（食品科学专业论文）乳酸菌中隐蔽质粒的研究.pdf

摘要摘要乳酸菌在自然界分布广泛，其中比较有代表性的菌属为乳杆菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠球菌属。很早以前，人们就利用发酵乳酸萄来制作不同风味的食品。在所有乳制品的加工和制作过程中，乳酸菌的发酵发挥了至关重要的作用。某些野生型的乳酸菌菌株作为益生菌，同时又是细菌素的生产者，在生物技术研究方面前景远大，它们在新兴的功能性食品的发展上有潜在的用途。随着研究的深入，人们发现乳酸菌许多重要的生理功能都直接或间接地与其携带的质粒有关。所以，乳酸菌质粒的研究对于筛选新的优良菌种，改良现有的生产菌种，组建食品级载体受体系统，建立乳酸菌体内分子克隆体系都具有重大意义。虽然通过基因工程技术我们可以对食品和药品工业产生很多正面的影响，但这一趋势在国外却被围绕这种技术产生的相关法律所阻挡。所以乳酸菌的基因调整，需要食品级别的发展，它的分子克隆系统只允许来自自体移植物或g r a s 生物体并且无抗生素标记。但是考虑到质粒的迁移性，防止功能性质粒迁移到肠道中其他有害菌中，提高有害菌群的抗性，所以对功能性质粒的食品级别使用还是要慎重，为了使质粒能够在宿主菌内稳定遗传，应该选用? 式复制的隐蔽质粒。本研究在对多株乳酸菌进行破壁处理后使用t a k a r a 质粒提取试剂盒进行质粒提取，对质粒电泳分析，选定的质粒供体菌，对质粒供体菌进行特性分析，并根据基因工程载体特性和隐蔽质粒的特点选择一个合适的隐蔽质粒，然后用s o u t h e r n 分子杂交试验分析该隐蔽质粒的复制方式，检验是否合适作为载体。具体实验方法：细菌质粒d n a 的提取，质粒d n a 的电泳分析，质粒d n a 电泳带的回收，目标质粒d n a 的酶切，以及s o u t h e r n 分子杂交试验。，在把2 1 株乳酸菌破壁处理后采用t a k a r a 质粒提取试剂盒进行乳酸茵质粒d n a 的提取，得到的质粒进行分析比较，选定包含质粒比较多的菌株l 1 2 作为隐蔽质粒的供体菌进行特性分析。在对l 1 2 中质粒比较后，选择质粒p b l l 0 2 作为目标质粒，用k p ni 、e c o ri 、p s ti 、b a m hi 、s a ci 五种酶对质粒p b l l 0 2 酶切分析并绘制大概的酶切图谱。对质粒p b l l 0 2通过标记探针等处理后进行s o u t h e r n 分子杂交试验，通过杂交结果的图谱确定了质粒p b l l 0 2 的复制方式为? 式复制。关键词：乳酸菌；隐蔽质粒；s o u t h e r n 分子杂交试验；? 式复制r e s e a r c ho fc r y p t i cp l a s m i di nl a c t i ca c i db a c t e r i aa b s t r a c tl a c t i ca c i d b a c t e r i aa r ew i d e l yd i s t r i b u t e di nt h en a t u r e n eg e n u sl a c t o b a c i l l u s l a c t o c o c c u s ，p e d i o c o c c u sa n dl e u c o n o s t o ca r ei n c l u d e db e i n gr e p r e s e n t a t i v e si nt h i sg r o u p t h el a c t i ca c i df e r m e n t a t i o n ，w h i c ht h e s eb a c t e r i ap e r f o r mh a sl o n gb e e nk n o w na n da p p l i e db yt h eh u m a n sf o rm a k i n gd i f f e r e n tf o o d s t u f f s n ew i l ds t r a i n s i nb i o t e c h n o l o g i e a la s p e c ta r ep e r s p e c t i v ea sb a c t e r i o c i np r o d u c e ra n dp r o b i o f i c s t h e yh a v eap o t e n t i a lu s ef o rt h ee s t a b l i s h i n go fn e w , t h es o - c a l l e d “f u n c t i o n a lf o o d s ”w i t ht h er e s e a r c hg o i n gd e e p l y ，w ef i n dt h e r ea r eal o to fi m p o r t a n tp h y s i o l o g i cf u n c t i o nc o n c e r n e dw i t ht h ep l a s m i d si nl a c t i ca c i db a c t e r i a s oi tt h er e s e a r c ha b o u tt h ec r y p t i cp l a s m i d si si m p o r t a n tt oo r g a n i z em o l e c u l a rc l o n i n gs y s t e ma n di m p r o v et h ec h a r a c t e ro fl a c t i ca c i db a c t e r i a n o wt h e r ea r em a n ym o r el a w st oc o n f i n eg e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g y , t h o u g hg e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g yc a l li m p r o v et h ef o o da n dd r u gi n d u s t r y t h eg e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g yn e e dh a v ed e v e l o p m e n ti nf o o d - g r a d e ，b e c a u s et h em o l e c u l a rc l o n i n gs y s t e mo ff o o d - g r a d em u s tm a k ef r o mt h es a n l ek i n do ro r g a n i s mo fg r a sw i t h o u ta n t i b i o t i c s - m a r k t op r e v e n tt h em i g r a t i o no fp l a s m i d st oh a r m f u l - f l o r aw h i c hb ei m p r o v e d ，w ec a nn o tu s ep l a s m i d sw i t hf u n c t i o n a l i t y f o rt h es t a b i l i z a t i o no fp l a s m i d s , w es h o u l dc h o o s e ? - s t y l er e p l i c a t i o np l a s m i d s t h es t u d yi su s i n gt a k a r ap l a s m i d s a b s t r a c t i o nk i tt oa b s t r a c tt h ed n ao fp l a s m i d sa f t e rb r o k et h ec e i l - w a l lo fl a c t i ca c i db a c t e r i a t h e njc h o o s eal a c t i ca c i db a c t e r i aa f t e ra n a l y s i st h ed n ao fp l a s m i d sw i t ht h ee l e e t r o p h o r e g r a ma n dc h o o s eas u i t a b l ec r y p t i cp l a s m i da c c o r d i n gt oa t t r i b u t eo fg e n e t i ce n g i n e e r i n gv e h i c l e l a s tia n a l y s i st h ew a yo fr e p r o d u c t i o no np b l l 0 2b ys o u t h e r nb l u t i n gt ob es u r et h a tt h ew a yo fr e p r o d u c t i o n t h en o v e lm e t h o d si n c l u d e ：a b s t r a c t i o no fd n ao fp l a s m i d si nl a c t i ca c i db a c t e r i a ，a n a l y s i so ft h ee l e c t r o p h o r e g r a mo fd n ao fp l a s m i d s ，r e c o v e r yt h ep l a s m i d ，a n a l y z e dt h ed n ao fp l a s m i d so fc u t t i n go i le n z y m e ，a n a l y s i st h ew a yo fr e p r o d u c t i o no nt h ep l a s m i db ys o u t h e r nb l o t i n g 1a b s t r a c tt h ed n ao fp l a s m i d sa f t e rb r n k i n gt h ec o i l w a l lo f2 1l a c t i ca c i db a c t e r i aw i t ht a k a r ap l a s m i d s a b s t r a c t i o nk i t ，t h e na n a l y s i sa n dc o m p a r i s o n ic h o o s el 1 2t oa n a l y s i s a f t e rc o m p a r i s o nt h ep l a s m i d si nl 1 2c h o o s ep l a s m i dp b l l 0 2 d r a we n z y m e c u ta r i a sa f t e rc u t t i n gp b l l 0 2w i t hj 印hi 、e c o ri 、p s ii 、b a m hl 、s a c1 a n a l y s i sp b l l 0 2u s i n gs o u t h e r nb l o t i n g , t h e nb es u r et h er e p r o d u c t i o no fp l a s m i dw h i c hi s7 k e yw o r d s ：l a c t i ca c i db a c t e r i a ；c r y p t i cp l a s m i d ；s o u t h e r n m o l e c u l a r - h y b r i d i z a t i o n ；? - s t y l er e p l i c a t i o ni ic a n d i d a t e ：c a oq i n g l o n gm a j o r ：f o o ds c i e n c es u p e r v i s o r ：h u og u i c h e n g独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得洼! 翅遗互墓丝益蔓挂型直盟笪：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：苕虚日期：z 一。7 年6 月z 驴日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名彩痧导师签名：日期：渺7 年月z 扩日日期z 彩7 年6 月z 汐日1 1 立题背景乳酸菌在自然界广泛存在，从人、畜、禽肠道到许多食品、物品及少数临床样品中都可分离到乳酸菌。由于绝大多数乳酸菌对人、畜健康的有益特性及其在国民经济中的重要作用，而受到了国内外微生物学工作者的重视。近年来，乳酸菌的应用发展很快，如乳酸发酵食品、药品、饲料等层出不穷。其生物学的研究也逐步深入，随着微生物学的发展，乳酸菌的应用将更加广泛，对人、畜健康有益作用的机理将日益清楚，乳酸菌将成为人类生活和国民经济中的重要微生物类群。细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的遗传成分，它是由环状双链的d n a 组成的遗传物质。质粒d n a 分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，遇到细胞分裂时，就将它的拷贝数准确地分配给每个子细胞。但在一定条件下。质粒又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，通过细胞分裂传递到后代。就分子量大小比较而言，质粒d n a 仅占细胞染色体组的一小部分，一般约为3 左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。正是由于质粒的存在，才赋予寄主细胞具有一些额外的特性。例如对抗生素的抗性就是其中最突出的代表。还有一类质粒，它们不赋予寄主细胞任何表型或者究竟赋予寄主细胞何种表型，迄今仍不清楚，因此特称这类质粒为隐蔽质粒。近1 0 多年来，随着分子生物学理论和技术的迅速发展，特别是作为生物技术里程碑的聚合酶链反应( p c r ) 技术的出现及核酸测序技术的不断完善，产生了许多的基因工程技术使我们可以把乳酸菌向我们有利的方向改变1 2 文献综述乳酸菌是在工业上有重要意义的一类微生物，在轻工、食品、医药及饲料工业等许多行业都具有广泛的应用。从越来越多的相关领域的研究也可以反映出乳酸菌的重要性。最初的研究主要集中在乳酸菌分类学、微生物学、生物化学、基因以及分子生物学等方面，目前主要研究乳酸菌在技术工艺特性，以及在促进健康和临床方面的应用。最近几年在这些领域的研究都取得了很大的进展。而且很多国家的政府和企业已经意识到了乳酸菌的经济意义。欧盟委员会和一些商业机构已经对乳酸菌的长期研究和利用进行了资金投入1 2 1 乳酸菌及质粒的定义乳酸菌( l a b ) 属于革兰氏阳性菌，乳酸细菌是一类能够利用糖产生乳酸的细菌通称，这个名称就细菌分类学而言实属于非正式、非规范的名称，是广义范畴的概念。可能是乳酸菌的名称易于为人们所理解和接受，所以通常被人们所引用。乳酸菌是革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阴性，所需营养复杂的耐酸球菌或杆菌。他们发酵碳水化合物并且主要以乳酸为最终产物。但是这只是对同型发酵的来说的，异型发酵的还会产生其他混合物像乙酸，二氧化碳和酒精。它们不但会增加食品的风味，而且有机酸和一些附加的代谢产物在食品的保藏中起很大作用；低p h 值和细菌素会抑制腐败菌和致病菌的生长，延长食品的货架期，而且乳酸菌的许多特性是由其质粒上的基因编码决定的。乳酸菌载体系统按复制方式的不同可分为两大基本类型：染色体整合载体和自主复制型质粒载体。染色体整合载体即温和噬菌体一些噬菌体感染细菌后，并不使细胞死亡，将其自身的基因组整合进宿主细胞的基因组，这些噬菌体被称为为温和性噬菌体。此时，这种宿主细菌称为溶原性细菌。溶原性细菌内存在的整套噬菌体d n a 基因组称为原噬菌体( p r o p h a g e ) ，溶原性细菌不会产生许多子噬菌体颗粒，也不会裂解；但当条件改变使溶原周期终止时，宿主细胞可能就会因原噬菌体的增殖而裂解死亡，释放出许多子代噬菌体颗粒。而另一类自主复制型质粒载体通常具有较高的拷贝数也就能够实现外源基因的高表达。质粒是存在于原核生物和在一些低等真核生物染色体外的遗传物质、通常双股分子是自主的和独立于染色体复制。质粒的大小变化极大( 从1 5 k b 到超过6 0 0 k b ) ，复制数( 从到数百拷贝每个细胞中) ，并且表现型转给他们的宿主( 0 r s b o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。质粒是独立遗传于细菌的染色体，但是一些质粒的复制和转录要依靠宿主编码的蛋白质。通常质粒不是宿主生长的必需因子，但一些质粒含有使宿主在某种特定环境下生存的基因。它们的表现型一般有：( 1 ) 蛋白质的水解作用，( 2 )碳水化合物、氨基酸和柠檬酸盐的代谢，( 3 ) 细菌素和颜料的生产和( 4 ) 对抗生素、重金属抗性和噬菌体的抗性，这些已经被认为是由质粒编码的( w a n ga n dl e e ，1 9 9 7 ) 。质粒按功能性分为两大类，一类为功能性质粒，一类为隐蔽性质粒。然而乳酸菌中存在的质粒很多都是隐性的，隐性是用来描述那些没有任何表型功能的质粒。隐性质粒一般是小而大量的，还未发现对宿主的表型有影响，从1 到高于l o o k b的质粒在很多l a b 中都无表型特征( v o nw r i g h ta n ds i b a k o v ，1 9 9 8 ) 。对于质粒的最小要求是它的复制能力和由此衍生的功能，而复制子正是隐蔽质粒的最重要地方。复制子是质粒中主要为复制编码转录基因的区域。很少超过3 k b ，它由三个部分组成( 1 ) 复制起始位点( o r i 位点) ；( 2 ) 启动子基因；( 3 ) 编码转录蛋白所需的转录基因( e s p i n o s ae ta 1 2 0 0 0 ) 。复制子主要是允许质粒复制，在宿主中存在和在细胞间转移( b e c ka n d m e y e r ，2 0 0 3 ) 。质粒自主的程度，取决于在不同宿主中复制子的功能性，由质粒对宿主的挑剔性反映。1 2 2 理论依据细胞中能够自我复制的d n a 分子叫复制子。质粒的复制子就是它本身。由于质粒进行自主复制，所以它的拷贝数，是群体质粒的个特征。质粒拷贝数是细菌群体中的平均数，为质粒d n a 的克分子量数，与染色体d n a 克分子量数之比。所以质粒拷贝数的计算式为：c p = d p x m c d c x m p 。式中c p 为每个细胞中质粒拷贝数，d p l ld c 质粒和染色体在凝胶中的含量，m p 是质粒的克分子量，m c 是每个细胞中染色体克2分子量。由于实际质粒拷贝数在平均数上下变动很大，加上操作时d n a 的损失，测定质粒拷贝数时的d n a 可靠性为一2 0 + 2 0 。所以现在一般是在紫外灯下估计质粒d n a 带和染色体带荧光强度之比，来确定质粒的拷贝数。1 3 j质粒d n a 分子至少有一个复制原点或o r i 位点，复制从这里开始。此外质粒必须在这个位点上含有复制蛋白，它是由质粒本身编码的，位于o r i 位点附近。这种蛋白在复制时发挥起始作用。其它需要的蛋白，包括r n a 聚合酶、连接酶、引发酶、螺旋酶等全依赖宿主提供。质粒复制起点叫o r i v ( o r iv e c t o r ) ，多数证据是根据观察复制中的质粒d n a 的电镜照片确定的。d n a 质粒复制方式有三种：t h e t a ( ? ) 、r o l l i n gc i r c l e ( r c r ) 和线型( 1 i n e a r )复制【3j 。现分别讨论如下。t h e t a 式复制要质粒编码的特一些质粒在开始复制时在o r i 位点双链d n a 打开，产生像希腊字母? 的结构，由此得名。这时需要螺旋酶的结合，同时还需殊因子p e p a 和宿主编码的d n a 。d n a 双链的打开暴露了新d n a 合成的模板，r n a 引物开始复制，它以单向或双向沿着质粒前进。为了判断? 式复制是单向还是双向复制，用内切酶的酶切位点，便可知道复制方向了。在单向复制时，单个复制叉沿着分子移动，直至回到原点。然后两个d n a 链分离。双向复制时，两个复制叉从原点区分开，一条链一个方向。当两个复制叉在分子的某一处相遇，就完成了复制。? 式复制在复制过程中产生双链复制中间体而不是单链的这就使得质粒在结构上具有更好的稳定性1 5 1 。近年来，从革兰氏阳性菌，特别是冤霞蔚中发现了大量的? 复制模式质粒的存在如p c d 4 p s r q 9 0 0 ，p j w 5 6 3 等。除少数例外，通过t h e t a 机制复制的质粒在复制过程中都需要一个质粒编码的r e p 复制起始蛋白。有一些复制子在前导链合成前期也需要宿主细胞编码的d n a 聚合酶i 才能完成。r c r 复制r c r 模式复制时，引导链和延迟链合成的启动在时间和空间上都是分离的。复制开始时，复制蛋白将一股d n a 在正链( + ) 起点处切开一个小口，在置换合成期间，形成多个单股中间体，延迟链在负链( 一) 起点合成的启动之后，置换合成，最终转化为双股d n a 分子。这种复制模式命名为滚环式( r c r ，r o i l i n gc i r c l er e p l i c a t i o n ) 复制。线形复制主要是指链酶菌p s l a 2 线形质粒在端粒处的复制，在骝霹菌中并未发现这种复制方式。质粒的不亲和性在进行克隆试验前，一定要考虑到所用载体与其他载体以及宿主内生质粒的兼容性，这就要考虑到质粒的不亲和性( p l a s m i di n c o m p a t i b i l i t y ) 。所谓质粒不亲和性，有时也被称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的质粒，不能在一个宿主细胞系中稳定的共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐排斥( 稀释) 掉。这样的两种质粒叫做不亲和质粒。必须指出“不亲和性”这个术语的使用，是有相当严格的前提条件的。只有在确3实证明第二种质粒a 已经进入含有第一种质粒b 的宿主细胞，而它的d n a 并不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种质粒却不能长期共存，这种情况下才能说a 和b是不亲和质粒。p m b l 的派生质粒( 或c o l e l 派生质粒) ，它们彼此间是互不相容的，这样的质粒属于同一个不亲和群( i n c o m p a t i b i l i t y g r o u p ) 。而彼此能够共存的亲和的质粒则属于不同的不亲和群。由此可见，属于同一不亲和群的质粒在亲缘关系上则比较接近。根据质粒的不亲和性，可将它们分成许多不亲和群。现在，大肠杆菌质粒中至少已鉴别出了3 0 个以上的不亲和群。其中，属于p 、q 和w 的大肠杆菌质粒，被叫作滥交质粒( p r o m i s c u o u sp l a s m i d ) 。因为这种质粒能在许多革兰氏阴性菌中自我转移，并能在不同宿主细胞中稳定存活下去。( 3j 所以潜在着将克隆的d n a 转移到广泛的寄主细胞中稳定的存活下去的危险性。这也是我们以l a b 中质粒构建载体所必须考虑的问题。质粒不亲和性的分子基础，主要是由于他们在复制功能上的相互干扰造成的。因此，如果含有一种p m b l 派生质粒的宿主细胞被另一种p m b l 派生质粒所转化，那么选择出含有第二种质粒的细胞，往往也就失去了第一种质粒。大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度与质粒拷贝数成正比。阻遏蛋白通过其靶序列间的相互作用。使双链d n a 中的一条链断裂从而导致质粒d n a 复制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环( n e g a t i v ef e e d b a c kl o o p ) 。当质粒面临高质粒数和高阻遏蛋白质时，其复制活动便被抑制了；而当质粒处于低拷贝和低浓度阻遏蛋白质的条件下，它的复制反应便会继续进行。根据这种道理，现在我们考虑如果同一个细胞中含有两种相容质粒，那么每种质粒所产生的阻遏蛋白都不会影响另一种质粒的复制。因此两种相容质粒都保持自己的正常拷贝数，而与另一种质粒毫不相关。相反地，如果同一个细胞含有的是两种不相容质粒，那么质粒中编码阻遏蛋白质的基因相似，它们各自产生的阻遏蛋白不仅调节自身复制，而且调节与之共存的不相容质粒的复制。这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒的拷贝数，比其它单独感染状态下的正常拷贝数减少很多。其原因是这种情况下，每一种质粒的复制速率和拷贝数控制，都由一对不相容的阻遏蛋白总浓度联合调控的。但如此还无法解释不相容质粒的分离问题。我们知道，在一个细胞中两种不相容的质粒是组成一个统一的质粒库，而拷贝数控制体系又无法辨别它们，只是随机的从中选择一种典型的进行复制。这样一来，尽管细胞中总拷贝数得到调节，但两种质粒之间的复制数是有所偏差的。因此，经过了几个复制周期和细胞分裂世代之后，不可避免地出现不相容质粒的分离。如果不相容质粒的拷贝数相当，而每一种抑制剂又都能有效地抑制两种质粒地复制，此时不相容性反应也会出现的，因为从两种质粒组成的质粒库随机选择一种质粒进行复制的起始效率不同，而起始效率的不同会导致单细胞中两种质粒起始浓度不等，进而导致细胞中一种质粒浓度占优势，另一种质粒随着遗传代数增加而减小拷贝数，直至消失。当两种不相容质粒拷贝数并不相等，高拷贝数的对复制抑制剂的敏感性要差一些，于是在抑制剂浓度达到可抑制低拷贝质粒复制水平时，高拷4引言贝的质粒仍可继续复制，从而最终使低拷贝质粒从混合细胞中消失。1 2 3 本研究所涉及领域及存在问题虽然通过基因工程技术我们可以对食品和药品工业产生很多正面的影响，但这一趋势在国外却被围绕这种技术产生的相关法律所阻挡。所以嬲霞廖的基因调整，需要食品级别的发展，它的分子克隆系统只允许来自自体移植物或g r a s ( 一般认为安全的，美食品和药物管理局用语) 生物体并且无抗生素标记。食品级基因表达系统一般要求如下：宿主菌为食品级微生物如乳酸乳球菌，乳酸杆菌及双歧朴菌等；采用食品级选择标记，且载体不含非食品级功能性d n a 片段；采用食品级诱导物等i l 。首先，宿主菌要求保证安全，1 9 8 9 年美国食品药品管理局( ( f d a ) 和美国饲料公共协会( a a f c o ) 批准可以作为安全的益生菌菌种4 2 株，其中包括屎肠球菌和粪肠球菌。争议最大的肠球菌，证明在正常情况下是安全的，对于其它的经常被利用的冤霞蔚也仍然是安全的，所以一般的冤露蔚菌株不会存在什么影响到安全性的问题。然后是基因工具的安全性，这也是最主要的问题。( 1 ) 食品级选择标记：根据采用的选择方法还可以把标记系统分为三类：糖利用标记、营养缺陷标记以及编码细菌素抗性或免疫性的标记。糖类利用标记糖利用标记既有显性标记也有互补标记。因为冤霞蔚能够利用多种糖类。所以糖利用标记非常重要。木糖、菊糖和蔗糖3 种糖作为标记的为显性标记，有些冤霞茵不能发酵这3 种糖所以可以将发酵糖的基因导人与这些基因没有任何同源性的非发酵宿主中 1 q 。营养缺陷型标记营养缺陷型标记是建立在t r n a 一直基因基础上的。d i c k l e y 等 ”l 构建了一个乳酸乳球菌的食品级表达载体p f g l 。此载体由乳酸乳球菌一个质粒最小复制子、赭石突变抑制基因s u p b 和一段人工合成的多克隆位点。当宿主菌为赭石突变株时，s u p b 就可以作为选择性标记。细菌素抗性或免疫性标记在细菌素中对乳链菌肽的研究最为深入。与其他的细菌素不同乳链菌肽在5 0 多个国家中被认可用作食品防腐剂。因此可以利用乳链菌肽抗性作为食品级的筛选标记t a k a l a 13 】等 6 1 就构建了一个以乳链菌肽抗性基因作为筛选标记的食品级克隆载体p l e b 5 9 0 。( 2 ) 非食品级功能性d n a 片段，是指一些抗性蛋白质的编码片断，由于质粒的迁移性很容易迁移到肠道中的无益菌体中，有使致病菌获得以前不具备的抗性的可能，所以对于功能型质粒而言是不太适合作为食品级基因载体的，因而隐蔽型质粒现在成为食品级分子载体的首选。然而隐蔽型质粒一般都是滚环式复制方式，滚环式复制方式在复制时会产生单链的d n a ，而单链的d n a 在细胞分裂时会导致细胞内的质粒数不稳定，可能会导致质粒的消失，具有遗传不稳定性。51 3 国内外研究进展1 3 ，1 传统的乳酸菌菌种改良方法驯化培养采用适当的细菌培养方法和特定的培养条件，对目的菌株进行驯化培养，以筛选出较优良的更适合生产的菌株。如双歧杆菌为严格厌氧菌，对氧特别敏感，如果未经驯化，则存在需厌氧生产设备、发酵时间长、不耐酸、接触空气容易死亡从而影响产品质量等不足。刘吉成等对厌氧性双歧杆菌经生长条件诱导进行耐氧、耐酸、耐和凝固驯化，筛选出一株耐氧、耐热和耐酸性的菌株，并且凝乳时间由驯化前的5 6h 缩短为1 2h ，但生理学鉴定与驯化前菌株一致，未发生变异。驯化后菌种减少了发酵时间，简化了发酵工艺及设备，降低了生产成本。诱导突变突变是一种常用的育种手段，具有速度快、收效大、简便易行等优点。按诱变剂不同分为化学诱变、辐射诱变等几种类型。鲍行豪等以原生产菌株青春型双歧杆菌为出发菌，进行”c o 辐射诱导，筛选出两个优良菌株，在液体培养物中存活时间与存活率均较原菌株有非常显著的提高。i b r a h i m 等用m n n g 和乙甲基硫磺酸盐对双歧杆菌、乳杆菌进行化学诱导，结果是目的菌株b 一半乳糖苷酶表达活性上升了7 0 2 2 2 ，有利于提高其对乳糖吸收不良病人的活治疗价值。3 原生质体融合原生质体融合是通过人为方法，使遗传性状不同的两个亲株细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组已获得兼具两个亲本优良性状的遗传性稳定的融合子的过程。由于该技术具有基因重组频率高、重组类型多、可克服种属间杂交的“不育性”进行远缘杂交等优点，因此，在乳酸菌菌种改良中得到广泛的应用。黄用等采用p e g 介导的化学融合法对双歧杆菌和酿酒酵母进行原生质体融合，成功地筛选到两株兼具双亲遗传特性的融合菌株；采用细胞融合仪成功实现了保加利亚乳杆菌与双歧杆菌原生质体的融合。1 3 2 乳酸菌质粒的提取研究质粒性状首先的工作是质粒的分离。但由于冤露菌是革兰氏阳性菌，细胞壁具有较厚、肽聚糖含量较高以及分子交联度比较紧密的特点，同时质粒大小差异较大，大质粒在提取过程中易断裂，且拷贝数低，细胞裂解也有一定困难，所以一般质粒提取方法对入冤蓐蔚质粒的提取不是很有效。1 9 8 3 年，a n d e r s o n 和m ck a y 首次提出了一种适用于提取乳酸球菌大小质粒的方法，采用了合适的生长和裂解条件，并将碱变性和热变性结合使用，成功地从乳酸链球菌中提取到了多个质粒，取得了较好的效果。乳杆菌质粒的研究工作开展的则比较晚，1 9 8 4 年，k l a e n h a m m e r 提出了提取乳杆菌质粒的一般方法，发现乳杆菌在质粒组成上差异也较大，许多菌株无质粒或很少质粒，而嗜酸乳杆菌的一些菌株却含大量质粒。1 9 9 3 年，r e i n k e m e i e r 分别6利用机械法和酶解法处理细胞壁，对于多株乳酸杆菌质粒进行了提取，结果表明机械法在质粒提取中更具有高效性、快速性和可重复性的特点。质粒大小测定的方法很多，9 8 0 年，i s h i w a 等利用电子显微镜精确地测出了发酵乳杆菌质粒的分子量。1 9 8 1年，s c h u f f e r 根据质粒在琼脂糖凝胶电泳时的迁移速度，测算其大小，凝胶电泳法更为方便实用1 3 3 乳酸菌质粒的功能早在2 0 世纪七十年代m c k a y 及其同事就提供证据证明了l a c t o c o c c u s l a c t i s ( 乳酸乳球菌，当时为n 组链球菌) 的许多代谢特性是乳球菌所固有的且不稳定，这与其所含的大量丰富的质粒d n a 相关，比如：乳糖分解代谢、蛋白酶产生、柠檬酸吸收、噬菌体抗性、细菌素产生、多糖的生物合成、细菌素产生、金属离子抗性或敏感性、抗生素抗性、热协迫反应等遗传性状皆由质粒编码。改良现有的生产菌株和筛选新的优良菌株通过对乳酸菌质粒编码特性的研究，构建合适的质粒载体，通过转导、结合、电击转化等分子生物学手段将其转移到生产菌株中，使目的基因得以表达。利用这种方法，人们已经实现了对一些生产菌株的改良。例如，噬菌体感染发酵菌种是困扰发酵工业的一大难题。研究发现，乳酸菌的些质粒编码有抗噬菌体的基因。1 9 8 6 年，s a n d e r s 等分离和鉴定出编码特定的噬菌体抗性的片段，并将其转移到生产菌株中，成功地构建了具有多种噬菌体抗性的菌株。在美国，这种菌株已被用于奶酪的工业化生产，大大降低了生产中的损失。另外，用编码抗噬菌体和抗n i s i n 的结合质粒p n p 4 0 导a , l a c t o c o c c u sl a c t i ss u bs pl a c t i s 4 2 5 a 生产菌株后，通过噬菌体和n i s i n 检测，发现重组体既抗噬菌体，也抗n i s i n 。这种重组菌具有更大的适用价值。乳酸菌被广泛应用于很多乳制品发酵中以快速产酸，执行此作用的能力与微生物发酵乳糖的能力和需要来自于酪蛋白的必需氮源相关。长期以来已知乳球菌在牛奶中经系列转接后蛋白水解力减弱，归因于蛋白水解表型从p r t + 变成p r t 一，连续培养物经过延长培养不可逆地丢失了蛋白水解活力。乳球菌中乳糖代谢和蛋白酶活性的不稳定性得到很好的证明，这2 个特性的丢失出现得很频繁且不可逆，暗示负责这些功能的基因是由质粒控制的。通过转导进行遗传分析了c 2 中乳糖代谢和蛋白酶活性皆与3 0 m d a l 的质粒相关联这一结论。蛋白酶活性可能是由质粒携带的且与乳糖发酵能力相独立，但随后也发现蛋白酶活力不稳定，极易丢失且是不可逆的。蛋白酶缺陷型突变菌一直是自发产生的，其产生的频率高达( 1 一3 ) ，受温度及吖啶黄的影响且突变为不可逆。乳酸菌可以产生多种细菌素，目前报道有4 0 余种。研究表明，许多乳酸菌细菌素的产生由质粒编码。现己通过分子生物学手段，将细菌素结构基因克隆到生产菌株中，不仅使生产菌株获得了产生细菌素的能力，而且为人工大量合成细菌素提供了可能。近几年，活菌钊剂产品越来越受到人们的关注。在对益生菌进行筛选时，菌株携带的质粒特性的研究也越来越受到重视。研究发现，细菌耐药性的产生有两种类型：一种为染色体介导或突变产生的耐药性，一般发生率很低：另一种为质粒介导的耐药性，也是最为常见的一种方式。如果菌株的耐药性是由质粒或转座子编码，7当其用于活菌制剂时，耐药性因子将有可能在菌群中相互传递而发生扩散。如果某些致病菌或条件致病菌获得某一种或几种耐药因子，抗生素对患者将无法奏效，后果不堪设想。通过对乳酸菌质粒的研究，选择没有或含有尽可能少的可转移耐药因子的乳酸菌作为发酵食品和活菌制剂的菌株。另外，还可以应用生物技术去除生产菌株的耐药质粒。从而保证食品用乳酸菌和活菌制剂中菌株的使用安全。1 3 4 质粒消除质粒是在细菌细胞内普遍存在的共价闭合环状的小型d n a 分子，质粒作为独立于染色体的遗传物质，能够独立自地复制，从而赋予宿主菌株以特定的表型或性状。细菌的某些表型特征，包括抗性、代谢能力、致病性、共生现象、接合转移等往往由质粒控制11 。对质粒进行遗传学研究时，研究人员常希望得到其消除质粒的衍生菌株，以便两者比较观察质粒的遗传功能。某些质粒可自发的从细胞中丢失，但大多数质粒在细胞内很稳定。要想获得消除质粒的菌株，需要使用合适的物理或化学方法干扰质粒复制、或降低质粒的稳定性，人为地提高质粒丢失的频率【2 】，以达到质粒消除的目的。由于结构及生理上的独特性，不同菌株的质粒消除机制各不相同，到目前为止，尚没有普遍适用的质粒消除方法。但不同研究者使用不同的方法。对某些具体菌株或质粒的消除已获得满意的结果，以下是常见质粒消除方法的适用范围及效果。1 3 4 1 利用消除剂对细菌质粒的消除嵌合染料( i n t e r c a l a t i n gd y e s )嵌合染料包括吖啶黄( a c r i f l a v i n e ) 、吖啶橙( a c r i d i n eo r a n g e ，a o ) 、溴化乙锭( e t h i d i u m b r o m i d e ，e b ) 、喹吖因( q u i n a c r i n e ) 等，这些染料都可用作质粒消除剂( c u r i n ga g e n t ) 。嵌合染料能够消除质粒，它的作用机理是选择性地抑制质粒的复制。s i n g hm 等31 用a o 消除e c o l ik 1 2j 5 3 中的质粒r 2 7 、r p 4 、r 1 及p b r 3 2 2 ，每种质粒的消除率均不同，并随着a o 浓度的增加而提高。对于质粒r 2 7 来说，a o最有效浓度为3 0 0ug m l ，而r 1 、p b r 3 2 2 最有效浓度均为2 0 0 pg m l ，而r p 4 的最有效浓度达到了4 0 0 i tg m l 。质粒r 2 7 最高消除率为4 1 1 2 ，r 1 为3 5 ，p b r 3 2 2 为1 6 1 5 ，r p 4 为1 0 。当e c o l i k l 2j 5 3 处于指数生长期时，a o 作用效果最佳，细胞处于其它生长阶段或a o 过量，质粒消除率极低或根本无效。除吖啶类物质外，e b 也被广泛用于细菌质粒的消除。b o u a n c h a u d 等【4 】用e b以较高的频率消除了肠细菌( e n t e r o b a c t e r i a ) 和葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c i ) 中带有抗生素抗性的质粒，实验结果的可重复性也优于吖啶类物质。除上述菌株之外，嵌合染料还能消除真养产碱菌( a l c a l i 2 9 e n e se u t r o p h u s ) 、丁香假单胞菌( p s e u d o m o n a ss y r i n g a e ) 、深红红螺菌( r h o d o s p i r i l l u mr u b r u m ) 中的各种质粒。但是某些根瘤菌( r h i z o b i u ms p p ) 及农杆菌( a g r o b a c t e r i u ms p p ) 中的大质粒( 3 7 0 k b ) 则难以用8引言嵌合染料消除。香豆霉素( c o u m e r m y c i n ) 及新生霉素( n o v o b i o c i n )香豆霉素及新生霉素是d n a 解旋酶( d n a g r y a s e ) 的抑制剂。d n a 解旋酶能够使得完成了复制的两个子代环状双链d n a 互相分开。因此，当d n a 解旋酶被抑制的时候，质粒d n a 复制中间物就会大量积累，从而不能产生子代d n a 。低浓度的香豆霉素就可有效地消除e l c o l ik 1 2 中的质粒p b r 3 2 2 ，p m b 9 51 。此外用浓度为1 7 pg m l 的香豆霉素还可消除e l c o l ik 1 2 c 6 0 0 中的c o l e l 质粒，当香豆霉素浓度为5ug m l 时，效果最佳并且细胞存活率最高。利福平fr i f a m p i c i n )利福平能直接与细胞中的r n a 聚合酶结合并抑制其活性。j o h n s t o n 等【6 】研究了用利福平消除金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c ia u r e u s ) 中的质粒c o r a l ，c o r a l 编码青霉素抗性、镉离子抗性及红霉素抗性基因。当初始细胞量为1 0 5 m l ，利福平浓度为0 1 0 1ug m l 时，质粒消除效果最佳，对青霉素敏感的菌落同时也失去了对镉离子及红霉素的抗性，表明整个c o m i 质粒已被消除。该作者还做出推论，即由于利福平对细菌生长及质粒维持( p l a s m i dm a i n t e n c e ) 的作用不同，s a u r u s 中质粒的复制及分离也许与某个专一r n a 聚合酶有关，不久此推论即得到其他人的证实【7 】。如果没有这种专一性的r n a 聚合酶存在，那么对利福平有抗性的细菌，不宜用利福平作为质粒消除剂。丝裂霉素c ( m i t o m y c i nc )丝裂霉素c 能抑制菌体的代谢活动，其自身被还原为相应的氢醌( h y d r o q u i n o n e )并进一步生成有活性的，能对嘌吟碱基进行亲核攻击的中间反应物，使d n a 双链产生交联，阻止了r n a 的转录。r h e i n w a l d 等【8 】用丝裂霉素c 成功地消除了恶臭假单胞菌( p s e u d c o m o n a sp u t i d a ) 中编码氧化茨酮( c a m p h o r ，c a m ) 基因的质粒。用含有亚致死浓度丝裂霉素c 的l b 培养液培养细胞4 8 h ，分离单菌落，将其转移至基本培养基或含d 2 茨酮平板，鉴定质粒消除的菌落，结果表明质粒的消除率达2 3 。丝裂霉素c 既是d n a 合成的阻遏物叉是诱变剂，其有效浓度和致死浓度随菌株的不同而有很大变化，原因之一就在于细胞膜对其通透性的差异。因此，在使用丝裂霉素c 时，同时使用表面活性剂改变膜的通透性，能改善丝裂霉素c 的使用效果。在假单胞菌属的质粒消除中使用丝裂霉素c 的报道较多，很少有消除其它菌属质粒的报道。另外丝裂霉素c 的价格昂贵，对其应用有所限制。十二烷基硫酸钠fs o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，s d s )细菌染色体d n a 与质粒d n a 的一个共同特点是它们均附着于细胞膜上进行复制。s d s 是一种离子型表面活性剂，在合适的浓度下它能溶解膜蛋白，破坏细胞膜，s d s 可