（食品科学专业论文）纤维素酶高产菌株的选育及酶的分离纯化研究.pdf

摘要 纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物，同时它也是地球上数量最大的再生资 源。目前，自然界中纤维素只有- d , 部分得到了利用，绝大多数纤维素不仅被白白浪费，而 且还会造成环境污染。利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人类急需的能源、食物和化工 原料，对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。 纤维素酶( c e l l u l a s e ) 能将天然纤维素降解生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖。目前， 纤维素酶在水解纤维素在食品、饲料、酿造、化工、纺织、医药和环境保护等领域均有广泛 廊用。纤维素酶来源多样化原生动物、节肢动物、软体动物和昆虫等均能产生，动物的瘤 胃中有共生的纤维分解菌和原生动物。在高等植物中也有纤维素酶，目前用于生产纤维素酶 大多采用微生物来源。 本课题采用绿色木霉1 3 0 1 0 和1 3 0 0 2 作为出发菌株，利用诱变因子的协同作用，对其进 行了诱变育种，得到酶活力较高的突变菌株绿色术霉s p l 3 0 1 0 ( t r i c h o d e r m av i r i d e ) ，用于发 酵并从发酵液中分离纯化纤维素酶，目的旨在得到高的回收率，通过硫酸铵分段盐析、离子 交换层析、分子筛凝胶过滤层析等较简单的方法纯化得到有高活力的纤维索酶纯品。主要实 验结果如f ： 1 紫外线、弧硝酸钠和硫酸二乙酯三种不同的诱变因子对绿色术霉1 3 0 l o 菌体细胞的致 死作用表现出相似的趋势，在一定范围内都与诱变剂量呈线性正相关。利用紫外线、亚硝酸 钠及硫酸二乙酯复合诱变的协同效应，研究其诱变时间、诱变剂量和正突变率的关系。在协 同诱变条件下，多轮反复诱变绿色木霉1 3 0 l o 后，菌株的酶活力有大幅提高，筛选得到了产 纤维素酶活力单位提高了1 7 3 1 5 的菌株一s p l 3 0 l o 。诱变因子的复合、协同诱变，可以减弱 单一诱变剂反复诱变产生的诱变抗性和饱和性，是一种有效的选育优良菌株的方法。 2 确定了硫酸铵梯度盐析的浓度范围。在硫酸铵浓度为3 0 时，酶的活性极低，且杂蛋 白含量较高。收集硫酸铵为3 0 5 0 饱和度范围内的盐析酶蛋白，收集产物具有较高酶活性。 继续收集5 0 到6 5 范围内的盐析酶蛋白，酶的比活仍然较高。收集6 5 8 0 范围内的盐 析酶蛋白，酶的比活较低。综合考虑酶的收率及酶的比活，采用3 0 6 5 饱和度范围内的硫 酸铵盐析。 3 探索并确定了d e a e s e p h a d e xa 2 5 离子交换层析的参数。结果表明，不同的平衡缓冲 液p h 值介质对酶蛋白的吸附有很大的影响，其中p h 值为8 5 时，吸附效果最好。初始洗脱的 盐浓度对洗脱效果也有很大影响。采用试管实验简单快捷的确定了初始洗脱的盐浓度节省 了人量时间，实验表明，在初始盐浓度为0 1m o l l 时即可。 4 采用d e a e s e p h a d e x a 2 5 离子交换层析纯化纤维素酶。采用的平衡缓冲液p h 值为8 5 ， n a c i 梯度线性化洗脱浓度为：0 1 0 0 5 0 m o l l 。洗脱后n a c i 浓度在0 1 3 5 m o l l 至0 4 5 m o l l 时洗脱出多个蚩白峰。在n a c l 浓度高于o 4 5 m o l l 时，基本没有蛋白洗出。洗脱流速为3 0 m l b ， i 西南农业大学硕士论文 摘妥 每管收集50 m l ，1 0 m i n 收集一管，发现收集的1 5 0 管中第9 9 管活性最高，在第一蛋白峰处没 有目的酶活性，为杂蛋白。在n a c l 浓度为0 3 0 5 0 4 1 6 m o l l 时，即可将纤维素酶洗脱下来。 5 采用s e p h a d e xo 7 5 分子筛凝胶过滤纯化纤维素酶。流速为1 8 m l h ，每收集管5 0 m l ， 1 0 m i n 收集一次。层析出现一个小的蛋白洗脱峰和一个大的蛋白峰。经活性检测，大的蛋白洗 脱峰没有酶活性，小峰出现酶活性。 6 对各步纯化后的酶蛋白s d s p a g e 凝胶电泳，分离胶浓度1 2 ，浓缩胶浓度4 。银染 鉴定纯度。结果表明，原发酵液含有大量的不同分子量的蛋白，经过盐析透析后酶液杂蛋白 明显减少，但仍然含有多种蛋白。经过离子交换层析后，在胶的下端有三条较弱的杂蛋白带， 其它杂蛋白已完全去除。再经过凝胶过滤层析，纤维素酶进一步得到纯化，s d s p a g e 凝胶电 泳后，银染显示单条带表明酶蛋白得到纯化。并确定了酶蛋白的分子量为4 6 ，0 0 0 d a 。 关键词：纤维素酶；绿色木霉：诱变育种：分离纯化 a b s t r a c t c e l l u l o s ei st h em o s ta b u n d a n to r g a n i cr a wm a t e r i a li nt h ew o r l d ，a n di ti st h eo n l yr e n e w a b l e r e s o u r c et h a ti sa v a i l a b l ei n l a r g eq u a n t i t i e s p r e s e n t l y , o n l yaf e wc e l l u l o s ea r eu t i l i z e d ，m o s to f c e l l u l o s ea r ew a s t e da n d p o l l u t ee n v i r o n m e n t s oi th a sg r e a tr e a l i s t i cm e a n i n gf o rh u m a nb e i n gt o s o l v ee n v i r o n m e n tp o l l u t i o n ，f o o d s h o r t a g ea n de n e r g yc r i s i s t h a t u s i n gc e l l u l a s ep r o d u c e db y m i c r o o r g a n i s m t r a n s f o r mc e l l u l o s et oe n e r g y ，c h e m i c a la n df o o d c e l l u l a s ec a nd e c o m p o s et h en a t u r a lc e l l u l o s ei n t oc e l l u l o s em o l e c u l a rc h i n a , c e l l o b i o s ea n d g l u c o s e a tp r e s e n t ，t h ec e l l u l a s eh a sa p p l i c a t i o n si na b r o a df i e l ds u c ha sf o o di n d u s t r y ，f e e d s t u f f , b r e w a g e ，c h e m i s t r yi n d u s t r y , w e a v e ，c u r a t i v ea n de n t i r o n m e n tp r o t e c t i ti sd i v e r s i f i c a t i o nt h a tt h e o r i g i no fc e l l u l a s e i tc a np r o d u c e db yp r o t o z o a n ，a r t h r o p o d ，m o l l u s ka n dh e x a p o d c e l l u l a s ea l s o e x i s ti na l t i t u d ep l a n t p r e s e n t l y , t h eo r i g i no f m i c r o o r g a n i s mm o s t l yb ea d o p t e dt op r o d u c ec e l l u l a s e i nt h i sr e s e a r c h ，as t r a i n c a p a b l eo fp r o d u c i n gc e l l u l a s e - - t r i c h o d e r m av i r i d e 1 3 0 1 0w a s a d o p t e di n t h i sr e s e a r c h rt r i c h o d e r m av i r i d e1 3 0 1 0w a sm u t a t e db yc o o p e r a t i o nw i t hc o m p l e x m u t a t i o ni nt h ee x p e r i m e n tf o ri n c r e a s i n gc e l l u l a s ep r o d u c t i o n w eg o tah i g he n z y m eu n i ts t r a i n n a m e dt r i c h o d e r m av i r i d es p l 3 0 1 0 t h ec e l l u l a s ew a s s e p a r a t e da n dp u r i f i e df r o mt h ec u l t u r ef l u i d ， t h es t r a i ni s o l a t e du s e da sf e r m e n t a t i o ns e e d t h ep u r p o s eo ft h i sr e s e a r c hi st om a k et h ec e l l u l a s e h o m o g e n e o u sb yu s i n gt h er e l a t i v e l ys i m p l ep u r i f i c a t i o np r o c e d u r e sa n da c h i e v eh i g hc e l l u l a s e a c t i v i t y b ym e a n so f a m m o n i u ms u l p h a t ef r a c t i o n a lp r e c i p i t a t i o n ，a n i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y o nd e a e - s e p h a d e xa 2 5 ，g e l - f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y o ns e p h a d e xg 7 5 ，t h ec e l l u l a s ew a s s e p a r a t e da n dp u r i f i e d t h em a i n r e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h r e em u t a t i o na g e n t sp o s s e s s e da n a l o g i c a lm o r t a lr a t i ot r e n d ，w h i c hp o s i t i v e l yr e l a t e dt ot h e m u t a t i o na g e n t sc o n c e n t r a t i o n t h er e s u l ta t t e s t e dt h a tu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ( 2 0 w ，3 0 c m ) i r r a d i a t e d 10 m i na n da p p e n d e dn i t r i t e - n ar 0 3 v w ) t h e ni n o c u l a t e di n t of l a to f d i e t h y l s u l f a t e ( 0 0 6 m l ) t h ec e l l u l a s ep r o d u c i n go fm u t a t i o ns t r a i n ，n a m e dt r i c h o d e r m av i r i d es p l 3 0 1 0c o u l di n c r e a s e 1 7 3 1 5 a f t e rr e p e a t e d c o m p l e xm u t a t i o n i t i l l u m i n a t e dt h a t c o m p l e xm u t a t i o nc o u l dw e a k e n r e p e l l e n c ea n ds a t u r a t i o nb ys i n g l em u t a t i o na g e n t 2 t h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo ft h ea m m o n i u ms u l p h a t ef r a c t i o n a lp r e c i p i t a t i o nw a sd e t e r m i n e d w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f t h ea m m o n i u m s u l p h a t ew a s3 0 ，t h ec e l l u l a s ea c t i v i t yw a sv e r yl o w a n d t h ee n z y m ew a sm i x e dw i t h q u a n t i t i e so fu n w a n t e dp r o t e i n s i n s t e a d ，i ft h ec o n c e n t r a t i o nw a s c o n t r o l l e db e t w e e n3 0 t o5 0 ，t h ep r o d u c th a dh i g ha c t i v i t y c o n t i n u et oc o l l e c tt h ea m m o n i u m s u l p h a t ep r e c i p i t a t i o nb e t w e e n5 0 t o6 5 a n dt h es p e c i f i ca c t i v i t yw a ss t i l lh i g h h o w e r e r , i f t h e 西南农业大学硕士论文 a b s t r a c t p r o t e i no f t h ea m m o n i u ms u l p h a t ep r e c i p i t a t i o nw a sc o n t r o l l e db e t w e e n5 0 t o6 5 ，t h es p e c i f i c a c t i v i t yw 3 st o ol o w c o n s i d e r i n gt h ea p p r o p r i a t er e c o v e r y a n dp u r i f i c a t i o no ft h ee l a s t a s e ，t h e e n z y m ep r o t e i nw a sc o l l e c t e di nt h er a n g eo f 3 0 t o6 5 t h e a m m o n i u m s u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n 3 t h ep a r a m e t e r sc o n c e r n i n ga n i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo nd e a e s e p h a d e xa 2 5w e r e o b t a i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i f f e r e n tb a l a n c eb u f f e rp hh a dg r e a te f f e c to nt h ea d s o r p t i o nt o e n z y m ep r o t e i n t h eo p t i m u ma b s o r p t i o np hw a s8 5 t h e i n i t i a lc o n s i s t e n c eo fs a l tf o re l u a t i o n h a v ee f f e c to nte l u a t i o n d c p t e dt e s tt u b ee x p e r i m e n tt oa s c e r t i o nt h et h ei n i t i a lc o n s i s t e n c eo fs a l t ， s a v e m a n y t i m e s t h ee x p e r i m e n t i n d i c a t e t h a t t h e i n i t i a lc o n s i s t e n c eo f s a l t i s o 1m o l l 4 p u r i f yt h ec e l l u l a s eb yt h em e a n so fa n i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo nd e a e s e p h a d e x a 2 5 t h et r i sb u f f e ra tp h 8 5w a su s e da se l u e n ta n dt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f s o d i u mc h l o r i d ew a s c o n t r o l l e db e t w e e n0t oo ，6 0 m o l l a f t e re l u a t i n g s e v e r a lp e a k so f p r o t e i na p p e a r e db e t w e e no 1 3 5 t o0 4 5 m o l ls o d i u mc h l o r i d e a b o v e0 4 5 m o l l t h e r ew a s n e a r l yn op r o t e i ne l u t e d t h ev e l o c i t yo f e l u a t ei s3 0 m l h a n dc o l l e c t5 0 m le a c ht u b ea n de v e r yo t h e r10 m i n t h ee l u t e dn o 9 9t u b e s d i s p l a y e dt h eh i g l l a s ta c t i v i t ya m o n g t h el5 0t u b e s t h e nt h es o d i u mc h l o r i d ec o n c e n t r a t i o nw a s f r o m0 3 0 5 m o l lt o0 41 6 m o l l ，t h ec e l l u l a s ec a db ee l u t e dc o m p l e t e l y 5 t h eu n r e f i n e dc e l l u l a s ew a s a p p l i e d t ot h ec o l u m no fg e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y o n s e p h a d e xg 7 5 t h ev e l o c i t yo f e t u a t ei s18 m l h a n dc o l l e c t5 0 m le a c ht u b ea n de v e r yo t h e r 10 m i n t w op r o t e i n sp e a k sw e r ee l u t e do u t ，o n es h o r ta n da n t h e rb i g g e r c e l l u l a s ea c t i v i t yw a s d e t e r m i n e db yc e l l u l o s ed i g e s t i o ni nt h es m a l lp e a ka n dt h eb i g g e rp e a ka p p e a s e do na c t i v i t y 6 t h eh o m o g e n e i t yb yt h ew a yo fs d s p a g ew a sc o n f i r m e d ，d y e i n gw i t hs i l v e rn i t r a t ef o r l h e d i f f e r e n tp u r i f i c a t i o ns t e p s t h ec o n c e n t r a t i o no fs e p a r a t eg l u ei s1 2 a n dt h ec o n c e n t r a t eg l u e4 t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h er a wf e r m e n t a t i o nf l u i dc o n t a i n e dp l e n t yo fp r o t e i n sw i t hd i f f e r e n t m o l e c u l a rw e i g h t s a f t e rt h ea m m o n i u ms u l p h a t ef r a c t i o n a lp r e c i p i t a t i o na n dd i a l y s i s ，t h eu n w a n t e d p r o t e i n sw e r er e d u c e ds i g n i f i c a n t l y b u tt h ep r o d u c t s t i l lc o n s i s t so fal o to fo t h e rk i n d so f p r o t e i n s t h r o u g ht h ea n i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo nd e a e s e p h a d e xa 2 5 ，m o s to fp r o t e i n s w e r e r e m o v e d h o w e v e ra tt h ee n do ft h eg e l ，t h r e ew e a kp r o t e i ns t r i p ss t i l le x i s t e d a tl a s tt h r o u g ht h e g e l - f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h yo ns e p h a d e xg 一7 5 ，t h e c e l l u l a s ew a sp u r i f i e da b s o l u t e l ya n di t s h o w e dh o m o g e n e i t yb ys d s p a g e t h em o l e c u l a rw e i g h tw a s4 6 ，0 0 0 d a k e y w o r d s ：e e l l u l a s e 、t r i c h o d e r m av i r i d e 、m u t a t i o nb r e e d i n g 、p u r i f i c a t i o n v 西南农业人学硕士学位论文文献综述 第1 章文献综述 粮食生产、污染预防、环境整治、可再生材料、可再生能源这几个方面是影响可持续发 展的主要因素。随着不可再生资源的逐渐消耗，可再生资源的利用成为研究的热点。其中纤 维素作为一种数量极其庞大的可再生资源必将会成为食品、能源等领域的重要原料“。 纤维素是地球上数量最大但又未得到充分利用的一类多糖，微生物对它的降解、转化是 自然界碳素循环的主要环节。纤维素是植物细胞壁的主要组分之一，占植物秸秆干重的4 0 5 0 ( 见表1 1 ) 。它对增强细胞壁的机械支撑强度、维持不透水性以及抗逆性有重要的功能作 用”。在自然界有机物中，纤维素储存量最多，据粗略估计，全世界纤维素的资源约为7 + 1 0 k g ， 每年经绿色植物光合作用合成的纤维素产量高达4 + 1 0 k g ”1 。因此，纤维素是地球上最丰富 且取之不尽的天然可再生资源。然而，至今人部分植物秸秆中的纤维素都被燃烧处理或任其 腐烂，只有很小的一部分被人类所利用，这样既造成了宝贵自然资源的浪费，义严重污染环 境。例如以秸秆作饲料”“，全世界每年农作物秸秆产量可达4 0 亿吨，我国年产量达5 7 亿 吨，用于饲料的部分还不足1 0 ，其中直接饲喂或粉碎后饲喂不足6 ，青贮”1 、氮化”“、秸 秆饲料所利用的秸秆量仅占其产量的2 8 ，发酵利用的仅约占1 3 “，我国秸秆的饲料利用 率与发达国家2 0 9 6 的利用率相比有很人差距。 表1 几种原材料的纤维素、半纤维素、术质素台量 t a b l e1t h ec o n t e n to f c e l l u l o s e ，h e m i c e l l u l o s ea n dl i g n i ni ns o m em a t e r i a l s 纤维素是一种无水葡萄糖的线性多体分子，其重复单位称纤维二糖，完全降解后的产物 葡萄耱是食品、燃料和化学原料的重要来源。人类一旦掌握了经济的水解纤维素技术，就不 但可以提高纤维素的利用率，又可以减少森林工业、农业、造纸工业、木材加工业以及纺织 业所产生的废料对自然环境的污染。因此，许多国家特别是发达国家都很重视纤维素的研 究工作。美国化学协会也指出，唯一可代替石油的化学原料是纤维素废弃物。然而，人类或 大部分动物都不能消化纤维。要利用纤维素必须首先将其分解。如果能用酶法糖化工艺将纤 维素转化为葡萄糖，将给人类提供新的重要资源。所得到的葡萄糖可以作为人类的直接食物 或动物的饲料，井可广泛地用作微生物蛋白质“和其他发酵产品生产的原料”“。 纤维素酶在充分利川农作物秸秆等农副产品废弃物、降解秸秆中的纤维素、开辟新的粮 l 西南农业大学硕士学位论文文献综述 食和能源方面具有巨大的潜力“”1 。目前用于纤维素酶生产的菌株多为木霉、青霉及曲霉 等“”“6 “”1 ，普遍存在酶活力较低的问题。筛选高效纤维素分解菌，确定纤维素酶的固态发酵 工艺，是利用秸秆纤维索的关键。通过高效纤维素分解菌发酵秸秆及其他含纤维素的农副产 品卜脚料，生产纤维素酶作为饲料添加剂“”，可提高饲料利用率和粗饲料的营养价值，降 低饲料成本。冈此高效纤维素酶产生菌的选育、发酵工艺研究及饲用纤维素酶的生产应用具 有广阔的开发前景。 1 1 纤维素及纤维素酶概述 1 1 1 纤维素的结构和组成 纤维素分子是由许多吡喃型的d 一葡萄糖残基通过b 一1 ，4 糖苷键连结而成的链状高分子聚 合物”“。纤维素是一种分子量很大的多糖，分子量可以达到儿十万，甚至几百万。纤维素在 植物细胞壁中总是与半纤维素和木质素等物质共存。纤维素分子的经验式为( c 。h ；。0 。) 。，其中n 是葡萄糖苷键数目，称为聚合度( d p ) ，它的聚合范围非常宽，可以从儿百到一万五千左右， 甚至更大。纤维素分子中含碳4 4 4 4 ，氢6 17 9 6 和氧4 9 3 9 。 11 2 纤维素酶的来源、组成及性质 11 2 1 纤维素酶来源 纤维素酶来源广泛，原生动物、节肢动物、软体动物和昆虫等均能产生纤维素酶，动物 的瘤胃中有共生的纤维分解菌和原生动物。在高等植物中也有纤维素酶，其作用是使细胞壁 松弛，与种子发芽、细胞生长有关。在微生物方面细菌产生的纤维素酶的量较低，主要是 e g ，少数细菌能分泌外切葡聚糖酶，而且这些酶主要是胞内酶或是吸附于细胞壁上，很少能 分泌到细胞外，增加了提纯的难度在工业上很少采用“。目前研究较多的是纤维素粘菌属、 生孢纤维粘菌属、纤维杆菌和芽孢杆菌属。放线菌中的分枝杆菌和原放线菌几乎不产纤维素 酶或产量极低，产量稍高的主要是黑红旋丝放线菌“c t i n o m y c e sm e l a n o c y c l u s ) 、玫瑰色放线 菌乜c t i n o m y c e sr o s e o d i a s t a t i e u a ) 和纤维放线菌0 c t i n o m y c e $ c e l l u l o s a e ) 。目前用于生产纤维索 酶的微生物大多属于真菌，研究较多的有木霉属( t r i c h o d e m a ) 、曲霉属0 s p e r g i l l u s ) 、青霉属 ( p e n i c i l l i u m ) 、p e l l i e n l a l i a 属和枝顶孢霉属( a s p e r g i l l u s ) 的菌株。其中尤以木霉属的产量居 多，里氏木霉、康氏木霉( t r i c h o d e r m a k o n i n g i i ) 和绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 等是木霉属中 酶活性较高的菌种，特别是绿色木霉( t r i c h o d e r n t av i r i l e ) 及其近缘的菌株。真菌产生三类纤维 素酶，能分泌到菌体外，一般不聚集形成多酶复合体，但相互发生强烈的协同作用。目前已 制成制剂的有绿色木霉、黑曲霉( a s p e r g i l l i u sn i g e r ) 、镰刀霉( f u s a r i u ms p ) 、拟青霉 ( p a e c i l o m y c e ss p ) 和斜卧青霉( p e n i c i l l i u md e c u m b e n s ) 等的纤维素酶。酵母虽然不产纤维素酶， 但可以利用酵母表达系统表达纤维素酶基因，其产物高度糖基化，经：确加工修饰后可直接 2 分泌到培养基，表达水平高。如用酵母表达的c h b i i 、e gi 的产量可达l o o m g l 以上，并具 有止常的生物学活性”3 2 73 2 8 1 2 9 1 2 9 ( 3 0 1 3 1 。 i i 2 2 纤维素酶的组成 纤维素酶( c e l l u l o s e ) 是降解天然纤维素生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖的一组酶 的总称。它不是单成分酶，而是由三类起协同作用且具有不周催化反应功能的酶组成的多酶 体系，根据其催化功能的不同可分为：1 、内切葡聚糖苷酶又称c x 酶、c m c 酶( e n d o 1 ，4 0 - d g l u c a n a s ee c 32 1 4 ，来自真菌简称e g ：来自细菌简称l e n ) ，该类酶能随机地在纤维素分子 内部降解1 ，4 一b 糖苜键；2 、外切葡萄糖苷酶又称c 酶( e x o 1 4 - 1 3 d g l u e a n a s ee ，c3 2 1 9 1 ， 来自真菌简称c b h ；来自细菌简称c e x ) ，它能从纤维素分子的还原或非还原端，水解b i ， 4 一糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故而又称为纤维二糖水解酶( c e l l o b i o h v d r o l a s e ) ：3 、 纤维二糖酶又称p 一葡萄糖营酶( b 一1 , 4 一g l u c o s i d a s e ，e c3 2 1 2 1 ，简称b g ) ，它把纤维二糖、纤 维三糖水解成单个的葡萄糖分子。三种酶各有专一性，但能相互协调，只有在这三类酶的 协同作用下，最终才能把纤维素分子降解成葡萄糖。微生物特别是真菌能产生这类酶的复合 物，从而把纤维素分子降解为葡萄糖分子为自己所利用。迄今为止，未见有关单个酶组分能 把纤维素分子降解成葡萄糖的报道【3 3 】 3 4 1 3 5 1 。 1 1 2 3 纤维素酶的理化性质 纤维素酶的天然品存在于许多霉菌、细菌中，在银鱼、蜗牛、白蚁中也有发现。外观为 灰白色的无定形粉末或液体：其最适宜的作用温度为4 0 。c 5 5 c ；反麻最适p h 值为4 o 6 0 ， 在4 0 * ( 2 7 0 c 以下稳定存在；溶于水，几乎不溶于乙醇、乙醚和氯仿等有机溶剂“6 “；其酶 催化效率高，比般酶高1 0 6 1 0 7 倍：酶的催化反应具有高度专一性，酶对其作用底物有，m 格的选择性；催化反应条件温和：酶的催化活力可被调节控制：无毒性。 1 1 3 纤维素酶的分子结构 在一级结构和三维结构的研究中人们发现，纤维素酶分子普遍具有类似的结构，全酶分子 呈蝌蚪状，由具有独立活性的两个结构域和连结序列构成( 如图1 ) 。由球状的催化结构域 ( c a t a l y t i cd o m a i n s ，c d ) 、连接桥( 1 i n k e r ) 和纤维索结合结构域( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n s ，c b d ) 三部分组成。( 1 ) a 代表纤维素结合结构域：它对酶的催化活力是非必需的，但它执行调h 酶 对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用”1 ：( 2 ) b 区代表了高度糖基化的连接桥：纤维 素酶的连接医大多富含g l y 、s e r 、t h r 。连接桥的作用可能是保持c d 和c b d 之间的距离， 也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体；其存在的重要性尚有争议：( 3 ) 球状的催 化结构域：它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。c b d 在纤维素酶中位于氨基端 或羧基端，它通过一段高度糖基化的l i n k e r 与c d 相连”。部分纤维素酶含有2 0 1 5 0 个氮基 西南农业大学颀十学位论文文献综述 酸残基的重复序列，重复序列可能与纤维素酶复合物中蛋白一蛋白之间的相互作用有关。纤维 素酶结构域拆分的研究为内切酶和外切酶底物的特异性作山了合理的解释：内切酶的活性位 点位于一个开放的c l e f t 中，它可与纤维素链的任何部位结合并切断纤维素链；外切酶的活性 位点位于一个kl o o p 所形成的t u n n e l 里面它只能从纤维素链的非还原末端切下纤维二糖”。 后来的有关研究也进一步证实了上述分析”“”。 114 纤维素酶的作用机制 1 1 4 1c b d 的作用机制 图1 纤维素酶分子结构 f i g lt h ec o n f i g u r m i o no f c e l l u l a s em o l e c u l e 虽然纤维素酶的水解机制有了基本的阐明，但目前仍未阐明酶和纤维素分子的吸附作用 机制。c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 的c b d 由1 5 0 个氨基酸残基组成，折叠成紧密的3 * 3 * 4 5 n m 棱 形结构。该c b d ( c f i m i 和rr e e s e i 的c b d 情况类似) 结合于三个连续的纤维素分子链，这样通 过c b d 和纤维素分子间的作用，导致纤维素内部氢键的断裂，有助于在脱吸附后催化域对糖 苷键的水解，同时也有助于酶或c b d 的重新吸附“。至今还没有实验表明c b d 是否不会脱吸 附而沿着这三条纤维素链一直作用下去，尽管基于c b d 是一种锲形结构和c b h 作用的连续 性的事实，c b h 作用是如此，但对于e g 不是这样，已有实验表明c b h 和e g 对结晶纤维素 的水解程度是完全不同的。 1 1 4 2c d 的作用机制 t r e e s e i 的c b h i 和c b h i i 的催化域直径长度大约是3 n m ，l i n k e r 大约是9 n m 分子量分别 是5 2k d a 和4 7 2 k d a 。 z f u s c a 的e g i i 的催化结构域是5 3 * 3 8 * 3 6 n m ，分子量是4 3 k d a ( 2 4 ) ， 而在徽纤维中单根纤维素分子链的直径是o 6 m l n m 。尽管纤维素酶催化域和l i n k e r 的大小因 酶的不同而不同，但这些事实表明一旦纤维素酶被c b d 结合到纤维素分子链上，就会有大量 接触纤维紊链的机会并且在一条链上将有许多的作用位点其总的催化机会依赖于l i n k e r 柔韧 性“”“。总之一旦纤维素酶被它的c b d 结合到底物上，它将能在一个限定的范丽内水解许 多的糖苷键。催化域对纤维素的水解主要在微纤维水平上对无定形纤维来说，很难界定它 的酶解水平，因为对相同数量的纤维素它将有更多的空间可以想象相对结晶纤维素来说， 4 西南农业大学硬上学位论文文献综述 它更容易渗透，冈为在无定形区将更少有结构上的限制，导致纤维素酶更容易对其攻击，因 而酶活较高。 i 1 5 纤维素酶的降解机理 1 9 0 6 年，s e i l l i e r e 首次在蜗牛的消化液中发现了能分解天然纤维素的纤维素酶。1 9 3 3 年， g r a s s m a f l 从一种真菌产生的纤维素酶系中分辨出两个组分。1 9 5 0 年，r e e s e 等曾阐明没有一 种纤维素酶生产菌能生产出分解棉花中的天然纤维素的酶，但后来发现有的菌株生产的酶能 分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维素，因而提出了由，丁j 天然纤维素的特异性 而必须以不同的酶协同作用才能分解的c i - c x 假说“。这个假说认为：纤维素酶的二组分c 酶、c x 酶和b 一葡萄糖苷酶对纤维素的作用方式不同，c t 酶作用于纤维素的结晶区，使之转变 为可被c x 酶作用的形式；c x 酶随机水解非结晶纤维素、可溶性纤维素衍生物和葡萄糖的 p l ，4 一寡聚物；1 3 - 葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水解成葡萄糖。在水解天然纤维索( 高结 晶度纤维素) 时，c - 酶和c x 酶是分阶段协调作用的，首先是c - 酶作用于纤维素的结晶区，但 对它只转化不水解：然后是c x 酶作用，将己转化成无定形纤维素的部分水解为可溶性纤维低 聚糖，再由p 一葡萄耱营酶分解成葡萄糖。w o o d ，f a t e r s t a 和k a r d a 等也发现了纤维素酶在水 解纤维素过程中也具有协同作用“6 ”。 协同作用一般认为是内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶需要 的新的游离末端然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，d 一葡萄糖苷酶 再水解纤维二糖单位形成葡萄糖“。一般来说协同作用与酶解底物的结晶度成正比，当酶组 分的混合比例与霉苗发酵滤液各组分相近时，协同作用最大，不同菌的内切与外切酶之问也 具有协同作用1 。 1 1 ，6 纤维素酶生产工艺 同其它酶制剂的生产一样，纤维素酶也主要有固体发酵和液体深层发酵两种，国内外 研究人员在这方面做了大量有价值的工作。 1 1 6 1 固体发酵法 固体发酵法是以玉米等农作物秸秆为主要原料，通过接种微生物进行的发酵工艺。具有 投资少、工艺简单、产品价格低廉的优点。目前国内绝大部分纤维素酶生产厂家均采取该技 术生产纤维素酶。张苓花等( 1 9 9 8 ) 以康氏木霉为菌种进行固体发酵，首先对菌种进行了诱变， 并利用酵母菌与康氏木霉间的微生态关系进行混合发酵防止了“白毛菌”的污染，提高了 酶活力“。邬敏辰等”“( 1 9 9 8 ) 以里氏木霉w x r 一8 为出发菌株，经紫外和亚硝基胍诱变处理 后，得到一株抗纤维二糖阻遏突变株r m 一2 7 ，得到了其固体发酵的昂佳条件。s o u z a 等( 1 9 9 9 ) 以橙色热子囊菌( t h e r m o o s c u s a u r a n t i a c u s ) 为菌株，采用响应面法研究了木聚糖酶的固体发酵， 发现起始含水簧和甘蔗渣的量是影响产酶的最主要因素。g u t i e r r e z c o r r e a 等1 ( 1 9 9 9 ) 以经碱 5 处理的甘蔗渣为主要碳源，研究了里氏木霉l m u c 4 e i 和黑曲霉a t c c l 0 8 6 4 共同发酵产纤维 素酶的条件。 6 2 液体发酵法 采用固体发酵虽然有许多优越之处然而其存在着根本上的缺陷，以秸秆为原料的固体 发酵法生产的纤维素酶很难提取、精制。由于技术上存在困难，目前我国纤维素酶生产厂家 只能采取直接干燥粉碎得到固体酶制剂或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂，这样得到的产品 外观粗糙且质量不稳定，杂质含量高。因此，随着液体发酵酶制剂工艺的发展及菌种性能的 提高，采