（食品科学专业论文）醋蛋酶解产物生物活性成分的研究.pdf

中文摘要摘要醋蛋是以醋和鸡蛋为主要成分，营养丰富、合理，不仅服用安全，而且能增强人体自身的免疫力和抗病力，具有预防、治疗和康复的三重功效，是一种防病健身的特效保健饮品。经动物实验和临床试验证明，醋蛋液具有降血压、降血脂等保健功能。本文研究了醋蛋的泡制工艺、醋蛋经消化酶酶解后功能因子的分离提取和醋蛋液的抗氧化活性，结果表明具有一定的研究价值。本课题首先对醋蛋的泡制工艺和影响浸泡的因素进行了研究，确定了醋蛋的泡制工艺，在泡制天数为2 天、泡制温度为4 2 5 和用醋量为1 5 0 m l 时，泡制的醋蛋液比较均匀，无结块，没有不溶解的蛋壳，醋蛋液酶解后水解液的a c e 抑制活性最高。用胃蛋白酶一胰酶复合酶体系水解醋蛋液，作用条件为：温度3 7 ，酶底比1 ：1 0 0 ，胃蛋白酶p h 2 o ，胰酶p h 7 5 ，分别水解5 h 。醋蛋酶解液a c e 抑制活性物质的分离纯化和结构分析。醋蛋黄和醋蛋白水解液首先经过b i o g e lp 一2 纯化，用去离子水洗脱分别得到五个主要组分，其中组分c 和i ia c e抑制活性最高，采用半制备r p h p l 进一步纯化组分c 和i i ，分别得到活性最高的组分e 和组分2 。用高效液相一液质联用分析组分e 组分2 ，得到它们的相对分子质量分别是5 9 0 d a和6 4 9 d a ，氨基酸组成和序列分别是r i 砷一a l a - a l a g l y t r p 、a r g l y a l a - a l a g 坤一a l a - p h e 。组分e 和组分2 经保温后i c 5 0 基本没有变化，故可以确定这两种组分是a c e 抑制剂。采用连苯三酚( p a ) 自氧化法、邻二氮菲一f e ”氧化法、二苯代苦味肼基自由基( d p p h )法三种体外实验方法来测定醋蛋液酶解产物清除自由基的能力。研究结果表明，醋蛋液酶解产物能有效地抑制连苯三酚自氧化，其i c 5 0 值为8 m 舻n l ；有明显清除羟自由基o h 和d p p h 自由基的作用，8 m m l 的醋蛋液酶解产物的羟自由基o h 和d p p h 自由基清除率分别为9 5 8 0 和9 8 8 0 。证明醋蛋液酶解产物有较强的抗氧化活性，其抗氧化活性随浓度升高而增强，与浓度呈良好的量效关系。醋蛋液酶解产物用去离子水为洗脱液经凝胶色谱分离，得到抗氧化活性较高的组分相应的a c e 抑制活性也较高，其中组分c 浓度为o 2 m 咖l 时d p p h 自由基清除率为5 0 5 6 、a c e 抑制活性为7 5 6 ，经高压液相色谱( h p l c ) 测定，组分c 可能是相对分子质量在6 0 0 左右的多肽类物质。关键词：醋蛋；降血压：a c e 抑制活性；抗氧化活性；自由基英文摘要a b s t r a c tt l l ev i n e g a 卜e g g ，w h i c hh a st h er i c ha n dr e a s o n a b l en u t r i t i o n ，i sab e n e rd r i n k sa 1 1 di t sm a i nc o m p o s i t i o na r em ev i l l e g a ra n dm ee g g i tc a nn o to n l ys n 群h e ni m m u n i t yo fh u m a nb o d i e sb u ta l s or e s i s td j s e a s e t h er e s u l t so fa l 】i m a la n dc r o w dt e s t ss h o w e dt h a tt l 】ev i n e g a r _ e g gb a sr e m a r l ( a b l ef 1 1 n c t i o no fi o w e r i n gh y p e n i p e i i l i aa n db l o o dp r e s s u r e i nm i sp a p e r 山ep m c e s s i n gt e c h i l i c so f “sm a r i n a t e t i o na i l dp u r i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no ft t l eb i o a c t i v ec o m p o n e n t sa n da 1 1 t i o x i d i z e da c t i v e n e s so fh y d m l y s a t ew e r es t i l d i e d t h ep r o c e s s i n gt e c h n i c sa 1 1 dt 1 1 ee f ! f e c t i n gf a c t o r so fv i n e g a r e g g sm a r i n a t e t i o nw e r es m d i e di nt 1 1 i sp a p e lt h eo p t i m u mp a m m e t e ro fp r o c e s s i n gw a sa sf o l l o w i n g ：t i m ew a st w od a y s ，t e m p e r a t l l r ew a s4 2 5 ，v o l u m eo fv i n e g a rw a s1 5 0 m l 1 1 1m j sc o n d i t i o n ，v i n e g a r - e g gj u j c ed i dn o th a v ea g g l o m 锄t e sd o e sa i l dn o th a v et | l ei n s o l u b l ee g gs h e l l v i n e g 扑e g gj u i c ew a sh y d m l y z e db yp e p s i n p a n c r e a t i ns y s t e m ，a i l dt h ec o n d i t i o n sf o ri tw e r et 1 1 et e m p e r a t u r eo f3 7 ，e s = 1 ：1 0 0 ，p h 2 0 ( p e p s i n ) ，p h 7 5 ( p a n c r e a t i n ) a i l d5h o u r sr e s p e c t i v e ly t h eh y d m l y s a t eo fv i n e g a 卜e g g y o l ka n dv i n e g a r - e g g w h i t ew a sp u r i f i e db yu s i n gg e lf i l t f a t i o nc 1 1 r o m a t o f a p h ya n df i v ec o m p o n e n t sw e r eo b t a i n e dr e s p e c t i v e ly ，锄o n gw h i c hc o m p o n e n tc 锄di ih a dt 1 1 eh i 曲e s ta c ei n l l i b i t o r ya c t j v j t yt h e yw e r ef u r l l e rs e p r a 刚，u s i n gr p 一唧l ca n dc o m p o n e n t sea n d2h a dt l l el l i 曲e s ta c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yt h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to fea i l d2w a si d e n t i f i e da s5 9 0 d aa i l d “9 d ab yu s i i l g l c m a s ss p e c 廿o g m p h y t l l e 皿m a r ys m l c t i l r eo fa c ei l l l l i b i t o r ya c t i v i t yp e p t i d ew a si d e n t i f i e da s1 印一a l a a l a g l y 一1 砷a n da r g g l y a l a a l a g l y a l a p h e i i lm i sd i s s e n a t i o n ，m ea i l t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fp e p s i n p a i l c r e a t i nd i g e s to fv i n e g a r - e g gj u i c ew a ss m d i c dj nv j u s j n gt h r e em o d e j so fa n t i o x j d a c i o no ns u p e r o x i d ea i l i o nf r e er a d i c a l s0 2 。，h y d m x y lf k er a d i c a l s+ o h ，a l l dd p p h 。丘e er a d i c a l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp e p s i n p a n c r e a t i nd i g e s to fv i n e g a r e g gj u i c eh a dw e l lf i e er a d i c a ls c a v e n g i n ga c t i v i t ya n dm es c a v e n g i n ga c t i v i t yo fp e p s i i l p a n c r e a t i nd i g e s to fv i n e g a r - e g gj u i c eo n0 2 一，。o ha n dd p p h 。a l li n c r e a s e dw i mt h ec o n c e n 廿a t i o no fv i n e g a r - e g gj u i c e w h e n 山ei i l l l i b i t o r yc o n c e n 仃a t i o no fp e p s i n p a n c r e a t i nd i g e s to fv i n e g a r e g gj u i c ew a s8 m g m l ，t h ei n h i b i t i o n so n0 2 ，0 ha n dd p p h w e r er e s p e c t i v e l y5 0 ，9 5 8 0 a n d9 8 8 0 p 印s i n p a l l c r e a t i nd i g e s to fv i n e g a r e g gj u i c ew a si s o l a t e db ys e c ，a n dc o m p o n e n t sw i mh 培h e rd p p h m d i c a l ss c a v e n g i n ga c t i v i t i e sa l s oh a dt h e1 1 i 曲e ra c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y w h e nt h e c o n c e n 仃a t i o no f 山ec o m p o n e n tcw a s0 2m 咖l ，i t si n h i b i t i o no nd p p h w a s5 0 5 6 a i l di t sa c ei l l l l i b i t o r ya c t i v i t y7 5 6 1 1 1 ei d e n t m c a t i o nb yh i 曲p e r f o 珊a n c ei i q u i dc h m m t o g r a p h y ( h p l c ) s h o w e d 山a tt h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i 曲to fm ec o m p o n e n tcw a s6 0 0t o131 ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ec o m p o n e n tcm j g h tb eak j n do fp e p t i d e k e y w o r d s ：v i n e g a r e g g ；l o w e rb l o o dp r e s s u r e ；a c ei n h i b i t o r ya c t i v i t y ：a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y ；f r e er a d i c a l s独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：王坠塑日期：加年乡月，汨关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：谨：鳖这导师签名：日期：上卯年占月，日第一章绪论1 1 醋蛋简介1 1 1 鸡蛋的营养和化学组成第一章绪论鸡蛋是一种营养丰富又易被人体消化吸收的食品，它与肉品、乳品、蔬菜一样是人们日常生活中的重要营养食品之一。我国是世界上蛋类生产最多的国家，蛋和蛋制品在国民经济中占有一定的地位。鸡蛋是人类已知天然的最完善的食品之一，营养成分见表l l 。鸡蛋提供极为均衡的蛋白质、脂类、糖类、矿物质和维生素，从鸡蛋蛋白质的含量( 1 l 一1 5 ) 、蛋白质的消化率( 9 8 ) 、蛋白质的生物价( 全蛋为9 4 ，蛋黄为9 6 ，蛋白为8 3 ) 和必需氨基酸的含量及其相互构成比例与人体的需要比较接近四方面可看出，鸡蛋含有较高的蛋白质，且是全价蛋白质，再有鸡蛋内含有丰富的磷脂类和固醇等特别重要的营养素。除此之外，蛋黄中铁、磷含量较多，且易被人体吸收，可作为婴幼儿及贫血患者补充铁的良好食品。表1 1 鸡蛋的营养成分( 1 】成分全蛋干物质含量幢蛋白质含量旭总脂肪悖卵磷脂倡脑磷脂儋总灰分，m g磷，m g钙垭铁m g维生素a i u维生素b l 唱维生素b 加g维生素删能量，k j1 1 2 醋的营养价值醋是以米、麦、高粱或酒、酒糟等酿成的含有醋酸的液体【2 l 。食醋本身含有许多对人体有益的营养成分。如合成蛋白质的基本物质1 8 种氨基酸( 包括8 种必需氨基酸) ：醋中含有的糖类物质如葡萄糖、果糖、麦芽糖等是人体活动的重要能源之一；醋中含有的维生素b ，、维生素b 2 、维生素c 等，在人体生命活动中有着重要作用；醋中还含有丰富的无机盐如钾、钠、钙、铁、锌、铜、磷等，都是人体生长发育、生殖和抗衰老的生理过程或1 垃m苈船u蛆m舛mm7s 16610412l20023江南大学硕士学位论文代谢中必不可少的成分。中医认为醋性味甘平，有活血化淤、消食开胃、止血、解毒、养肝、降血脂等功效。现代科学研究证明，醋对人体具有消除疲劳、调节体液酸碱度，促进消化，防止肥胖，防治高血压及动脉硬化、延缓衰老，防腐杀菌、抗癌、解酒、防便秘、美容护肤等功能。近年来，欧美日等发达国家以及我国沿海发达地区己刮起一股“喝醋风”，把醋作为日常保健饮品。1 1 3 醋蛋液的营养价值醋蛋液不仅综合了两者的营养成分和食疗作用，而且相互作用后使营养成分更易于吸收，并产生一些新的生物活性成分：醋化了的蛋黄，分解释放出具有健脑、防衰、降低胆固醇等作用的卵磷脂、胆碱和生物素等物质；醋浸蛋清，可释放出大量溶菌酶和抗癌因子阿维丁等物质；被醋软化溶解的蛋壳变为醋酸钙，这种离子钙极易被小肠吸收，它不仅对人体骨骼生长发育起作用，而且可治疗老年人骨质疏松、防治高血压等疾病【4 3 舯j 。经动物实验证实【5 0 ，”】，醋蛋液具有健胃消食、补血、提高动物细胞免疫力、抗疲劳、延缓细胞衰老、防止脑力减退和心肌老化等作用。北京医科大学、武汉同济医科大学等单位的临床实验研究表明：长期服用醋蛋液是安全的，对人体无任何毒副作用和不良反应，而且醋蛋液可降血压、降血脂，软化血管、预防动脉粥样硬化，调节心脏机能、补充膳食钙摄入不足、刺激肠胃蠕动加快等。综合科学研究和人群调查结果表明，醋蛋液作为一种纯天然强身保健制品，它对人体的功能主要表现在以下几个方面：补充机体营养，改善代谢，调节机体平衡，增进食欲，消除疲劳，强身健体；溶解胆固醇，防治动脉硬化、高血压、脑血栓、高血脂等心脑血管疾病；改善肠胃功能，促进消化，对便秘、消化不良、腹泻等胃肠道疾病有明显作用：强身免疫，增强机体抗病能力，并能有效防治糖尿病、风湿性关节炎、气管炎、中老年综合症及中老年骨质疏松等；延缓衰老、防止肥胖、养颜美容等作用【3 】。醋蛋液营养丰富、合理，适于任何年龄的人服用，尤其是中老年人、妇女、儿童等，是一种防病健身的特效保健饮品。由于醋蛋液制作简单、成本较低、安全有效，目前拥有广泛的群众基础和市场前景。统计数据表明，我国即将步入老龄化社会，目前全国6 0 岁以上的老人已突破1 2 亿人，其中许多人正经受着腰腿疼痛、失眠、记忆力下降、头晕眼花、便秘等中老年综合症的折磨：随着人民生活水平的不断提高，高血压、冠心病、脑血栓、糖尿病、肥胖症等“富贵病”患者越来越多。据报道，目前高血压患者己近亿人。而醋蛋液作为一种“保健食疗”的传统疗法，对防治上述疾病均有很好的作用。据中国营养学会发布的中国居民膳食指南( 1 9 9 7 年4 月) 指出，我国居民v a 、v b 2和c a 的摄入量普遍不足。若把富含醋酸钙、v a 、v d 、v b 2 、卵磷脂等营养成分的醋蛋液作为日常保健饮品坚持长期服用，即可补充膳食不足，满足人体正常需要，从而保持身体健康。第一章绪论1 2 降血压的概述1 2 1 高血压概述虽然对高血压的发病机理的研究已愈百年，但是由于其病因十分复杂，对高血压的发病机制至今仍未有确切的认识。目前认为遗传因素、膳食调配不当、神经调节紊乱、内分泌失调、外界环境影响及某些脏器的病变等都与高血压的发生、发展密切相关；高血压的发病机理学说众多，其中较有代表性的有：精神神经源学说、内分泌学说、肾源学说、遗传学说、过多摄钠学说、胰岛素学说等，已知许多系统与血压的维持有密切的关系，其中重要的有中枢神经系统、肾上腺系统、肾素一血管紧张素一醛固酮系统、血管舒缓激肽一激肽一前列腺系统等，这些系统受内外环境的影响而变化，从而参与机体血压的调控，多种致病因素都有可能影响以上各系统而使血压升高。8 0 年代以前的降血压药物有镇静药、生物碱利血平、可定乐等，他们的降压时间短且不稳定或是有不良反应目前己很少使用，随着受体学说的不断发展，受体药物很受重视，钙拮抗剂、a c e i ( 血管紧张素转换酶抑制剂) 的研制成功，使抗高血压的药物获得更为重要的发展。近年来抗高血压药物的发展，着重注意同时对心肌肥厚与动脉粥样硬化的预防与逆转作用，钙拮抗剂与a c e i 在这方面可能有良好的前景，特别是a c e i 剂是当今降血压药物发展最快的一种。a c e i 对各期高血压患者都有效，不影响交感神经对血管平滑肌的调节作用，也不引起心率加快，合成a c e i 主要不良反应为易引起皮疹、蛋白尿、白细胞减少等“。正是由于药物治疗过程中出现上述种种不适症，高血压的非药物治疗越来越引起有识之士的重视，w h 0 推荐的阶梯治疗方案已将非药物治疗作为治疗高血压的基础。高血压的非药物治疗主要有二种方式1 4 ，一是直接针对高血压的危险因子的措施，如限制食盐、控制和减轻体重、戒酒和经常性运动：二是控制其他心血管病的危险因子的措施，如戒烟、限制膳食中总胆固醇和脂肪酸的摄入量以控制血清胆固醇。新近的研究表明，多种功能保健因子对高血压有预防或降压功能，由于这些功能因子存在于我们日常食用的食品中或可通过温和的方式获得，将成为非药物治疗高血压中新的最引人注目的途径。1 2 2a c e 与降血压肽a c e 是一种含锌二肽羧基肽酶，相对分子质量为12 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 ，在人体组织及血浆中广泛存在，主要存在于血管内皮细胞内，在肺毛细血管细胞含量最为丰富。其作用主要有二：其一是将血管紧张素i ( a n g i ) 转换为血管紧张素( a n g 田；其二是同时降解激肽，使之失活i ” 3 1 3 。体内的肾素一血管紧张素系统( r e n i n n 瘿o t e n s i ns y s t e m ，r a s ) 和激肽释放酶一激肽系统( k a l l i k r e i nk i n i ns y s t e m ，k k s ) 对血压的调节起着重要作用。r a s 系统是体内重要的血压调控系统，直接参与血管收缩、代谢及交感神经的调节，是高血压主要的原因之一。r a s 由血管紧张素原( a g d 、肾素、a c e 及血管紧张素酶原( a t r )组成。肾素能将血管紧张素原( a n g ) 水解释放出十肽的a n g i 。a c e 是r a s 系统的关键酶，a n g i江南大学硕士学位论文是a c e 的底物，a c e 能切下a n g 】羧基末端的二肽( i i s l e u ) ，使之变成a n g o 在正常条件下，a c e 是a n g 生成的限速因素，a c e 的活性决定于a n g 产率。a n g 是r a s 系统中最主要的生物活性成分，是强有力的血管平滑肌收缩物质，按单位计算，升压作用比去甲肾上腺素强1 0 _ 4 0 倍。它作用于血管壁上的受体使周围小动脉和前毛细血管平滑肌直接收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对n a + 、k + 的重吸收，引起血量和钠储留量增加，使血压升高。而其前体a n g 和a n gi 则无活性。k k s 系统中的激肤如缓激肤的主要作用是作用于血管内皮的缓激肽受体促进一氧化氮和前列腺素等血管扩张因子的释放，促进血压下降口在k k s 系统中，a c e 能使激肽失活，使k k s 系统处于抑制状态，导致血管收缩血压升高。r a s 和k k s 系统在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，其平衡协调对维持正常血压十分重要。r a s 产生具有升压作用的a n g ，k k s 产生具有降压作用的舒缓激肽。r a s 与k k s 的平衡失调被认为是高血压发病的重要原因之一。由于a c e 在r a s 和k k s 系统中对血压调节起重要作用，抑制a c e 活性对降低血压有积极的影响，因而寻找更有效的a c e 抑制剂一直是高血压药物研究中的热点课题。降血压肽是一类a c e i ，通过抑制a c e 活性而起到降血压的作用。1 9 6 5 年，f e n - e i m 从巴西毒蛇的毒汁中分离出一种多肽类的物质，能够增强缓肽的作用，故将其称为缓激肽增强因子。后来又发现这种肽类物质有抑制a c e 的作用，使a n g 转变为a n g 的过程发生障碍。1 9 7 1 年，0 n d e t t i 等人合成了b p f s 成分之一的壬肽抗压素，这是第一个用于临床的a c e i 。a c e 是一种金属肤酶，含有两个结合z n ”的位点，即所谓“必须结合位点”，包括降血压肽在内的各种a c e i 的共同作用是与a c e 活性部位的z n ”结合，使之失活a c e i 与此基团结合的强度及与附加结合点结合的数目决定了a n g i 作用的强度和持续时间。降血压肽是对a c e 活性区域亲和力较强的竞争性抑制剂，它们与a c e 的亲和力比a n g i 舒缓激肽更强，而且也较不容易从a c e 结合区释放，从而阻碍a c e 催化水解a n g i 成为a n g 以及催化水解舒缓激肽成为失活片段的两种生化反应过程，起降血压的作用。1 9 6 5 年f e n 廿i r a 首次从南美洲腹蛇的毒液中发现了a c e i ，它能够抑制舒缓激肤酶从而增强血管舒激肽的活性，这引起了世界各国研究者们极大的兴趣，而后日本学者从亚洲腹蛇的毒液分离出具有类似活性的a c e i ，我国学者从浙江腹蛇、江西腹蛇的毒液中也分离出类似活性的a c e i 。降血压肽的活性与其氨基酸结构和组成密切相关。c h e u n g 等人经研究认为a c e i 的活性主要取决于c 端氨基酸，c 端氨基酸为芳香族氨基酸( 包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸) 和脯氨酸时其抑制活性较高。另外，c 端为疏水性的撷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或碱性氨基酸的肽与a c e 的亲和力较强，抑制活性较高，但是脯氨酸则例外。最早从蛇毒液中分离提取的a c e 晗有许多脯氨酸残基，c 端为脯氨酸的抑制活性最高。但不少抑制活性较强的降血压肽的结构不符合c h e u n g 等降血压肽结构模式，如来源于沙丁鱼的c 1 1 肽( t y r c y s s e 卜p h e 一e l y s g l y t ”一p r o v a l m e t ) ，来源于金枪鱼的c 8 肽( p r o t y r h i s 一e l y s t r p g l y a s p ) ，m a t s u i e 等用碱性蛋白酶酶解沙t 鱼获得的a c e i 主要由酸性氨基酸组成，疏水性氨基酸含量很低。a c e i 的氨基酸组成和结构与其抑制活性的具体关系尚未研究透彻，有关机理尚不清楚，可能是不同氨基酸结构的a c e i 与a c e 的活性中心有着不同亲和力的缘故。4第一章绪论1 9 7 1 年，c u s h m a | l 和c h e u n g 建立t 紫外分光光度法，a c e 在3 7 、p h 8 3 条件下催化j解血管紧张素i 的模拟物衄l ，产生马尿酸，该物质在紫外2 2 8 n m 处具有特征吸收峰。当力入a c e 抑制剂时，a c e 对h h l 的催化分解作用受到抑制，马尿酸的生成量减少。过测定力入抑制剂前后所生成马尿酸紫外吸收的差别即可算出抑制活性的大小。但该方法对实验捎作要求甚高，实验易产生误差。动物实验是评价降血压肽效应的有效方式。降血压肽生彩学效应评价的实验动物一般是原发性高血压大白鼠( s h r ) 。降血压肽的动物试验般采辟口服或静脉注射的方式，以不同剂量喂食或注射，同时做a c e 工药物对照组，比较不同齐量对s h r 血压的影响，并与a c e i 药物的降压效果进行比较。值得注意是，许多肽段在体夕|实验中对a c e 具有抑制活性，但在体内实验中却无降压效果。许多学者认为，是由于a c e摄入体内后存在一个消化降解过程，有可能将其降解为无活性的片段。也有报道认为，这些抑制肽只是a c e 的底物，不是真的抑制剂，所以它们在体外实验测得的活性较高，而在体内无效。另外也有些a c e i 体外实验活性不高，动物实验结果却表明其有明显的降血压效果。这可是a c e i 被摄入体内后被胃肠道的消化酶降解，生成了有降血压活性的片段。1 3 抗氧化性介绍1 3 1 抗氧化活性与抗衰老自由基是指含有一个或一个以上未配对电子的基团或原子，一般都具有很高的反应活性，但是活泼程度与其特定的结构有重要关系。自由基在生物体内可以进行链反应，它的产生有多种原因，如药物和其他化学物质的代谢作用、离子辐射、光照射、过渡金属的单电子氧化、发炎部位白细胞或其它细胞免疫物质的分泌等。人体的正常代谢过程中不断产生自由基，这对于许多生化反应是必要的。体内与自我免疫有关的吞噬细胞在消灭细菌、真菌、病毒和其它抗原物质时会产生自由基；健康机体对各种外界影响作出反应的同时会产生自由基；年龄老化过程中机体也在不断产生自由基。氧无处不在而且氧易于接受电予，氧自由基在细胞代谢过程中普遍存在。人体是一种依赖氧的有机体，所以人体总是处于自由基伤害的危险之中1 4 j 。在生物体内氧可以通过单电子产生化学性质活泼的氧自由基，它们包括超氧阴离子自由基( 0 2 一) 、脂自由基( r o o ) 和羟基自由基( o h ) 等。氧自由基可以与d n a 、蛋白质和多不饱和脂肪酸( p o l ”n s a t l l r a t e df a t 【ya c i d ，p u f a ) 作用，造成d n a 链断裂和氧化性损伤、蛋白质一蛋白质交联、蛋白质一d n a 交联和脂质过氧化。脂质过氧化是造成生物体氧化损伤的主要原因。p u f a 是生物膜的基本组成，极易被活性氧引发的脂质过氧化所损伤，造成生物膜结构和功能的破坏，从而引发各种心血管疾病、癌症与老化现象。生物体内的氧化最终导致生物体的衰老。因此机体的氧化作用引起了世人的关注。通常氧自由基代谢在机体内的生成和去除出于平衡状态，不会对身体造成严重损伤，但是当机体的自由基去除能力减弱或自由基去除剂供给不足，以及摄入生成自由基的物质过多时，体内的自由基过剩。正常情况下，人和动物体内具有抵抗这些氧化作用的防御系统而使机体得到保护，但是随着年龄的增长和疾病的发生，导致体内的氧化还原动态平衡一s 江南大学硕：t 学位论文体系出现障碍，自由基清除剂含量和活性的降低会引发组织器官的衰老。生物体内的抗氧化剂通过捕获或淬灭过氧自由基，抑制微粒体脂质过氧化和p u f a 的氧化变性，从而维持生物膜的结构和功能的完整性，预防和治疗一些疾病，其反应为：r o o 斗a r 0 h - r o o h + a r 0 r o o + a m 一分子产物1 3 2 抗氧化活性物质概述我国农科院茶叶研究所于1 9 8 4 年开始研究茶叶天然氧化剂，分离出了茶叶抗氧化成分；在猪油、大豆油、菜油i 花生油等食用油脂中添加质量分数0 0 2 0 0 8 的茶叶天然抗氧化剂，证明具有优异的抗氧化活性，过氧化值和酸价的抑制率在9 0 以上，抗氧化的效价比v e 高5 倍，与v c 和v e 并用具有协同增效作用【3 ”。美拉德反应物具有抗氧化性。氨基酸和单糖的美拉德反应挥发性产物具有和复杂美拉德反应产物一样的抗氧化能力f 3 ”。人们研究了豆豉美拉德反应得到的类黑精的抗氧化活性，发现在不同的添加量水平，类黑精均有抗氧化作用，其中质量分数o 5 和质量分数1 0 添加量抗氧化效果较明显，质量分数1 的添加量与0 0 2 的b r 作用相当。翁新楚等人对多胺型化合物精胺的抗氧化性质进行了研究，发现有较强的抗氧化作用，并且随浓度的升高而急剧升高。另外，还有一些生物碱、愈疮酸和某些微生物代谢产物都具有一定的抗氧化作用。香辛料植物的提取物，主要有迷迭香、鼠尾草、百里香、牛至草、丁香、薄荷、胡椒、生姜、芝麻、大蒜等。1 9 5 1 年c h i p u l t 等报道迷迭香和鼠尾草具有优异的抗氧化能力，1 9 8 2年至1 9 8 4 年i i l a t a i l i 和n a k a t a n i 等从迷迭香干叶的正已烷提取物中分离得到三种酚系二萜化合物川：迷迭香酚、表迷迭香酚和异迷迭香酚，他们对猪油和亚油酸都有很强的抗氧化能力，尤其对猪油抗氧化能力是b h a 和b h t 的4 倍。y a y o ，n a k a t a n i 等人从百里香的丙酮提取物中分离得到六种黄酮类物质及五种联苯化合物，发现三种黄酮类化合物和两种联苯化合物的抗氧化能力与b h t 相当【3 8 ，3 。余佰良等对山苍子精油及提油后余渣的抗氧化作用的研究表明，山苍子精油具有很强的抗氧化活性，相当于b h a 的2 倍以上，而提油后的山苍子余渣的几种溶剂的萃取物均有一定的抗氧化作用，尤以氯仿提取物的抗氧化效果最好，强度约为b h a 的7 5 。众多果蔬类植物中亦有表现出优异的抗氧化性能的物质。凡是能干扰自由基链反应中链引发和链增长过程、清除活性氧的化合物统称为自由基捕获剂或抗氧化剂，这些生物抗氧化剂多来源于食物，如深色水果、蔬菜、牛奶、蛋黄和海鱼等。目前有很多研究表明，一些食物中的蛋白质具有抗氧化活性，而且大多数蛋白质的水解物具有抵抗脂肪酸过氧化的活性。随着蛋白质生物化学、生理学与营养学的发展，人们发现蛋白质经消化道酶的作用后，并非仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以低肽( 如二肽、三肽等) 形式直接吸收，而且二肽和三肽的吸收速度比同一组成的氨基酸快。自然界中许多动物、植物蛋白在适宜的作用条件下水解都能产生抗氧化肽，这使得通过水解技术制备大量的天然抗氧化肽有了来源上的保障。随着生物工程技术( 包括上游技术6第一章绪论和下游技术) 的发展，许多种来源不同、特性各异的商品蛋白酶出现、酶成本的降低，使利用特定蛋白质资源进行限制性酶解生产各种生物活性肽成为可能。而且，各种新型分离技术( 膜分离技术、离子交换树脂吸附分离技术、亲和层析技术、等电点分离技术等) 的相继产业化应用，进一步使各种生物活性肽系列组分的分离纯化和富集成为现实。近年来，国外学者己从多种食物蛋白酶解液中分离出具有抗氧化性的肽片段，研究原料主要有大宗优质蛋白资源如大豆蛋白、乳酪蛋白、肉类蛋白；洋蛋白资源如a m a r o w i c z等( 1 9 9 7 年) 通过s e p h a d e xg l o 凝胶过滤柱色谱从c a p e l i n 水解产物中分离出四个肽片断，采用p 一胡萝h 素一亚油酸盐模型分析每个片段的抗氧化性，发现有一个肽片断有显著的抗氧化性，另有两个呈弱抗氧化性，还有一个表现出促氧化性：k i m 等( 2 0 0 1 年) 将从阿拉斯加青鳕皮中提取的胶原蛋白采用a j c a 2 l a s e 、p r o n a s ee 和胶原蛋白酶在三步循环的酶膜反应器中顺序水解，发现第二步采用p m n a s ee 水解完毕由分子量在1 1 5 4 1 5 k d a 肽组成的产物抗氧化能力最强。表l 近几年国内酶解蛋白获取抗氧化肽研究1 5 立题背景和意义高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高的为特征的临床综合症，它常伴有心脏、血管、脑和肾脏等器官和结构的全身性疾病，是引发心、脑、肾和血管等各种并发症和导致中风、促进动脉硬化、冠心病的一个重要危险因子。高血压是一种慢性病，潜伏期长，高血压的早期阶段，一般没有什么不适症，直至发生临床迹象，心脏病发作、脑血管破裂等导致死亡。因此高血压被称为“无声杀手”。高血压是一种高发病率、高并发症、高致残率的严重影响人体健康的疾病，也是造成死亡的恶魔，直接威胁着人体的生命，使国家和家庭承受很大的经济负担，虽然如此，仍然有五分之四的患者不知道自己患有高血压或没有认真进行治疗，由于药物治疗法存在的副作用，天然食物中的降血压的功能因子的摄入今后将成为高血压非药物治疗的重要组成部分。虽然食品a c e i 比人工合成的a c e i 抑制活性弱，但它们的重要性在于这些活性相对较弱的的降血压物质潜在于我们日常摄入的食物中。功能性食品指对人体具有增强机体防御能力、调节生理节律、预防疾病和促进康复等有关生理调节功能的加工食品。生物活性肽出于其特殊的生理功能，利于消化吸收和安全一7 一江南犬学硕士学位论文性高而易于被人体接受。生物活性肽类食品是国际保健品行业研究和开发的热点之一，日本、美国和欧洲己率先推出具有各种功能的肽类食品及食品添加剂，形成了一种具有极大商业化前景的行业。新型功能食品的开发有助于减少和控制与饮食有关的慢性疾病。当前医学研究重点中，列前三位的肿瘤、心血管疾病和衰老均与自由基引起的细胞膜脂质氧化性损伤有关。美国每年大约有6 0 万人死于心血管疾病，其中半以上是冠心病。1 9 9 9 年台湾卫生署公布的台湾十大死亡原因中，脑和心血管疾病分居十大死亡原因的第二和第三名。近年来根据流行病学的调查和研究发现，人类的饮食生活形态与癌症发病率有密切关系。生物体内和食品中脂质的氧化产物可能是衰老和疾病的诱因。在食品的制造和贮藏过程中常常发生的油脂氧化现象，不仅导致产品品质劣变，而且可能与肿瘤、心血管疾病和衰老的发生有很大的关系。随着生活质量的提高，因活性氧和自由基作用导致器官病变而引发疾病的现象越来越引起了广泛的重视。食物中若含有天然抗氧化物质，不但可以减低食物因脂质过氧化而造成的营养价值、风味和口感的损失，亦可以防止人们由于脂质过氧化作用而引发的疾病或衰老。人们期望不断开发天然的具有潜在抗氧化作用的肽类食品。有关营养流行病学的一个发展就是使用预防性的食品对人体的健康起到保护作用。醋蛋液作为一种天然存在并且具有潜在抗氧化活性的物质，对一些疾病起到防治效果，无病人群食用可以有预防保健作用，有病人群食用起到非药物治疗的作用。醋蛋液尚未有规模化的工业化生产，因此醋蛋水解液的a c e 抑制活性和抗氧化活性的研究和利用既具有很大的经济效益，也具有一定的社会效益。本论文将对醋蛋水解液a c e 抑制活性物质进行分离纯化，以期找到具有降血压活性的功能因子，并对其抗氧化活性进行初步研究研究，为将醋蛋液开发成为保健功能食品奠定理论基础。1 6 本课题研究内容1 醋蛋泡制工艺的确定及醋蛋液的酶解。2 水解液a c e 抑制活性物质的分离纯化。3 水解液抗氧化活性研究以及抗氧化活性物质的初步分离纯化。第二章醋蛋液泡制工艺的确定及醋蛋液的酶解第二章醋蛋泡制工艺的确定及醋蛋液的酶解2 1 引言随着社会的不断发展，“多醋少盐”、“重醋轻盐”成为餐桌上的新时尚。而以高度米醋为醋基，加入鸡蛋浸泡后，辅以各种营养物质而成的醋蛋液，以其取材方便、制作简单、服用安全等特点，深受广大消费者的欢迎。醋蛋是以醋和鸡蛋为主要配方成分，具有预防、治疗、康复功效的保健佳品。醋蛋液营养丰富、合理，适于任何年龄的人服用，尤其是中老年人、妇女、儿童等，是一种防病健身的特效保健饮品。由于醋蛋液取材方便、服用安全、疗效显著，目前拥有广泛的群众基础和市场前景。醋、鸡蛋都是天然食品，它们对人体健康有益无害；醋蛋液不仅服用安全，而且对增强病人机体自身的免疫力和抗病力都有一定的作用。因而，长期服用醋蛋液，具有预防、治疗和康复的三重功效。我国即将步入老龄化社会，其中许多人正经受着腰腿疼痛、失眠、记忆力下降、头晕眼花、便秘等中老年综合症的折磨：随着人民生活水平的不断提高，高血压、冠心病、脑血栓、糖尿病、肥胖症等“富贵病”患者也越来越多。而醋蛋液作为一种“保健食疗”的传统疗法，对防治上述疾病均有很好的疗效。醋蛋疗法是近年兴起的一种以醋和鸡蛋为主要成份的广泛用于治疗和预防多种疾病的非药物疗法。传统的醋蛋泡制方法多种多样，不尽相同，本章在传统醋蛋液的制作基础上研究了不同的泡制工艺之间产品的优劣，即确定了泡制醋蛋的工艺及其参数，因醋蛋液经临床实践和动物实验证明具有降血压、降血脂和抗氧化等保健功能，因此本文体外模拟人体消化过程对其进行酶解为进一步研究酶解液中具有生物活性的功能因子奠定基础。2 2 实验材料与仪器2 2 1 实验材料鸡蛋9 。特酿浸蛋米醋胃蛋白酶胰酶乙酸乙酯硼酸乳酸乳酸钠磷酸二氢钾磷酸氢二钾分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯分析纯马尿酞组氨酞亮氨酸( h i p h i s l e u ，h h l )其余试剂均为分析纯市售上海宝鼎酿造有限公司s i 舯a 公司s i g m a 公司上海化学试剂公司南京化学试剂厂上海化学试剂公司上海化学试剂公司国药集团化学试剂有限公司上海恒信化学试剂有限公司日本多肽公司江南大学硕士学位论文2 2 2 实验仪器高速分散器电热恒温水浴锅台式离心机s c r 2 0 b c 高速冷冻离心机t g l 一1 6 c 离心机d s h z 一3 0 0 多用途水浴恒温振荡器d z f 一6 0 2 l 真空干燥器组织捣碎机p h 计d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w2 3 实验方法2 3 1 醋蛋浸泡工艺梅特勒一托利多仪器有限公司北京长安科学仪器厂上海安亭科学仪器厂日本h r r a h i 公司上海安亭科学仪器厂上海太仓市实验设备厂上海精宏实验设备有限公司上海模具厂梅特勒一托利多仪器有限公司p h 锄a c i a 公司选用新鲜红壳鸡蛋一只，将生鸡蛋洗净，鸡蛋表面用酒精消毒晾干放入2 5 0 m l 的烧杯中，加入9 度特酿浸蛋米醋1 5 0 札，用保鲜膜密封室温浸泡4 8 h 。蛋壳全部溶解后用消毒纱布进行过滤，将蛋膜清洗后挑破搅匀，弃去蛋膜再密封浸泡2 4 h 。制成后密封，放入冰箱内冷藏。工艺流程：米醋+ 鲜蛋? 处理? 浸泡? 破衣搅拌? 浸泡? 粗滤2 3 2 醋蛋浸泡工艺参数的研究2 3 2 1 浸泡天数的选择设定醋蛋泡制天数分别为1 d 、2 d 、3 d 、4 d 、5 d 、6 d ，其他条件参照2 3 1 ，泡制好后将醋蛋液酶解，测水解液的a c e 抑制活性。2 3 2 2 浸泡温度的选择设定醋蛋泡制温度分别为4 、l o 、2 5 、3 0 、3 5 ，其他条件参照2 3 1 ，泡制好后将醋蛋液酶解，测水解液的a c e 抑制活性。2 3 2 3 浸泡用醋量的选择设定醋蛋泡制用醋量分别为1 2 0 m l 、1 5 0 m l 、1 8 0 m l 、2 0 0 m l ，其他条件参照2 3 1泡制好后将醋蛋液酶解，测水解液的a c e 抑制活性。2 3 3 醋蛋液的酶解本实验是体外模拟人体消化过程进行的，经胃蛋白酶作用后的醋蛋液进一步被胰酶作1 0第二章醋蛋液泡制工艺的确定及醋蛋液的酶解用。由于胰酶是一复合酶，其中至少含有四种以上的蛋白酶( 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶) ，因此比纯的胰蛋白酶更能反映出体内的消化情况。胃蛋白酶和胰酶的最适反应p h 分别为2 o 和7 5 。用1 0m o l lh c l 调节醋蛋液( 1 0 m 鲈t l l ) 的p h 至2 0 ，加入胃蛋白酶( 按酶与底物的物质的量比为l ：1 0 0 的比例加入) ，于3 7 下水解5 h ，在1 0 0 水浴中保持1 0 l i n 后终止反应。用1 0m o l ln a o h 调节p h 至7 5 ，然后再接入胰酶( 按酶与底物的物质量比为1 ：1 0 0的比例加入) ，于3 7