使黄 体酮一步转化成1 l o 一羟基黄体酮，收率达8 5 以上，解决了生产可的松等皮质 激素药物的最大难题。化学合成难以完成的反应，利用微生物轻两易举得到了 实现，由此开创了微生物转化甾体化合物的先河。 微生物对甾体化合物的转化反应是多样的，它们对甾体每一位置( 包括甾体 母核和侧链) 上的原子或基团都有可能进行生物转化( 见图1 2 ) 1 7 。这些反应 至今已经发现的主要有氧化、还原、水解、酯化、酰化、异构化、卤化、a 环 开环、边链降解等( 见表1 - 1 ) 【2 1 。以上反应不一定都是单一的转化，有时一种 微生物还可以对某种甾体化合物同时产生数种不同的转化反应。目前在甾体激 素药物的生产中，比较重要的微生物转化反应主要有羟基化、脱氢、边链降解 等。在这些反应中，羟基化反应应用最多，边链降解的重要性也不容忽视。人 们可以直接利用微生物切除天然甾醇的侧链生产甾体药物中间体雄烯二酮( a d ) 和雄二烯二酮( a d d ) ，a d 与a d d 再经化学方法进行结构改造可得到一系列有价 值的甾体激素类化合物。这不仅从根本上改交了薯蓣皂素法生产某些甾体药物 步骤多，转化率低，价格贵等不足之处，而且使得自然界丰富的甾体资源得到 有效的利用，鳃决了甾体医药工业中所需原料的问题，促进了甾体医药工业的 迅速发展。 2 川l 八嚣岳导辨 漪c h s j c弋器id 紧_ 卜 j ；： k ，看1 8 一h 。乏 l o l y 圈1 - 2 甾体化台物的微生物转化反应位点 f i g 1 - 2b i o t r a n s f o r m a t i o ns i t e so fs t e r o i d s 袭1 1t 业上重要的甾体药物微生物转化反应 t a b l e 卜ii m p o r t a n tk i n d so f b i o t r a n s f o r m a t i o ni ni n d u s t r y 1 2 雄烯二酮和雄二烯二酮 1 2 1 雄烯二酮和雄二烯二酮的功能作用 雄烯二酮( 雄甾4 烯3 ，1 7 二酮，a n d r o s t e n e d i o n e ，简称a d ，分子式： c 1 9 h 2 6 0 2 ) 和雄二烯二酮( 雄甾1 , 4 二烯3 ，1 7 二酮，a n d r o s t a d i e n e d i o n e ，简 称a d d ，分子式：c 1 9 h 2 4 0 2 ) 是制备甾体激素类药物的重要中间体。a d 主要用 来生产雄性激素、蛋白同化激素、螺内脂等药物；面a d d 是合成1 9 去甲甾体系 列雌激素，如雌酮( e s t r o n e ) 、炔诺酮( n o r e t h i s t e r o n e ) 和黄体酮( p r o g e s t i n ) 的重要 前体物。a d 与a d d 除了可以合成性激素外，还可以通过在其1 7 位酮基上引入 皮质激素侧链傻之能够应用于皮质激素的生产。因此，通过a d 与a d d 几乎可 以合成所有的甾体药物 s l 。 3 图1 - 3 a d 与a d d 的结构式 f i g 。1 - 3t h es t r u c t u r eo f a da n da d d a d d 1 2 2a d 和a d d 的传统制各方法 目前a d 和a d d 的制备有两种途径【9 1 。其一是薯蓣皂甙元途径：即从野生中 药材“穿地龙”等植物中提取薯蓣皂素，进行化学合成。其二是微生物转化途 径：即以自然界丰富存在的动植物甾酵为原料，通过微生物发酵技术将甾醇侧 链选择性切除得到产物。 a d 和a d d 的传统生产方法的局限性在于：( 1 ) 化学工艺过程复杂，步骤 繁琐；( 2 ) 成本商、消耗大( 穿地龙1 7 0 公斤一皂素1 4 公斤一双烯一醋酸地氢 表雄酮一表雄酮- - a d ( d ) i 公斤，总成本不低于￥1 0 0 0 元公斤) ；( 3 ) 破坏环 境。目前穿地龙资源十分紧张，人们无秩序、不科学采挖，不但破坏了地表植 被，还破坏了生态环境。而人工种植黄姜由于种植周期长、大量占用耕地，且 严重破坏地力，大量浪费了有限的土地资源。此外，提取皂素过程也严重污染 环境d o 。 l 。2 3a d 和a d d 的微生物转化途径 1 2 3 1 微生物转化途径的优势 由于市场对a d ( d ) 的需求日益增长，传统生产方法所用原料薯蓣皂甙元资 源日渐枯竭，价格也不断攀升。因此，目前以稀缺的薯蓣皂甙元为原料的工业 体系逐渐被以自然界丰富存在的动植物甾醇为原料的工业体系所代替乃甾体医 药工业发展的一大趋势。 1 2 3 2 微生物降解动植物甾醇的机理 ( 1 ) 微生物法生产a d ( d ) 的过程机理 1 9 6 8 年s i h 和w h i t l o c k ”】就对胆固醇代谢作了一系列实验并作了全面解释。 微生物降解胆固醇生产a d 的过程包括c 3 位的酯化，5 双键被异构酶催化转位 到4 - 双键的异构化以及c 1 7 边链的降解。甾醇c 1 7 边链的降解与脂肪酸b 氧化相 似i i2 1 ，开始于c 2 7 羟基化，再氧化成c 2 7 羧酸，然后通过1 3 氧化失去丙酸、乙酸、 最后再失去丙酸，形成c 1 7 酮化合物。而后a d 再进行c 1 , 2 脱氢即可得至j a d d 。如 图1 4 所示： 4 d 图1 4 胆固醇转化为a d d 与a d 的反应途径【1 3 1 f i g 1 4t h er e a c t i o np r o c e s sf r o mc h o l e s t e r o lt oa d da n da d ( 2 ) 甾核的降解 微生物对甾醇降解并不终止于a d ( d ) 的生成。a d 生成之后，微生物还将对 其c 1 2 位进行脱氢及9 一q 羟化，然后a 环芳构化，b 环开裂。甾核即被降解。如图 1 - 5 所示： o o c 0 2 + i - 1 2 0 图1 - 5 甾体母核的降解过程m f i g 1 5t h ed e g r a d m i o no fs t e r o i dn u e l e a r 甾醇降解过程的机理表明，在微生物转化甾醇过程中，要想获得大量a d 、 a d d 等重要甾体药物生产中间体，必须设法控制好c i ，氧化边链酶，9 - 0 羟化酶 和c 1 2 脱氢酶活性，使反应朝有利于产物生成的方向发展。 1 2 4 微生物转化法生产a d ( d ) 的国内外发展概况 微生物转化法生产a d ( d ) 经过了两个较大的发展阶段，即：传统单一水相 系统微生物转化和包括两相系统、双水相系统、浊点系统在内的新型发酵系统 微生物转化。 1 2 4 。1 传统单一水相系统的发展 早在1 9 4 4 年，t u r f i t t l 就报道了分枝杆菌能利用胆固醇及植物甾醇作为生 长繁殖的唯一碳源，但它除了降解侧链外，还进一步降解甾体的骨架，因此不 能用于生产甾体激素的中间体如a d 等。直到1 9 6 9 年日本a r i m a l l 5 , 1 6 等人用添加 抑制剂的方法使分枝杆菌只降解胆圃醇的侧链生成a d d 而不降解甾核，从此开 始了微生物降解各种甾醇合成a d d 的研究。7 0 年代，m a r s c h e c k 【1 7 】等用诱变的 6 艘静古 方法筛选到分枝杆菌m y c o b a c t e r i u mn r r lb 3 6 8 3 ，无需加入抑制剂便能有效降 解胆固醇、胆甾酮、植物甾醇等的侧链产生a d d ，该菌的进一步诱变得到了丧 失c i ，2 脱氢酶活力m y c o b a c t e r i u mn r r lb 3 8 0 5 的突交株，该菌能有效产生a d 。 自2 0 世纪8 0 年代以来，微生物降解甾醇生成a d 、a d d 技术得到充分发展。国 外很多大的制药公司如日本三菱化成，西德先令( s c h e r i n gag ) ，荷兰g i s t ，美 国u p j o h n 等在8 0 年代后期就已将甾醇发酵生成4 a d ，a d d 的路线用于工业生 产，大大降低了成本s ，旧】。近些年来，随着基因工程技术的进展，有研究者从 基因方面考虑寻找非致病微生物菌落，经过诱变等方式处理获得突变菌株，提 高产物产量 2 0 , 2 1 】。r a n j i t 等就构建了一株含有质粒p j l l 的节杆菌，能对甾醇侧 链进行选择性降解生成a d 而不降解甾核。此外，在培养基优化，提高甾醇溶解 度等方面，国外专家学者们也作了大量研究，并取得一定突破。 国内对a d ( d ) 生物转化的研究起子2 0 世纪9 0 年代初期，9 0 年代中期停滞了 一段时间，近些年又有所复兴。 2 0 世纪9 0 年代初期对a d ( d ) 的微生物转化研究主要集中在探索不同菌种转 化甾酵能力的高低以及培养基的优化。其中，中科院上海有机化学研究所的王 敬一f 2 2 】等选用了一株牝牛分枝杆菌，生物中心的陈知本【2 3j 等选用了一株分技杆 菌，上海医科大学的王黎明等【”l 选用了一株诺卡菌，上海医科大学的史济平等 1 2 5 选用了一株珊瑚红球菌分别进行了研究。这些菌种的转化能力都不是很高， 一般底物投料量在0 1 0 2 5 时，a d ( d ) 收率只有3 0 多。只有陈知本等研究 的分枝杆菌在适当的发酵条件下，得到了8 9 的最高产率【2 引。培养基优化方面 主要研究的是培养基成分的改变、助溶齐j 乙醇添加量、无机金属离子、温度、 p h 、通气量、以及投料方式、底物诱导等因素对发酵的影响。大多数实验结果 证明，培养基中碳源含量的多少与甾体的降解有密切关系。适量的碳源既使菌 体生长旺盛，又利于边链降解所需酶系形成，并不至于使甾体被彻底氧化，从 而有利于累积a d ( d ) 。碳源浓度过高并不利于发酵。一般4 的乙醇对甾醇助溶 效果较好，并且能促使菌体形成不完整细胞膜，从而有利于底物进入代谢库便 于生物转化。大多金属离子无明显作用，c 0 2 + 可能对9 a 羟化酶有抑制作用，因 而对a d d 的形成有利。甾体转化的酶系往往是一种诱导酶，在整个菌体生长过 程中添加适量甾醇有诱导作用，不仅提高了a d ( d ) 的转化率，还相应提高了底 物的投料量，而且底物投料方式以分批加入时对发酵有利。此外，中科院生物 工程研究中心的张丽青 2 6 l 等研究一株用诱变方法筛选到的分枝杆菌降解胆固 醇生产a d d 时，还试用了上海医药工业研究院的s i p 1 3 0 0 大孔吸附树脂( 2 0 6 0 目) ，可选择性地只吸附产物而不吸附底物，解决了提高投料浓度及产物与胆固 醇的分离问题。 近些年来对a d ( d ) 生物转化的研究主要集中在菌种的诱变选育，甾核降解 抑制剂的作用及培养基优化上。中国药科大学的李莹1 27 j 等采用紫外光、y a g 倍 7 频脉冲激光及两者复合诱变方法进行诱变育种，得到一株分枝杆菌高产优质突 变株，产a d 能力提高了1 1 6 ，且不再产生结构类似物a d d 。哈尔滨理工大学 的吴宝华等f 2 朝采用紫外线照射、n t g 、5 - b u 等化学诱变剂及复合诱变方法，筛 选出株转化大豆甾醇转化率达9 5 ，a d ( d ) 产率达4 5 的高产节杆菌菌株。在 抑制剂的选择方面，主要研究了n i 2 + ，c 0 2 + ，m n 2 + ，a ，o 一联吡啶、邻菲罗啉等 酶抑制剂对a d d 积累的影响，证明添加适当的抑制责寸可抑制9 a 羟化酶活性，防 止甾核降解，有利于a d d 的积累。但是抑制剂对甾醇降解酶也有轻微抑制作用， 因此添加时间非常关键。时间提前，抑制甾醇降解酶活性使甾醇转化率降低， a d d 产率随之下降：时间延长，部分a d d 会被进一步降解，无法大量积累 2 9 1 。 由于这些抑制剂一般会对菌体生长产生毒性或抑制作用，所以往往在菌体生长 好后加入，并且要控制好最佳浓度。浓度太低，不能完全抑制9 a 羟化酶活性； 浓度太高，不仅会对菌体产生毒性，使活细胞数量下降，而且会抑制c 2 6 羟化酶， 阻碍甾体边链的降解1 3 0 】。 培养基优化方面也有一些新成果涌现。哈尔滨理工大学的车成彬等睁l j 证明 葡萄糖为碳源不如玉米浆为碳源产率高，而且磷酸盐充足能提高产率。这可能 是因为一方面磷酸盐的缓冲能力使菌体处在一个较为适宜的p h 环境中，另一方 面磷酸盐对于侧链降解酶的作用有利i ”j 。复旦大学的叶丽等 3 3 1 认为葡萄糖浓度 太高对反应有抑制作用，可能是因为葡萄糖通过糖酵解及己糖单磷酸途径产生 还原剂n a d p h ，因此提高葡萄糖量使细胞中n a d p h 过多，从而增强了还原反 应，而阻碍了氧化反应，使甾体1 ，2 一脱氢酶活力降低，a d d 产量随之下降【“】。 实验还研究了h c 0 3 。对a d d 的生成影响，证明适量的h c 0 3 。，并延长发酵对闻确 实有利于a d d 的产生。这与文献f 3 5 1 报道某些微生物在降解c 2 4 有分枝的甾醇边 链时，h c 0 3 会直接参与反应相吻合。总体来说，经过培养基优化，在投料浓 度在0 2 0 3 时，一般转化率能提高到到5 0 。但随着底物投料浓度上升， 转化率呈下降趋势。 以上研究均是在单水相系统中进行的，主要存在问题在于： ( 1 ) 底物甾醇和产物a d ( d ) 在水中的溶解度低 甾体化合物在水中的溶解度很低，一般的溶解度范围在1 0 4 1 0 4 m o l l 之 间，属难溶性或微溶性化合物 3 6 1 。甾醇在水中的溶解度低于2 m g l 【35 。，产物a d 和a d d 在水中的溶解度也不高于5 0m g l 1 3 7 。甾体化合物的这种难溶性严重影 响着甾体转化反应的速率和产率，也是微生物转化工业中最主要的问题p ”4 。 如何增大甾醇的溶解度并使之有效均匀地分散，是提高甾体转化反应活性和速 率的关键控制因素。 早期解决甾醇溶解度的方法是采用有机溶剂迸料。甲醇、二甲亚矾、二甲 基甲酰胺【4 、乙醇是研究比较多的四种溶剂，它们均易溶于水并较容易溶解甾 体化合物。近来有人采用聚丙二醇( p p g ) 及硅氧烷作为溶剂使投料浓度及转化率 s 大大提高，有文献 4 2 1 表明在p p g 作为溶剂的条件- f m y c o b a c t e r i u ms p m b 3 6 8 3 能成功的将植物甾醇降解为a d ，底物浓度从5g ，l 到3 0 9 l ，转化率最高可达 9 0 。另外硅氧烷作为溶；f ! j 也可达到类似结果。但是这种投科方式其投料浓度 受到两个因素制约：一是溶剂对菌的毒性；二是甾醇在该溶剂中的溶解度。由 于水溶性有机溶剂的生物相容性差，对微生物细胞有一定的毒害作用，因此投 入浓度受到限制，在很大程度上制约了底物投料量的增加。 采用添加表面活性剂等的乳浊液进料方法也得到广泛研究。如环颧稽一”、 卵鳞脂( 4 4 1 、聚氧丙烯醇【45 1 、t w e e n8 0 t 4 6 】等。这些表面活性剂一方面增加底物的 溶解度，同时也改变细胞膜的通透性【47 i ，对加快底物的传递和与微生物作用会 产生明显效果。h e s s e l i n k 等【4 8 l 通过实验证明1 3 c d 能显著增加分枝杆菌 m y c o b a c t e r i u m5 p n r r l b3 6 8 3 降解胆固醇、谷甾醇及4 胆甾烯酮边链生成 a d ( d ) 的产率，当环糊精与底物的摩尔比率为2 ：1 对微生物降解边链的活性可增 加1 7 3 倍，a d 的收率从3 5 ，4 0 提高到8 0 以上，发酵周期却由1 7 5 h 减小到 1 2 0h 。b c d 的存在并不影响细胞的生长比率和细胞密度，在甾体边链降解过 程中，c d 作为种惰性甾体增溶剂、反应载体及保护剂，不影响生物催化剂本 身 4 9 1 。 超声波乳化也是提高甾体转化速率的有效手段之一。超声波在固液分散体 系中可比常规的研磨和搅拌更有效地降低含水悬浮液颗粒的尺寸，而底物颗 粒尺寸越小，固液接触表面积越大，越有利于底物的溶解和扩散，从而增大 甾体底物与微生物细胞的接触，提高转化率。 ( 2 ) 产物抑制 甾体的微生物酶转化为可逆反应，过大的产物浓度对转化酶有反馈抑制作 用5 。r e i c h er 等采用树脂等吸附剂的原位产物去除方法实现了解除产物抑制 和傈护产物迸一步降解，在底物浓度达到1 0 9 l 时也获得了较高的产物转化率 【5 2 】。 ( 3 ) 细胞膜、细胞壁的阻碍作用 甾体的微生物转化，是在微生物细胞产生的甾体转化酶的催化作用下进行 的。而甾体转化酶又为胞内酶，这就决定了只有扩散进人细胞的底物才能与酶 接触和进行有效转化。甾体微生物降解是一个缓慢的过程，其原因不仅在于底 物和产物溶解度低，还在于它们进出微生物细胞的速度也很低。一些改变分枝 秆菌细胞壁和细胞膜完整性的因素如突变，表面活性剂及细胞壁、细胞膜组成 成份生物合成抑制剂等能影响疏水性及亲水性物质的渗透性p “。k o r y e k a m a c h a l a 等( 5 4 1 研究表明，聚阳离子( 例如，鱼精蛋白，聚乙烯亚胺) 能增加疏水化 合物对分枝杆菌细胞壁的渗透，发酵液中有鱼耩蛋白存在时，- 谷甾醇的转化 率提高了3 倍。l e o ns e d l a c z e k 等f 5 5 i 证明1 1 1 氯苯丙氨酸及d l 亮氨酸作为分枝杆 菌细胞膜脂质双层外层脂质化合物生物合成抑制剂，在浓度适合时可成倍提高 9 a d ( d ) 的产量。而默聚糖合成的抑制剂如甘氨酸( 1 5 m g m l ) 和万古霉素 ( 1 5 0 “g m l ) 能使细胞的转化活性提高近3 倍，另外粘菌素在浓度为1 0 t t g m l 到 1 5 9 9 m l 时也能提高转化率。但是，分枝杆菌细胞膜脂质双层内层的霉菌酸，