（市政工程专业论文）构建降解有机氯化物基因工程菌研究.pdf

武汉理工大学硕士学位论文 摘要 环氧丙烷生产废水中含有较高浓度的有机氯化物，如氯丙醇、丙二醇、二 氯异丙醚、氯丙酮等，是生化法处理的难点。本文以环氧丙烷生产废水为出发 点，主要研究以下三方面的内容。 首先，研究有机氯化物的生物降解机制。在生物学领域采用生物信息学方 法对1 ，3 一二氯一2 一丙醇的生物降解机制进行研究。获取了i ，3 一二氯2 一丙醇降解 途径中的关键酶h a l o h y d r i ne p o x i d a s ea ( 卤代醇环氧酶a ) 和h a l o h y d r i ne p o x i d a s e b ( 卤代醇环氧酶b ) 的相关信息、序列特性及d n a 序列信息，并对其进行了同 源分析。由同源分析的结果可知，能够合成这两种关键酶的相关微生物在自然 界中分布广泛。其中，具有代表性的同源微生物有：棒状杆菌属( c o r y n e 。b a c t e r i u m s p ) 、节细菌属( a r t h r o b a c t e r s p ) 、伯克霍尔德氏菌( b u r k h o l d e r i as p ) 等。 其次，选取盐生杆菌j 7 ，大肠杆菌d h 5 口和细菌w h z j 来研究三种微生物对 环氧丙烷废水的适应性机制，结果表明细菌对环氧丙烷废水中有机物的降解能 力才是限制细菌生长的主要因素之一；选取棒杆菌( c o r y n e b a c t e r y u ms p ) c i c c 1 0 1 8 9 为试验菌株，通过对关键酶的活性鉴定实验，证明棒杆菌c i c c1 0 1 8 9 不能 高效利用1 ，3 一二氯一2 一丙醇作为碳源，但该细菌中可能存在着能合成可降解1 ， 3 一二氯一2 一丙醇的酶( 卤代醇环氧酶a 或卤代醇环氧酶b ) 的基因。 最后，采用分子生物学手段对1 ，3 一二氯一2 一丙醇生物降解代谢途径中的关 键酶潜在目的基因进行克隆研究。利用p c r 技术从棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) c i c c1 0 1 8 9 基因组中扩增出大小约为7 0 0 b p 的基因片段，将其连接到p h x 3 0 3 载 体上构建重组质粒p h x 3 0 3 - h h e b ，并转化至e c o l id h 5q 筛选出四个阳性菌，双 酶切鉴定和p e r 扩增鉴定两种鉴定结果存在矛盾，核苷酸序列测定及分析结果 表明，克隆出的基因序列与g e n b a n k 中报道的伯克霍尔德氏菌( b u r k h o l d e r i a ) 的 非潜在目的基因具有很高的相似性。h h e a 和h 1 1 e b 基因克隆的进一步研究中，潜 在目的片段基因没有扩增出来，至此全部试验结束。本文最后对试验结果进行 了分析并提出建议。 关键词：有机氯化物生物降解棒杆菌基因克隆 武汉理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ee p o x yp r o p a n ew a s t e w a t e rc o n t a i n sh i g hc o n c e n t r a t i o no fc h l o r i n a t e d o r g a n i cc o m p o u n d s ，s u c ha sc h l o r o p r o p a n o l ，p r o p y l e n eg l y c o l ，d i c h l o r o i s o p r o p y l e t h e ra n dc h l o r o a c e t o n ee t c w h i c hi st h er u bo ft h eb i o d e g r a d a t i o nt r e a t m e n t t a k i n g u s eo fe p o x yp r o p a n ew a s t e w a t e ra sas t a r t i n gp o i n t ，t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t s i n c l u d et h r e ea s p e c t s ：t h eb i o d e g r a d a t i o nm e c h a n i s mo fo r g a n i cc h l o r i d e ，t h e e x p e r i m e n tf o ri d e n t i f y i n gt h ea c t i v i t yo ft h ek e ye n z y m e ，t h eb i o d e g r a d a t i o ns t u d y o f1 3 - d i c l o r o 2 一p r o p a n o ls t r u c t u r a lr e s e m b l i n gc h l o r o p r o p a n o li nt h ef i e l do f b i o l o g ya n dt h ec l o n i n ga n de x p r e s s i o nr e s e a r c ho ft h ek e ye n z y m eo ft h eg o a lg e n e i nt h eb i o d e g r a d a t i o np a t h w a yb ym o l e c u l a rb i o l o g y , w h i c ha i m sa tc o n s t r u c t i n g g e n e t i cb a c t e r i af o rt h ee f f i c i e n tb i o d e g r a d a t i o no fc h l o r i n a t e do r g a n i cc o m p o u n d s f i r s t l y , i ti st h es t u d yo ft h eb i o d e g r a d a t i o nm e c h a n i s mo fo r g a n i cc h l o r i d e b y u s i n gb i o i n f o r m a t i c si nt h ef i e l do fb i o l o g y , r e s e a r c ht h eb i o d e g r a d a t i o nm e c h a n i s m o f1 ，3 - d i c l o r o 2 p r o p a n 0 1 t h er e l e v a n ti n f o r m a t i o na n dt h es e q u e n c ei n f o r m a t i o no f d n ao fh a l o h y d r i ne p o x i d a s eaa n dh a l o h y d r i ne p o x i d a s eb w h i c hi st h ek e y e n z y m e si n t h ep r o c e s so ft h eb i o d e g r a d a t i o no f1 ，3 - d i c h l o r o 一2 一p r o p a n o i ，a r e a c q u i r e d a n dt h eh o m o l o g ya n a l y s i so fh a l o h y d f i ne p o x i d a s ea a n dh a l o h y d r i n e p o x i d a s ebi sm a d e 。功er e s u l ts h o w st h a tr e l e v a n tm i c r o b i o t i nt h a tc a ns y n t h e s i z e t h o s ek e ye n z y m e si s w i d e l ys p r e a di nt h en a t u r e a n dt h et y p i c a lr e l e v a n t m i c r o - b i o t i ni sa sf o l l o w s ：c o r y n e b a c t e r i u ms p ，a r t h r o b a c t e rs p ，b u r k h o l d e r i as p e t c s e c o n d l y , s e l e c th a l o b a c t e r i u ms p j 7 ，e c o l id h 5 aa n db a c t e r i o l o g i c a l w h 一2 r j ，s t u d yt h e i ra d a p t a b i l i t ym e c h a n i s mf o rp r o p y l e n eo x i d e ，t h er e s u l ts h o w s t l l a tt h em a j o rf a c t o rw h i c hl i m i t st h eg r o w t ho fb a c t e r i a li st h a tt h eb a c t e r i a lc a nn o t d e g r a d et h eo r g a n i cm a t t e ri ne p o x y p r o p a n ew a s t ew a t e r s e l e c tc o r y n e b a c t e r i u m ( c o r y n e b a c t e r i u ms p ，c i c c1 0 18 9f o rt h et e s ts t r a i n s 。t h r o u g ht h ee x p e r i m e n tf o r i d e n t i f y i n gt h ea c t i v i t yo ft h ek e ye n z y m e i tp r o v e st h a tc o r y n e b a c t e r i u mc i c c 1018 9c a nn o te f ! f i c i e n t l yu s e1 3 一d i c h l o r o 一2 p r o p a n o la sac a r b o ns o u r c e ，b u tt h e b a c t e r i ah a v et h eg e n ew h i c hc a ns y n t h e s i z et h ee n z y m e ( h a i o h y d r i ne p o x i d a s eao r h a l o h y d r i ne p o x i d a s eb ) f o rd e g r a d a t i n gt h e1 ，3 - d i c h l o r o 一2 一p r o p a n 0 1 f i n a l l y i ti sh eb i o d e g r a d a t i o ns t u d yo f1 。3 一d i c l o r o 一2 一p r o p a n o ls t r u c t u r a li nt h e f i e l do fb i o l o g ya n dt h ec l o n i n ga n de x p r e s s i o nr e s e a r c ho ft h ek e ye n z y m eo fg o a l g e n ei nt h eb i o d e g r a d a t i o np a t h w a yb ym o l e c u l a rb i o l o g y 7 0 0b po ft h eg e n e f r a g m e n t sf r o mc o r y n e b a c t e r i u ms p c i c c1018 9w a sa m p l i f i e db yp c ra n dl i g a t e d i n t ov e c t o rp h x 3 0 3 t h er e c o m b i n e dp l a s m i dw a sc o n s t r u c t e da n d 仃a n s f e r r e di n t oe c o l id h 5 aa t a p p r o p r i a t et e m p e r a t u r e s c r e e n i n g f o u r p o s i t i v eb a c t e r i a , t h e d o u b l e e n z y m ed i g e s t i o n a n dp c ra m p l i f i c a t i o ni d e n t i f f c a t i o nr e s u l t se x i s t c o n t r a d i c t o r y , s e q u e n c i n ga n da n a l y s i ss h o wt h a tt h ec l o n e dg e n es e q u e n c eh a sh i g h i i 武汉理工大学硕士学位论文 s i m i l a r i t yw i t ht h en o n p o t e n t i a lt a r g e tg e n e si nb u r k h o l d e r i ar e p o r t e di ng e n b a n k i nt h ef u r t h e rs t u d yo fc l o n i n gh h e aa n dh h e b ，t h ep o t e n t i a la i m e dg e n ef r a g m e n ti s n o ta m p l i f i e d u n t f l ln o wt h ew h o l et r i a li se n d ，t h ep a p e ra n a l y z e st h er e s u l t sa n d m a d er e c o m m e n d a t i o n si nt h ee n d k e yw o r d s ：c h l o r i n a t e do r g a n i cc o m p o u n d sb i o d e g r a d a t i o nc o r y n e b a c t e r i u ms p g e n ec l o n e i i i 此页若属实，请申请人及导师签名。 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特i i i i 以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其它教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：瓤期j 垒翌年妇 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部 内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生签名：j 鲰师签名：查塾 日期垫翊生笪旦 注：请将此声明装订在论文的目录前。 武汉理工大学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 环氧丙烷废水概述 环氧丙烷( p o ，p r o p y l e n eo x i d e ) ，又名氧化丙烯，是一种无色、具有醚类 气味的低沸易燃液体。凝固点1 1 2 1 3 ，沸点3 4 2 4 。与水部分混溶，与乙醇、 乙醚混溶。有毒，对人体有刺激性。环氧丙烷( p o ) 是一种重要的有机化工产品， 是丙烯系列产品中仅次于聚丙烯和丙烯腈的第三大衍生物，同时也是一种重要 的基本有机化工原料。环氧丙烷广泛应用于化工、轻工、医药、食品和纺织等 行业，需求量逐年增加，具有很好的应用前景，产量也逐年增加。 目前国内都基本采用氯醇法工艺生产环氧丙烷，氯醇法是以烯烃和氯气为 原料，首先将丙烯气体、氯气和水按一定配比送入氯醇化反应器中进行反应， 未反应的丙烯与反应中产生的h c l 及部分的二氯丙烷等自反应器项部排出，经 冷凝除去氯化氢和有机氯化物，丙烯循环回用。反应器底部得到氯丙醇质量分 数为4 - - - 5 的盐酸溶液。将该溶液与过量约1 0 的石灰乳混合后送入皂化塔 中皂化，再经精馏即可得到环氧丙烷。该工艺流程比较短，工艺成熟，收率高， 生产比较安全，且投资少。但缺点是对设备有腐蚀，产生的环氧丙烷废水的特 点是高温( 经闪蒸和换热后达6 0 - - 一8 0 ) 、高p h 值( 约为1 0 1 2 ) 、高盐( c a c l 2 质量分数为3 5 - - 一4 o ) 、高s s ( s s 浓度为0 3 - - - 0 5 ) ，高c o d 值( 约为 2 0 0 0 3 0 0 0 m g l ) ，同时生产过程中还会产生大量含有口一氯丙醇和一氯丙醇 ( 以下均简称氯丙醇) 、二氯丙烷、二氯异丙醚、氯丙酮等难生物降解的有机氯 化物。这种含有机氯化物的环氧丙烷废水对环境的污染日趋严重i l j 。 1 2 有机氯化物处理技术现状 有机氯化物不仅存在于环氧丙烷废水中，也是危险废品和垃圾提取物的重 要组成部分，在地面水和土壤污染中比较普遍。同时，随着人造化学剂如：致 冷剂、灭火剂、油漆、溶剂，除草剂和农药的广泛使用，使得有机氯化物长期 以来在环境中无节制的释放及不断积累，对环境及人类身体健康造成极大的危 害。特别是近年来在一些食品中也发现有许多这类化合物( 如氯丙醇系列物) ， 武汉理工大学硕士学位论文 欧盟等国家对此都提出了越来越严格的控制标准团。因而如何处理有机氯化物 成为一个迫切的问题。 1 2 1有机氯化物物化处理技术进展 对于这类污染物，最初一般采用物理化学方法( 如气提、萃取、土埋、活性 碳吸附、焚烧等) 治理。这些方法都只是污染物的转移，不能从根本上治理，且 容易造成二次污染，成本也较高，对食品、调味品中存在的类似污染就更无能 为力了。 中国科学院范经华等【3 - 4 】采用电化学催化方法同步脱硝脱卤进行研究。试验 采用化学沉积法负载钯一铜合金( 4 ：1 ) 的多孔钛板作为电解反应器阴极，电解 硝酸盐氮( n o ；一n ) 和五氯酚( p c p ) 的混合溶液。结果表明：p c p 的脱卤效果与 单独脱卤时相似，但p c p 的存在对n o ；一n 的还原脱除有明显影响。利用多孔 钛板负载的钯一铜二元合金电极，选择合适的反应参数，可有效地脱除水中的 硝酸盐氮和卤代有机物。 近年来，各国科学家广泛开展的利用便宜金属铁及其化合物脱氯降解技术， 为有机氯化物的处理提供了一条新的途径【5 6 1 。金属铁能够有效地降解有机氯化 物，但也面临着以下挑战：金属铁对某些氯化物反应性较低，降解不完全，生 成含氯产物，有的毒性较大；随着时间的推移，金属铁表面惰性层或金属氢氧 化物的形成，使得铁的反应性降低。科学家们尝试用二元金属( 如p d f e 、n i f e 等) 进行脱氯降解。同时，也开展了利用自然界中普遍存在的含铁化合物处理有 机氯化物的研究。但目前这一技术在降解机理上不甚明了，反应动力学方面的 研究也有待于深入。对于二元金属体系，催化剂为钯时，脱氯效果最好，但钯 为贵金属，工程上应用成本较高。在催化剂筛选方面应该做一些研究工作，以 廉价催化剂代替贵金属钯 7 1 。 华南理工大学的陈元彩等【8 】采用化学絮凝法处理造纸废水中的有机氯化 物，试验研究表明化学沉淀处理可有效地去除漂白废水中的难于生物降解的高 分子物质，因而可提高后续的生物处理效率。但物化混凝处理后水中残存的铝等 金属离子在生物体中的累积效应还有待于进一步研究。 广西民族学院的夏璐等【9 】采用2 5 3 7 n m 的紫外光为光源，二氧化钛作催化 剂，对造纸废水的有毒成分4 一氯一愈创木酚进行了光催化降解。结果表明，化学 2 武汉理工大学硕士学位论文 纯二氧化钛经过高温焙烧处理可以增大其催化活性，光强、溶液的初始浓度以 及酸碱度影响4 一氯一愈创木酚的降解率。通过紫外光谱图对4 一氯一愈创木酚的降 解进行跟踪，结果表明，氯化有机物中的苯环特征峰完全消失，降解较彻底。 1 2 2 有机氯化物生物处理技术进展 基于采用一般的物理化学方法很难降解，生物降解能够通过微生物作用将 有毒物质转化为无毒物质，投资少且无二次污染，因而近年来已成为各国研究 的热点，因此充分利用微生物降解技术日益重要。 广东工业大学的乔庆霞【1o 】通过驯化选育优势菌使生物法应用于含有机氯化 物的漂白废水的治理。在实验室中通过驯化筛选获得4 株优势菌a 一1 ，b 一1 ，b 2 和c 一1 。考察了废水相对浓度，p h 值和菌液量对4 株优势菌处理漂白废水效果 的影响，发现随着这些条件的变化，4 株菌的处理效果具有相似的变化趋势。 在废水相对浓度为5 0 ( 原废水浓度的5 0 ) 、p h 值为7 o 、菌液量为2m l 时， 对有机氯化物和c o d 汀的综合处理效果较好。 采用m y c o r 、m y c o p o r 工艺【1 1 】将白腐菌分别固定在旋转生物转盘和滴 滤器的泡沫载体上，前者处理碱抽提段废水，2 d 内可去除6 2 t o c l 和大于8 0 脱色率；后者在停留时间为6 1 2 h ，可获得8 7 脱色率、8 0 a o x 去除率和 4 0 c o d 去除率。p a l l e r l a t l 2 】等用聚氨脂预聚物固定的白腐菌的生物反应器处理 漂白废水时，在2 4 h 停留时间的连续流处理中，可脱除7 2 一- 8 0 的颜色和 5 2 5 9 的a o x 。 选择适当的生物降解环境能提高菌种的活性，b r o c h e d u e 1 3 1 等用移动床生 物膜m b b r 反应器处理3 个新闻纸厂的综合废水，在m b b r 反应器中微生物 吸附于反应器中自由移动的塑料载体上，可提高微生物停留时间，在后续的化 学沉淀处理中只需原来1 3 到1 4 药剂量就可获得9 5 的c o d 去除率。 有研究【1 4 】表明，氯代芳香族化合物中氯原子具有强烈的吸电子性，使芳环 上电子云密度降低，在厌氧条件下，电子云密度较低的有机物在酶催化下，易 受到还原剂的亲核攻击，发生氯原子的亲核取代，显示出较好的生物降解性。 氯化有机物在厌氧条件下还原脱氯是一种重要的脱毒反应，且这种还原反应由 非甲烷菌产生的，随着氯代程度的增加，还原脱氯速度加快，释放的能量增多。 b o m a n 等【1 5 】采用超滤一厌氧，在不产甲烷条件下，获得了6 0 6 5 a o x ( 可 3 武汉理工大学硕士学位论文 吸附有机卤化物) 和7 0 , - - , 8 0 的氯酚去除率。 h a g g b l o m 等人【l6 】采用厌氧流化床与好氧滴滤池联合处理工艺，对a o x ， 氯酚，c o d 的去除率分别为6 8 、7 7 和6 1 。w a n 9 0 7 3 通过连续流厌氧一好 氧法处理漂白废水对比实验，发现厌氧一好氧工艺可提高氯代有机物的还原脱 氯能力，从而提高漂白废水的a o x 及c o d 的去除率。 对于难生物降解有机物，传统生物处理工艺不能有效维持连续的驯化培养 物，冲击负荷大，特别是其中的有毒有害组分降解困难。于是，人们试图通过 对代谢菌种的改良来提高难生物降解有机废水的降解效率。有效菌株的获得主 要来自两个方面，其一是从污染现场或处理设施中筛选分离得到，其二是构建 工程菌。 1 筛选分离有效降解微生物 通过污染现场分离，研究人员得到了不少难降解有机氯化物的高效降解微 生物。比如好氧菌p s e u d o m o n a ss p 和b a c i l l u ss p 能降解氯苯、好氧菌r a l s t o n i a e u t r o p h as p a 5 能降解有机氯农药、厌氧菌d e s u l f i t o b a c t e r i u md e h a l o g e n a n s 和好 氧菌b u r k h o l d e r i as p 以及好氧菌c o m a m o n a st e s t o s t e r o n i 能降解多氯联苯【l8 1 。为 了减少分离筛选菌种方面的低水平重复，研究人员开始建设高效降解菌株库， 构建系统进化树，从分子生物学水平探讨降解代谢途径的起源与进化，极大地 丰富了微生物资源，并促进了微生物资源的利用。 高效微生物应用于实际生物处理系统中也有很好的表现。如g l l i m 等筛选 出l o 种能降解二氯甲烷的菌种，分解能力可达0 8 9 ( l h ) ，应用于流化床生物 反应器，二氯甲烷分解能力可提高到1 6 9 ( l h ) 。尽管如此，高效降解微生物在 实际废水的生物处理系统能否长期有效发挥作用，尚有不少问题需考虑。如降 解菌在废水复杂的生态系统能否优势生长，系统能否增殖维持相当数量的目标 污染物驯化培养物等。 2 构建工程菌 尽管可以从环境中分离筛选得到菌株，但降解污染物的酶活性往往有限， 同时菌种选育工作费时耗力，虽然理论上微生物能适应降解所有有机污染物， 但面对今天层出不穷的新化合物的挑战，依靠微生物的自然进化能力显然是滞 后的，远不能满足生物处理的需要。如果能对这些菌株进行遗传改造，提高微 生物酶的降解活性，并可大量繁殖，就可以定向获得具有特殊降解性状的高效 菌株，方便有效地应用于污染处理。 4 武汉理工大学硕士学位论文 1 3 氯代醇处理技术现状 环氧丙烷废水中含有氯丙醇、二氯异丙醚、二氯丙烷等难生化降解的有机 氯化物，其中，氯丙醇是氯醇法生产环氧丙烷的废水中的重要副产物。不仅环 氧丙烷废水中含有大量的氯丙醇，在酱油、蚝油等调味品的半成品到成品中也 发现有大量残留的氯丙醇系列物，如l ，3 - - - 氯一2 一丙醇、2 ，3 一二氯一卜丙醇、 2 一氯一1 ，3 一丙二醇和3 氯一1 ，2 一丙二醇等【捌。因此在欧美等国都对调味品中此类 物质的含量作出了越来越严格的规定，并且查封我国大陆及香港出口的调味品 或禁止销售。调味品中氯丙醇的残留问题也开始引起我国有关部门的重视。因 此，处理氯丙醇系列物是目前急需攻克的技术难题。 重庆协力达生物化学研究所的罗贵伦【2 l 】采用碱法清除氯丙醇，试验结果表 明，氯丙醇在p h 2 ，即认为细曲 己长好) 。 瞧刮 培养基ep h = 10 隅圉 武汉理工人学硕士学位论文 图3 - 1细菌在各培养基中的生长情况 由图3 1 可以看出 ( 1 ) 在培养基d ，e ，f 中，细菌w h z i 在p h = 7 时可以生长，而在p h = 1 0 、p h - - 1 1 时不生长；在培养基g ，h 中，细菌w h - z j 在p h - - 7 时可以生k ， 而在p h = 】o 时不生长。这说明：p h 值是抑制细菌生长的因素之一。微生 物生长有一个最适生长的p h 值范围，还有一个最低与最高的p h 范围，低丁或 高出这个范围，微生物的生长就被抑制i 已经有一定耐盐能力的细菌w hz j ( 适麻c 1 浓度为1 8 0 0 0 m 叽) 可以适应c i 浓度为2 4 0 0 0 m g l ，甚至3 2 0 0 0 m g l 。 ( 2 ) 在培养基d ，e ，厶g ，h 中，大肠杆菌d h 5 口都没有生长，说明大肠 杆菌d h 5 口不能适应氯离子的浓度，过高的氯离于浓度抑制了它的生长； ( 3 ) 在培养基d ，e ，f g ，h 中盐生杆菌j 7 也部没有生长，因为盐生杆 菌的生长非常缓慢，通常需要生长1 5 天【三【上才能观察到生长，而且盐生杆菌 j 7 的生长需要光照。因此在本实验生长6 天的情况下，没有观察到生长。但本 试验对用于生物处理的细菌要求是：细菌的生长要快：细菌利用有机物的 效率要高；细菌对生长条件的要求不高。由此可以看出，盐生杆菌j 7 并不符 合本试验所需细菌的要求。 ( 4 ) 在培养基i 中都观察不到三种细菌的生长，说明细菌不能有效利用环氧 丙烷废水中的有机物即对环氧丙烷废水有机物的降解能力是限制细菌生长的 主要因素之一。 第二阶段试验结果如下所示： 测试并记录细菌在培养基中六天的生长情况。试验结果如图3 - 2 所示。 武汉理工大学硕士学位论文 _ _ ； _ 33 关键酶的活性鉴定实验 331 试验材料和仪器 3 31 1 试验菌株 供试菌株为棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) c i c c l 0 1 8 9 ，购自北京市中国工 业微生物菌种保减管理中心。 331 2 试剂 武汉理工大学硕士学位论文 试验中用到的主要试剂见表3 3 ： 表3 - 3 主要试剂 试剂级别生产厂家 k 2 h p 0 4 分析纯上海试剂一厂 k h 2 p 0 4分析纯上海试剂一厂 m g s 0 4 7 h 2 0 分析纯上海试剂一厂 4 n 0 3分析纯广东汕头市西陇化工厂 c a c l 2 分析纯上海试剂一厂 牛肉膏分析纯北京双旋微生物培养基制品厂 蛋白胨分析纯北京双旋微生物培养基制品厂 n a c l分析纯上海试剂一厂 琼脂粉分析纯武汉市华顺生物技术有限公司 l ，3 一二氯一2 - 丙醇 分析纯深圳市亚王康丽技术有限公司 3 3 1 3 培养基 ( 1 ) 无机培养基同前； ( 2 ) 牛肉膏蛋白胨培养基1 5 】： 牛肉膏 5 9 蛋白胨 1 0 9 n a c l 5 9 琼脂粉 2 0 9 ( 配固体培养基时才加入) h 2 0 1 0 0 0 m l p h 7 2 - - 7 4 1 2 1 灭菌2 0 r a i n 3 3 1 4 仪器 试验中用到的主要仪器见表3 4 ： 武汉理工太学硕士学位论文 表3 - 4 试验中用到的常用仪器 试验仪器 生产厂家 y x q - l s - 1 8 s 1 型不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 u v - 1 7 0 0 紫外可见分光光度计 日本岛津( s h i m a d z u ) 公司 j a 2 0 0 3 型电子精密天平上海良平仪器仪表有限公司 s w a 一2 d 双人净化工作台苏州净化设备有限公司 q y c 2 0 0 型全温空气摇床上海福玛实验设备有限公司 7 8 - 1 型磁力加热搅拌器江苏省姜堰市银河仪器厂 332 试验方法 l 挑取经过牛肉膏蛋白胨固体培养基平板划线后的棒杆菌 ( c o r y n e b a c t e r i u ms p c i c c1 0 1 8 9 ) 单菌落接种于4 5 m l 的牛肉膏蛋白胨液体培 养基中1 2 1 8 h 温控摇床过夜培养( 2 2 0 r r a i n ，3 7 * ( 2 ) 。取过夜培养的菌液4 0 0 f l l 接种于5 0 m l 的牛肉膏蛋白胨液体培养基中扩大培养以待用。 2 毗1 ，3 - 二氯一2 一丙醇作为唯一的碳源加入到无机培养基中，加入量依次 为：5 0 m g l 、1 0 0 m g 几和2 0 0 m g t l 。同时做以甘油( 丙三醇，2 0 0 m g ，l ) 作为唯 一碳源的对照试验。温控摇床中培养( 2 2 0 r m i n ，3 7 ) ，测试并记录其7 天的生 长情况( 若o d 鲫2 ，即认为细菌已长好) 。 333 结果与讨论 测试并记录细菌在培养基中7 天的生长情况。试验结果如图3 3 所示 武汉理工大学硕士学位论文 图9 3 棒杆菌c i c c1 0 1 8 9 在各培养基中的生长情况 由图3 3 可以看出在以甘油作为唯一碳源的无机培养基中棒杆菌c i c c 1 0 1 8 9 第三天就已经生长好，说明棒杆菌能将甘油作为唯一的碳源有效利用；而 在以l ，3 一二氯2 丙酵作为唯一碳源的无机培养基中棒杆菌c i c c1 0 1 8 9 有生长 现象，但生长得不好，说明棒杆菌c i c c1 0 1 8 9 不能高效利用1 ，3 一二氯一2 一丙醇 作为碳源，但该细菌中可能存在着抗1 ，3 - 二氯一2 一丙醇的基因。 34 小结 i 培养基韵p h 值是抑制细菌生长的因素之一。 2 没有经过耐盐能力驯化的大肠杆菌d h 5 不能适应氯离子的浓度，即 过高的氯离子浓度抑制了它的生长，更不用说能够有效利用废水中的有机物； 3 经过驯化具有一定耐盐能力( 可适应a 。浓度1 8 0 0 0 m g l ) 的细菌w h 7 j 可以适应c l 浓度高选3 2 0 0 0 m g r l 的环氧丙烷废水，即高盐度并不是限制细菌生 长的障碍。 4 从武汉沙湖污水处理厂取回的活性污泥中的细菌不能有效利用环氧丙烷 废水中的有机物，即对环氧丙烷废水中有机物的降解能力才是限制细菌生长的 主要因素之。 5 捧杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) c i c c1 0 1 8 9 不能高效利用i ，3 二氯2 一 丙醇作为碳源，但该细菌中可能存在着抗1 ，3 - 二氯一2 一丙醇的基因。 一一一 武汉理工大学硕士学位论文 第4 章h h e a 和h h e b 基因的克隆研究 4 1 引言 本章研究旨在第二章对氯丙醇生物降解机制的研究以及第三章对棒杆菌中 关键酶的活性鉴定实验的基础上，从能合成关键酶h a l o h y d r i ne p o x i d a s ea ( 卤 代醇环氧酶a ) 和h a l o h y d r i ne p o x i d a s eb ( 卤代醇环氧酶b ) 基因的代表性微 生物棒状杆菌中提取出该微生物的基因组总d n a ，用p c r 手段扩增出所需要 的潜在目的片段基因h h e a 或h h e b ，经确认鉴定后作为潜在目的基因使用，并 构建重组质粒p h x 3 0 3 h h e a 或p h x 3 0 3 一h h e b ，最后将重组质粒p h x 3 0 3 h h e a 或p h x 3 0 3 h h e b 转化到感受态细胞大肠杆菌d h 5 a 中进行表达，以便于后续构 建工程菌，达到高效降解有机氯化物一l ，3 一二氯2 丙醇的潜在目的。 4 2 试验材料和仪器 4 2 1 试验菌株和质粒 供试菌株为棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) c i c c1 0 1 8 9 ，购自北京市中国工 业微生物菌种保藏管理中心。载体p h x 3 0 3 和e c o l id h 5 a 由武汉理工大学理学 院生物科学与技术系谢浩实验室提供。 4 2 2引物 引物h h e b f 2 和h h e b r 2 根据棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p ) 的h a l o h y d r i n e p o x i d a s eb 在n c b i 上的登录信息设计，设计上游引物为5 - 钮g 丸玎t c g g c ta a cg g a a g ga a aa g - 3 ，其中引入e c o ri 酶切位点；下游引物为 5 - - g c ct g ca g t g g c c c ag c cg c cg t cg 37 ，引入h i n d i 酶切位点；引 物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 4 2 3 试剂 武汉理工大学硕士学位论文 试验所用到的主要试剂见表4 1 。 表4 1 主要试剂 试剂级别生产厂家 胰蛋白胨生化试剂北京双旋微生物培养基制品厂 酵母浸粉生化试剂北京双旋微生物培养基制品厂 n a c l 分析纯上海试剂一厂 e d t a 分析纯上海试剂一厂 t r i s ( - - 羟甲基氨基甲烷、生化试剂武汉市华顺生物技术有限公司 琼脂粉生化试剂武汉市华顺生物技术有限公司 溶菌酶生化试剂武汉市华顺生物技术有限公司 氨苄青霉素生化试剂武汉生命技术有限公司 s d s ( 十二烷基硫酸钠)分析纯国药集团化学试剂有限公司 丙三醇分析纯上海申博化工有限公司 m 叮t p s生化试剂武汉凌飞科技有限公司 兄d n 枷n d h i m a r k e r s生化试剂天根生化科技( 北京) 有限公司 t a q d n a 聚合酶 生化试剂天根生化科技( 北京) 有限公司 1 0l o a d i n gb u f f e r 生化试剂上海硕盟生物科技有限公司 h i n d i i i生化试剂 上海硕盟生物科技有限公司 e c o ri生化试剂上海硕盟生物科技有限公司 t 4 d n a 连接酶生化试剂东洋纺( 上海) 生物科技有限公司 c i a p生化试剂东洋纺( 上海) 生物科技有限公司 4 2 4 培养基 ( 1 ) l b ( l u r i - - b e r t a n i ) 培养基同前； ( 2 ) 选择培养基l b a 5 2 】： 当刚灭菌的l b 固体培养基凉到大约5 0 6 0 c 时，向其中按 1 0 0 2 l a m p r 1 0 0 m l l b 比例加入氨苄青霉素。 4 2 5 主要试剂盒 武汉理工大学硕士学位论文 d p 3 0 2 细菌基因组d n a 提取试剂盒购白天根生化科技( 北京) 有限公司； d p 2 0 9 琼脂糖凝胶d n a 回收试剂盒购自天根生化科技( 北京) 有限公司。b i o s p i n p l a s m i dd n ae x t r a c t i o nk i t ( 购自杭州博日科技有限公司) ；b i o s p i ng e l e x t r a c t i o nk i t ( 购自杭州博日科技有限公司) 。 4 2 6 仪器 试验中用到的主要仪器见表4 2 。 表4 2 试验中用到的常用仪器 试验仪器生产厂家 7 8 1 型磁力加热搅拌器江苏省姜堰市银河仪器厂 y x q l s 一1 8 s i 型不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 u v - 1 7 0 0 紫外可见分光光度计 日本岛津( s h i m a d z u ) 公司 j a 2 0 0 3 型电子精密天平上海良平仪器仪表有限公司 s w - c j 一2 d 双人净化工作台苏州净化设备有限公司 q y c 2 0 0 型全温空气摇床上海福玛实验设备有限公司 d y c p 31 b ( 迷你) 型电泳槽北京市六一仪器厂 2 0 0 4 2 1 ( 5 0 1 ) 超级恒温水温 常州国华电器有限公司 z 3 6 h k 型高速冷冻离心机德国h e r m l e ( 哈默) 公司 d p x 9 0 8 2 b 1 型电热恒温培养箱上海福玛实验设备有限公司 0 5 0 8 0 1t g r a d i e n t9 6 型p c r 仪 德国w h a t m a n b i o m e t r a 公司 p h 2 1 1 c 型台式酸度计 北京哈纳科仪科技有限公司 4 2 7常用溶液的配制 ( 1 ) 破细胞壁溶液：本实验室存有1 m ，p h = 8 0 的t r i s ( 三羟甲基氨基甲烷) 和0 5 m 的e d t a 。用时取上述2 0 1 t l t h s ，4 l t l e d t a 再加9 7 6 l 无菌水，混 均即配成0 0 2 mt r i s ，0 0 0 2 me d t a 的细胞破壁液； ( 2 ) 1 0 ( 1 ) 的s d s ( 十二烷基硫酸钠) ：称1 0 0 9 s d s 转移至约含o 9 l 无 菌水的烧杯中用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，用无菌水定容至1 l 后贮存。用时 将上述贮存液稀释成5 的s d s ； 武汉理工大学硕士学位论文 ( 3 ) 5 0 x t a e t 5 3 】：称量t r i s2 4 2 9 ，1 0 0 m l 0 5 m 的e d t a ( p h - - 8 o ) ，加入5 7 1 m l 的冰醋酸，用无菌水定容至1 0 0 0 r a l 。用时将上述贮存液稀释成1 t a e ； ( 4 ) e b ( 溴化乙锭，d n a 染色剂，1 0 m g m l ) ：在1 0 0 0 m l 水中加入l g 溴化乙锭，使之充分溶解，于室温保存在棕色瓶中。e b 为强诱变剂并具有中度 毒性，使用时需要带上手套。 ( 5 ) 氨苄青霉素：将氨苄青霉素溶于无菌水，配制成2 0 0 m g m l 的水溶液， 过滤除菌，分装于1 5 m l 离心管中，贮存于一2 0 。 4 3 试验方法 4 3 1 棒杆菌总d n a 的提取蚓 棒杆菌c i c c1 0 1 8 9 总d n a 使用细菌基因组d n a 提取试剂盒提取，经改 进后方法如下： ( 1 ) 将2 8 。c 摇床过夜培养的棒杆菌l m l 接种到5 0 m l l b 液体培养基中摇床 2 8 。c 培养3 h 左右至o d 6 0 0 值达到o 6 ，以获得足够的菌体； ( 2 ) 将菌液装入5 0 m l 离心管中，2 5 。c ，5 0 0 0 9 离心1 0 m i n ，去掉上清液， 保留沉淀； ( 3 ) 用1 9 6 l 破壁液重悬沉淀，再转入1 5 m l 离心管中； ( 4 ) 加入适量溶菌酶，