（食品科学专业论文）芒果多酚的提取、分离纯化及抗氧化、抑菌作用研究.pdf

华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 为了充分利用芒果，开发芒果多酚，本实验主要以芒果核仁为材料，通过单因 素和正交实验确立了芒果多酚的最佳提取条件。通过大孔树脂结合s e p h a d e x l h - - 2 0 对芒果多酚粗提物进行分离纯化和分级制备，采用h p l c - e s i m s 对主要组分的 结构做了初步分析。在此基础上对芒果多酚的租提物和不同组分进行了抗氧化、抑 茵作用的初步研究，主要研究结果如下： 1 比较了乙醇回流法、微波提取法、超声波提取法从紫花芒核仁中提取多酚 类物质的最佳提取工艺条件。乙醇回流法的最佳工艺为6 0 乙醇水溶液为提取溶 剂，提取时间6 0 r a i n ，料液比1 ：1 0 ，水浴温度6 0 1 2 ；在此工艺条件下多酚得率为 7 1 6 。微波提取法的最佳工艺为6 0 乙醇水溶液为提取溶剂，料液比1 ：1 5 ，3 8 5 w 功率下微波2 5 r a i n ：在此工艺条件下多酚得率为6 8 5 。超声波提取法的最佳工艺 为6 0 乙醇水溶液为提取溶剂，料液比为1 ：2 0 ，超声2 次，每次6 0 m i u ；在此工艺 条件下多酚得率为4 9 2 。相比乙醇回流法和超声波提取法，微波提取法具有耗时 短、能耗低和提取效率高的优点。 2 通过筛选采用2 号树脂对芒果多酚粗提物进行初步分离纯化，其最佳吸附 条件为4 m g m l 料液浓度，上柱流速选择2 b v h ；最佳洗脱条件为以3 b v 的6 0 乙 醇水溶液在2 b v h 的流速下对2 号大孔树脂进行洗脱。 通过2 号大孔树脂初步纯化结合s e p h a d e xl h 2 0 柱层析分离，可使芒果多酚各组 分得到有效的分离，初步的h p l c - e s i m s 分析表明，芒果核多酚主要活性组分为三 没食子酰基葡萄糖、四没食子酰基葡萄糖等化合物。 3 芒果多酚的抗氧化、抑菌作用的研究结果表明，苹果芒多酚组分活性最 高，对o h 以及0 2 - 有较好的清除效果，0 5 m g m l 的该组分在水杨酸体系和2 脱氧 d 核糖体系对o h 的清除率分别为9 1 4 9 、8 8 7 9 ，对0 2 的清除率为8 9 6 6 ； l m g m l 的该组分对脂质过氧化的抑制率为6 1 5 0 。该组分对供试的大肠杆菌、枯 草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和金黄葡萄球菌都有较强的抑菌活性，最低抑制浓度 为2 3r a g h a ；但是对供试的黑曲霉和啤酒酵母均无明显抑菌活性。 关键词：芒果多酚；提取；分离纯化；抗氧化；抑菌 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 a b s t r a c t i no r d e rt om a k ef u l lu s eo fm a n g o ，p o l y p h e n o l sw a se x t r a c t e df r o mm a n g ok e r n e l s e e d sa n dt h eo p t i m u me x t r a c t i n gm e t h o da n dc o n d i t i o n sw e r ec o m f i r m e dt h r o u i g hs i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a lt e s t m a c r o p o r o u sa d h e s i v er e s i nc o l u m na n ds e p h a d e xl h 2 0 c o l u m nw e r ee m p l o y e dt os e p a r a t ea n df r a c t i o n a t et h ec r u d ee x t r a c ta n dt h es t r u c t u r e so f t h em a i nc o m p o u n d sw e r e a n a l y z e db y h p l c - e s l - m s t h ea n t i o x i d a n ta n d a n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo ft h ec r u d ee x t r a c ta n di t sf r a c i o n sw e r ea l s oi n v e r s t i g a t e d t h e m a i nr e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w s ： 1 m e t h o d so fe t h a n o lr e f l u x i n ge x t r a c t i o n ，m i c r o w a v e - a s s i s t e de x t r a c t i o na n d s u p e r s o n i cw a v e a s s i s t e de x t r a c t i o nm e t h o dw e r eu s e d t oe x t r a c tp o l y p h e n o l sf r o m m a n g ok e r n e ls e e d sa n dt h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r es h o w na sf o l l o w s ： t h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o nf o re t h a n o lr e f l u x i n gm e t h o dw a sa sf o l l o w s ：6 0 e t h a n o la se x t r a c t i n gs o l v e n tw i t has o f i d s o l v e n tr a t i oo f1 ：1 0 e x t r a c t i n gf o r6 0m i n a t6 0 u n d e rt h i sc o n d i t i o n , t h ee x t r a c t i n gy i e l dw a s7 1 6 t h eo p t i m u me x t r a c t i n g c o n d i t i o nf o rm i c r o w a v e - a s s i s t e de x t r a c t i o nm e t h o dw a sa sf o l l o w s ：6 0 e t h a n o la s e x t r a c t i n gs o l v e n tw i t has o l i d s o l v e n tr a t i oo f1 ：1 5 ( w v ) a n dm i c r o w a v ep o w e ro f3 8 5 w , e x t r a c t i n gf o r2 5m i l l u n d e rt h i sc o n d i t i o n , t h ee x t r a c t i n gy i e l dw a s6 8 5 f o r u l t r a s o n l c - a s s i s t e de x t r a c t i o nm e t h o d , t h eo p t i m u mc o n d i t i o nw a sa sf o l l o w s ：6 0 e t h a n o la se x t r a c t i n gs o l v e n tw i t has o l i d s o l v e n tr a t i oo f1 ：2 0 , e x t r a c t i n gf o rt w ot i m e s w i t h6 0m i l lp e rt i m e u n d e rt h i sc o n d i t i o n , t h ee x t r a c t i n gy i e l dw a s4 9 2 c o m p a r e d w i t he t h a n o l r e f l u x i n g e x t r a c t i o na n du l t r a s o n i ce x t r a c t i o n m e t h o d s ，m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o nh a st h ea d v a n t a g e so ff a s t e re x t r a c t i o n , l o w e r e n e r g yc o n s u m p t i o na n dh i g he x t r a c t i o ny i e l d 2 i tw a ss h o w e dt h a tt h ec r u d ee x t r a c tc o u l db es e p a r a t e da n dp u r i f i e db yn u m b e r2 m a c r o p o r o u sa d h e s i v er e s i nc o l u m na n ds e p h a d e x i h 2 0c o l u m n t h eo p t i m u m a d s o r p t i o na n ds e p a r a t i o nc o n d i t i o n sf o rt h ec r u d ee x t r a c to nn u m b e r2m a c r o p o m a s a d h e s i v er e s i nc o l u m nw e r ec o n f i r m e da sf o l l o w s ：t h ef e e dc o n c e n t r a t i o no f4 m g m lw i t h f l o wr a t eo f2 b v h ；t h ed e s o r p t i o ns o l v e n tw a s3 b vo f6 0 e t h a n o lw i t hf l o wv e l o c i t y o f 2 b v h 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 h p l c - e s i - m s a n a l y s i s s h o w e dt h a tt h em a i na c t i v ec o n s t i t u e n to fm a n g o p o l y p h e n o l s w e r e g a l l o t 勰n i 鹤c o m p o u n d ss u c h 笃t r i - o - g a l l o y ! 一g l u c o s ea n d t e t r a o g a l l o y l g l u c o s e 3 t h ea n t i o x i d a n ta n da n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fm a n g op o l y p h e n o l sw e r es t u d i e d t h e r e s u l ss h o w e dt h a tt h em a n g op o l y p h e n o l so ff r a c t i o n h a de f f e c t i v es e a v e n g n ge f f e c t o nt h eh y d r o x y lr a d i c a l ( o h ) a n dt h es u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l ( o f ) t h es c a v e n g i n g r a t i oo f o hw a s9 1 4 9 i ns a l i c y l i ca c i ds y s t e ma n d8 8 7 9 i nd rs y s t e mw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no ft h ef r a g m e n tw a s0 5 m g m 1 t h es c a v e n g i n gr a t i oo f0 2 、w a s8 9 6 6 t h ei n l u b i t i o nr a t i oo fl i p i dp e r o x i d a t i o nw 6 s6 1 5 0 w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no ft h e f r a c t i o nw a sl m g m 1 t h ef r a c t i o nh a de f f e c t i v ea n t i m i e r o b i a la c t i v i t yo nf o u rk i n d so f b a c t e r i at e s t e dw i t hm i co f2 - 3 m g m i b u ti th a dn or e m a r k a b l ee f f e c t i v ea n t i m i c r o b i a l a c t i v i t yo ny e a s ta n da s p e r g i l l u sn i g e r k e y w o r d ：m a n g op o l y p h e n o l s ；e x t r a c t i o n ；s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；a n t i o x i d a n ta n d a n t i m i e r o b i a la c t i v i t y 脚 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特另9 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同2 t - 作的同志对本研究所做的任 何贡献均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研尧生签名：同丽啊。 时问：仞口7 # - 月z 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者鲐陋咀导师始力磊l 签名日期：知一7 年月2 f 日签名日期：扣刁年易月z 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第一章前言 1 植物多酚的研究现状 1 1 植物多酚的药理作用 植物多酚( p l a n t p o l y p h e n 0 1 ) 是一类广泛存在于植物体内的多酚类物质，在植物中 的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素，主要存在于植物的皮、根、木、叶、果 中。 植物多酚的结构复杂，化学性质活泼，并且常以大量性质相似的同系物的混合 物形式存在，“因此本世纪3 0 年代以前，多酚化学的进展一直非常缓慢。植物多酚的 科学分类方法直到1 9 7 0 年才由胁d 即b e 横出，即根据化学结构不同，植物多酚分 为水解单宁( 格酸酯类多酚) 和缩合单宁( 黄烷醇类多酚或原花色素) 。前者主要是格酸 及其衍生物与多元醇以酯键或甙键形成，可细分为格单宁和鞣花单宁两类；后者主 要是羟基黄烷醇类单体的缩合物，单体间以c - c 键相连( 石碧和狄莹，2 0 0 0 ) 。水 解单宁和缩合单宁在构成单元骨架上完全不同，由此造成它们在化学性质、应用范 围上的显著差异，但是它们在分子结构上仍具有某些共性：( 1 ) 酚羟基数目众多，以 邻位酚羟基( 连苯三酚、邻苯二酚) 最为典型；( 2 ) 分子量较大，且分布较宽。正是这 种化学结构，赋予多酚独特的化学性质，如能与蛋白质、生物碱、多糖结合，使其 物理、化学行为发生变化；能与多种金属离子发生络合或静电作用；具有还原性和 捕捉自由基的活性；具有两亲结构和诸多衍生化反应活性等等。使植物多酚具有止 血、抑制微生物、抗过敏、抗突变、抗癌、抗肿瘤、抗衰老等多种生物活性。 1 1 1 抗氧化作用 现代医学研究证明，很多疾病如组织器官老化等都与过剩的自由基有关( 刘运 荣和胡健华，2 0 0 5 ) 。而植物多酚有着出色的抗氧化能力，能够有效地清除人体内 的过剩自由基。因此，利用植物多酚的这一性质，就能减缓人体组织器官的衰老， 并且可以对自由基诱发的生物大分子损伤起保护作用。血液流变性降低，血脂浓度 增高，血小板功能异常是诱发心脑血管疾病的重要原因( 裘爱泳等，2 0 0 3 ) 。据报 道，植物多酚物质能够抑制血小板的聚集粘连，诱导血管舒张，并抑制脂新陈代 谢中的酶作用，有助于防止冠心病、动脉粥样硬化和中风等常见心脑血管疾病的发 生( r e e dj ，2 0 0 2 ) 。以茶多酚f r p ) 为代表的植物多酚由于其结构中苯环上具有钆8 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 个羟基的连( 或邻) 苯酚基，苯环上的p 电子与氧原子尚不成对的单电子相互作用，发 生共轭效应，其结果是不成对的单电子靠向苯环，氢氧键减弱。所以，含酚基的物 质具有较活泼的羟基氢，能提供氢离子，竞争性地与不饱和脂肪酸争夺活性氧；能 与脂肪酸自由基结合，使自由基转化为惰性化合物，中止自由基的连锁反应，即中 止油脂自动氧化；同时各茶多酚分子在抗氧化后产生的游离基间也会互相作用，生 成新的酚型化合物，而其继续具有抗氧化功能( 吴天容，1 9 9 7 ) 。因其对氧自由基 的强清除作用，能对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护，维护细胞膜的流动和 蛋白质的构象，防止辐射诱发的d n a 断裂( 可能插入碱基对平面) ，从而在抑制脂质 过氧化、心血管病、抗癌、抗突变、抗衰老、抗白内障等方面有独到功效。其抗氧 化性通过下述几种途径体现：首先，口的酚羟基能作为供氢体，提供质子h + 将单线 态氧1 0 2 还原成活性较低的三线态氧3 0 2 ，减少氧自由基产生的可能性；并能夺取过 程中产生的脂质过氧化自由基，生成活性较低的多酚基，打断自由基的氧化链反应， 有效清除体内自由基。其次，在中性和酸性条件下，口的邻位二酚羟基与金属离子 整合，阻止金属离子对活性氧等自由基的生成和链反应的催化作用，发挥抗脂质过 氧化作用( 武煜和顾振纶，2 0 0 5 ) 。 茶多酚不仅能捕获氧化过程中产生的自由基，而且能作用于与自由基有关的酶。 生物体内许多氧化酶与自由基的生成有关，如黄嘌呤氧化酶系、p - 4 5 0 酶系、髓过氧 化酶、脂氧化酶和环氧酶。研究表明，茶多酚对上述各种氧化酶有抑制作用。许 多研究表明，茶多酚不仅能防护体内抗氧化酶，还能促进和调动机体内抗氧化酶f 主 要有超氧化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽酶( g s h ) 和过氧化氢酶( c a i ) 】的活性。茶 多酚还能再生v e 、v a 、g s h 、s o d ，从而保护和修复抗氧化系统( 黎伟等，2 0 0 7 ) 。 杨贤强等( 1 9 9 2 ) 在沙土鼠脑缺血再灌注试验中观察到，茶多酚可以防止s o d 活性 的显著下降和丙二醛( m 吼吣含量的上升。赵秀兰等( 1 9 9 7 ) 报道，绿茶对小鼠各脏 器中的谷胱甘肽s - 转移酶( g s t ) 含量均有一定的诱导作用，其中肝脏、肺脏中的 g s t 活性以及肝脏、肾脏、小肠中的g s h 含量明显高于对照组。 1 1 2 抗癌作用 多酚类物质在哺乳动物细胞中有广泛的生物效应。大量的流行病学研究以及动 物试验都证明多酚类物质可以阻止和抑制癌症的发病。多酚的抗癌作用是多个方面 的，可以对癌变的不同阶段进行相应抑制。多酚是一种十分有效的抗诱变剂， 能 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 够减少诱变剂的致癌作用，并提高染色体精确修复能力，从而达到提高细胞免疫 力和抑制肿瘤细胞生长的目的( 赵扬帆和郑宝东，2 0 0 6 ) 。已有的研究证明，绿茶、 花茶、乌龙茶均有抗癌作用，这是由于茶叶中的茶多酚可以阻断亚硝酸盐等多种致 癌物质在体内合成，并具有直接杀伤癌细胞的功效，对胃癌、肠癌等多种癌症的预 防和辅助治疗均有裨益。长期饮用茶，能够减少癌症和肿瘤的发病率( 张国莹， 1 9 9 4 ) 。有统计资料显示，日本国内，凡绿茶消费较多的地区，胃癌发病率较低( 陈 曾三，2 0 0 0 ) 。 茶多酚有极强的消除有害自由基，阻止脂质过氧化作用；诱导人体内代谢酶的 活性的增高，促进致癌物的解毒；抑制和阻断人体内源性亚硝化反应，防止癌变和 基因突变，抑制致癌物与细胞d n a 的共价结合，防止d n a 单链断裂；提高机体的细 胞免疫功能( 吴永宁，1 9 8 8 ) 。黎丹戎等( 2 0 0 1 ) 进行了茶多酚抑制肝癌细胞生长 研究。结果表明，在2 5 、5 0 、1 0 0 、2 0 0 、2 5 0 和5 0 0 , u g m l 浓度下，茶多酚对b e l - 7 4 0 2 的生长抑制率与药物浓度呈正相关，i c 5 0 为1 5 0 * , g m l 。 苹果果肉的抗癌效果也已得到验证，虽然果肉本身抗癌细胞的增殖能力较差， 但在苹果果肉提取物的长期作用下，也能够达到抑制癌细胞增殖的目的。另外，葡 萄籽活性提取物也有抗肿瘤的功效( 赵扬帆和郑宝东，2 0 0 6 ) 。 1 1 3 提高免疫功能 国内外的大量研究资料证明，茶多酚可全面增强人体的免疫功能，具体表现在： 全面增加免疫细胞的数量，包括淋巴细胞系( 特指磷巴细胞和b 淋巴细胞) 、单核吞 噬细胞系( 特指巨噬细胞) 、合粒细胞系的细胞数量；激活免疫细胞的活性，促使吞 噬性能明显提高；体液免疫明显增强等( 何皎，1 9 9 9 ) 。 1 1 4 抗凝血作用 现代科学研究证明，茶多酚可防止贫血，对缺铁性贫血、辐射损伤性贫血、运 动红细胞性贫血、高原性红细胞增多症等有良效；具有抗凝、促进纤维蛋白原溶解 作用，抑制血小板凝集，改善血液的高凝状态，使血液粘度下降，因而有预防血栓 效果，促进造血器官机能、催化细胞的血红蛋白的合成( 颜亭祥和张文高，2 0 0 0 ) 。 1 1 5 抑菌消炎和抗病毒 植物多酚对多种细菌、真菌、酵母菌都有明显的抑制作用。尤其对霍乱菌、金 黄色葡萄球菌和大肠杆菌等常见致病细菌有很强的抑制能力，并且不影响生物体本 3 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 身的生长发育。体外试验证明，茶多酚对痢疾杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌均 有很强的抑制作用，最佳抑菌浓度为i o o m 鲫，其机理在于茶多酚的氧化产物与菌体 蛋白质结合导致细菌死亡，使细菌数量大量减少( 李海波，2 0 0 4 ) 。茶多酚还可以 用作胃炎和溃疡药物的成分，抑制幽门螺旋杆菌的生长和抑制链球菌在牙齿表面的 吸附。 近年来大量的研究表明，治疗流感、胞疹都与植物多酚抗病毒作用有关。目前， 尚无治疗爱滋病的有效方法。而植物多酚可用于抗爱滋病的研究，低分子量的水解 单宁被发现可用作口服剂来抑制爱滋病，延长潜伏期。茶多酚也可用于抗病毒，红 茶和绿茶提取物能够抑制甲、乙型流感病毒；儿茶素能够抑制人体呼吸系统合孢体 病毒。茶多酚对于肠胃炎病毒和甲肝病毒等也有较强的对抗抑制作用( 赵扬帆和郑 宝东，2 0 0 6 ) 。 日本冈山大学与筑波生物医学研究所在开发研究骨质疏松防治的治疗剂中发 现，含有单宁的数种植物有抑制骨分解的高活性，特别是椿树叶中水解性复合单宁 对抑制骨分解作用良好。单宁具有收敛性，可用于治疗胃肠道出血、溃疡和水泻等 症；外用于创伤、灼伤，可减少分泌和防止感染，有局部止血作用。 1 1 6 抗老化和防晒 植物多酚在2 0 0 3 0 0 n m 之间还有着较强的紫外吸收能力。尤其是对能量高、破 坏力大的远紫外区有更强的吸收作用，因此植物多酚可以作为抗老化剂和防晒剂的 有效成分。 1 2 植物多酚的资源利用情况 在涉及的众多富含多酚的植物中，葡萄( 李凤英等，2 0 0 5 ) 、茶叶、银杏叶是 研究最多的素材。人们从葡萄籽( 范培红等，2 0 0 4 ) 、叶和其它部分已分离、鉴定 了1 6 种原花青素，即8 个二聚体，4 个三聚体，其它为四、五、六聚体。目前葡萄 籽和皮( 夏中生等，2 0 0 5 ) 已成为各国利用植物多酚最重要的资源。在美、德、法、 意、日、澳大利亚、加拿大、罗马尼亚、匈牙利等国已有许多相关专利及产品问世。 如在法国沿海地区的一种原花青素，抗氧化效果很强，以此命名的碧萝芷 ( p y c n o g e n 0 1 ) 上市以来，迅速成为国际销售最好的营养补充剂之一，在欧洲已经 有3 3 年历史，美国1 7 年长盛不衰，2 0 0 3 年全美销售额突破3 0 亿美元。此外，茶 多酚和银杏黄酮也已被广泛地用于食品、医药、精细化工等领域。近几年，有关苹 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 果( 孙建霞等，2 0 0 2 ) 、莲房( 邓乾春等，2 0 0 6 ) 、黑荆树皮( 何有节等，1 9 9 9 ) 、 松树等材料中的多酚的提取、结构及抗氧化抑菌等活性的研究也有很多报道，尼柯 维斯基公司成功开发并推出了以“苹果酚”命名的苹果多酚产品，并广泛应用于胶 姆糖、糖果、甜点、饮料等产品中。柑橘中的黄酮类化合物( 陆蓓等，2 0 0 6 ) 以及石 榴( 贾冬英等，2 0 0 6 ) 等水果中多酚类物质的抗氧化活性也有所报道。而对其它植 物材料中多酚的研究报道相对较少。 2 芒果多酚的研究现状 随着植物多酚化学的不断发展，植物多酚类物质在各个应用领域的应用范围逐 渐扩大。随着植物多酚在多个领域的潜在应用价值日益被人们认识，寻找新的富含 多酚的植物资源已经成为项重要课题。 芒果作为一种热带水果，在我国的台湾、广东、广西、海南和福建南部，云南 南部等地区均有分布。2 0 0 0 年我国芒果的总产量已达2 9 3 6 万吨。芒果果肉营养丰富， 糖含量高达1 2 2 0 ，含蛋白质5 5 6 ，脂肪1 6 1 ，碳水化合物6 7 2 9 ，还含有 丰富的维生素a 、维生素b 、维生素c ，及少量的钙、磷、铁及其他矿物质。此外， 研究表明带皮芒果还富含芒果酮酸、异芒果醇酸等三萜酸及没食子酸、间双没食子 酸、没食子鞣质、槲皮素、异槲皮苷、芒果苷等多酚类化合物。 a n d r e a ss c h i e b e r ( 2 0 0 0 ) 等用丙酮和甲醇从芒果肉中提取多酚化合物，先用乙 酸乙酯在p h 7 和p h 2 条件下分离，再利用s e p h a d e x l h 2 0 进一步分离纯化，并通过 h p l c 和i - i p l c m s 分析了芒果多酚化合物，分析结果表明其中含有没食子酸、咖啡 酸、原儿茶酸、香豆酸、芒果苷、栎皮酮、没食子单宁等。 t o s h i l d d ek a b u k i 等( 2 0 0 0 ) 对芒果核粗提物的抗食品病源微生物的性质进行了 研究，并借助h p i c 对芒果核粗提物进行了分析。结果表明芒果核粗提物对革兰氏阳 性菌有较强的抑制作用，对革兰氏阴性菌的抑制作用较弱。i - i p l c 分析表明具有病源 微生物抑制活性的成分是多酚物质。 y e a n y e a ns o o n g 等( 2 0 0 4 ) 研究了不同水果果核的抗氧化活性与多酚含量的相 关性，结果表明芒果多酚具有较强的抗氧化活性。 国外有学者用有机溶剂( 三氯甲烷与甲醇之比为2 ：1 ，乙酸乙酯) 提取并分离芒 果核的抗氧化成分( 主要是酚和磷脂) ，并测定了芒果核的抗氧化成分对水牛乳脂的 抗氧化活性。结果表明往乳脂中添加酚、磷脂混合物比添) j n b h a 更有益于抗氧化。 5 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 国内对芒果多酚化合物的相关报道较少，主要是对芒果皮粗提物的微生物抑制 活性和抗氧化活性进行了初步研究。 徐志和吴莉宇( 2 0 0 2 ) 对芒果皮萃取物在抗食品病源微生物中的应用进行了研 究，结果表明，当在培养基中添加浓度为2 m g m l 的芒果皮的8 5 乙醇萃取物时，常 见的食品病源微生物中，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌不能生 长，其中对大肠杆菌的最小抑制浓度( m i c ) 为0 5m g m l ；对志贺氏菌生长有抑制作 用；而对乙型溶血性链球菌、毛霉菌没有抑制作用。在相应的浓度和培养条件下， 常用的食品防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾都未表现出上述食品病源微生物抑制活性。 李琳( 2 0 0 3 ) 研究了枇杷皮和芒果皮粗提液在卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸过氧体系 和油脂中的抗氧化活性，并比较了两种粗提液对羟基自由基和超氧阴离子自由基的 清除能力，结果表明：枇杷皮和芒果皮粗提液对卵黄脂蛋白不饱和脂肪酸过氧体系 和鲜榨花生油均有较强的抗氧化性能，并具有较强的清除两种自由基的能力，其中 芒果皮的抗氧化性优于枇杷皮。 3 研究目的、意义及内容 纵观文献资料可以看出，目前国内外对于芒果多酚的研究非常有限，虽然对芒 果多酚粗提物的抗氧化、抑菌作用有了初步的研究结果，但缺乏对芒果多酚的提取 工艺、结构分析、生物活性以及构效关系的系统研究。我国芒果产量很大，除鲜食 外，主要被加工成芒果于、果冻等。在加工过程中占芒果总重4 0 左右的果皮和果 核一般都被丢弃或用作饲料，而果皮和果核等副产物中含有大量的可被利用的多酚 类化合物。建立从芒果副产物中提取分离多酚类高效抗氧化功能因子的新技术，这 对提高我国芒果的附加值和利用率、避免资源浪费和环境污染，减少疾病发生，提 高人民生活水平和身体素质，均具有十分重要的意义。 因此，本课题旨在通过芒果多酚的提取工艺、分离纯化、分析方法及抗氧化、 抑菌活性进行较为系统的研究，为芒果的综合利用和深度开发提供依据。论文的主 要研究内容包括：( 1 ) 芒果核中多酚类化合物的提取工艺研究；( 2 ) 芒果多酚的纯 化及结构分析；( 3 ) 芒果多酚的抗氧化、抑菌作用研究。 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第二章芒果多酚提取工艺研究 目前，多酚类化合物的提取方法主要有：水提法、有机溶剂提取法、超声波法、 微波辅助萃取法等。水提法具有成本低、安全，适合工业化生产等优点；但由于水 的极性大，易把蛋白质、糖类、无机盐等溶于水的成分浸提出来，从而使提取液存 放时，易腐败变质，同时给后续的分离带来困难，现在已经很少被单独使用。有机 溶剂提取法具有提取效率高、易于实现工业化生产等优点，是目前国内外使用最广 泛的方法，但成本较高，杂质含量也较高。超声技术提取是目前比较新的提取方法。 近年来，超声技术己应用于提取植物中的生物碱、营类、生物活性物质等研究。此 法是利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，加速 药物有效成分进入溶剂，从而提高提出率、原料的利用率，缩短提取时间，并且避 免高温对提出成分的影响。微波辅助萃取技术( m a e ) 是微波与传统有机溶剂萃取相 结合的一项新型萃取技术。与其它的提取方法相比较，微波萃取技术具有选择性高、 快速高效、收得率高及提取物纯度高、质量稳定、耗能低、溶剂用量少( 可较常规方 法少5 0 - - 9 0 ) ，安全无污染等特点，且符合绿色化学与环境保护要求。目前，此 项技术的应用范围已从最初的环境分析样品制备迅速扩展到食品、化工和农业、天 然产物等领域。 因此，本文比较了有机溶剂回流提取法、超声波法和微波萃取法对芒果核中多 酚类化合物的萃取效果，并通过正交试验确立了芒果多酚的提取工艺，旨在为芒果 多酚的工业化生产提供依据。 l 材料和方法 1 1 实验仪器、材料和试剂 1 1 1 实验仪器 h h - 4 数显恒温水浴锅：国华电器有限公司 循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司 u v - 1 7 0 0 紫外分光光度仪：s h i m a d z u ： e 京瑞利分析仪器有限公司 a l 2 0 4 型电子天平：m e t i z e rt o l e d o 上海有限公司 可调试移液器：熟电( 上海) 仪器有限公司 k q 3 2 0 0 b 型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司 7 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 美的p j 2 1 c b f ( k a ) 微波炉：武汉工贸有限公司 a l p h a l 4 l d 型真空冷冻干燥机：德国m a t i nc h r i s t 公司 1 1 2 实验材料 芒果核仁粗粉：芒果购于武汉市螃蟹甲水果批发市场，有紫花芒、苹果芒和台 农芒三个品种，去皮、去肉、去壳后将芒果核仁真空冷冻干燥，然后粉碎制得。 1 1 3 主要实验试剂： 没食子酸：a r上海国药集团化学试剂公司 9 5 乙醇：食用级武汉市一轻江南公司新河酒精分装厂 无水乙醇a r上海振兴化工一厂 磷酸：a r武汉亚泰化工试剂有限公司 无水碳酸钠a r上海虹光化工厂 磷铝酸a r天津光复精细化工研究所 钨酸钠： a r 天津福晨化学试剂厂 1 2 实验方法 1 2 1 芒果多酚含量的测定 1 2 1 1 标准曲线的制作： 总多酚的测定采用f o l i n d e n i s 法( 严守雷等，2 0 0 3 ) ，用没食子酸作为对照品。 精密称取没食子酸标准y 1 0 r a g ，用水溶解定容于1 0 0 m l 容量瓶中。精密吸取0 2 5 m l 、 0 5 m l 、0 7 5 m l 、l m l 、1 2 5 m l 、1 5 m l 、1 7 5 m l 、2 m l 于2 5 m l 比色管中，加入2 5 m l f o l i n d e n i s 试剂之后0 5 8 m i n 后加入2 5 m 1 1 0 的碳酸钠溶液，加蒸馏水定容至2 5 m l ，摇匀后予 室温下放置1 h 。2 5 m l f o l i n d e n i s 试剂中加入2 5 m 1 1 0 的碳酸钠溶液，于2 5 m l 比色管 中，加蒸馏水定容，摇匀后于室温下放置1 h ，即得空白溶液。随行空白，在7 6 0 r i m 波长处测定标准品溶液的吸光值。以比色管中没食子酸的浓度为横坐标，吸光值为 纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线见图2 1 。 8 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 名 = 卜 一 趔 紫 宦s 比色管中没食子酸的浓度( i i g m 1 ) 图2 - 1标准曲线 f i g 2 - 1t i r es l l t l l k l a l mc m 结果表明，没食子酸在浓度1 1 0 9 9 m l p q 与其吸光值呈良好的线性关系，在此范 围内的线性回归方程为：y - - - 0 1 1 9 5 x + 0 0 1 0 5 ，r 2 = 0 9 9 9 9 。 1 2 1 2 样品的测定： 精密吸取i m l 芒果提取滤液用蒸馏水定容至5 0 m l ，再精密吸取2 m l 于2 5 m i 比色管 中，加入2 5 m i f o l i n d e n i s 试剂之后0 5 m i n 8 m i n 后加入2 5 m 1 1 0 的碳酸钠溶液，加 蒸馏水定容至2 5 m l ，摇匀后于室温下放置1 h 。以上述相同方法配置空白溶液，在 7 6 0 r i m 波长处测定样品溶液的吸光值。根据回归方程计算样品溶液总多酚的浓度， 计算芒果多酚的得率。 1 2 2 乙醇回流法工艺条件的研究 1 2 2 1 单因素实验条件 1 2 2 1 i 乙醇浓度的选择 称取预先干燥、粉碎的芒果核仁粗粉5 份，每份2 5 9 ，料液比1 ：1 0 ，分别加入 4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 的乙醇水溶液，水浴温度为6 0 ，回流1 h ，将提取液 抽滤，收集滤液定容，按1 2 1 2 的方法测定滤液中多酚的含量，计算芒果多酚的得 率。 1 2 2 1 2 提取温度的选择 称取预先干燥、粉碎的芒果核仁粗粉7 份，每份2 5 9 ，料液比为1 ：i 0 ，加入6 0 乙醇水溶液，分别在3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 条件下回流1 h ，将提取液抽滤， 收集滤液定容，按1 2 1 2 的方法测定滤液中多酚的含量，计算芒果多酚的得率。 9 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 2 2 1 3 回流时间的选择 称取预先干燥、粉碎的芒果核仁粗粉4 份，每份2 5 9 ，料液比为1 ：1 0 ，加入6 0 乙醇水溶液，分别回流0 5 、1 、1 5 、2 h ，将提取液抽滤，收集滤液定容，按1 2 1 2 的方法测定滤液中多酚的含量，计算芒果多酚的得率。 1 2 2 1 4 料液比选择 称取预先干燥、粉碎的芒果核仁粗粉4 份，每份2 5 9 ，分别以不同的料液比1 ：1 0 、 1 ：1 5 、1 ：2 0 、1 ：2 5 加入6 0 乙醇水溶液，回流1 h ，将提取液抽滤，收集滤液定容，按 1 2 1 2 的方法测定滤液中多酚的含量，计算芒果多酚的得率。 1 2 2 2 正交设计 根据单因素实验确定的范围，乙醇浓度、提取温度、回流时间和料液比作为考 察的4 因素，每因素3 水平，以芒果多酚得率为指标，用l 9 ( 3 4 ) 正交表安排试验， 得出最佳提取条件。 1 2 3 微波提取法工艺条件的研究 1 2 3 1 单因素实验条件 1 2 3 1 1 乙醇浓度对芒果多酚得率的影响 称取预先干燥、粉碎的芒果核仁粗粉5 份，每份2 5 9 ，料液比为1 ：2 0 ，分别加 入水以及2 0 、4 0 、6 0 、舳的乙醇水溶液，中火微波3 m i n ，取出搅拌均匀后抽 滤，收集滤液定容，按1 2 1 2 的方法测定样品液中多酚的含量，计算芒果多酚的得 率。 1 2 3 1 2 料液比对芒果多酚得率的影响 称取预先干燥、粉碎的芒果核仁粗粉4 份，每份2 9 ，分别以不同的料液比1 ：1 0 、 1 ：1 5 、1 ：2 0 、1 ：2 5 加入6 0 乙醇水溶液，中火微波3 m i n ，取出搅拌均匀后抽滤，收集 滤液定容。按1 2 1 2 的方法测定样品液中多酚的含量，计算芒果多酚的得率。 1 2 3 1 3 提取时间对芒果多酚得率的影响 称取预先干燥、粉碎的芒果核仁粗粉3 份，每份2 9 ，料液比为1 ：2 0 ，加入6 0 乙 醇水溶液，分别中火微波l m i n 、2 m i n 、3 m i n ，取出搅拌均匀后抽滤，收集滤液定容。 按1 2 1 2 的方法测定样品液中多酚的含量，计算芒果多酚的得率。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 2 3 1 4 微波功率对芒果多酚得率的影响 称取预先干燥、粉碎的芒果核仁粗粉3 份，每份2 9 ，料液比为1 ：2 0 ，加入6 0 乙 醇水溶液，分别在1 1 9 w ( 低火) 、2 3 1 w ( q p l 氐火) 、3 8 5 w ( 中火) 、5 3 9 w ( 高火) 条件下微 波3 m i n ，取出搅拌均匀后抽滤，收集滤液定容。按1 2 1 2 的方法测定样品液中多酚 的含量，计算芒果多酚的得率。 1 2 3 2 正交实验 根据单因素实验确定的范围，乙醇浓度、提取温度、回流时间和料液比作为考 察的4 因素，每因素3 水平，以芒果多酚得率为指标，用l 9 ( 3 4 ) 正交表安排试验， 得出最佳提取条件。 1 2 a 超声波提取法工艺条件的研究 1 2 4 1 料液比对芒果多酚得率的影响 称取预先干燥、粉碎的芒果核粗粉4 份，每份2 5 9 ，分别以不同的料液比1 ：1 0 、 1 ：1 5 、1 ：2 0 、1 ：2 5 加入6 0 的乙醇水溶液，超声6 0 r a i n ，取出搅拌均匀后抽滤，收集 滤液。滤渣再重复提取一次，取出后抽滤，合并两次滤液后定容。按1 2 1 2 的方法 测定滤液中多酚的含量，计算出多酚得率。 1 2 4 2 乙醇浓度对芒果多酚得率的影响 称取预先干燥、粉碎的芒果核粗粉6 份，每份2 5 9 ，分别加入水以及2 0 、4 0 、 6 0 、8 0 的乙醇水溶液和无水乙醇，料液比为1 ：2 0 ，超声6 0 r a i n ，取出搅拌均匀 后抽滤，收集滤液。滤渣再重复提取一次，合并两次滤液后定容。按1 2 1 2 的方法 测定滤液中多酚的含量，计算出多酚得率。 1 2 4 3 提取时间对芒果多酚得率的影响 称取预先干燥、粉碎的芒果核粗粉5 份，每份2 5 9 ，按料液比1 ：2 0 舰1 入6 0 的乙 醇水溶液，分别超声3 0 m i n 、6 0 r a i n 、9 0 r a i n 、1 2 0 r a i n 、1 5 0 r a i n ，取出搅拌均匀后抽 滤，收集滤液。滤渣再重复提取一次，合并两次滤液后定容。按1 2 1 2 的方法测定 滤液中多酚的含量，计算出多酚得率。 1 2 4 a 超声次数对芒果多酚得率的影响 称取预先干燥、粉碎的芒果核粗粉3 份，每份2