（物理电子学专业论文）线性阵列电极电控生物芯片及其控制系统的研制.pdf

摘要 基于线性阵列电极的电控生物芯片( e l e c t r i c c o n t r o lb i o c h i pb a s e do i l l i n e a r a r r a y e de l e c t r o d e ，l e e cb i o c h i p ) 属于微全分析系统的一种，可对多种微 流体及生物分子电控操作，是一种集进样、分离、检测、智能操控等功能于一体的生 化分析平台，具有微型化、集成化、便携化及操作自动化的特点。 近年研究表明，在生物芯片上集成特定结构的电极阵列，用电学方法可以精确操 控微流体及生物分子的行为，本论文从生化分析的电控机理出发，研制了l e e c 芯片及 其控制系统。研究内容包括线性分布式电极阵列的理论设计，以普通载波片和有机高 聚物p d m s ( p o l y d i m e t h y l s i l o x a n e ) 为基本材料的芯片制作工艺，l e e c 芯片和p c 8 板 的连接方式，硬件控制系统的设计以及控制芯片工作的单片机程序编制等，此外还包 括电化学检测方法的研究。 硬件系统以c 8 0 5 1 f 0 2 0 为控制核心，设计了一种i o 网络组合控制电路来控制5 4 根p t 电极，在三态( 高压、接地、悬空) 之间的任意转换。其中a d 器件, - i p a 采集温 度、电压信号，键盘、液晶等人机交互接口便于人工操作。整个系统设计体现了高度 集成、低功耗、高扩展性以及自动操控等特点。 最后用自行研制的l e e c 芯片进行了测试和初步的d n a 分离实验，证明系统在兼容 性、控制时序方面运行正常，与芯片能良好衔接，新型芯片能成功分离d n a 片段，并 总结了一套较为成熟的实验方法。 关键词：微全分析系统，生物芯片，电控，线性阵列电极，单片机 r e s e a r c ho i le l e c t r i c c o n t r o lb i o c h i pb a s e do i ll i n e a r - a r r a y e d e l e c t r o d e c h e n c h a o ( p h y s i c a le l e c t r o n i c s ) d i r e c t e db yp r o z h a oz h a n a b s t r a c t e l e c t r i c c o n t r 0 1b i o c h i pb a s e do n l i n e a r - a r r a y e de l e c t r o d e ( l e e cb i o c h i p ) a so n e 妊n d o f p t a s ( m i e r o t o t a l a n a l y s i ss y s t e m s ) c a nc o n t r o le l e c t r i c a l l ym i c m f l u i d a n db i o c h e m i c a l m o l e c u l e sa n d ，i sai n t e g r a f i v ep l a t f o r mf o rb i o c h e m i c a la n a l y s i s ，w h i c hi si n t e g r a t e d m u l t i p l ef u n c t i o n ss u c h a si n j e c t i o n ，s e p a r a t i o n ，d e t e c t i o na n da u t o m a t i co p e r a t i o ne t c a n e w m e t h o d o f e l e c t r i c c o n t r o l f o r o p e r a t i n g m i c m f h i d a n d b i o c h e m i c a l m o l e c u l e s a c c u r a t e l y h a sb e e n r e p r e s e n t e d i nm a n yr e c e n ts c i e n t i f i cr e s e a r c h e s a r r a y e de l e c t r o d e s i n t e g r a t e do nm i c r o c h i p ，a sag o o dm e t h o d t og e n e r i ce l e c t r i cf i e l d ，h a v eb e e nu s e d w i d e l y a n ds o ，w ed e v e l o p e dal e e c b i o c h i pa n d ac o n t r o ls y s t e mf o ri t m y d i s s e r t a t i o ni n c l u d e st h e o r e t i e a ld e s i g no f l i n e a r - a r r a y e de l e c t r o d e sa n d ，t h e p r o c e d u r eo f m i c r o f a b r i c a t i n gm i c m f l u i d i cc h a n n e lb yu s i n g a l le l a s t o m e r i cm a t e r i a l s p d m s a sar e s u l t d i f f e r e n tt y p eo f p d m s - g l a s sl e e c c h i pw a sd e s i g n e da n dp r o d u c e d t h el e e c b i o e h i p c a r lb ec o n n e c t e dw i t hp c b ( p r i n t e dc i r c u i tb o a r d ) t h u si tc a l lg e n e r a t ea m o v i n g e l e c t r i cf i e l db y c h a n g i n gt i m e ，s c o p ea n d f i e l di n t e n s i t y d i s e r e t i o n a r i l y u n d e r s i n g l e c h i pp r o c e s s o r sc o n t r 0 1 m e a n w h i l e i ti sp r o b a b l et or e d u c e d r i v i n g v o l t a g ea n d d e c r e a s e t e m p e r a t u r eg r e a t l y a n d s oi n c r e a s er e s o l u t i o no f d n a s e p a r a t i o n t h ec o n t r 0 1k e r n e lo f t h e s y s t e m i sm i c r o p r o c e s s o rc 8 0 5 1 f 0 2 0a n d 。5 4p a r a l l e lp o r t sf o r c o n n e c t i n gh i g hv o l t a g es y s t e m h a v eb e e n e x p a n d e d a n e wn e t w o r kc i r c u i tf o ri oc o n t r o l w a sd e s i g n e dt oc o n t r o l5 4p te l e c t r o d e st os w i t c hd i s c r e t i o n a r i l yi n3s t a t e s h i g h v o l t a g e g r o u n d i n g a n d s u s p e n d i n g t h e n e w s y s t e m h a st h ec h a r a c t e r i s t i co f h i 曲i n t e g r a t i o n ，l o w p o w e rc o n s u m p t i o n a n d h i s he x p a n s i b i l i t ya n d ，i sag o o de x a m p l eo fe x t e n d i n gl a r g e n u m b e r s o f p a r a l l e lp o r t s t oc o n t r o lh i g hv o l t a g ea p p a r a t u sf l e x i b l y w eh a v eb e e ns u c c e e d e di na p r i m a r ye x p e r i m e n t o f s e p a r a t i n gd s - d n a l a d d e r1 0 0 u s i n g t h en e wl e e c b i o c h i p t h ee x p e r i m e n td e m o n s t r a t e d t h a tt h en e wl e e c b i o c h i pc a n s e p a r a t ed n af r a g m e n t ss u c c e s s f u l l y a n d 血ew h o l ec o n t r o ls y s t e mw o r k e dn o r m a l l y b e c a u s eo f i t sg o o dc o m p a t i b i l i t ya n dt i m i n gc o n t r o l l a b i l i t y k e y w o r d s ：ut a s ，b i o c h i p ，e l e c t r i cc o n t r o l ，l i n e a r a r r a y e d e l e c t r o d e s i n g l e c h i pp r o c e s s o r “ 第1 章前言 第1 章前言 生物芯片技术主要是指通过微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元 和诊断系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分的准确、快速、大信息 量的检测和疾病的诊断，杂交反应和电泳分离是分子生物学检测中的两种常用手段。 生物芯片分为很多种，如诊断芯片、d n a 杂交反应芯片、电子芯片、毛细管电泳芯 片、微阵列芯片，还有近年来兴起的微全分析芯片。 微分析芯片是微全分析系统ut a s ( m i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s ) 将从样品制 备、分离、化学反应到检测的整个分析过程集成缩微到芯片上的结果，又称之为缩微 芯片实验室( 1 a b o r l c h i p ) 。 1 1 生物芯片的基本介绍 诊断芯片是微机械加工工艺发展后的产物。它是将常规的检验步骤和试剂集成在 小小的芯片上，用计算机来控制检验并报告结果。它不仅用于诊断疾病，还可用于保 健监测。诊断芯片不仅可在医院里用于快速诊断，还会进入千家万户成为大众日常健 康和疾病监控的有效手段。 d n a 芯片是通过核酸分子杂交原理进行酸序列分析的，芯片上已知序列的核酸探针 通过碱基配对来检测分析未知序列，即杂产测序( s b h ) 。由于光刻技术具有非常高的 分辨率，可以在硅片上按设计要求合成出高密度的寡核苷酸探针阵陈，这个探针阵列 由一定长度的寡核苷酸的所有可能序列组成，而且探针阵列中每一位置的寡苷酸的序 列都是已知的，将标记过的待分析序列与芯片上的探针阵列进行杂交，严格探控制反 应条件，那么与靶序列完全互补的探针显示最强的杂交信号，利用高分辨率检测装置 检测杂交信号，经过计算机分析处理，即可检测出所有的与靶序列完全的序列，进而 确定等测序列。目前最常用的检测系统是用荧光素标记靶序列，杂交后用激光共聚焦 扫描系统检测。 电子芯片是由美国n a n o g e n 公司开发的，目前国内清华大学和复旦大学也在开发 第1 章前言 这一技术。这种芯片为带有阳电荷的硅芯片、芯片经热氧化，制成l m m 1 m 的阵列、 每个阵列含有多个微电极，在每个电极上通过氧化硅沉积和刻蚀出样品池。将连续链 亲和素的琼脂糖覆盖在电上，在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上， r o n a l dg s o s n o w s k i “1 等人采用微电子工艺，在基片上构建了2 5 个半径4 0um 的 p t s i 。心电极( 图1 1 ) ，在电场作用下，生物素标记的探针被转运到特定的电极上与 目的片段杂交，达到了能检测单碱基错配的分辨率，这种杂交不仅反应速度快，通过 改变电场强度还可控制分子结合的强度，更重要的是，可在此类芯片上直接制备杂交 样品，克服了规常分子微阵列芯片的制样困难。电子芯片最大特点是杂交速度快，可 大缩短分析时间。制备复杂、成本高是其不足。 图1 1 阵列电极d n a 杂交反映芯片 在生物、化学、材料等科学实验中，经常需要对流体进行操作，如样品dna 的 制备、pcr 反应、电泳检测等操作都是在液相环境中进行。如果要将样品制备、生 化反应、结果检测等步骤集成到生物芯片上，则实验所用流体的量就从毫升、微升级 降至纳升或皮升级，这时功能强大的微流体装置就显得必不可少了。因此随着生物芯 片技术的发展，微流体技术作为生物芯片的一项关键支撑技术也得到了人们越来越多 的关注。 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc e ) 作为一种微流体分析设备，对于 dna 测序、司法鉴定、pcr 产物分析来说是一个强有力的手段。与平板凝胶电泳 相比，毛细管电泳能更快速、更准确地分离dna 片段，这是因为可以在毛细管两端 加上更高的电压。毛细管电泳的缺点是一次只能分析一个样品，毛细管微阵列电泳将 第1 章前言 平板凝胶电泳和毛细管电泳两种方法的优点结合起来，在毛细管微阵列上并行地进行 电泳，它能增大电泳泳道数目、提高电泳速度，是一种有着巨大应用前景的方法。 电泳芯片具有广泛的应用前景，表1 1 对它的应用领域和实际的应用情况进行了 总结。 表1 1 电泳芯片的应用 电泳芯片的应用领域 实际应用 基因、蛋白质研究快速高通量测序、d n a 指纹识别、法医学应用、 基因表达分析等 化学、生物战防御病原体、毒素的检测和确认、早期诊断、治疗类 选法等 临床分析对血液和体液进行快速分析、根据棉衣、酶分析 的结果进行及时诊断、电化学检测、细胞技术等 高通量药物筛选药物的并行反应和分析、毒理分析等 环境检测 原位环境污染分析 植入式器件用于活体药物输送、以及活体疾病状况监测等 作为化学或生物化学研究的的实验工并行反应、分析用生物样品的纯化、p c r 、r t p c r 具( 如微量有机合成、样品制各、核 反应等 酸序列放大等) 作为进行基础研究的平台( 如研究流 研究微流道内电渗和拉曼流特性、研究酶底物的 体特性、研究化学反应进程、仿生研 扩散特性、开发具有生物功能的器件、单分子检 究或研究微量样品等)测等 在毛细管电泳的基础上，近几年发展出集成度更高的集成毛细管电泳技术。集成 毛细管电泳技术是在硅、玻璃、塑料等基体上刻蚀出毛细管槽，用盖板封闭好后，在 毛细管中填入媒体，使电泳分离的整个过程集成到块几平方厘米的基片上，构成一 个微全分析系统，称为微全分析芯片，具有以下优点： 1 )分析所需的样品量大大减少( 皮升) ，分析质量大大提高。分离效率和分析速度是 常规毛细管电泳仪的几十倍。 第l 章前言 2 )只需极少量的昂贵检测试剂，从而极大地降低了成本。 3 )电渗泵技术的采用实现了快速、连续、一体化的注样和分离。 4 )高灵敏度的激光诱导荧光检测技术使得样品的分析极限和理论塔板数大大提高。 5 )利用如激光诱导荧光、电化学、化学发光、质谱等检测器的集成或连用实现更为 灵敏的一维或多维测定及更为广泛的应用。 6 )仪器成本低，有很强的市场竞争力。( 目前市场所售的p c r 加上电泳分离装置大约 售价为3 0 0 ，0 0 0 美元。而新制的具有相同功能的微型系统估约为数千美元) 。 可以预见，2 1 世纪生物芯片的发展趋势是实现大幅度降低污染、提高产量、样品 与试剂低耗的同时，又要实现设备便携化、系统集成化、操作自动化、数据获取和分 析智能化。集成微缩芯片型的微全分析系统是一个必然的发展方向。 1 2 微全分析系统的基本概念 在1 0 一l o o p m 宽的沟道系统中对流体或气体进行操控的技术被称为微流控技术， 以微流控技术为核心、通过m e m s 技术加工出的、应用于生物、化学、生物医学等领 域的芯片型微全分析系统被称为微全分析芯片。 c 2 ；l | r r i e r c a r r i e r s a n ；? r 拈c n ，i o rp u r p pl n ，譬l i 、? 微型化学分析系统概念示意图 图1 2 微全分析系统概念示意图 图1 2 显示了微全分析系统的概念图。似芏万优系现j 竹刀”心门a 司j f 心- h - 片式两 4 第1 章前言 类。芯片式微全分析系统是目前的发展重点，依据芯片结构及工作机理可分为两大类： 微阵列芯片( m i c r o a r r a yc h i p ) 和微全分析芯片( m i c r o f l u i d i cc h i p ) 。微阵列芯 片是在面积不大的基片表面上有序的点阵上排列了一系列固定于一定位置的可寻址 的识别分子，主要以亲和结合技术为核心。其特点是使用方便，测定快速，通常是一 次性使用，有很强的专用性。这类芯片在前几年发展较快，在国外已实现产业化，已 有数百家企业在生产这种芯片。 另类芯片，即微全分析芯片，是在基片上使用微加工技术加工出l o - l o o p m 宽 的微沟道系统网络，主要以分析化学和分析生物化学为基础，以微机电加工技术 ( m e m s ) 为主要制作技术，是当前微全分析系统发展的重点。其优点在于把分析化学 实验室的各种功能如采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上，实 现便携化、智能性的操作，可多次使用，具有更广泛的适用性。 微全分析芯片使珍贵的生物试剂消耗大大降低到微升甚至纳升级，同时分析速度 成倍地提高，费用大大下降，从而为分析测试技术普及到千家万户创造了条件。该技 术除涉及到大量的微加工技术和芯片材料的知识外，还涉及到广泛的基础理论知识和 应用技术，例如微米通道中的传质、导热、吸附及微区反应规律等。这些都对相关的 研究提出了挑战。 1 3 微全分析芯片的设计 在微全分析芯片的设计方面已经取得显著的进步，计算机辅助设计( c a d ) 工具的 使用使得芯片的设计更容易更科学。严谨的设计使得微全分析芯片能够完成在片反应 和多通道分离等复杂功能。在过去的几年当中，涌现了许多不同结构，能行使不同功 能的微全分析芯片，图1 3 给出了一些芯片的结构设计图。 图1 3 a 表示含有两个交叉通道和四个用于样品，废液，阳极和阴极的贮液池的微 芯片。3 。通过引入u 型回弯沟道可以大大的增加分离通道的长度；为了更进一步的扩展 分离路线长度，还设计出了一种叫做同步循环( s c c e ) 的毛细管电泳微芯片：它的通 道形成一个循环，并带有两对相连的电极。在两对电极之间切换电压使得分离物在环 状通路内循环迁移，这样可以增加分离路线长度，如图1 3 b 所示；r i c h a r db m s c h a s f o o r t 等人研究了在微结构中利用电场效应控制的流动系统网络，实现了利用电 第1 章前言 场的作用控制样品的流动，起到了宏尺度中的阀门和泵的功能。1 ，如图1 3 c 。其它的 还有在芯片上建构长方形通道，通过样品毛细管注入样品“1 、能进行自由溶液毛细管电 泳芯片的设计等“1 。 图1 3 一些微全分析芯片的结构设计图 为了同时分析大量样品，可以在微全分析芯片上设计出分离通道阵列。多通道的 微全分析芯片在设计上要考虑到各种因素，如芯片的几何形状受到底片尺寸、检测方 第1 章前言 法的限制，样品池和废液池要占据一定的空间，形状的设计应与进样设备匹配，还有 一个限制是所有的通道必须有相同的几何形状，并且从阳极到阴极，从进样区到检测 器的距离要相等。图1 3 d 是用来测定基因型的多通道微全分析芯片，这个微芯片使 用4 8 个平行的分离通道，它能在八分钟内分离两组样品( 每组有4 8 个，共9 6 个样 品) 。最近，由9 6 个放射型的分离通道组成的微全分析芯片也已被设计出来，用来 进行d n a 测序【g 】。 w a t e r s 等人加工出了一种微全分析芯片，将四个p e r 小室分别与毛细管电泳通道 相连，可以同时或依次地分析聚合酶链式反应产物。芯片结构如图1 3 e 所示 9 1 ；b u r n s 等人报道了一种高度集成的微全分析芯片系统，它集成了微流体控制、流量监铡、带 有加热装置和温控传感器的p c r 反应室、有内置电极的凝胶电泳通道、进行荧光检测 的光电探测器等组件，系统结构如图1 3 f 所剥1 0 l ； s c h a s f o o r t 等人设计了一种微 全分析芯片，通过对4 0 0 n m 长的微流道壁施加1 5 m v c m 的轴向电场来控制电渗流的 方向1 。 1 4 微全分析芯片的制作工艺 玻璃由于具有出色的光学特性，良好的表面特征，以及成熟的微加工技术，而成 为常用的微全分析芯片材料。玻璃材料微全分析芯片的微加工技术以光刻技术为基础 是用光刻的方法在玻璃基底刻蚀出微管道系统，整套技术已经很成熟。 使用玻璃、硅基材料有一个明显的劣势就是加工成本过高，尤其在加工用于d n a 测序和并行药物筛选等面积较大( 约l o o e m 2 ) 的微流控器件的时候表现得更为明显。 使用聚合材料加工微全分析芯片则具有很大的成本优势，这一点对于强调“一次性使 用”的分析应用领域( 这方面的应用要绝对避免交叉污染) 是非常重要的。 塑性微全分析芯片的加工方法包括激光消融法( 1 a s e ra b l a t i o n ) ，铸模法 ( m o l d i n g ) 等。常用的加工塑性微全分析芯片的材料有聚碳酸酯p o l y c a r b o n a t e 、聚 甲基丙烯酸甲酯p o l y ( m e t h y lm e t h a c r y l a t e ) ( p m m a ) 、聚苯乙烯p o l y s t y r e n e 、硝化 纤维 n i t r o c e l l u l o s e 、聚乙烯p o l y ( e t h y l e n e ) 、聚四氟乙烯 p o l y ( t e t r a f l u o r o e t h y l e n e ) ( t e f l o n ) 、聚二甲基硅氧烷p o l y ( d i m e t h y l s i l o x a n e ) ( p d m s ) 等。一般加工塑性微全分析芯片的流程是利用传统的光刻工艺；o n - e 微全分析 第1 章前言 芯片的模具，然后用铸模法得到沟道未封闭的微全分析芯片，最后进行封装得到微全 分析芯片。 最近，许多种聚合物被用来加工微全分析芯片，由于聚合物芯片的成本较低，使 用简单，受到广泛的关注，尤其是p d m s 材料加工微全分析芯片，如软印法、三明治法 ( m e m b r a n es a n d w i c h ) 和固体铸模机打印法( s o l i d - o b j e c tp r i n t i n g ) 等。如图1 4 是利用固体铸模机打印法加工p d m s 微全分析芯片过程示意图。 图1 4 固体打印法加工p d m s 微全分析芯片过程示意图 利用一种特殊的固体打印机，根据设计好的文件，将p d m s 微全分析芯片的模具直 接“打印”出来，打印所需的“墨水”是一种热塑性塑料，模具制好后，再用复模法 加工出p d m s 微全分析芯片。与利用光刻技术加工模具的方法相比，固体打印法加工过 程简单，不需要曝光机、显影液和干净的房间等，可以一次加工出多级结构或面积较大 的模具，节省成本，制作过程省时省力，使用的材料无毒，可以在没有通风设施的环 境中加工。缺点是分辨率较低，利用这种方法加工的最窄沟道要达到2 5 0 微米宽；使 用的材料在极端的环境之下容易变形，加工出来的器件表面较粗糙，限制了其在光学上 的应用。 i 5 微全分析芯片的检测方法 第1 章前言 1 5 1 光学检测法 微全分析芯片的检测空间非常小，因此使用灵敏的检测手段是非常重要的。激光 诱导荧光检测法( l a s e ri n d u c e df l u o r e s c e n c e ，l i f ) 具有极高的灵敏性，到目前为 止，它是被最经常采用的检测法。 最常应用于微全分析芯片的l i f 检测系统是共聚焦检测系统，用激发光源提供一 个连续的、经过校准的光束，经过二色分光镜反射进入一个多孔物镜中，物镜将激光 汇聚成束很窄的光束聚焦在微通道内荧光标记物上，用来激发荧光。荧光标记物发 射的荧光经过物镜的收集和校准，由二色分光镜返回。在这个方向，分光镜反射激光 并使波长相对较长的荧光通过，一个消除色差的透镜将光聚焦至一个空间滤光器的入 口( 共聚焦孔道) ，这个空间滤光器和显微镜的物镜是共聚焦的。只有来自于芯片聚焦 区域的光线才能穿过微孔，这样，源自芯片表面的散射光和源自通道外的荧光被消除 掉了，增加了信噪比，构成一个高灵敏度的检测系统。经过空间滤光器的光线再被导 入至一个或几个检测器，如光电倍增管( p m t ) 或电荷耦合器件( c c d ) 等等。可以将 p m t 或c c d 的输出进行前置放大，数字化并输入计算机进行处理，最后得到有用的信息。 图1 5 本实验室的c c d 荧光检测系统 上图为本实验室的c c d 荧光检测系统，其它的光学检测法包括：化学发光、电化 学发光检测法、非荧光的光学检测法等。 第1 章前言 1 5 2 电化学检测 虽然l i f 法能够提供分子水平的灵敏度，但对于微流控器件来说该系统体积太大， 减弱了由于器件微型化所带来的好处。解决这个问题的一个很好的选择就是电化学检 测法。当将电极加工到微芯片上后，会大大提高灵敏度，同时大大降低反应时间。 w o o l l e y 等人设计了集成有电化学检测器的d n a 分析芯片，电化学检测器是在分离通道 3 0 m 处的一个1 0 t 目n 宽的工作电极，为了减小分离时所加的高压电场的影响，这里采用 了柱后检测的模式，通过这种非直接的检测模式，对0 x 1 7 4h a e i i i 的限制酶降解物 进行了检测，检测精度可达2 8 z m o l “。g a v i n 和e w i n g 为在微通道内进行连续电泳分 离加工出一种阵列式的电化学检测结构，它由在微通道的出口处的5 p m 的空间( 9 5 p m 宽，1 2 2 啪长，0 2 p m 高) 内放置1 0 0 个铂微电极阵列组成，使用这种器件在神经 递质分离电化学检测应用中获得了成功“”。 1 5 _ 3 质谱检测 质谱( m a s ss p e c t r o s c o p y ，m s ) 在分析化学中是一个很有用的工具，它可以完成 分离，检测以及对许多组分的确认的工作，如多肽和核酸等。使用一系列微型电子喷 射器件，可以实现质谱与毛细管电泳的联用，这些微流控器件是在没有任何电泳分离 的情况下利用电渗的原理将样品注入质谱的，而且可以在微流控器件上放置多种样品 并进行自动分析。最近有报道利用气动喷雾器为电子喷射产生稳定的样品流，这样就 不需要难于加工和集成的电子喷射头了，并且整个器件的加工过程只需一步蚀刻步骤 就可以。目前已经开发出用于蛋白质质谱分析的微流控系统，它的样品流和数据分析 完全由计算机进行控制，外加的高电压是用来产生电渗推动液体流进入质谱的，在整个 过程中并未进行电泳分离。 1 6 微全分析芯片的应用 一项新技术总是在不断应用的过程中变得愈来愈成熟的。目前的大部分关于微全 分析芯片研究工作都是指向生命科学领域的应用，如核酸，蛋白质及其它的各种类型 第1 章前言 的样品分析，商业化的微全分析芯片产品的应用也是集中在这个领域。 1 6 1 微全分析芯片应用于核酸分析 核酸分析是微全分析芯片的一个主要应用领域。目前已经利用微全分析芯片进行 了寡聚核苷酸。r n a ，基因型和d n a 分离、测序等方面的分析，分析过程非常迅速，如 对寡聚核苷酸进行分析只需不到一分钟的时间，d n a 测序的时间不到2 0 分钟。微全分 析芯片在商业上，如测试医学上重要的l o c i 的基因型及人类d n a 基因组测序中也已得 到了应用。 通过微全分析芯片进行基因测试发展得很快，这有利于快速辨识遗传疾病有关的 基因，然后进行遗传药理学方面的研究。如1 9 9 7 年，w o o l l e y 等人使用毛细管阵列电 泳微全分析芯片分析了来自予遗传性血色沉着病诊断的候选基因h l a h 基因的限制性 酶降解产物的标记物，他们使用平行放置的l i f 扫描器对嵌入式t h i a z o l eo r a n g e 染 料标记的1 2 种样品进行了分析“，应用于商业上的高速、高效基因型分析微全分析芯 片产品目前还处于开发阶段。 随着人类基因组计划的令人兴奋的发展，使用微全分析芯片进行d n a 测序引起了 人们广泛的注意。如m a t h i e s 实验室的w o o l l e y 等人于1 9 9 5 年首次使用微全分析芯片 成功地进行了d n a 测序，他们使用注入了变性聚丙烯酰胺凝胶分子筛的玻璃微金分析 芯片对能量转移荧光染料标记的d n a 测序片断进行分离，有效分离通道为3 5 a m ，分离 时间为1 0 一1 5 分钟，使用这种芯片可以读出具有1 5 0 2 0 0 个碱基对的d n a 片断“”。另 一种提高微全分析芯片读出长度的方法是使用更短的通道，并且对分离条件进行优化。 l i u 等人使用一个四色检测器，线性聚丙烯酰胺凝胶分子筛，单通道毛细管电泳微全分 析芯片，可以读出超过5 0 0 个碱基对的d n a 片断，分析时间不到2 0 分，分析精度可达 百分之九十九点四，这证实了使用微全分析芯片可以进行高速，高效的d n a 测序“。 集成核酸样品制备和分析是微全分析系统的一个重要目标。有关盯a s 应用于核酸 样品制备和集成分析的报道首先出现在1 9 9 6 年“7 “”“”1 ，另外w a t e r s 等人用一个高度 集成微全分析芯片完成溶胞，多路p c r 放大，及电泳分析等功能，p c r 对象在微全分析 芯片上的点c o l i 细胞内进行放大，然后在不到3 分钟内进行分离“0 1 。 另种方法就是将样品制备和毛细管电泳操作在不同的微全分析芯片上完成， 第1 章前言 c h e n g 等人在一块微全分析芯片上对人类基因组基因进行随机的非特异性放大，然后将 等分试样注入另一块微全分析芯片上进行肌肉发育不健全疾病的特殊位点的多路p c r 放大，然后对放大产物进行传统的毛细管电泳分析和微芯片上的毛细管电泳分析对比， 得到相似的结果，这说明了复杂的样品制备和分析可以在微全分析芯片上同时完成。“； b u r n s 等人通过微加工的方法制成了高度集成的微流控器件，可进行d n a 样品制备，片 断分离，并可以进行在片的光电二极管检测。这个功能强大的微芯片能够利用加热器， 温度传感器，及一光电二极管检测器在微通道内对样品进行驱动和检测，应用半保留 复制的方法放大目标d n a ，并与嵌入式染料混合，在交联式的聚丙烯酰胺凝胶中电泳分 离，用光电二极管检测，所有的这些过程都在一片微全分析芯片上完成，并在4 分钟 内就可以检测到相应的片断“。 1 6 2 微全分析芯片应用于蛋白质、肽的分析 蛋白质的分离是生物系统分析中得一项重要组成部分，使用微全分析芯片对蛋白 质进行分离也是目前的一个研究热点，目前有使用区带电泳，s d s 电泳，等电聚焦电泳 等方法进行快速蛋白质分离的报道。y a o 等人报道了利用微全分析芯片上进行的s d s 电泳的应用，荧光素标记的蛋白质在一个5 c m 长的充满s d s2 4 2 0 0 的通道内进行分离， 使用l i f 检测法进行检测，外加电压为1 5 k v ，分离时间为3 5 2 0 0 秒“：h o f m a n n 等人报道了对蛋白质进行等电聚焦电泳的微全分析芯片器件，集成有在片检测器的微 全分析芯片进行毛细管等电聚焦电泳需要进行区带移动，将蛋白质区带移至检测器处， 他们对三种最常见的区带移动方式：化学驱动，压力驱动，电渗驱动进行了比较，结 果发现电渗驱动是微全分析芯片上进行区带驱动的最佳技术，这是由于电渗驱动具有 高速、广泛适用性、所需器材最少等优点，在7 c m x 2 0 0 “m x1 0 帅的通道内，他们对c y 5 标汜的肽段进行了聚焦，整个的分析时间少于5 分钟”“。 微全分析芯片除了应用于核酸和蛋白分析外，研究人员现正努力拓展它的应用领 域，目前有许多关于微全分析芯片应用于细胞培养、细胞控制，临床诊断、聚合酶链 式反应( p c r ) 等方面的报道。 第l 章前言 1 7 芯片型微全分析系统的发展趋势及展望 芯片型微全分析系统与传统的分析方法相比具有有很多优势，如可以精确控制样 品的注入，减少分析过程的人为介入，减少污染；具有良好的焦耳热发散性，还可以 可外加极高的应用电场，这样只需消耗掉很少的样品量就可进行快速的电泳分离；可 集成多种功能组件，满足皮升量级的样品制备和分析的需要；光印制技术、微机械加 工技术、计算机辅助设计( c a d ) 使得加工微芯片上的精细结构变得非常简单，费用较 低廉，这使微全分析芯片的商业化成为可能。 虽然微全分析芯片具有种种优点，但要达到真正的实用化目的还须克服许多技术 上的困难。目前急需解决的问题有： 提出实用的整个硬件系统的加工和集成解决方案，并对其进行优化； 对微分析芯片上的微流体理化行为进行充分的研究，并完善交互可控的微流体样 品操纵和自动化的技术； 对微全分析芯片上的“微世界”和“外部世界”的联系加以改善，对微全分析芯 片进行实用的、系统水平的集成； 不断进行新材料、新方法、新应用的探索等。 这些要求将指引微分析芯片的发展方向，最终目标是将从样品制各、分离、化学 反应到检测的整个分析过程集成化，以获得所谓芯片实验室( 1 a b o n c h i p ) 。1 9 9 8 年6 月，n a n o g e n 公司的程京博士和同事们首次报道了用芯片实验室所实现的从样品 制备到反应结果显示的全部分析过程。他们用这个装置从混有大肠杆菌的血液中成功 地分离出了细菌，在高压脉冲破胞之后用蛋白酶k 脱蛋白，制得纯化的d n a ，最后用 另一块电子增强的d n a 杂交芯片分析证实提取物是大肠杆菌的d n a 。这是向缩微实验 室迈进的一个成功的突破。 目前，含有加热器、微流量控制器、电子化学和电子光探测器的芯片已以研制出 来了相信不久的将来，包含所有步骤的缩微芯片实验室将不断涌现。 从目前的发展水平看，微分析芯片已突破其发展初期在加工技术及基本流控技术 上的主要难关，正进入深入的基础研究，广泛扩大应用领域，及产业化的转折时期。 不久的将来，以微全分析芯片为核心的微分析系统将取代当前化学分析实验室的很多 设备，使化学分析进入病房、生产现场甚至家庭。在此基础上荐经过三、五年，能监 第l 章前言 测自身生化指标及基因变异、食品卫生及环境状况的便携式“个人化验室”将可能成 为现实。 1 8 研究背景和本论文介绍 生物芯片单独组件在应用中尚不完善，d n a 分析需要这些器件连接、集成，目前尚 没有一种适合于此的微平台。另外，大部分功能组件需要外部的光学读出装置来解读 功能，体积大、耗费高，限制了其应用。采用廉价的集成化芯片，把其流动、加热和 检测等功能集成在一起，是生物芯片的重要发展方向，这就是集成化分析芯片。 分析设备的微缩能使进样、分离和检测集成实现，分析速度得以大大提高，样品 和溶剂用量消耗减少，检测器效率也得以提高。目前生物技术也被移植到电泳芯片上， 在芯片上制作了p c r 扩增反应器，实现了d n a 杂交检测，使电泳芯片的功能不断多样 化，展示出了诱人的应用前景。 如m a b u r n s o ”等人研究的微全分析芯片( 图1 3 f ) 能够实现d n a 样品的定量 注入、扩增、检测等功能。但在芯片上实现的功能有限，比如对样品的预处理、分离、 提取等还不成熟，仅能检测最多几十个碱基对的寡核苷酸。主要的问题是对在微尺度 的芯片上实现的原理和方法研究的较少。 近年研究表明。通过在微芯片上构建可精确寻址的电极阵列，用各种电学的方法 ( 如直流高压，高频电场等) 可以对微流体以及生物分子的行为进行精确而复杂的操 控，如对单个细胞或d n a 分子实旄输运、固定、切割、集中等各种电操作。许多学者 的工作都强有力的证实了这种控制方案的可行性、可控性。上述m a b u r n 等人的研 究，进样方法仍然采用的是宏观尺度下的机械的方法，但是对于芯片来说，还是电控 方式更方便、更合理一些。 如r o n a i dg s o s n o w s k i “1 等人设计了电控可寻址的电极阵列系统，可对各个电极 单独控制，并研究了利用直流电场控制d n a 杂交过程中的快速测定。电子可寻址电极 阵列提供了对多种生物分子反应进行控制的直流电场，电场作用可以对d n a 分子进行 转移、集中等操作，促进了两个交互反应：寻址过程中带电分子的传输以及在静止基底 4 第1 章前言 上的集中、固定和杂交的快速识别。 关于对单个d n a 分子的微操作，t a k a t o k iy a m a m o t o 。”等人基于静电微操作对d n a 分子进行“外科手术”的研究，在电场的作用下，可以把长链的、处在自由状态的、 呈卷曲状的d n a 分子拉直、固定，进行有选择、有目的的切割，便于进行分析( 图1 6 ) 。 b ) t m n v hs 呲峙b c 螂蛳r o 鲥n | ：p o 呦吐缸 c i o d 岫 a 俯视图b 截面图 图1 6 用于操作d n a 分子的电极阵列 上图为电场作用下，d n a 分子被拉直、固定的示意图。用了一组真空蒸发上的铝电 极，用1m h z 能量的电源激活电极直到平均场强达1w m 。随后发生静电定向。d n a 溶液流入电极系统后，d n a 分子的端部能通过双向电泳作用推到电极边缘，并永久的锚 定在电化活性材料( 如铝) 上这样可以获得结构可知( 完全拉直) 、位置可知( 在 电极边缘) 的固定d n a 分子。 微分析芯片的重要特点是进样、分离、检测、数据采集等各种功能高度集成在一 块微小芯片上，尤其是集成了控制电极后，芯片与外接的硬件控制系统可以完好的衔 接，使微芯片上的“微世界”和“外部世界”的联系加以改善，真正实现微全分析系 统实用化的、系统水平的集成。集成控制电极的芯片在检测方法上也具有很大的优势。 例如可以采用探测电极实施更为精确的电化学检测，如安培检测、电导率检测等。制 作芯片时可以把检测电极一起集成制作，设计硬件控制系统时也可以把检测电路考虑 进去，这样从工艺制作到控制系统的搭建可以实现自上而下的统一设计。 总之，随着生物芯片的研究不断深入，对电控d n a 的分离、操作等技术越来越引 起重视。基于上述国际研究动态，我们提出“线性阵列电极电控生物芯片的研制”课 题( r e s e a r c h o ne l e c t r i c c o n t r o l b i o c h i p b a s e do n l i n e a r a r r a y e d 第1 章前言 e l e c t r o d e ，l e e cb i o c h i p ) ，研究d n a 等生物分子在电场控制下的输运、分离，以及 固定、拉伸、计算机控制寻址等操作，同时研制相应的芯片连接系统、硬件控制系统， 以及微弱电流、电压信息采集及控制等软硬件的开发。 研究的主要目的是研制一种快速，主动，可以直接由电场控制、操作的电泳芯片。 希望能做成一种广谱的生化分析芯片，使得传统的生物化学分析过程能够在芯片上完 成，包括生物样品的采集、处理、分离、提取及检测等：芯片应用范围宽，不仅可以 对d n a 片断进行分析，而且可对d n a 分子、核小体乃至染色体、细胞等进行操作和分 析。 电场控制的生物芯片可以和微电子线路集成，主要采用微电子机械系统( m e m s ) 技 术制作，采用多路信息采集、传输及处理技术，研制针对芯片的智能控制、寻址扫描 及检测系统。 研究的主要内容包括基于电控的线性阵列电极电泳芯片的理论设计，微加工技 术，集成化、智能化的自动控制系统的构建以及整套系统的整合和应用研究等。 论文分五章，第一章对微全分析芯片型微全分析系统的发展简史、基本概念、加 工微全分析芯片的材料和微加工技术、微全分析芯片的设计、执行功能、检测、应用 等方面的内容进行了综述，并给出了微全分析芯片型微全分析系统的发展趋势及展 望，阐明了论文的研究背景以及研究意义；第二章介绍基于电控的线性阵列电极电泳 芯片设计思想及实现方法，给出了理论设计模型及计算机模拟结果，并最终给芯片定 型，分析了其结构特点和工作原理。第三章阐述了微芯片的工艺制作过程，同时也介 绍了制作中用到的光刻技术，聚合材料p