（高分子化学与物理专业论文）哺乳动物内质网体和细胞核中亲免蛋白的研究.pdf

中文摘要 且 h c y p 3 3 与m r n a的特异性结合能够促进 h c y p 3 3的p p i a s e 活性。并且 这种 促 进能 够被c s a 所抑 制。 由 此 说明 ， 人亲 环 素3 3 是 一 种p o ly (a ) 十 r n a即 m r n a结合蛋白 ， 并作为 功能 蛋白 有可能参与t 细胞核内r n a的输送过程或与 转录有关的信息传递过程。 关键词: f k b p 2 3 b i p a t p a s e 活性 人亲环素3 3 m r n a p p i a s e 活性 ab s tr a c t ab s t r a c t t h i s d i s s e r t a t i o n i s c o m p o s e d o f t w o p a rt s : t h e f i r s t p a rt i n v e s t i g a t e d t h e b i n d i n g s p e c i fi c i ty b e t w e e n f k b p 2 3 a n d b i p i n m a m m a l i a n e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m a n d t h e i n fl u e n c e o f t h e b i n d i n g t o b i p a t p a s e a c t i v i ty . t h e s e c o n d p a rt o f t h i s d i s s e rt a t i o n s t u d i e d t h e b i n d i n g s p e c i f i c i ty b e t w e e n h c y p 3 3 a n d m r n a i n m a m m a l i a n k a ry o n a n d t h e i n fl u e n c e o f t h e b i n d i n g t o h c y p 3 3 p p i as e a c t i v i ty . f k b p 2 3 s t u d i e d i n t h e f i r s t p a r t i s a m e m b e r o f i m m u n o p h i l i n f a m i l y . i m m u n o p h i l i n s a r e h i g h l y c o n s e r v e d p r o t e i n a n d t h e y p o s s e s s t h e p e p t i d y l - p r o l y l c i s - t r a n s i s o m e r as e ( p p l as e ) a c t i v ity . b i p , w h i c h i s l o c a l i z e d i n e n d o p l as m i c re t i c u l u m , i s a m e m b e r o f t h e h s p 7 0 ( h e a t s h o c k p r o t e i n 7 0 ) f a m i l y . h s p 7 0 i s a m e m b e r o f m o l e c u l a r c h a p e r o n e s t h a t p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n p r o t e i n s t r a n s f e r r i n g b e t w e e n d i ff e r e n t s u b c e l l u l a r s t r u c t u r e s a n d p r o t e i n s f o ld i n g t o f o r m f u n c t i o n a l s t r u c t u r e i n i t s p h y s i o l o g i c a l l o c a t i o n . t h i s s t u d y c l a ri f i e d t h a t f k b p 2 3 b i n d s s p e c i f i c a l l y t o b i p , t h e b i n d i n g i s in te rr e l a te d w ith c a 2 + c o n c e n tr a t io n a n d t h e sw it c h p o i n t i s 2 - 3 m m i n m o u s e e n d o p l as m i c r e t i c u l u m b y m e a n s o f i m m u n o p r e c i p i t a t i o n . t o m a k e s u r e t h e a c t u a l b i n d i n g s i t e , w e c l o n e d t h e n - t e r m i n a l a n d c - t e r m i n a l o f m f k b p 2 3 a n d m b i p . b y m e a n s o f a ff i n i ty a d s o r p t i o n w e p r o v e d t h a t t h e c - t e r m i n a l d o m a i n o f m f k b p 2 3 b i n d s t o t h e c - t e r m i n a l d o m a i n o f m b i p a n d t h e w e a k b i n d i n g o f m f k b p 2 3 n t o mb i p n i s t h e b i n d i n g o f e n z y m e ( p p i ase ) a n d i t s s u b s t r a t e in b i p n . f u rt h e r m o r e , w e a l s o f o u n d t h a t o n ly t h e b o u n d mf k b p 2 3 , b u t n o t t h e fr e e m f k b p 2 3 , i n h i b i t s t h e a t p a s e a c t i v i ty o f m b i p ; a n d t h i s s u p p r e s s i o n i s d u e t o t h e p p i as e a c t i v i ty o f m f k b p 2 3 b y t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o d o f p y r u v a t e k i n a s e a n d l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e . t h e s e c o n d p a rt o f t h i s t h e s i s s t u d i e d h u m a n c y c l o p h i l i n 3 3 ( h c y p 3 3 ) w h i c h w as d i s c o v e r e d i n h u m a n t c e l l n u c l e o l u s . c y c l o p h i l i n s ( c y p s ) a r e w i d e s p r e a d i n p r o k a ry o c y t e s , e u k a ry o t e s a n d i n a v a r i e ty o f s u b c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s . d u e t o i t s p e p t i d y l c i s / t r a n s i s o m e r a s e ( p p l a s e ) a c t i v i ty , c y c l o p h i l i n p l a y s a k e y r o l e i n t h e p r o c e s s o f f o l d i n g o f n a s c e n t p e p t i d e s , tr a n s p o r t a t i o n a n d a s s e m b l y o f b i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l e s . t h e s e q u e n c e a n a l y s i s s h o w s t h a t h c y p 3 3 c o n t a i n s t w o f u n c t i o n al d o m a i n s : o n e i s t h e r n a - b i n d i n g d o m a i n a t t h e n t e r m i n u s a n d t h e o t h e r i s p e p t i d y l c i s / t r a n s i s o me r a s e d o ma in a t t h e c t e r mi n u s . i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y w a s a p p l i e d t o s t u d y t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n h c y p 3 3 a n d d i ff e r e n t c e l l u l a r r n a s . t h e r e s u l t s s h o w e d t h a t h c y p 3 3 b i n d s s p e c i fi c a l l y t o m r n a n a m e l y p o l y ( a ) + r n a , b u t n o t p o l y ( a ) - r n a o r t r n a . f u r t h e r m o r e , b y a s t a n d a r d p e p t i d e a s s a y t o d e t e r m i n e t h e p p l a s e a c t i v i t y w e p r o v e d t h a t h c y p 3 3 p o s s e s s e s p p l a s e a c ti v i t y . t h e b i n d i n g o f m r n a t o h c y p 3 3 s t i m u l a t e s h c y p 3 3 s p p i a s e a c t i v i t y a n d t h e s t i m u l a t i o n c a n b e i n h i b i t e d b y c y c l o s p o r i n a ( c s a ) . t h i s m e a n s t h a t h c y p 3 3 a s a k i n d o f m r n a b i n d i n g p r o t e i n m a y i n v o l v e i n t h e tr a n s p o r t a t i o n o f m r n a a n d t h e s i g n a l t r a n s d u c t i o n d u r i n g tr a n s c r i p t i o n p r o c e s s . k e y w o r d s : f k b p 2 3 b i p a t p a s e a c t i v i t y h u m a n c y c l o p h i i i n 3 3 m r n a p p l a s e a c t i v i t y 符号说 明 符号说明 f kbp 2 3 mf kbp 2 3 b沪 m bi p cs a c y p p pl a s e p d i dh f r ca n ca m t or r y r i p 3 r hs p h s r g s t er p cr 第一部分哺乳动物内 质网体中f k b p 2 3 与b i p 特异性结合及活性方面的研究 f k 5 0 6 b i n d i n g p r o t e in 2 3 f k 5 0 6 结合蛋白2 3 m o u s e f k b p 2 3小鼠f k b p 2 3 i m m u n o g l o b u l in b i n d i n g p r o t e i n免 疫 球 蛋白 结合 蛋 白 mo u s e b i p小鼠 b ip c y c l o s p o r i n e a环抱菌素a c y c l o p h i l i n亲环素 p e p t i d y l - p r o l y l c i s - t r a n s i s o m e r a s e肤脯氨酞顺反异构酶 p r o t e i n d i s u l f i d e i s o m e r a s e蛋白二硫键异构酶 d ih y d r o f o l a t e r e d u c t a s e二 氢 叶 酸还原 酶 c a l c in e u r i n钙调磷酸酶 c a l mo d u l i n钙调蛋白 t a r g e t o f r a p a m y c i n雷帕 霉素靶蛋白 r y a n o d in e r e c e p t o r r y a n o d i n e 受体 l n o s i t o l ( 1 , 4 , 5 ) t r i s p h o s p h a t e r e c e p t o r三 磷 酸 肌醇受 体 h e a t s h o c k p r o t e i n热激蛋白 h e a t s h o c k r e s p o n s e热休克反应 g l u t a t h i o n e - s - t r a n s f e r a s e谷胧甘肤- s 一 转移酶 e n d o p l a s m i c t e t i c u l u m内 质 网体 p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n聚合酶链式反应 h c y p 3 3 rbd p pl a s e m r n a t rna r rna v rna s n r n a s c rna rrm d s rb d 第二部分 哺乳动物细胞核中h c y p 3 3 与m r n a 特异性结合及活性方面的 研究 h u m an c y c l o p h i l in 3 3人亲环素3 3 r n a b i n d in g d o m a i n r n a结合区域 p e p t i d y l - p r o l y l c i s - t r ans i s o m e r a s e肤脯氨酞顺反异构酶 m e s s a g e r n a信使r n a t r a n s f e r r n a转运 r n a r i b o s o m a l r n a核糖体r n a v i r a l r n a病毒r n a s ma l l n u c l e a r r n a核内小 r na m a l l c y t o p l a s m i c r n a胞质内小r n a r n a r e c o g n i t i o n m o t i f r r m模体 d o u b l e s t r and e d r n a b i n d i n g d o m a i n双链r n a结合模体 符号说明 cs d nm r o l d s h o c k d o ma in n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e 冷休克模体 核 磁共 振 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了 解南开大学关于收集、 保存、 使用学位论文的规定， 同 意如下各项内 容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本;学校有权保存学位论文的印 刷本和电 子版，并采用影印、 缩印、 扫描、 数字化或其它手段保存论文; 学校有权提供目 录检索以 及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务; 学 校有权按有关规定向国家 有 关部门 或者机构送交论文的 复印 件和电子版; 在不以赢利为目 的的 前 提下， 学校可以 适当复制论文的 部分或全部内 容用于学术活动。 学 位 论 文 作 者 签 名 :.工j 呵 年翔 z ss j 白 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名:学 位论文作者签名: 解密时间:年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下: 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文， 是本人在导师指导下， 进行 研究工作所取得的成果。 除文中已 经注明引 用的内 容外， 本学位论文 的研究成 果不包含任何他人创作的、 已公 开发表或者没有公开发表的 作品的内 容。对本论文所涉及的 研究工作做出 贡献的 其他个人和集 体， 均己 在文中以明确方式标明。 本学 位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者 签名: ? o y 4 e 夕 ” 参 第 一部分 哺乳动物内 质网体中f k b p 2 3 与b i p 特异性结合 及活性方 面的 研究 第一部分 哺乳动物内质网体中 k b p 2 3 与b i p特异性结合 及活性方面的研究 本 部分 课题 研究的f k b p 2 3 属于亲免蛋白 “ m m u n o p h i l i n )家 族的 成员。亲 免蛋白 具有两大主要 特征: 一是存在的 广普性和遗传上的 保守性，即从低等生 物、 植物、动物直至人等高 级哺乳动物的 体内以 及细胞的各亚结构中均有亲免 蛋白存在;二是肤脯氨酞顺反异构酶 ( p p i a s e )活性，这种活性能被与之结合 的用于 器官移植的免 疫抑制剂f k 5 0 6 所抑制。 本部分课题 研究的另 一个对象b i p 是 h s p 7 0家 族在内 质网 体中 的成员。 在生命体中，蛋白 质在 其生理 位置需折叠 成具有正常生 理功能的 空间 结构才具有活 性。 h s p 7 0 家 族蛋白 在生物 体内的主要 功能是在蛋白 质于细胞内 亚细胞结构间 转运的 过程及其折叠 过程中，充当 分子 伴侣的角色。 目 前，关于亲免蛋白结 合类免疫抑制剂在器官移植中发 挥作用的分子生物 学机制，虽然有一些提法， 但是众说不一。 我们的 课题从内 质网体中蛋白 质输 送和分泌的方向 入手， 研究了f k b p 2 3 与它的特异性结合蛋白b i p 的 相互作用关 系，从而为进一步探索这个 亲免蛋白的 生理功能， 全面了 解亲免蛋白 结合 类免 疫抑制剂作用的分子 生物学机制提供了一 些线索。 以 下将简要介绍近年来有关亲免蛋白、 蛋白 质折叠以及分子伴侣等本 课题 相关领域的研究进展和本课题的研究内容与成果。 第一章 引言 第一章引言 第一节亲免蛋白 研究 概况 亲免蛋白 ( i m m u n o p h i l i n )家族 亲免蛋白名称的由来 1 . 1 . ， . 1 . 1免 疫抑制剂的 种类 免疫 抑制剂的成 功应用 是器官移植技术发展的有力保障。常用的免疫抑制 剂有四类:化学合成细胞毒素 类 ( 抗代谢剂和烷化剂); 抗生素类; 肾 上腺糖皮质激素类;生物制剂类。目前生物制剂类免疫抑制剂主要包括 c y c l o s p o r in e a , f k 5 0 6 及r a p a m y c in 1) o c y c lo s p o r in e a ( c s a ， 环 抱 菌 素a ) 是 一 种 中 性、 高 亲脂 性的 聚 肤， 由1 1 个氨基酸组成。它可作用于被激活的淋巴 细胞， 阻止淋巴因子基因的转录， 从 而 减 少il -2 的 表 达， 抑 制 细 胞 的 免 疫反 应 2 1 o c y c lo s p o r in e a的 应 用 使 器官 移 植 的 临床实践绝境逢生，它的应用不 仅大大延长了 异体实质 性器官的存活率， 而 且对自 身免疫 性疾病的治疗提供了 乐观的 前景3 1 f k 5 0 6 ( p r o g r a f ， 普乐可复) 是由 一种链霉菌属产生的 2 3 碳大 元环内酷 类 抗生 素. 分子 式为c 4 4 h 5 9 n o 12 h 2 0 ， 分子量为8 2 2 。 其作用强 度是 c s a的 1 0 0 倍，具 有很强的免疫抑制作 用， 且使用剂量小、 毒副作用小。 f k 5 0 6可与体内 的亲 免蛋白f k b p形成复合物， 作用于细胞分化早期，阻断淋巴 因子基因的转 录， 从而导致胸腺 髓质萎缩、成 熟胸腺细胞减少2 1 r a p a m y c m ( s i s o l i m u s , 雷帕霉素) 可在 g i s 期交界处通过干扰非钙依赖 性途径阻 断细胞周期， 并影响 b细胞的激活。目 前该药物的确切机制不十分清 楚， 尽管 也是通过与 f k b p形成复 合物来发 挥免疫抑制作用， 但可以 肯定其作 用机制与f k 5 0 6 完全不同4 ) 2免疫抑制荆在 生物体内的天然配塞 亲 免蛋白 第一章引言 第三节本课题提出的指导思想 从目 前的 研究报告可知f k b p 普遍存在于从低等到高 等的 生命个体中以 及细 胞的各个亚结构中，在遗传上具有高度的保守 性，而 且以 往的实 验表明，在头 饱类 真菌n e a u r o s p o r a c r a s s a中n c f k b p 2 2 与n c b i p 之间 可以 特异性地结合， 结合后 n c f k b p 2 2 对n c b i p 的a t p a s e 活性产生影响。 基因对照分析证明， m f k b p 2 3 与n c f k b p 2 2 有很大的同 源性。 与此同时，我们前期的体外 实验已 经证明，克隆 的m f k b p 2 3 与克 隆的m b i p 可以 特异性地结合， 并且由 于m f k b p 2 3 c 端的e f 手 模 体 结 构 具 有c a z+ 结 合 活 性 ， 使 得 这 一 结 合 受c a + 浓 度 的 影 响 。 由 于鼠 与 人的 基 因有很大的同源性，如果证明了在体内m f k b p 2 3 与 m b i p 也可以特异性结合并且 对m b i p 的a t p a s e 活性产生影 响的话，便可较容易推测出 人体内 类似蛋白质也 具有特异结合的可能性， 以及这种结合对蛋白生物活性的影响。 在实验设计方 面， 我们首 先克隆并提取实验所需的蛋白 质m f k b p 2 3 , m b i p , 和它们的分段蛋白， 并且我们还从小鼠肝脏中提取了内 质网体。 然后在 变换结 合缓冲液离子强度的条 件下研究它们相互之间的结合特异性，并测定其具体的 结合位点。 此外， 我们还测定m f k b p 2 3 及m b i p 在其结合情况下 m b i p蛋白 的 a t p a s e活性，以及在结合液中加入不同 浓度的 c 扩 + 离子， f k 5 0 6 或 g s t - m f k b p 2 3 c 的情况下m b i p所显示出来的 a t p a s e 活性。如果哺乳动物 内 质网 体中的 f k b p 2 3 与 b i p可以 特异性地结合， 并能 确定其具体的结合位点 以及结合对蛋白生物活性的影响，那么将对进一步研究哺乳动物细胞内质网体 中蛋白质的折叠机制提供一个新的重要依据。 第二章实验部分 第二章实验部分 第一节试剂及仪器 2 . 1 . 1 试剂 2 . 1 . 1 . 1 p o r 引物 依据m f k b p 2 3 和m b i p 基因序列及本实验的要求，我们按以下序列向 上海生工公司订购了以下引物: f k b p 2 3 全长:f k b p 2 3 f . 5 - c c g g c c g a a tt c a g c a c t g a g g a a g t g a a a a t - 3 f k b p 2 3 r : 5 - c c g g c c t c g a g g g a a a a c a g g t a t a a c c a - 3 f k b p 2 3 的n端: f k b p 2 3 n r : 5 - g g c c g g c t c g a g c t a g g t c a c a g c a t a a a g t t c a a t - 3 f k b p 2 3 的c端:f k b p 2 3 c f : 5 - g g c c g g a a tt c t a t g c t g t g a c c a a a g g a c c - 3 b i p全长: b i p f : 5 - c c g g c c g g a t c c a g g a g g a c a a g a a g g a g g a - 3 b i p r : 5 - g g c c g g c t c g a g c t a c a a c t c a t c t t t tt c t g a t - 3 b i p 的n端:b i p n r : 5 - g g c c g g c t c g a g c t a a a g c a g t a c c a g a t c a c c t g - 3 b i p的c端:b i p c f : 5 - c c g g c c g g a t c c t c t c t g g t g a t c a g g a - 3 2 . 1 . 1 . 2常规试剂 1 ) e . c o l i d h 5 原菌: h s d r 1 7 , r e c a l , e n d a l , g y r a 9 6 , t h i - 1 , r e l a l ; s u p e 4 4 a l a c u1 6 9 ( ( p 8 0 l a c z a m1 5 ) 2 ) p g e x - 5 x 1 质粒载体:p h a r m a c i a 公司 3 ) 细菌培 养用 胰化 蛋白 陈: o x o i d l t d , e n g la n d 4 ) 细菌培养 用酵 母 提取 物: o x o i d l t d , e n g la n d 5 ) 细菌培养用琼脂: t b d公司 6 ) 氨节青霉素 ( a mp ) :上海生工公司 7 ) 异丙基一 硫代- - d 一 半乳糖昔 ( i p t g ) :上海生工公司 8 ) 丙 烯酞胺和n , n ， 一 亚甲 双丙烯酞胺:上海生工公司 第二章实验部分 9 ) 十二烷基硫酸 钠 ( s d s ) :北京鼎国公司 1 0 ) 二硫苏糖醇 ( d t t ) :北京鼎国公司 1 1 ) t r i s 碱:联星公司 1 2 ) n , n , n ,n ，一 四甲 基二胺 ( t e m e d ) : t b d公司 1 3 ) 甘 氨 酸: t b d公司 1 4 ) 苯甲 基磺酸氟 ( p m s f ) : t b d公司 1 5 ) d n a酶 ( d n a s e ) :华美公司 1 6 ) 溶菌 酶:北京鼎国公司 1 7 ) t r i t o n x - 1 0 0 :华美公司 1 8 ) 亲和 层析凝胶 g l u t a t h i o n e s e p h a r o s e t m 4 b : p h a r m a c i a 公司 1 9 ) 凝血因 子x a : s i g m a 公司 2 0 ) 还原型谷肤甘肤: r o c h e 原装 2 1 ) 牛血清白 蛋白第5 组分 ( b s a - v ) : 联星公司 2 2 ) s d s - p a g e 低分子量标准蛋白 质:华美公司 2 3 ) 弗氏 完全佐剂: 鼎国 公司 2 4 ) 弗氏 不完全佐 剂: 鼎国 公司 2 5 ) 磷酸烯醇式丙酮酸:s i g m a 分装 2 6 ) 三磷酸腺昔( a t p ) :华美公司 2 7 ) 烟酞 胺腺0 9 吟二核 昔酸还原型辅酶 ( n a d h ) :华美公司 2 8 ) 丙酮 酸激 酶 ( p k ) : s i g m a 分装 2 9 ) 乳酸 脱氢酶 ( l d h ) : s i g m a 分装 常规化学试剂均购于天津科锐思化工有限公司，为国产分析纯 2 . 1 . 2 仪器 1 ) e c 1 2 0 垂直板电泳仪:北京六一仪器厂 2 ) b c m - 1 0 0 0 型生 物洁 净工 作台 : 安泰 空 气技 术有限 公司 3 )电子天平 ( 0 . 0 0 1 g 与0 . 1 g ) :德国k e r n公司 4 ) 超低温冰箱:美国r e v c o公司 5 ) 高压灭菌锅:s t u r d y公司 6 ) 蛋白 干胶 仪: b io t e c -f i s c h e r 公 司 第二章实验部分 7 ) e - 8 6 5电泳仪:德国c o n s o r t公司 8 ) c o o l p i x 9 9 0 数码照相机:日 本n i k o n 公司 9 ) h z q - q全温振荡器:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 1 0 ) 简洁 型 温振 荡器: 德国e p p e n d o r f 公司 1 1 ) p h 2 1 1 m ic r o p r o c e s s o r p h m e te r ( 精 密p h 计 ) : 意大 利哈 纳 公司 1 2 ) t u - 1 9 0 0 双光 束 紫外 可见光 分光 光度 计: 北 京普 析通 用仪 器有 限责 任公司 1 3 ) t g l - 1 6 g 冷 冻离 心机: 上 海安 亭科学 仪器 厂 1 4 ) 2 0 p r - 5 2 d高速离心机:日 立公司 1 5 ) x y j - 2台式高速离心机:江苏金坛医疗仪器厂 1 6 ) l 8 - 7 0 超速 离心 机: 美国贝 克 曼公 司 1 7 ) l q p - b - 4 制 冰机: 上 海安亭 科学 仪器 厂 1 8 ) l 8 - 7 0超速离心机:美 国贝克曼公司 第二节缓冲液及贮存液 2 . 2 . 1 细菌培养 l b 培养基 ( 每升)l b 平皿 胰化蛋白 陈l o g l b 培 养基 酵母提取物5 g琼脂粉 n a c l 1 0 g 用 5 m n a o h 调 p h 值 至7 .0 ， 高压 灭菌 氨节青霉素 ( a m p )贮存液 5 0 m g a m p / m l , h z o ，用灭菌水配制后一 2 0 保存 2 . 2 . 2 融合蛋白的表达及提取 0 . 1 m i p t g 贮存液 2 3 . 8 m g i p t g / m l h z o ，灭菌水配制，- 2 0 保存 第二章 实验部 分 1 0 0 mm p ms f( 苯甲基磺酞氟) 1 7 . 4 m g p ms f i m l 异丙醇， - 2 0 0 c 保存 mtpbs na cl 1 5 0 mm na 2 h p 0 4 1 6 m m n a h 2 p o 4 4 m m 调p h 值至7 . 3 ,高压灭菌后4 保存 5 m m谷肤甘肚- t r i s 缓冲液 1 . 5 m g 还原型谷眯甘肤l m l 5 0 m m t r i s ( p h 8 . 0 ) ， 现用现配 2 . 2 . 3 变性聚丙烯酸胺凝胶电 泳 ( s d s - p a g e ) 3 0 %丙烯酞胺5 x t r i s - 甘氨酸电泳缓冲液 丙 烯酸 胺2 9 % t ri s 碱1 5 . 1 g n ,n ，一 亚甲 双 丙 烯 酞胺1 %甘氨 酸 ( f ly ) 9 4 g 避光， 室温或4 1c 保存1 0 % s d s 5 0 m l 定容至1 0 0 0 m l 2 x s d s 样品缓冲液 t r i s . c l ( p h 6 . 8 ) 1 0 0 m m d t t( 二硫苏糖醇)2 0 0 m m s ds 4% 澳酚蓝。 2 % 甘油2 0 % 4 短时间保存，不含d t t 的2 x s d s 样品缓冲液可保存于室温 ， 应在临 用前取d t t 现加于上述缓冲液中 1 m t r i s c l ( p h 6 . 8 ) 2 4 . 2 2 g t r i s 加水至接近2 0 0 m l ，用浓盐酸调p h 至6 . 8 ， 补水至2 0 0 m l , 4 保存 2 6 第二章实验部分 1 . 5 m t r i s - c l ( p h 8 . 8 ) 3 6 . 3 3 g t r i s 加水至接近2 0 0 m l ， 用浓盐酸调p h 至8 . 8 ，补水至2 0 0 m l . 4 保存 1 0 %过硫酸钱贮存液 5 g 过硫酸钱加水至5 0 m l ，分装，- 2 0 保存。 1 m dtt 7 . 7 1 3 g d t t 加水至5 0 m l ，分装，- 2 0 1 c 保存。 蛋白ma r k e r 贮存液 瓶装国产蛋白 m a r k e r 中加入2 0 0匹灭菌水，再加等体积2 x s d s 样品缓 冲液，9 9 *c 煮沸3 - 5 m i n ，每管1 5 匹分装，- 2 0 保存 染色液 ( 每2 0 0 m l ) 考马斯亮兰r - 2 5 0 0 . 5 g 甲醇9 0 m l 冰醋酸2 0 m l 先将考马斯亮兰r - 2 5 0 溶于甲醇中，并过滤，再加入冰醋酸，最后补水 至2 0 0 m l ，室温保存 脱色液 ( 每 1 l ) 甲醇1 0 0 m l 冰醋酸7 5 m l 补水至 1 l ，室温保存 2 . 2 . 4 凝血因子 x a 对融合蛋白的裂解 凝血因子x a 裂解缓冲液 c a c 1 2 1 r u m na cl 1 00 r um t r i s . c l ( p h 8 . 0 ) 5 0 m m 高压灭菌后4 保存 凝血因子x a 贮存液 4 0 0 u n i t s 的 凝血因子x a 溶于8 0 0 l l灭菌水，分装， - 8 0 保存 第二章 实验部分 2 . 2 . 5 肝脏中内质网体的提取 l o x p bs na c l 1 . 3 7 m kcl 2 7 mm n a 2 h p 0 4 - 1 2 h 2 0 4 3 mm k h 2 p 0 4 1 4 mm 稀释 到1 x p b s 后， 溶 液的 p h 值自 动 到7 .3 左 右， 高 压灭 菌， 4 保存 r s b ( 每5 0 0 ml) t r i s c l ( p h 7 . 4 ) 1 0 m m m9 c 1 2 3 mm kcl l o mm 用稀盐酸调p h 值至7 . 4 ，高压灭菌后， 4 保存 2 x b u f f e r e( 每5 0 0 ml ) d 一 山梨醇2 m he p e s 1 0 mm edta 2 mm 用稀n a o h 溶液调p h 值至7 .4 ， 膜过滤除菌，4 保存 2 . 2 . 6 蛋白结合实验 结合缓冲液1 t r i s . h c l ( p h 7 . 5 ) na cl mg c 1 2 edta 高压灭菌后， 4 1c 贮存 结合缓冲液2 1 0 mm 1 5 0 mm 1 mm 5 mm 第二章 实验部 分 t r i s . h c i ( p h 7 . 5 ) na cl m9 c 1 2 ca c 1 2 高压灭菌后， 4 1 c 贮存 结合缓冲液3 t r i s . h c i ( p h 7 . 5 ) na cl mg c 1 2 ca c 1 2 高压灭菌后，4 *c贮存 l o mm 1 5 0 mm 1 mm 5mm l o mm 1 5 0 mm 1 mm mm 2 . 2 . 7 免疫沉淀 ( i m n u n o p r e c i p i t a t i o n ) b u f f e r s a l t( 每1 0 0 m l) t r i s c l ( p h 7 . 5 ) np- 40 1 0 mm 1 % na cl 3 0 0 mm 甘油1 0 % 用稀盐酸调p h 值至7 . 5 .高压灭菌后， b u f f e r n o s a l t ( 每1 0 0 ml ) t r i s c l ( p h 7 . 5 ) 1 0 m m np- 40 1 % 甘油1 0 % 用稀盐酸调p h 值至7 . 5 ， 高压灭菌后， 4 保存 4 保存 第二章实验部分 2 . 2 . 8 免疫印迹 ( w e s t e r n b l o t ) 转移缓冲液 甘氨 酸5 . 6 3 2 5 g t r i s 1 . 2 1 1 g s d s 0 . 0 5 g 无水甲醇1 0 0 m l 加适量水使固体溶解后，补水至5 0 0 ml ，室温保存 丽春红s 贮存液 丽春红s 0 . 2 g 三氯乙酸3 9 磺基水杨酸3 g 定容至1 0 0 m l ，室温保存，可反复使用 tbs na ci tris 1 5 0 mm 用盐酸调p h 值至7 . 5 , tbs t 加 t w e e n 2 0 于t b s 中， 碱性磷酸酶缓冲液 ( a p b ) t r i s . c l ( p h4 . 5 ) na ci mg c 1 2 室温或4 保存 n b t( 氮蓝四哇)贮存液 50 mm 室温保存 使其终浓度为0 . 1 %，室温保存 1 0 0 mm 1 0 0 mm 扣m 0 .0 5 g n b t 溶于1 m l 7 0 % d mf( 二甲基甲酞胺)中，4 保存 b c i p ( 5 - 澳- 4 - 氯- 3 - 叫噪磷酸盐)贮存液 第二章 实 验部分 0 . 0 5 g b c i p 溶于1 m l水中， - 2 0 c 保存 2 . 2 . 9 分光光度计法测定a t p a s e 活性实验 l o x b u f f e r t ri s . c l 印h 8 . 0 ) 0 . 2 m kc1 0 . 5 m mg c 1 2 1 0 m m 用稀h c l 调p h 值至8 . 0 ，高压灭菌后，分装，4 或一 2 0 保存。 丙酮酸激酶 ( p k) 1 d o o u溶 于 3 3 3 .3 匹 5 0 % 甘油 溶 液， 浓 度为 3 0 0 0 u /m l ， - 8 0 分 装保 存。 每 次 使 用时 取 出 3 匹， 加入 5 7 匹h 2 o 得1 5 0 u /m l 浓 度， 备 用。 乳酸脱氢酶 ( l d h ) 1 0 0 0 u溶于3 3 3 . 3 匹 5 0 %甘油溶液， 浓度为3 0 0 0 u / m l ，- 8 0 分装保存。 每次使用时取出 3 匹，加入5 7 泌 h 2 o 得1 5 0 u / m l 浓度，备用。 第三节实验方法 2 . 3 . 1 感受态 细胞的制备和质粒的 转化 为了得到目的蛋白，我们必须将目的基因引入到某一表达载体中进行 表达( 原理见图 2 . 1 ) 。 采用融合蛋白的形式在大肠杆菌中超量表达外源基因 产物是比 较普遍的一种蛋白表达技术。融合蛋白一般是指将外源基因引入 到某表达载体编码的高表达蛋白 n 端的3 末端，通常是大肠杆菌的一段序 列，它提供了良好表达所必需的信号。除此以外 以融合蛋 白的形式进行表 达还有三个优点:可提高外源基因产物的可溶性、稳定性以 及使提纯过程 简化。 第三章 实验结果与讨论 的a t p a s e 活性。 我们对该现象的推测是当m f