（食品科学专业论文）高色价红曲霉菌的理化诱变及液态发酵工艺优化的研究.pdf

高色价红曲霉菌的理化诱变及液态发酵研究 摘要 红曲霉在中国的应用已经有一千多年的历史了，红曲中含有的红色素是一种 优良的着色剂，在现代食品加工行业正发挥着重要作用，红曲发酵生产主要分为 固态发酵和液态发酵两种方式，液态发酵适宜工业化大生产，是红曲生产的主要 发展趋势。通过诱变技术获得高色价红曲霉菌种和优化红曲霉液态发酵工艺是摆 在微生物工作者面前的一个重大课题。 本论文包括以下方面的内容： 1 从红曲米中分离筛选出高色价红曲霉菌种，并且比较了分离方法的优缺 点。研究表明，红曲米直接分离法操作篙单，所需时间短，试验的成功带有较大 的偶然性。红曲米富集孢子分离法操作较为繁琐，所需时间长，但成功的几率高， 适合于科学研究。红曲米孢子分离法的操作与红曲米直接分离法和红曲米富集孢 子分离法相比较而言，操作简易性介于两者之间，但分离效果与红曲米富集孢子 处理法相差无几。故红曲米孢予分离法具有较大的实用价值和推广价值。 2 采用红曲米孢子分离法从红曲米中分离出了s z l ，s z 2 ，s z 3 ，s z 4 ，s z 5 ， s z 6 六株红曲霉，并通过摇瓶发酵筛选出s z 4 作为诱变出发菌株，s z 4 的发酵液红 色素色价为1 0 8 u m l 。 3 采用紫外氯化锂复合诱变对s z 4 进行诱变处理得到s z 4 0 1 ，s z 4 0 2 ，s z 4 0 3 ， s z 4 0 4 ，$ z 4 0 5 五个诱变菌株，经过摇瓶发酵和稳定性试验发现s z 4 0 1 不仅发酵 液色价高，而且稳定性好，故选取s z 4 0 1 作为生产菌种，其发酵液色价为 2 0 2 u m l 。 4 ，对发酵培养基中不同成分对红色素的产量的影响做了单因子研究，并用正 交试验通过对一株紫红曲霉s z 4 0 1 液态发酵法生产红色素的培养基研究，确定适 宜的发酵培养基配方为：大米粉9 ，n a n o ，0 ，2 ，k h 2 p o 。0 1 ，m g s 0 40 ，2 。在此 条件下s z 4 0 1 的发酵液色价达到5 7 o u 1 n l 。 5 对红曲霉s z 4 0 1 的最佳发酵工艺条件做了初步研究，并得到了一个较好的 工艺条件。红曲霉s z 4 0 1 摇瓶培养的最佳条件是：培养时间为3 d ，温度为3 2 。c ， 接种量为5 ( v v ) ，装液量为7 0 r a l 2 5 0 m l 三角瓶，转速为2 4 0 r m i n ，培养基初 始p h 为3 8 。在此条件下s z 4 0 1 的发酵液色价高达8 4 o u 1 1 1 l 。 关键词：红曲霉、高色价、理化诱变、液态发酵 a b s t r a c t m o n a s c u sh a sb e e nu s e di 1 2f o o df e r m e n t a t i o nf o rt h o u s a n d sy e a r s i nc h i n a ，t h ep h y s i o l o g i c a i l ya c t i v es u b s t a h o et h a tm o n a s c u sp r o d u c e dh a d b e e nr e s e a r c h e dw i d e l y ，m o n a s c u sr e dp i g m e n tisan a t u f a le x c e l l e n t s u b s t a n e e i tis p 1 a y i n gm o r ea n dm o r ei m p o r t a n tp c l e si nm o d e r nf o o d i n d u s t r y t h e r ea r et w oi l i a i nw a y sf o rt h ep r o d u c t i o no fm o n a s c u sr e d p i g m e n t ，o n e iss o l i df e r m e n t a t i o n ，t h eo t h e ri s 1 i q u i df e r m e n t a t i o n l i q u l df e r m e n t a t i o nist h em a i l 2t r e n di n t h ep r o d u c t i o i lo fm o n a s c u sr e d p i g m e n t t h isd iss e r r a t i o nm a i ni n c l u d e st h ef o l l o w i n gc o n t e n t s ： 1 s e p e r a t i n ga n dc h o o s i n gh i g h y i e l dr e dp i g m e n tm o n a s c u sf r o mr e d r i c ew i t ht h r e ek i n d so fw a yi ns e p e r a t i n gt e c h n i q u e t h em e t h o do f d i r e c t l ys e p a r a t i n gf r o mt h er e dr i c ei se a s yt om a s t o ta n dw i d l yu s e d b yf a r m e r ，b u ti tss e p e r a t i n gr e s u l ti sn o ti d e a l t h em e t h o do fs e r p e r a t i n g f r o mc o l l e c t i n gs p o r eisd i f f i c u l tt of l l a s t e r t h o u g hi t s s e r p e r a t i n g r e s u l tise x c e l l e n t t h em e t h o do fs e p a r a t i n gf r o ms p o r eise a s yt om a s t e r a n di tsr e s u l tisa 1 s oc x c c l l e n t s oi ti sc h o o s e da st h es e p a r a t i n gm e t h o d 2 t h r o u g ht h em e t h o do fs e p a r a t i n gf r o ms p o r e ，s i xs t r a i n so f m o n a s c u sw h i c hi n c l u d e s z l ，s z 2 ，s z 3 ，s z 4 ，s z 5 ，s z 6 ，i ss e p a r a t e df r o m t h er e dr i c e c o m p a r i e dt h e i rr e dv a l u e ，s z 4w a sc h o o s e da st h eo r i g i n a l s t r a i n i t sr e dv a l u ei s1 0 8 u m l ； 3 b r e e d i n gf o rt h eh i g h y i e l dr e dp i g m e n ts t r a i n so fm o n a s c u sb y t h em u t a g e n e s i so fu va n dl i c ia ss z 4w a st h eo r i g i n a ls t r a i n ，f i v es t r a i n s w a sf o u n d t h a ti ss z 4 0 1 ，s z 4 0 2 ，s z 4 0 3 ，s z 4 0 4 ，s z 4 0 5 c o m p a r i e dt h e i rr e d v a l u e s z 4 0 1w a sc h o o s e da st h ep r o d u c tm o n a s c u ss t r a i n i t sr e dv a l u ei s 2 0 2 u m l 4 e f f e c to fd i f f e r e n tc u l t u r em e d i u mo ny i e l do fm o n o n s c u sw a s s t u d i e db ys i n g l ef a c t o rt e s ta n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eb e s tc u l t u r em e d i u mf o rs z 4 0 1w e r ea sf o l l o w s ：r i c ed o w d e r 9 ，n a n 0 30 2 ，i ( h 2 p 0 40 1 ，s 0 40 2 i nt h i sc o n d i t i o n ，t h er e dv a l u eo f s z 4 0 1isi m p r o v e dt o5 7 o u m l 5 t h ec u l t u r ec o n d i t i o n sf o rp r o d u c i n gm o n a s c u sp i g m e n tb y m o h a s c u ss z 4 0 1w e r es t u d i e d t h eo p t i m u mc u l t i r a t i n gc o n d i t i o n sw e r e ： f e r m e n t a t i o np e r l e d3 d ，t e m p e r a t u r e3 2 0 c ，s e e d i n gv o l u m e5 ( v v ) ， f i l l e dv o l u m e7 0 m l 5 0 0 m lf l a s k ，r o t a t e ds p e e d2 4 r m i n ，i n i t i a l p h 3 8 i nt h i sc o n d i t i o n ，t h er e dv a l u eo fs z 4 0 1i si m p r o v e dt o8 4 o u r 【i l ， k e yw o r d ：m o n as c u s ；h i g h y i e l d ；m u t a g e n e s i so f p h y s i c sa n d c h e m i s t r y l i q u i d - f e r m e n t a t i o n 独创性声明 本人声明所提交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所傲的任何贡献均已 在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名胪 时间：a 尹、q 年，月彩日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存；汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 的媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 翮 。营分 n n ：坳年嗍日 时间：d 年p 月加 第一章文献综述 红曲在我国的应用至少已有1 0 0 0 多年历史，北宋初期陶谷所著清异录 中有“以红曲煮肉”的记载，元明时期，关于红曲的著述日渐增多。明代宋应星 天工开物，李时珍本草纲目之丹溪拾遗篇对红曲的制法及功能都有较为 详尽的记载。 红曲在目前的应用非常广泛。相关产品有红曲米、红曲红、红曲酶、洛伐 他汀类等。初步估计中国的红曲产业产值为2 0 0 亿元人民币左右，红曲在国民经济 中的地位可见非常重要。红曲产品在目前应用最多的是红曲红色素。红曲红色素 不仅是一种天然优良的食品着色剂，而且有防腐和保健功能。我国明文规定允许 食品加工使用红色食用色素为：甜菜红、胭脂红和红曲红。甜菜红和胭脂红在国 外己被禁止使用或限制使用，且可能发生原料供应上的问题。但红曲红色素以粮 食为原料，可通过发酵法大量生产，可以满足大规模生产的需要。面且，红曲霉 发酵产物本身具有较好的营养价值和一定的防腐作用，具有降低血脂、降血压、 抑瘤抗癌、提高人体的免疫力等药用功效，长期使用对人体有益无害。红曲霉产 生的红曲红色素在5 0 5 - - 5 1 0 n m 光波处有吸收峰。可以从固体发酵法生产的红曲中 提取，也可以从液体深层发酵法制取。民间主要以固体发酵培养红曲米的方式来 获得，但生产过程复杂、周期长、得率低、成本高。近年发展起来的液体发酵培 养法是生产红曲红色素较为理想的方法，具有工艺简单、生产周期短等优点。但 该方法生产红色素产率低，影响推广。 因此如何提高液态发酵法红曲霉红色素的产量和降低桔霉素的含量是摆在 食品工作者面前的一个重大课题。 1 红曲霉属在真菌中的分类地位及属内分种现状 长期以来，红曲真菌类药物是作为低等植物归入植物药。真菌的种类估计有 1 0 4 0 万种，目前己被研究过的约5 1 0 0 属、4 5 0 0 0 种，但有长期用药历史的传统 品种以及近来开发过的只有约3 0 余种，收入药典的只有寥寥5 个品种跚。对红曲 霉的分类，在各个时期，真菌学家的意见不一致。红曲霉属是v a nt i e g h e m 于1 8 8 4 年建立的属，命名为m o n a s c u s ，即单子囊菌之意，实际上这个名称是不确切的， 原因是他所观察的是成熟的子囊壳，其中的子囊壁已解体，只留存着子囊孢子， 故误认为只含有1 个子囊“1 。经b a k e r ( 1 9 0 3 ) 、o l i v e ( 1 9 0 5 ) 、y o u n g ( 1 9 3 1 ) 和李钟 庆( 1 9 8 2 ) 等多人的研究证实，该属菌的子囊壳中不仅含有1 个子囊，而且含有多 个子囊，每一子囊中均容有8 个子囊孢子，成熟后子囊壁解体，子囊孢子残留在 子囊壳中，所以往往只见到含有许多子囊孢子的子囊壳。由于各子囊壳的成熟时 间极不一致，一些子囊壁已解体，另一些子囊才开始形成。这个名称虽不确切， 但人们仍沿用原名至今“1 。 关于红曲霉属的分类地位，e a u m a n ne 啪等采用t m a r t i n 分类系统，红曲霉属 归于藻状菌纲的子囊菌，原囊壁子囊菌亚纲、曲霉目、曲霉科；刘波、戴芳澜、 傅金泉等也采用 m a r t i n 分类系统，将红曲霉属归于真菌门，子囊菌纲，真子囊 菌亚纲、曲霉目、曲霉科；而张纪忠等采用t a i n s w o r t h 分类系统，这也是目前 多数真菌学者趋向参照的分类系统，将红曲霉属归于真菌界、真菌门、予囊菌亚 门、不整囊菌纲、散囊菌目、红曲科。在此，于散囊菌目下建立红曲科，从而与 散囊菌科分开，红曲科下仅一属即为红曲霉属。陈驹声将红曲霉属归于半子囊菌 纲下，远藤章也认为红曲霉属隶属于半子囊菌科，与我国大多数学者的分类归属 不一致。 1 8 8 4 年来至今百余年来的文献中曾记述过2 0 种红曲霉菌，其中1 3 个红曲霉种 是由日本学者佐藤喜吉氏“1 等在2 0 ，3 0 年代从中国各地及朝鲜的红曲以及利用这 些曲的酿造饮品中分离鉴定并命名的。命名为m a n k a ，意指其来f l a i l k a ( 红曲 的闽南语读音) ，又由于日本学者所发表的研究报告上“1 ，将红曲的“麦”字旁 改成“米”字旁，以表明其是以大米为原料所制造的，因此，后来的研究者在文 字上亦如此改用了。红曲霉的命名在分类上尚有不完备之处，至今国际上不能形 成统一的标准，对某些独立的种，仍有异议。中国微生物菌种保藏管理委员会现 有发白红曲霉、巴克红曲霉、烟色红曲霉、紫红曲霉、红色红曲霉、锈色红曲霉 和变红红曲霉等7 种4 8 株保存菌株，其中有2 2 株只是通称为红曲霉，未予分种， 它们是从全国各地包括轻工业部食品发酵研究所、大连科学研究院、贵州省轻工 业研究所、上海市工业微生物研究所、辽宁食品发酵研究所、福建省轻工研究所 等收集而来的，其中已报道过用于制备中药红曲的有紫红曲霉、安卡红曲霉、巴 克红曲霉、红色红曲霉、变红红曲霉和烟色红曲霉等6 种。 2 初级代谢产物研究 2 2 1 酶 红曲霉能产生多种酶类，主要有淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糊精化酶、蛋白酶、 果胶酶、羧肽酶等，不同种类菌株产酶的类型及产量会有差异。某些红曲霉菌株 还能分泌直接催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的胞外酶。有对己酸乙酯合成能力较 强的红曲酯化菌进行四级扩大培养得到了酯化率i 8 5 的酯化酶制剂，用于白酒 生产取得了较好效果。1 。 2 2 脂肪酸 1 9 8 9 年，日本学者的研究表明不同红曲霉菌株产生的脂肪酸成分有很高的 相似性。国内宋洪涛“”采用了气相色谱进行分析，结果表明不饱和脂肪酸含量达 6 4 7 7 ，多烯不饱和脂肪酸含量达1 6 2 7 。经过活性测定认为它们可能有增 强m o n a c o l i n s 分解甘油三酯，降低极低密度脂蛋白胆固醇的功能。1 9 9 2 年，德国 学者发现m o n a s c u s p u r p u r e u s b 将短链脂肪酸转变为甲基酮“”，并对其代谢途径 进行了初步探讨，在不饱和脂肪酸方面，尚有待深入研究，以便对红曲的降脂作 用能有较为全面的了解。 2 3 有机酸 日本有人在利用红曲霉突变株生产酒精饮料时对产生的有机酸进行了分析， 发现突变株与亲株产生的有机酸成分很相近“”。泰国研究者对收集到的4 0 株红曲 霉菌株迸行筛选后选取菌株在含有1 0 葡萄糖，0 0 2 5 肉膏提取物的培养基中 培养，l 一苹果酸产量达n 2 8 1 9 l ，随后又对菌株进行诱变处理，分离得到的 突变株最大产量可达4 8 7 9 l ( 1 ”。 3 次级代谢产物研究 红曲霉的次级代谢产物主要有红曲色素，桔霉素，橙色素，洛伐他汀等。 3 1 红曲色素 3 1 1 红曲色素及其形成机理 红曲色素是红曲霉生长过程中产生的次生代谢物，具有着色防腐保健和药用 价值。红曲色素广泛应用于肉制品和腌制品等的着色防腐。在降低亚硝酸钠用量 的同时还具有保健功效。本草纲目中记载红曲消食、活姐、健脾燥胃，治打 扑伤损，治女人血气痛及产后恶血不尽。现代研究表明红曲霉产生的其它次生代 3 谢物有抑制胆固醇合成，预防和治疗胆结石、前列腺肥大以及抗肿瘤的作用。红 曲霉产生的生理活性物质还具有杀菌或抑菌作用。 红曲霉用于食品生产的主要种类有红曲霉，烟色红曲霉，紫红曲霉和红色红 曲霉等。红曲色素属于聚酮类色素，是红曲霉代谢过程中产生的一系列聚酮化合 物的混合物“”。红曲色素中已经探明结构的有1 0 种，其中6 种为醇溶性色素( 表1 ) 4 种为水溶性色素( 表2 ) 。醇溶性色素有红斑素、红曲红素、红曲素、红曲黄素、 红斑胺和红曲红胺等。水溶性色素有n 一戊二酰基红斑胺、n 一戊二酰基红曲红胺、 n _ 葡糖基红斑胺和n 一葡糖基红斑胺等“”。这些色素中具有应用价值的主要是醇 溶性的红曲素、红斑素和红曲红素。红曲色素中的黄色成分约占5 ，其性质比较 稳定，但因其含量低所以红曲色素呈现红色。红曲色素中呈现红紫两种颜色的色 素。因分离困难一般混合使用。红曲色素生物合成为1 分子乙酰c o a 和3 分子丙二 酰c o a ，在聚酮体合酶的作用下生成四酮化合物，四酮化合物再与1 分子丙二酰c o a 生成五酮化合物，如此循环使酮基化合物碳链加长，最后生成胞内色素胞内色素 与1 分子葡糖基或戊二酰基结合转化为胞外色素。红曲霉在色素合成过程中主要 产生两条支路。h a s s a n 等用核磁共振和1 3 c 同位素分析得到红色红曲霉的桔霉素 生物合成途径，发现桔霉素的生成与红曲色素的生成有一定的关联性，关联程度 与红曲霉的种类有关。r a s h e v a t 等通过对紫红曲霉的研究发现色素合成和脂质 合成也是共存的两者存在竞争作用，当c n 高时有利于脂质合成。 4 表1 - 1 醇溶性红曲色素的结构式和分子式 t a b l e l 一1m o l e c u l a rf o r m u l ao ft h em a i nc o m p o n e n t so fm o n a s c u sp i g m e n t s i ne t h a n o l s o l u b i l i t y 缸瘴蕾 缸虹 扛0 - - m t d d t tm 岫裟l _“mm 舢鬈慧脚 _ 一一 一 蛐o 删 - 一- 一 m 表i - 2 水溶性红曲色素的结构式和分子式 t a b l e l 一28 0 l e c u l a rf o r m u l ao ft h em a i nc o m p o n e n t so fm o n a s c u sp i g m e n t s i nw a t e r s o l u b i1i t y 。：皇兰竺竺竺；。 氲c d m m 1 h 舡玎h 舶k 蝻t 哪 一 ” | h t 。竺竺竺竺。 戴c d m 釉1 h 竹h 碡珀- _ 日h - 龇删 _- 3 1 2 红曲色素特性 红曲色素易溶于乙醇、丙二醇、丙三醇及其水溶液，在p h 低于4 o 的介质中， 5 妒咿妒妒妒 蓑 红曲色素溶解度降低。红曲色素熔点为1 6 0 1 9 2 0 c 。红曲色素含量低时其溶液呈 鲜红色，含量高时呈黑褐色并伴有荧光产生“”。红曲色素在p h 3 1 1 范围内稳定 性较好，当p h 大于1 1 时色素不稳定。红曲色素在中性条件下i 0 0 。c 加热6 0 s 色素残 存率为8 8 ，加热8 h 后色素残存率降至4 5 ，1 3 0 0 c 力n 热时色素变成褐色且不再溶 于乙醇。水溶性红曲色素的热稳定性优于醇溶性红曲色素。红曲色素在紫外光下 不易褪色，但对自然光不稳定，阳光照射5 h 后变为橙色，在散射光下存放4 0 d 开 始褪色，自然光下存放5 0 天其色素的残存率仅为2 0 。红曲色素对金属离子和氧 化还原剂均十分稳定，在n a c l 或c a c l ：溶液中红曲色素残存率高达9 9 8 ，而对 c u ”、z n ”的残存率也在9 7 以上，在0 1 的n a 2 s 0 3 和抗坏血酸等物质存在的介质 中其色素残存率均在9 5 以上，此外红曲色素对蛋白质具有较好的着色性能“”。 3 2 红曲霉产桔霉素的发现及其性质、检测方法 1 9 9 3 年，法国学者b l a n c “”等分别用不同的固体和液体的培养基培养红曲 霉，将培养物经t l c 硅胶板分离，发现分离出的己报道的抑菌活性物质m o n a s c i d i n a 与桔霉素在薄层层析板上具有相同的值，在波长3 5 0 n m 的紫外灯下均发淡黄色荧 光，且同样具有抑菌性。此后，b l a n c “”等人通过核磁共振、质谱、紫外吸收光 谱等对m o n a s c i d i na 进行了结构分析，证实m o n a s c i d i na 就是桔霉素。桔霉素是 由真菌产生的次级代谢产物。自然界中许多青霉和曲霉菌株都能产生桔霉素，产 桔霉素的特征菌是桔青霉，用查氏葡萄糖培养液3 0 l 接种桔青霉，培养两周后可 提取桔霉素4 5 - 6 0 9 ，产量高达1 5 0 0 2 0 0 0 m g l 嘲。桔霉素纯品为黄色晶体，熔点 1 7 8 1 7 9 c ，难溶于水，溶于氯仿、丙酮、乙酸乙脂、乙醇等有机溶剂，分子量 为2 5 0 。 图i - i 桔霉素的分子结构式 f i g l 。1 m o l e c u l a rf o r m u l ao ft h ec i t r i n i n 桔霉素是一种真菌毒素，具有肾毒性，且怀疑是人类某些地方病的潜在致病 剂。最近的研究表明桔霉素对肾脏的结构和功能极为不利“”。桔霉素可在线粒体 6 内聚集且干扰电子传递系统，导致d n a 合成受到抑止，并进一步使r n a 和蛋白质合 成受到抑止，肝糖原下降，胆固醇和甘油三酸脂合成受阻恤1 。桔霉素的检测方法 主要有高效液相色谱法，薄层层析法，酶联免疫法，抑菌圈法1 。 许赣荣等用酵母膏蔗糖培养基y e s ( y e a s te x t r a c ts u c r o s e ) ( 能检测霉菌是 否产生真菌毒素) 培养了近4 0 株红曲霉，从菌落形态特征看，大多数是m o a n a s c u s a n k a ，定性检测结果表明，大多数菌株的培养液中都检测出桔霉素，说明这些红 曲菌种本身具有产生桔霉素的能力m 1 。许赣荣等用m s g ( m o n o s o d i u mg l u t a m a t e ) 培养基( 检测桔霉素的产生，结果的重现性好于y e s 培养基) 液态发酵和米饭固态 发酵2 种方式，对3 6 株红曲霉菌株的产桔霉素性能进行了系统的研究。有6 菌株的 m s g 发酵液中未检测出桔霉素。其余3 0 菌株，产桔霉素0 0 9 6 6 6 5 m g l 。固态红 曲米中，仅有1 株菌在米饭上不生长，未测出桔霉素嘲。其余3 5 株红曲霉菌都产 桔霉素。最高的1 株菌红曲米中桔霉素平均含量达2 4 5 8 8 0 m g k g 。但该菌在m s g 液态培养时，桔霉素含量仅1 6 8 m g l 。说明用m s g 能初步确认红曲霉菌种是否产 桔霉素，但不能作为唯一的定性及定量标准。y o u z h i w a n g 等用h p l c 方法对来 自8 个种的2 3 个红曲霉培养物中的桔霉素含量进行了测定。试验表明，这8 种红曲 霉在y e s 上均能合成桔霉素，含量为6 5 4 8 0 m g l ，最高的含量4 8 0 m g l 汹。 3 3 红曲霉的其他次级代谢产物 3 3 1 降胆固醇活性物质 血脂为血液中所含脂类物质的总称。高血脂是导致心脑血管疾病的元凶，而 高胆固醇是高血脂的主要病因啪1 。人体内总胆固醇仅有1 3 来源于食物，大约有2 3 是由肝脏和小肠合成的m 1 。羟甲基戊二酰辅酶是胆固醇合成中的限速酶，莫 拉克林能竞争性地抑制h g _ _ c o a 还原酶，进而抑制了胆固醇的合成。 莫拉克林k 还能增加胆固醇的分解代谢，降低甘油三酯及低密度脂蛋白( l d l ) 的作用嘲。大量临床试验证明，莫拉克林类物质洛伐他汀都属于有效、低毒而且 能有效治疗高胆固醇血症的药剂，能明显降低体内的胆固醇含量。人体血液中莫 拉克林k 含量达到1 5g l 时就具有降低胆固醇的功效。近年研究表明莫拉克林 有酸式和内酯型两种构型，人体中真正发挥作用的是酸式莫拉克林k 。它可以直 接被人体吸收，不需要人体内的羟基酯酶参与水解，不增加肝、肾负担，直接发 挥降脂作用。陈运中等认为洛伐他汀通过促进m r n a 转录而调节高脂小鼠血清血 7 脂代谢水平，这可能是其调节血脂，预防动脉粥样硬化等心脑血管疾病的机制之 一。近年来，国内外为提高降脂活性物质产量做了大量工作。印红等人利用“神 舟3 号”返回式飞船搭载红曲霉菌0 7 0 8 ，以高产洛伐他汀和耐硒为选择条件，筛 选n 8 株耐硒又高产洛伐他汀的菌株，经连续发酵试验证明变异菌株的优良特性 可以保持稳定1 。 3 3 2 麦角固醇 麦角固醇( 麦角甾醇) 是维生素d 的前体，可以防治婴幼儿佝偻病，促进孕妇 和老年人对钙、磷的吸收。是一种重要的药品。自然界中维生素d 的含量很有限， 普通食品中的含量就更少，因而需要适当补充尤其是婴幼儿。麦角固醇还是生 产“考的松”，黄体酮的原料口町。在我们的工作中发现红曲霉属中的许多菌株都 能不同程度地产生麦角固醇，麦角固醇的含量与形成色素的含量不成比例关系。 朱效刚等人从1 6 株产麦角甾醇的红曲菌中，筛选到一株产麦角甾醇较高的红 曲菌，并对其产麦角甾醇的条件进行优化，使麦角甾醇含量达到8 1 2 m g g 干曲。 存在于菌体中的麦角固醇可以与发酵液中红曲色素分别提取，具有很高的开发价 值。 3 4 桔霉素与红曲色素的控制研究现状 法 雪b l a c n k 汹1 在发酵过程中控制桔霉素的生成研究中一直处于世界的前列， b l a c n k 教授的最新研究表明，红曲霉在液态发酵过程中：( 1 ) 桔霉素有可能被 红曲霉菌体消耗掉；( 2 ) 低通风量和降低培养基的含氮量可降低桔霉素的生成 量；( 3 ) 色氨酸和亮氨酸和降低桔霉素的生成量( 4 ) 在培养基中加入辛酸和醋 酸可减少桔霉素的生成量：( 4 ) 2 碳3 0 酮可强烈抑制桔霉素的生成而对红曲色素 的生成没有影响。 b l a n k 作为桔霉素首位发现和定性者同时也认为并不是所有红曲霉都产生桔 霉素，故国内外学者在对菌株的筛选上做了大量的工作，并取得了一定成绩。国 内主要有许赣荣等人取得了一些低产桔霉素高产红色素和洛伐他汀的菌株，日 本据报道曾发现一株不产桔霉素的红曲霉菌株，但经德国人用酶联免疫法检测发 现桔霉素并不是没有，而是含量仅每毫升纳克级。我国红曲霉资源非常丰富，在 诱选育种上具有一定优势“，周立平，许赣荣，姚万春等人报道用诱变选出具有 一定工业生产价值的变种“”。 4 固态发酵技术研究现状 s r o u s s o s 总结了固态培养的特点，认为固态培养，物料的水分活性低，基 质的混合和扩散都较困难，容易形成温度，基质浓度及产物浓度的梯度。物料热 传导系数很小“”。氧气和其它非极性气体的溶解度和扩散性较好。霉菌的固体培 养，比液态培养更容易产生孢子。某些霉菌，在固态培养状态下，产生的酶更多， 次级代谢产物的产率更高( 如青霉素) “”。 数千年来，固态培养装置及相关技术虽有进步，最大的技术进步是在2 0 世纪， 其特征是将传统的手工操作为主的固态培养技术转变为机械化操作，并正向自动 化控制的方向发展。生产规模越来越大，产品质量不断提高。下面是我国红曲行 业的几种典型的固态培养装置“”。地面培养：这是中国最为传统的方法。也称土 窖培养法。在一些规模很小的红曲家庭作坊，仍在使用，红曲米色价低，易污染 杂菌，是其主要问题。通风池法：这是中国目前最为广泛的培养装置。通风池培 养，虽然进料可实现机械化操作，但有些操作，如翻曲，仍然由人工完成，劳动 强度很大。圆盘制曲机：采用这一制曲装置，可以实现机械化翻曲。水分和温度 的控制也较通风池法更好。但对于红曲培养来说，机械翻曲的质量不如手工翻曲， 对红曲菌丝的损伤较大，设备投资较大。 我国大部分红曲产品中污染微生物数目很高，作为食品添加剂使用，是很不 应该的。我国红曲厂固态培养常采用开放式培养系统，一般空气不经过除菌处理； 有的种子本身就带有杂菌：有的厂虽然采用纯种培养种子，但在种子液接入米饭 的过程中，未按无菌条件来操作，有的对工厂的有关设备灭菌操作不彻底m 1 。解 决红曲米微生物总数超标，从技术上来说，关键是要解决培养曲池空气除菌的问 题。对于曲房的通风系统，采用空气除菌处理是必要的，在技术上也是可行的。 但需要增大风机的功率，增加过滤除菌装置。要使红曲产品占据重要的市场份额， 有必要在红曲厂( 特别是生产功能性红曲的工厂) 引入良好生产规范( g o o d m a n u f a c t u r i n gp r a c t i c e ) 及危害分析与关键控制点( h a z a r da n a l y s i s c r i t i c a lc o n t r o lp o i n t ) 等管理体系，不仅可解决红曲行业存在的一些杂菌污 染( 包括桔霉素问题) 等涉及食品安全等问题，还可解决其他与产品质量密切相关 的问题m 1 。 红曲米培养的主要工艺参数是物料水分含量，培养温度，湿度，通风。在不 9 同的培养，时间都有不同的要求。在温度和湿度控制方面，红曲厂都有较为完善 的控制手段，微机控制温度和湿度在某些厂得到应用，还有一些更为简便的方法， 如根据某厂的经验，可在进风管处设置一根进水管和蒸气管。在夏天时，可通入 冷水( 无菌水为好) ，进风将水雾化后，通入曲层，达到保湿和降温的效果。此法 比洒水的效果要好。在冬天，如果温度较低，空气干燥，则可通入减压蒸气，达 到升温和保温效果汹1 。在控温控湿方面，对于红曲色素的生产，已有较为成熟的 经验，并可实现自动控制，但针对红曲霉某些代谢产物生成与温度和湿度的关系 方面，缺乏较系统的研究。 5 红曲液态发酵生产红色素的研究现状 红曲霉是目前世界上生产色素的主要微生物，据卫法监发 2 0 0 1 1 8 4 号，红曲 霉，尤其是紫红曲霉被列为十大保健食品的真菌菌种之一。红曲霉在生长代谢过 程中产生红色天然色素，即红曲红色素，无毒。无副作用洲。溶于乙醇、水， 被广泛用于清酒、酱油、庭乳、豆酱、鱼、肉、糕点等食品的着色，安全性高， 热稳定性强，对蛋白质的着色性好，色调鲜红，由于生产周期短，产量稳定，价 格波动较小等优点，使其他天然色素望尘莫及，而合成食用色素的安全性正日益 受到挑战。国家允许食品加工使用的红色食用色素为：甜菜红，胭脂红和红曲红。 在国外。甜菜红、胭脂红已被禁止使用和限制使用，且可能发生原料供应上的问 题，但红曲红色素可以用发酵法生产，并且通过改良菌种来降低成本，价格较低， 因此进一步开发利用红曲红色素有着十分重要的意义。 根据菌种不同，培养条件不同，制取工艺不同，可以分别得到脂溶性，醇溶 性和水溶性三类红曲色素。其中水溶性色素用途最广，水溶性红色素可以从固体 发酵法生产的红曲中提取，也可以从液体深层发酵法制取。9 0 年代以来，国外研 究用液体深层发酵法生产红曲色素取得了很大进展，在我国液体深层发酵法生产 红曲色素方面也有重大突破，如宁夏轻工业设计研究院研究的液体深层发酵法生 产红曲色素的技术己实现工业化生产液态培养红曲，既可用于红曲色素的生产， 也可用于功能性红曲产品的生产咖1 。而且由于液态发酵情况下，生产过程中较易 控制杂菌污染，产品中含杂菌数显著降低。从发酵代谢控制上来看，液态发酵比 固态发酵更容易实现有针对性的添加营养成分? “，从而提高某些有用产物的产 率。因而在红曲霉的培养上将有很好的发展前途。 6 红曲霉在食品加工中的应用现状 6 1 红曲霉在传统食品加工中的应用 传统的红曲主要用于酿酒，制作红腐乳，用做食品着色剂及肉类的保存剂等。 我国福建、台湾等地的红曲酒生产有悠久的历史“”。红蓝酒是将糯米先蒸煮，然 后接种糖化菌和酵母，添加原料酒、红曲和水发酵后经压榨、澄清、贮存，调配 而成的。在台湾，红曲酒称为红露酒或老红酒，酒精含量一般为1 8 左右。其具 有爽快的香味和涩味，长年贮放不变质。福建红曲老醋是选用糯米、芝麻、红曲 为原科，将糯米蒸熟( 米饭熟透。均匀，蔬松不结团) ，拌入米量2 5 的古田红曲 ( 内含糖化酶、酒化酶等多种酶系) ，经液体发酵酿制而成。产品色泽棕黑，酸而 不涩，香中带甜，风味独特，畅销3 0 多个国家。红腐乳是将硬质豆腐切成一定太 小的方块，接种毛霉经前期发酵和盐渍，再加入红曲霉经后期密封发酵制成的传 统调味品。3 】。红腐乳在后期发酵过程中，利用红曲提供的色素和多种酶类，使产 品表面形成诱人食欲的红色，内部形成多种香气和香味成份嘲。 6 2 红曲霉在食品防腐中的应用 早在天工开物下卷就有这样记载：世间的鱼肉是最容易腐败的，但薄涂 红曲，即使在盛夏也不变质，经l o 天蛆蝇不近，色味不减，盖奇药也。这段记 述说明红曲有杀菌和抑菌作用，可防止鱼肉杂菌感染而变质。 红曲霉能够产生红曲色素、抑菌和降胆固醇等有益物质，也能产生桔霉素等 有害物质，因此，对红曲霉的代谢产物，尤其是抑菌物质需要作进_ 步的研究。 相信随着桔霉素等抑菌物质研究的深入，红曲霉产桔霉素问题也会得到解决，红 曲霉的应用也将进入一个新的阶段。红曲霉以其能发酵生产天然红色素、防腐剂 而备受关注。但是，多年来国内外对红曲霉的研究与应用大多集中在传统的酿酒、 制醋、着色剂领域，或利用红曲含有的糖化酶、蛋白酶生产红豆腐乳、黄酒和其 他保健食品( 如含有少量降胆固醇的红曲米粉等) 啕。红曲的防腐作用虽早有报 道，但其抑制微生物的种类、提取方法和防腐效率国内外研究甚少，红曲防腐剂 更没有实现工业化生产。目前食品添加剂正朝着天然、安全、高效方向发展， 为红曲防腐剂提供了广阔的发展空间。在腌肉领域，亚硝酸钠是传统的防腐配料， 但由于亚硝酸钠是一种毒性较强的物质，与形成致癌物亚硝酸胺有关，因此它在 肉肠中的使用量和残留量受到严格控制。据北京市卫生防疫站试验表明，加一定 的红曲防腐剂就可替代5 0 的亚硝酸钠，抑制肉毒梭状芽孢杆菌，抑菌率达9 6 以上，红曲防腐剂还可抑制大肠杆菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄 球菌，抑菌率在9 9 左右。在肉制品加工中，为了改善肉制品的品质，需要添加 一定量的辅科及其它添加剂，这些可能会对产品的颜色产生不良的影响我国己 开始立法限制或禁止使用合成色素。目前国内有各种肉类肠生产企业1 0 0 多家， 生产线5 0 0 多条，市场潜力巨大。预计未来我国熟肉制品将不断发展，因此具有 防腐功能的红曲红色素的潜在需求将不断增加嘲1 。目前有些国家要求我国出口肉 肠等食品必须使用天然防腐剂与色素，而具有防腐功能的红曲红色素完全符合上 述要求。 6 3 红曲霉在奶酪加工中的应用 世界上生产奶酪主要用小牛皱胃酶，且市场的需求量日益增加，致使每年需 宰杀小牛3 0 0 0 多万头，仍不能满足需要”1 。目前，各国都在不断寻找其代用品， 猪、羊、鱼等动物和菠萝、木瓜等植物蛋白酶虽起到了凝乳作用，但产品风味差。 用微生物凝乳酶生产出来的奶酪，产品质量和产量均无法与小牛皱胃酶相比。采 用红曲霉培养液代替凝乳酶，发现红曲霉培养液对奶酪的工艺及产品的品质都有 明显的影响。红曲霉在培养过程中添加的酸并不是直接导致凝乳的原因，凝乳的 主要作用是红曲霉培养过程中产生的酶的作用添加酸的培养主要是起到抑制其 它菌生长的作用嘲1 。添) b h c a c i 。对凝乳有一定的促进作用，如果不添加，产生的 凝块较软，凝乳时间延长。生产奶酪是可行的。用红曲霉培养液作凝乳剂的条件 为：红曲霉培养液的加入量为9 ，发酵剂加入量为2 ，发酵时问为2 h 。通过和 凝乳酶制作的奶酪对比，凝乳时间、产率差别不大，口味稍有差别。因此，红 曲霉培养液用于奶酪加工是具有发展前途的。 6 4 红曲霉在浓香型曲酒生产中的应用 浓香型曲酒的生产，其产品的质量要求除口感外，又要注意其微量成分的各 项指标要合理。己酸乙酯是浓香型曲酒中最重要的一个微量成分指标，它的高低 与酒质的等级有直接关系，所以提高己酸乙酯含量是酿造浓香型曲酒所追求的一 个目标。在长期的生产工作中，为达到增己降乳、提高酒质的目的，采用己酸茵 灌窖的方法，但效果不是很好嵋町。因己酸菌主要作用是产生己酸，但该部分酯化 1 2 率较弱，故单纯使用己酸菌效果不明显。红曲霉菌，根霉菌等真菌具有较强的酯 化己酸和乙醇生成己酸乙酯的能力，用于浓香型白酒生产，可明显地提高白酒质 量，是继己酸菌后在传统白酒生产上应用的又一重要的生物技术。红曲霉能代谢 出促进己酸与乙醇合成己酸乙酯的酯化酶，红曲霉菌种在浓香型白酒生产中应用 的方法有三种：( 1 ) 直接混入大稽发酵；( 2 ) 应用于双轮底发酵；( 3 ) 制成酯化液 e l i 0 直接混入大槽发酵浓香型曲酒发酵可分成主发酵期、生酸期、产香味期三个 阶段。在主发酵期，主要表现为淀粉糖化发酵生成酒精，发酵糟温度上升；生酸 期与主发酵期紧密相连，在此期间除生成酒精外，在窖内同时产生大量的乙酸、 乳酸及部分己酸、汀酸等有机酸，窖内温度稳定；当发酵糟发酵2 0 天左右时，发 酵糟的温度开始下降，酒精发酵基本结束，有机酸也有一定积累，此时进入产香 味期，在此期间，有机酸含量进一步增加，酸、醇在微生物酯酶的催化下生成酯。 在通常生产条件下，发酵糟内微生物所产酯酶的活力不高，醇、酸等反应底物浓 度较低，反应速度缓慢，且由于受各种工艺条件的限制己酸乙酯等主体香味成份 含量并不是很高砌1 。大曲中的有益微生物菌群如己酸菌、产酯酵母、酒精酵母等 微生物种类不稳定，数量难以控制，量比关系不固定等缺陷也十分明显，按一定 比例加入纯种培养的红曲霉，人为控制发酵，使得微生物数量足，功能强，类群 之间豹量比关系稳定，两者配合使用优势互补，突出己酸乙酯的主体香。 应用于双轮底发酵提高曲酒优质品率的关键是提高发酵母糟的质量，特别是 双轮底母糟的质量。通过工艺调整，创造一个有利于双轮底母糟产香环境，确保 双轮底母糟的质量风格，增加双轮底酒中相关物质( 特别是己酸乙酯) 的含量，是 提高浓香型曲酒质量的有效途径”1 。用己酸菌和生香酵母，再添加红曲霉入双轮 底母糟中共同发酵，与不添加红曲霉的双轮底母糟进行对照，其产酯量有明显增 加，酒也明显香些。这是因为所采用的红曲霉具有较高的酯化能力，其还可产生 各种有机酸，如乳酸、琥珀酸等，有利于改进白酒的风味。 制成酯化液，按一定比例配制酯化液优质黄水、4 酒尾、2 5 己酸、0 5 大曲粉、5 己酸菌液、红曲霉8 、优质老窖泥2 ，控制酒精度不高于1 0 为宜，p h 3 5 5 5 ，在3 2 c - - 3 5 c 下发酵4 5 天嘲1 。酯的提取方法包括直接蒸馏、加 入底锅中串蒸和加入香醅中串蒸。由于己酸乙酯是酵溶性的，增加酯化液中的乙 醇含量更有利于己酸乙酯蒸馏提取”1 。在酯化液蒸馏时一般应补加乙醇至2 5 ， 此时己酸乙酯提取率约为9 3 ，再增加乙醇量，己酸乙酯提