（制糖工程专业论文）超声场对啤酒酵母细胞膜通透性的影响.pdf

摘要 摘要 提高膜通透性在获取胞内产物方面有重要的应用意义。传统的用于提高细胞 膜通透性的方法是化学法。化学方法具有处理时间长、效率低、试剂用量大、成 本高、后处理麻烦、通用性差的缺点。本论文以啤酒酵母细胞膜为研究对象，系 统地研究了不同超声参数对啤酒酵母细胞膜通透性及细胞活性的影响。在此基础 上，对超声参数进行优化，选择合理的超声参数，确定了超声提高啤酒酵母细胞 膜通透性的最适工艺条件。进而与化学方法影响啤酒酵母细胞膜通透性进行了比 较。在以上研究的基础上，应用透射电镜观察，从微观角度分析了超声场提高啤 酒酵母细胞膜通透性的机理。得到如下结论： 不同功率的变幅杆浸入式超声波都使胞内核酸、蛋白质及f d p 这三种物质的 渗出率提高。6 0 0 w 超声的作用效果最为明显，5 0 0 w 超声次之，4 0 0 w 超声的效 果最差。作用时间的长短对胞内核酸、蛋白质及f d p 这三种物质的渗出率有不同 的影响。其中，胞内核酸、蛋白质渗出率在超声作用时间为2 2 5 s 时，达到最大值， 但f d p 渗出率随作用时间的增加而提高。随着超声作用时间的增加，细胞的存活 率逐渐减小。不同间隙时间的变幅杆浸入式超声处理后，胞外的核酸、蛋白质、 f d p 浓度均有所提高，但间隙时间为6 s ，8 s ，1 0 s ，1 2 s 时，核酸、蛋白质的浓度提高 率相差不大。间隙时间为4 s 的6 0 0 w 、5 0 0 w 、4 0 0 w 的超声处理后，f d p 的渗出 率均有很大程度的提高，但当间隙时间增大到6 s ，8 s ，1 0 s 时，f d p 的渗出率比间隙 时间为4 s 的相应功率的超声处理后的f d p 渗出率低。超声处理的间隙时间对细胞 的存活率影响不大。4 0 k h z 、1 0 0 w 以及2 5 k h z 、3 0 0 w 的两种清洗槽式超声对啤酒 酵母细胞的核酸、蛋白质、f d p 的渗出率及细胞的存活率几乎没有影响。 超声作用时间、间隙时间和超声功率三因素三水平正交实验表明：超声的功 率、作用时间与间隙时间对啤酒酵母细胞的核酸、蛋白质的渗出率影响不显著， 但功率对f d p 的渗出率影响显著，作用时间对f d p 的渗透有影响。超声功率对啤 酒酵母细胞的存活率有影响。优化后的超声处理参数为：功率为5 0 0 w ，作用时间 为2 7 0 s ，间隙时间为8 s 。在这些参数条件下，超声处理啤酒酵母不仅可以使细胞 膜通透性较大程度的提高，而且使细胞保持较高的活性。 实验表明，化学方法虽然可以提高细胞膜对f d p 的通透性，但是化学方法对 细胞活性的影响很大，经过化学方法处理后的啤酒酵母细胞的存活率很低。而且 成本高，后处理过程复杂，不易实现生产连续化。适当超声处理不仅可以提高细 胞膜对代谢产物的通透性，使细胞仍保持一定的活性，而且操作参数易控制、目 华南理工大学工学硕士学位论文 ，| _ - i i i e 日_ _ _ e e e e e ! j = e ! = = = ! | = e = ! = | e _ 目= ；e m j _ _ _ _ - _ _ _ _ e e j j e e 目= ! ! = = 一 标产物易分离、无残余毒性、与环境友好高效价廉、无污染、适用性强、易于实 现自动化、连续化、具有极大的应用潜力，显示出超声方法的优越性。 透射电镜的观察显示，在超声作用下，一部分细胞的细胞膜已被破坏。细胞 膜出现多处断裂，其结构不再完整，当超声的强度足够大时，细胞膜结构消失。 功率超声使细胞膜通透性提高，其机理是功率超声的空化作用使细胞膜机械破裂， 导致细胞内的物质渗出细胞外。 本课题创新点在于，将超声场技术应用于改变啤酒酵母细胞膜通透性，同时 不改变细胞生物活性；并通过透射电镜观察超声处理前后有细胞壁细胞的细胞膜 结构的变化：提出了超声场影响细胞膜通透性的机理。本课题研究不仅为超声法 提高细胞膜通透性提供了工艺参数和理论依据，而且丰富了声化学理论。 关键词：超声；睥酒酵母；细胞膜；空化；通透性 a b s t r a c t i ti s i m p o r t a n tt oi n c r e a s e t h ep e r m e a b i l i t yo fc e l lm e m b r a n ef o ra c h i e v i n gp r o d u c t s i n s i d et h ec e l li ni n d u s t r y a sat r a d i t i o n a lm e t h o d ，c h e m i c a lt r e a t i n gi su s e dt oi n c r e a s et h e p e r m e a b i l i t y h o w e v e r , i th a s l o t so fd i s a d v a n t a g e ss u c ha sl o n gt i m eo ft r e a t i n g ，l o w e f f i c i e n c y , l a r g ed o s a g eo fc h e m i c a l s ，h i g hc o s t ，u n e a s yt op o s t t r e a ta n d d i f f i c u l tt ob eu s e d c o m m o n l y t a k i n gy e a s tc e l lm e m b r a n e a st h eo b j e c t ，e f f e c to fd i f f e r e n tp a r a m e t e r so fu l t r a s o u n do n i t sp e r m e a b i l i t yw a ss t u d i e di nt h i st h e s i s b a s e do nt h a t ，u l t r a s o u n dp a r a m e t e r sf o ri n c r e a s i n g t h ep e r m e a b i l i t yw e r eo p t i m i z e d t h e n ，c h e m i c a lm e t h o d st oi n c r e a s et h ep e r m e a b i l i t yw e r e d i s c u s s e d ，a n dc o m p a r e dw i t h u l t r a s o u n di r r a d i a t i o n f u r t h e r m o r e ，t h em e c h a n i s mo f u l t r a s o u n di n f l u e n c i n gt h ep e r m e a b i l i t yw a ss t u d i e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) t h em a i nc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w s ： d i f f e r e n tp o w e r so f p r o b eu l t r a s o u n di n c r e a s e dt h er e l e a s eo f n u c l e i ca c i d ，p r o t e i n a n df d pi n s i d ey e a s tc e l l s a n dt h es i g n i f i c a n c eo fd i f f e r e n tp o w e r se f f e c t i n gt h ec e l l p e r m e a b i l i t y w e r ei nt h eo r d e r ：6 0 0 w 5 0 0 w 4 0 0 w t h er e l e a s eo fn u c l e i ca c i d ， p r o t e i n a n df d pw a se f f e c t e d b yu l t r a s o n i c a t i n g t i m ei nd i f f e r e n t d e g r e e a f t e r u l t r a s o n i ct r e a t i n gf o r2 2 5 s ，t h er e l e a s eo fn u c l e i ca c i da n dp r o t e i nr e a c h e dt h em a x a m o u n t w i t ht h ep r o l o n g i n go ft h et i m e ，f d p sr e l e a s ei n c r e a s e d ，a n dt h es u r v i v a l r a t i oo fy e a s td e c r e a s e d t h ec o n c e n t r a t i o no fn u c l e i c a c i d ，p r o t e i na n df d p , w a s i n c r e a s e db yp r o b eu l t r a s o u n dw i t hd i f f e r e n tg a pt i m e h o w e v e r , t h ec o n c e n t r a t i o no f n u c l e i ca c i da n dp r o t e i ni n c r e a s e dl i t t l ew h e nt h ei n t e r v a lt i m eo fu l t r a s o u n di n c r e a s e d f r o m6 st o8 s ， 1 0 s ，o r12 s f o r6 0 0 w ，5 0 0 wo r4 0 0 wu l t r a s o u n dw i t hag a pt i m eo f4 s f d pr e l e a s ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ，c o m p a r e dw i t hn ou l t r a s o u n dt r e a t i n g w h i l ei t w a sl e s st h a nt h a tb y4 s g a pt i m e ，w h e nt h eg a pt i m ec h a n g e df r o m4 st o6 s ，8 so r1 0 s t h e g a pt i m eo fu l t r a s o u n dh a dl i t t l ee f f e c to nt h ec e l ls u r v i v a lr a t i o n oe f f e c to nt h e r e l e a s eo f y e a s tn u c l e i ca c i d ，p r o t e i n ，f d pa n d t h es u r v i v a lr a t i oo f y e a s tw a sf o u n db y u l t r a s o u n dw i t h4 0 k h z ，1 0 0 wo r2 5 k h z ，3 0 0 w t h ec o n c l u s i o n sw e r ei n d i c a t e da sf o l l o w sb yo r t h o g o n a le x p e r i m e n tw i t ht h r e e f a c t o r so fu l t r a s o u n dp o w e r ，t r e a t i n gt i m ea n dp u l s et i m e ：t h e s et h r e ef a c t o r sh a dn o r e m a r k a b l ee f f e c to nt h ep e r m e a b i l i t yo fn u c l e i ca c i da n dp r o t e i n h o w e v e r ，f o rt h e r e l e a s eo ff d p ，t h ee f f e c to fu l t r a s o u n dp o w e rw a ss i g n i f i c a n t a n dt r e a t i n gt i m ea l s o g a v et h ee f f e c t a sf o rt h es u r v i v a lr a t i oo fc e l l s ，u l t r a s o u n dp o w e rh a ds o m ec e r t a i n i n f l u e n c e t h eo p t i m a lp a r a m e t e r sw e r e ：u l t r a s o u n dp o w e r5 0 0 w , t r e a t i n gt i m e2 7 0 s i l l 华南理工大学工学硕士学位论文 a n dp u l s et i m e8 s u n d e rt h e s ep a r a m e t e r s ，u l t r a s o u n dc o u l dn o to n l yi m p r o v et h e p e r m e a b i l i t y o f y e a s tc e l lm e m b r a n e s ，b u ta l s ok e e p a l m o s ta l lt h ec e l l sa l i v e e x p e r i m e n t ss h o w e dt h a t c h e m i c a lm e t h o d sh a ds e r i o u se f f e c to nt h es u r v i v a l r a t i oo fy e a s ta l t h o u g ht h e yc o u l di n c r e a s e df d pp e r m e a b i l i t yo ft h em e m b r a n ea tt h e s a m et i m e ，t h e yw e r en o te a s yt oo p e r a t ec o n t i n u o u s l y , a n dt h e i rc o s tw e r eh i g h ，t h e p o s t t r e a t i n g w a s c o m p l i c a t e d c o m p a r e d w i t h t h a t ，a p p r o p r i a t e u l t r a s o u n dc o u l d i n c r e a s ec e l lm e m b r a n ep e r m e a b i l i t yw i t h o u tk i l l i n gt h ec e i l s f u r t h e r m o r e ，i t sa n e f f e c t i v e ，l o w p r i c e ，n op o l l u t i o n ，a p p l i c a b l ea n de a s y t o a u t o m a t ew a y s o ，u l t r a s o u n d i r r a d i a t i o ns h o w e dm a n ya d v a n t a g e st ot r a d i t i o n a lc h e m i c a lm e t h o d s t h es t r u c t u r eo fc e l lm e m b r a n ew a s i n v e s t i g a t e db y t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p y t h ep h o t o g r a p h ss h o w e dt h a tp a r t so f c e l lm e m b r a n e sw e r ed a m a g e db y u l t r a s o u n di r r a d i a t i o n w h e nu l t r a s o u n di n t e n s i o nw a sg r e a te n o u g h ，t h ec e l l sw e r e b r o k e ni n t op i e c e sa n dt h e i rm e m b r a n e sd i dn o te x i s ta n yl o n g er t h a tw a st os a y ，t h e m e c h a n i s mo fu l t r a s o u n da f f e c t i n gc e l lm e m b r a n e p e r m e a b i l i t yw a st h a tt h em e m b r a n e w a sp e r f o r a t e db yu l t r a s o u n di r r a d i a t i o n ，w h i c hr e s u l t e di nt h es u b s t a n c e si n s i d et h e c e l l sr e l e a s i n gi n t ot h eb r o t h t h en e wv i e w so ft h i s s t u d y w e r e ：u l t r a s o u n dw a su s e dt o i n c r e a s i n g t h e p e r m e a b i l i t yo fy e a s t ，w h i l ek e e p i n gt h ec e l l sa l i v e t h es t r u c t u r eo fc e l lm e m b r a n e w i t hw a l lw a s i n v e s t i g a t e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ，a n dt h em e c h a n i s m o f u l t r a s o u n df i e l da f f e c t i n gc e l lm e m b r a n ew a sd i s c u s s e d t h i s s t u d y n o t o n l yp r o v i d e d t h e o r e t i c a lb a s i sa n d p a r a m e t e r s f o ri n d u s t r i a l a p p l i c a t i o ni ni n c r e a s i n gp e r m e a b i l i t yb yu l t r a s o u n di r r a d i a t i o n ，b u ta l s oc o n t r i b u t e dt o t h ed e v e l o p m e n to f t h e o r yo fs o n o c h e m i s t r y k e yw o r d s ：u l t r a s o u n d ；y e a s t ；c e l lm e m b r a n e ；c a v i t a t i o n ；p e r m e a b i l i t y 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：妄1 糟 日期：矽p 绰g 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密吼 ( 请在以上相应方框内打“”) 日期：厕年石月占日 日期：研年夕月日 第一章绪论 1 1 膜通透性的重要性 第一章绪论 来源于植物的药品、香料、色素油类及乳胶等产物在人类生活中具有重要的 作用。人类已应用的3 万多种天然物质中有8 0 以上来源于植物。目前，来自植 物细胞培养的有用物质有4 0 0 种左右，包括色素、固醇、生物碱、维生素及激素、 多糖、植物杀虫剂及生长激素等数十个类别【l 】。植物细胞培养生产的各类初级及次 级代谢产物均为可再生资源，为取之不尽、用之不竭的生物资源，其生产不受地 理环境及气候等自然条件影响，是值得重视和开发的生物资源。植物细胞培养过 程中，初级及次级代谢产物通常并不释放到培养基中，而是储存于细胞中。要获 得有关化合物，需从收集的细胞中提取。传统的提取代谢产物的方法是破碎细胞， 但这种方法大大缩短了细胞的使用周期，给本己生长缓慢的植物细胞的培养增加 了一个非常不利的因素。因此在不降低细胞活性及其生物碱合成能力的前提下 促使胞内产物释放便成了植物细胞培养中一个非常重要的环节。对大部分植物细 胞来说，代谢产物产生后，主要储存于液泡中，这样胞内产物的释放就需要穿过 液泡膜和细胞膜两道障碍【2 l 。近年来已经发展了一系列的方法来部分或全部克服这 些障碍。但这些方法又会使细胞受到一定的损伤，导致细胞活性降低，甚至死亡， 从而失去了研究的意义。 就微生物而言，营养物质的吸收和代谢产物的排泄是物质透过细胞膜的过程。 如果细胞膜的通透性很差，代谢产物的排泄有一定的困难，在细胞内积累产生反 馈抑制作用会影响进一步合成，无法提高产量，甚至代谢途径发生变化。例如， 在使用缺失a 一酮戊二酸脱氢酶的棒状突变株于葡萄糖培养基中发酵谷氨酸时，在 细胞中谷氨酸积累到5 0 毫克，干重时，己达到饱和。由于反馈调节作用谷氨酸的积 累终止，产酸难于提高，如果将细胞内的谷氨酸释放出细胞，降低胞内谷氨酸的 浓度，可以解除反馈抑制。显然，细胞膜对代谢产物的通透性在发酵工业也是一 个十分重要的问题。人为地改变细胞膜的通透性以利于代谢产物在细胞外( 培养 基中) 的积累，使代谢朝着人们希望的方向进行，是实现代谢人工调控的重要方 法之一。 1 2 细胞膜 所有动物细胞都由一层薄膜所包围，这就是细胞膜或称为质膜。细胞膜是一 华南理工大学工学硕士学位论文 种具有特殊结构和功能的半透性膜。它一方面允许某些物质有选择性地通过，但 又能较严格地保持细胞内物质成分的稳定。微生物和外界交换的主要屏障是细胞 膜。 1 2 1 细胞膜的组成 多种膜性结构的化学分析表明，膜的主要组成成分有脂质、蛋白质和糖类等 一般以脂质和蛋白质为主，糖类的含量很少引。 1 2 1 1 膜脂构成细胞膜的脂质主要为磷脂，此外还有糖脂，胆固醇等。不 同细胞其脂质组成差异很大，仅从某一细胞生物膜的组成来看也不是一成不变的， 它随着细胞的生长、分化、外界条件的改变而异。 磷脂膜上磷脂可分为两大类：甘油磷脂和鞘磷脂。 甘油磷酯以甘油为骨架，甘油的l 位与2 位两个羟基与两条脂肪酸链( r i 、 r 2 ) 生成酯，3 位羟基与磷酸生成酯，这样的结构就是最简单的甘油磷酯一磷酯酸。 在生物膜中，虽然磷酯酸的含量不多，但是它是生物膜其它甘油磷酯合成的前体， 它的磷酸基团可以与其它醇生成醣，如磷酸基分别与丝氮酸、乙醇胺、胆碱或肌 醇结合即形成： 丝氨磷脂( p h o s p h a t i d y l s e r i n e ，p s ) 、乙醇胺磷脂 ( p h o s p h a t i d y l e t h a n o a m i n e ，p e ) 、胆碱磷脂( p h o s p h a t i d y i c h o l i n e ，p c ) 、肌醇磷脂 ( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ，p 【) 。这4 种磷脂是组成膜的主要成分。 鞘磷脂( s p h i n g o m y e l l i n ，s m ) 不含甘油而代之以鞘氨醇骨架，只含l 条脂肪 酸链以酰胺键与n h 2 基相连，磷酸基团则与胆碱生成酯。 1 2 1 2 糖脂糖脂是由糖及脂质组成，它可分为两类：糖鞘氨脂和糖甘油脂。 糖鞘氨脂是由鞘氨醇、脂肪酸及糖组成，分布广泛，几乎所有动物细胞膜都有， 特别是神经细胞含量甚丰；糖甘油脂是以甘油代替鞘氨醇，在植物及细菌中含量 较多。 1 。2 1 3 胆固醇细胞膜中的固醇以胆固醇为主。一般说来动物细胞膜胆固醇 的含量要较植物中的高。它可能是起着调节细胞膜中脂质的物理状态的作用。 1 2 1 。4 膜蛋白 细胞中大约有2 0 - - 2 5 的蛋白质与膜结构相联系的，膜蛋自 ( 包括酶及受体) 属单纯蛋白质的很少。多是糖蛋白、脂蛋白或糖脂蛋白，它们 是生物功能的主要执行者。它们与其它蛋白质在组分上没有什么不同，都由氨基 酸组成，只是疏水氨基酸含量相应较多。 第一章绪论 l = _ = = = _ 目e ! j _ _ e = 自_ 目自= _ _ e = 目_ = = _ - t j e i _ _ 一 1 2 1 5 糖类细胞膜中含有一定的糖类，它们主要以糖蛋白和糖脂的形式存 在。膜中的糖以寡糖链共价结合于蛋白，形成糖蛋白：有少量的糖以共价结合于 鞘脂上形成糖脂。 1 2 1 6 水和金属离子估计水约占膜重量的3 0 ，其中大部分呈结合状态。 膜上金属离子的一些膜蛋白与膜的结合有关，例如c a 2 + 对调节膜的生物功能有相 当重要的作用，m 9 2 + 对a t p 酶复合体与质膜的结合有促进作用。 1 2 2 细胞膜的结构 电镜观察表明，多种细胞的膜都具有类似的结构，它可分为三层，即在膜的 靠内外两侧各有一条厚约2 ，5nm 的电子致密带，中间隔有一层厚约2 5 nm 的透 明带，总厚度约为7 5 r l m 。这种膜性结构在细胞膜和胞内细胞器上均可见到。 1 2 2 1膜脂的结构特点虽然细胞膜上有磷脂、糖脂、胆固醇，磷脂又有许 多类，每一类磷脂由于脂肪酸烃链长短饱和度不同更有许多种，糖脂由于糖基的 不同也有许多种，但是膜脂都有共同的结构特点，它们都是两性分子( a m p h i p a t h i c m o l e c u l e s ) ，在一个分子中既含有极性部分又含有非极性部分。 两性的膜脂分子在水溶液中能迅速地在水一空气界面形成单分子层，极性头 部与水接触，疏水的尾部伸向空气一侧；如加入较多量的膜脂，使水一空气界面 达到饱和，膜脂分子就形成微团或双层微囊。 大多数天然膜脂更倾向于双层微囊的形式。在这种双层微囊的结构中，膜磷 脂的极性头部通过疏水键、静电引力和氢键，对水有强烈的亲和力，因而排在外， 与外界水溶性环境相邻：其疏水尾部相互聚集，尽量避免与水接触，所以彼此相 同排列，极性头指向水相内部，相邻两个分子磷脂的非极性区尾尾相联，决定了 脂质双分了层的结构，脂质双分子层的结构构成发生物膜的基本骨架。 脂双层的内外两侧是不对称的，不对称性主要决定于磷脂的头部，脂双层内 侧是含有氨基酸的磷脂丝氨酸磷脂( p s ) 、肌醇磷脂( p e ) 有较强的负电性，胆碱 磷脂( p c ) 及鞘磷脂( s m ) 在脂双层的外侧。内外两侧磷脂的脂肪酸也不完全相 同，p c 及s m 多为饱和脂肪酸，p s 、p e 含不饱和脂肪酸较多。 近年来生物物理及物理技术的发展，可以快速准确的测出分子的运动。应用 荧光漂白法时间分解、荧光偏光解消法，可测出膜质的运动，应用不同的荧光探 针，可以在磷脂分子内分别结合到脂肪酯的长链、甘油骨架及碱基( 如胆碱) 上， 测出磷脂不同部位的运动速度及偏转的角度，可以看出其运动状态。 华南理工大学工学硕士学位论文 1 2 2 2 膜蛋白的结构特点根据膜蛋白在膜是的结合位置及状态，膜蛋白可 为外周蛋白和整合蛋白。 外周蛋白通过离子键与膜脂的极性头相结合，它不伸入脂双层中。外周蛋白 易于分离，般用比较温和的处理如改变溶液的离子强度或p h 、加入金属螯合剂 就能使外周蛋白从膜上溶解下来，而不破坏膜的基本结构。外周蛋白一般约占膜 蛋白的2 0 一3 0 。这类蛋白质可溶于水。线粒体膜上的细胞色素c 、已糖激酶、 f l a t p 酶、红细胞膜的纤维状蛋白等都属于这一类。 整合蛋白约占膜蛋白的7 0 8 0 ，它们主要通过与脂双层疏水区的疏水作用 而结合在膜上。有的全部埋于脂双层的疏水区内，有的部分插入脂双层中，有的 贯穿整个脂双层。整合蛋白质与膜脂结合很紧密，不易与膜分离，通常只有用去 垢、有机溶剂、超声波等剧烈条件处理才能把它们从膜上分离下来，这类蛋白质 的特征是水不溶性。 膜蛋白与膜脂相似，在膜内是可以运动的，方面它有本身的运动，另一方 面它镶嵌在脂质中，脂质运动对它有影响，膜蛋白的自身运动有两种形式可分为 侧向扩散和旋转扩散。 在生物膜的流动性和膜两侧不对称性的一系列重要研究面果的基础上，1 9 7 2 年美国s i n g e r 和n i c o l s o n 提出“流体镶嵌模型( f l u i d m o s a i c m o d e lo f m e m b r a n e ) 。 这个模型与过去提出的种种模型的主要差别在于是突出了膜的流动性，认为膜是 由脂质和蛋白质分子排列的流体：它强调了生物膜的不对称性，即生物膜在结构 与功能上的两侧不对称性。这表现在膜蛋白在膜两侧分布的种类的数量不同；膜 的脂双层膜脂的组分及其含量有差异；膜上的糖基都分布在非细胞质一侧。结构 上的两侧不对称保证了膜蕊侧在功能上的不同【4 】。 1 。3 改变通透性的方法 目前国内外所使用的改变对代谢产物通透性的方法主要包括：化学法，如有 机溶剂法，抗生素法；物理法如空气干燥、渗透压冲击、温度冲击、超声波处理 等，以及p h 扰动等。 1 3 1化学法 化学法包括有机溶剂法，抗生素法等。有机溶剂法一般采用甲苯，氯仿，戊 二醛，d m s o ( 二甲基亚砜) 等。其机理是有机溶剂透过细胞壁与细胞膜的脂质体进 行反应，破坏细胞膜的结构和脂质体的流动性，使细胞膜失去原有的对胞内外物 质的传递调控能力，从而提高细胞膜的通透性引。化学渗透法也有自身的缺陷。时 4 第一章绪论 i e e = 目e ! = i = 自- e e _ i = _ _ = e t = = _ e ! j - e 目- 口= j l z = 一 间长，处理时间则长达2 h 以上；效率低，一般胞内物质释放率不超过5 0 ；往往 需添加还原剂作保护，以防活性损失太多；通常为提高收率面采用较高的试剂浓 度，试剂用量大，成本高，也给后处理带来不便。另外，有些化学试剂有较强的 毒性，对产物有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂。化学 方法通用性也比较差，某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞6 1 。 1 3 2 物理法 物理方法效率高，无残余毒性，环保，参数易控制且具有普遍性，可用于动植物和 微生物等各类细胞，因而引进普遍的关注。 1 3 2 1 空气干燥段学辉等恤l j 等经培养过滤分离后的啤酒酵母细胞均匀地分 布在细目过滤网上过滤网放在一个相应大小的布氏漏斗上，从漏斗的底部均匀 通入压缩空气，2 4 下气流干燥2 4 小时，然后将细胞悬浮在磷酸钾缓冲液中，检 测其细胞的酶活性和上清液的核酸物质浓度都比较高，这可能是因为经空气干燥 的酵母细胞，其细胞膜受到结构性破坏较严重，而且还发现经空气干燥的细胞合 成a t p 的时间比不处理缩短了2 个小时，这是因为空气干燥提高了细胞的通透性， 有利于充分发挥细胞内酶的催化活性作用。 1 3 2 2 渗透压s m i t h 等i 通过向培养基中加入无机盐n a c i 、k c i 和有机盐山 梨醇改变了渗透压，发现每瓶含有0 1g n a c l 时可使细胞内泻花碱含量明显增加， 且细胞活性不受任何影响，而含有1 0gn a c l 时胞内泻花碱含量明显降低，但胞外 泻花碱含量上升，细胞活性为原来的7 1 2 ，同时他们还指出山梨醇浓度为0 i ，0 ，2 m o u l 时促进细胞内泻花碱的积累，浓度0 5 m o l l 时则大大抑制胞内泻花碱的积 累：k c i 浓度为每瓶0 2 9 时也促进胞内泻花碱的积累，但他们未对其它的浓度做 研究。t a n a k a 等哺研究了高离子强度( 其实也是渗透压) 对长春花细胞的影响，在 m s 培养基中加入k c i 、n a 2 s 0 4 、m g s 0 4 无机盐来增强培养基的离子强度，所采 用的计算离子强度的公式为：l = 1 2 m iz 2 i ，m i 为摩尔浓度，z i 为其化合价。 发现细胞释放出的5 磷酸二脂酶的量只与培养基中的离子强度有关，而与加入 的物质无关，且当离子强度高0 9 时释放的酶量恒定，约为5 3 。对细胞的活性 研究发现，0 4 m k c i 严重降低了细胞活性，而0 2mm gs 0 4 和0 1 3 3mn a 2s 0 4 则对细胞活牲无太大的影响。应汉杰( 9 j 等用0 8 5 的n a c i 和t t o o l l 葡萄糖及 i m o l l 的磷酸盐组成的混合液对细胞通透性进行研究，发现该混合液对细胞通透 性的改变主要是依靠渗透压的作用，而且这种作用程度随着温度的升高而加剧。 并且，经这种混合液处理后酵母的酶活较高，特别是在3 5 下处理的细胞，而4 0 华南理工大学工学硕士学位论文 处理和酵母细胞的活性下降，则是与温度升高导致酶的活性下降。 1 3 2 3 温度冲击p a r k 等d o l 为提高长春花细胞培养中泻花碱的含量，将其在 有1m 山梨醇的培养基中培了2 0 小时，加入5 d m s o 并将其冻至一4 0 达4 8 小时，然后将其融化并进行培养，发现胞外泻花碱含量增加，他们认为泻花碱的释 放是由于细胞融化后细胞壁的p h ( 5 5 ) 较低，其实这其中原因很多，在含1m 山 梨醇的培养基中培养以及d m s o 的加入都足以使其释放胞内产物，同时细胞的冻 融对细胞内产物的释放作用也不可忽视。 1 3 2 4 电处理电处理法是近年来发展起来的一种渗透细胞的方法，它是指 在一定参数的电场作用下，在细胞膜脂双层中形成孔洞的现象。由于短时程，高 强度的电脉冲作用使生物膜的类脂分子层发生瞬时混乱，膜通透性暂时增大，形 象的说，就是“穿孔”。目前，国外主要研究高强度电脉冲场( h i g he l e c t r i cm a g n e t i c p u l s ef i e l d ，h e m p f ) 下细胞的电穿孑l 效应，其磁场强度一般大于1 0 5 v m ，脉冲时 间一般为l o 一一1 0 1 s 。 1 9 9 0 年c h a n g 1 用快速冰冻电子纤维技术揭示了细胞电穿孔的动态过程。结 构表明电穿孔使细胞通透性增大的原初过程在几个毫秒内实现，这时空洞的直径 为2 0 4 0 n m ，接着引发了胞内物质的外喷过程，在2 0 n m 内形成了火山口形的孔洞， 其直径迅速扩大到以细胞骨架为边界约2 0 1 0 0 n m 的大小，并在数秒内保持不变。 从物理学角度看，细胞质和细胞液均为电溶液，细胞膜则为一电介质层。根 据z i m m e r i m a n n l l2 j 理论，当一球形细胞暴露于外电场e 中而引起膜电压为v o = 1 5 a e c o s0 ，式中a 为细胞半径，o 为给定膜位置与电场方向的夹角，方程表明随着 电场强度的增大，首先在电场方向的膜位置( 即0 = 0 。和1 8 0 。) 出现击穿，电场 强度继续增大，大于0 。的位置也将达到击穿。而在0 = 9 0 。的膜位置上，外电场 引起的膜电势为0 ，即此处的膜不会被击穿。当脉冲时程大于1 0 0us 的电脉冲会 导致细胞膜产生不可逆电击穿。 国内从9 0 年代初就开始研究低电脉冲场下细胞的非热生物效应。对电穿 孔而言，场强小于1 0 4 v m 即叫低电场。彭勇等 t 3 1 用低强度瞬态电磁场处理动物 细胞后发现一些胞内蛋白可以溢出细胞，荧光标记抗体蛋白可以进入细胞。陈明 福等【1 4 1 采用新型超宽频带横电磁传输室b t e mc e l l ，在低强度脉冲电场 ( w e m p e 电压1 8 7v ，场强2 0v c m ，频率3 0 0h z ，脉宽5 0n s 或1 0 0n s ) 作用下， 鸡红细胞膜上出现直径o t 一0 9um 大小不等的孔洞，被穿孔的细胞约占所观 察细胞的i ，细胞穿孑l 率与照射时间无明显相关。另外，还观察到有l 的细 胞虽未穿孔但有小泡从膜上凸出或出现凹陷；台盼蓝能进入人红细胞。他们对低 强度脉冲电场电处理机理进行探讨，认为强电场与弱电场的电穿孔可能有着不同 第一章绪论 的作用机制，弱电场下穿孔的原因可能为：( 1 ) w e m p f 对膜上许多较为敏感的 压控型离子通道具有作用，微小的电压变化就可以开启细胞内外离子的对流，从 而导致膜结构发生变化形成电穿孔。( 2 ) 实验所用电场为重复周期信号，这种周 期性的策动力可能对细胞膜结构产生某种谐振，或是同步蛋白质的构象振荡，从 而形成电穿孔。( 3 ) 以一种机械冲击力的形式将膜击穿。 电处理法具有效率赢，无残余毒性，参数易控制和普遍性等特点，可用于动 植物和微生物等各类细胞【l5 1 6 1 。各种植物或组织中代谢产物的回收都可用电处理 法。将植物细胞或组织用直流、整流、交流或电容器放电等任何形式的电进行处 理，处理可在一次或多次脉冲或连续通电情况下进行，处理次数并不特别重要，重 要的是总的脉冲处理时间。由于电处理法是通过将细胞或组织打孔，从而释放出胞 内产物，因此电流的选择应根据可使细胞穿孔的电压及处理时间等因素来定。 1 3 2 5 超声波处理超声波是一种能量形式，当强度超过一定值时，将会使 媒质的状态、组分、结构或功能发生变化】。低频超声波的空化作用可以导致细 胞的非热生物效应，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放或胞外物质入 细胞内。 1 4 超声波与细胞膜通透性 1 4 1 超声波 高于人耳听觉上限阈值的声波，称为超声波。超声波的频率段很宽，包括2 0 k h z 至t 0 9 h z 。近年来。超声学出现了许多新的应用技术，主要应用在两个方面：检测 超声和功率超声。 检测超声又称为超声波的“被动应用”，是利用小功率( 毫瓦量级) 超声在媒质 中的传播特性，检测或控制各种非声学量及其变化，工作频率一股在o 5 2 0 m h z 有时高达i g h z 。功率超声又称为超声波的“主动应用”，是用较大功率的超声对 物质作用，以改变或加速改变物质的一些物理、化学和生物特性或状态的技术。 工作频率一般在数万赫兹，有时也高达几兆赫兹u 8 l 。 超声频率高，波长短，有良好的指向性，衍射现象少，束射性强，易于通过 聚焦集中能量，可在组织界面上反射，可被血细胞反向散射，因而在化学化工、 生物工程、食品、医疗卫生、环境保护及国防工业等中均有着极其广泛的应用。 华南理工大学工学硕士学位论文 1 4 2 超声波与细胞膜通透性 细胞膜通透性可受多种因素影响，超声即是其中之一。超声对细胞的影响之 一是使细胞膜通透性改变，早已发现经低频率、低功率超声波处理，可改变细胞 膜的通透性，使胞内物质释放或使胞外物质进入细胞内。当超声强度过强时，细 胞本身就要受到损伤以至逐步衰亡。 利用适当参数的超声，使超声的强度既不伤害或少伤害细胞本身 1 9 1 ，而且可 以提高细胞膜通透性，以达到释放代谢产物或中间产物。目前利用超声改变细胞 膜通透性已应用于基因转导，强化化学方法治疗肿瘤等疾病领域。 1 4 2 1 在发酵工程中的应用低频超声波的空化作用可以导致细胞的非热 生物效应，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放或胞外物质入细胞内。 选择适当的超声参数，使细胞膜通透性提高，代谢产物或中产物迅速释放，同时 不伤害或少伤害细胞本身，从而不影响代谢反应的进一步进行。这对于发酵产物 的获得具有重要的意义。 有研究表明，超声波处理后的绿脓杆菌细胞膜对疏水性化合物1 6 一脱氧硬脂 酸( 1 6 - - d s ) 的通透性增强，且胞内1 6 一d s 随声场辐射功率而增大2 。1 9 9 0 年 j o e r s b o 等拉”人发现超声处理甜菜原生质体后，其膜通透性在l 小时后才逐渐减少。 j u c h u l 2 2 1 等用2 5 k h z 的超声发生器( 输出功率为8 0 w ) 处理生产庆大酶素的 m i c r o m o n o s p o r a s p p 细胞，研究显示，当超声离线处理时间从3 0 s 增加到1 5 0 s 时， 胞内g m ( 庆大酶素) 释放从3 8 3 提高到7 5 8 。菌丝体可以耐受超声作用，细 胞不受超声损伤，而且合成g m 的能力加强。超声波在