（分析化学专业论文）神经递质电化学生物传感器研究.pdf

主里型兰垫查查兰壁主婴塞圭望些堡奎：奎塑墨一 中文摘要 在综述了皇丝兰生物传感器和生物电化学分析方法的基础上，本论文 以制备新型高性能的电化学生物传感器为出发点，进行了过氢化氢、望越 和乙酰胆碱的电化学生物传感器的制备和研究工作。在传感器的制备过程 中，发现经过电化学预处理，碳基底电极对过氧化氢有一特殊的虫沆目娩， ( 因此专门有一割对这一现象进行了初步的研究。为了开展电化学生物传感 与生物学的交叉研究，论文工作中组建了膜肚钳系统并进行了初步的应用， 咽此也专门有一割对此进行讨论。 ， f 通过吸附亚甲蓝分子于石蜡饱和浸渍的光谱石墨电极( w s g e ) 上， 制备了亚甲蓝修饰电极( i v i b w s g e ) 。发现亚甲蓝在w s g e 电极表面非 常稳定，可5 小时连续扫描而伏安峰电流没有明显降低，因此可能成为一 种高性能、长寿命生物传感器的基础电极。对亚甲蓝分子能够在w s g e 电 极表面发生如此稳定的吸附作用，提出了亲水亲脂两相界面机理的假设。 在m b ，w s g e 基础电极上，通过戊二醛交联辣根过氧化物酶制备了过氧化 氢电化学生物传感电极( 阳m b ，w s g e ) ，制作过程简便而又易于重现； 该传感器在水溶液中具有良好的电化学行为，有良好的稳定性和重现性， 对过氧化氢有灵敏的电流响应，线性范围为99 x 1 0 - 6 64 9 x 1 0 m o l l ，1 0 倍浓度的多巴胺和抗坏血酸不干扰测定，并适合于长期的使用。m b 在该 传感膜中的电子转移速率常数为0 1 2 s ，有高效的电子媒介作用和稳定的 性能，因此m b w s g e 酶可望成为酶传感器的一种新型基础电极。 在玻碳电极上用电化学方法沉积了一层均匀分布的亚微米直径的铂颗 粒，并在其上修饰一层胆碱氧化酶膜，制成了新型胆碱酶电极( c h o x p t b l a c k g c e ) ；配合电子扫描电镜表征，确定了电沉积亚微米铂颗粒的优化 条件，包括( 1 ) 玻碳电极预处理：10 m o l l n a o h ，+ 1 8 v ( v s s c e ) ，2 m i n ； ( 2 ) 电沉积：o0 1 m o i l 氯铂金酸+ o0 5 m o l lp h 70 p b s ，一03 5 v ，1 0 m i n ： 确定了c h o x p t b l a c k g c e 传感器的优化的电位阶跃测试条件为：0 1 m o l l p h 7 0p b s ，e ，= 1 5 0 m v ，e 2 = 5 0 0 m v ；用电位阶跃后1 m i n 的响应为采样电 流，其得到线性检测范围为2 4 x 1 0 - z _ 1 0 m m o i l ，检测限为74 1 0 - 6 m o l l ， 3 0 天后电流响应下降仅5 。由于可用仪器的限制，本章使用电位阶跃法 检测，为了消除充电电流的影响，对电流衰减1 m i n 后的值采样，因此本 c h o x p t b l a c k g c e 传感检测，未能达到其应有的灵敏度和检测限；该传感 器制作方法简便、重现性好、寿命较长、线形范围宽、灵敏度较高，可以 在此基础上制作乙酰胆碱传感器。 中国科学技术大学博士研究生毕业论文：中文捕要 在成功研制的铂黑修饰电极基础上，利用交联剂戊二醛和惰性蛋白质牛 血清蛋白固载乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶而制作了乙酰胆碱电流型生物传 感器微阵列( a c h e t c h o x p t b l a c k g c e ) 。研究确定了酶膜中胆碱氧化酶 和乙酰胆碱酯酶的最佳配置为：活性单位比例为l ：1 5 。研究确定了该传感 器的优化的电位阶跃测试条件为：0l m o i lp h 7 0p b s ，局= 1 5 0 m v ，e 2 = 5 0 0 m v ；用电位阶跃后1 r a i n 的响应为采样电流，其得到线性检测范围为 29 x 1 0 一1 2 1 0 一m o l l ：信噪比为3 时，检测限为87 1 0 - 6 m o l l 。该传感 器具备了良好的稳定性和重现性；并可长期使用。 发现玻碳电极或充蜡光谱石墨电极在经过在强酸或强碱溶液中的电化 学预处理后，在01 2 v ( v ss c e ) 左右出现了对过氧化氢的还原电流峰。初 步认定该电流响应与电极表面的含氧基团的电化学催化作用密切相关；提 出了一种可能的电极反应机理，认为醌基团作为表面电化学催化剂催化还 原过氧化氢。这个特殊的伏安响应可能给制备过氧化氢传感器提供新的思 路，需要加以注意并做进一步深入和系统的研究。 为配合活体电化学分析研究，成功组建了包括有防震台、屏蔽罩、倒 置相差显微镜、膜片钳放大器、p c 5 8 6 微机、膜片钳数据采集分析包和微 动操作器的膜片钳系统。采用常规全细胞模式电压钳操作方式，初步研究 了肾上腺嗜铬细胞的钠、钾和钙的离子通道的电压依赖性反应，和钠离子 通道的反转电位。采用电流钳操作方式，观察了肾上腺嗜铬细胞的动作电 位。这一在电化学实验室组建的膜片钳系统，是电化学和电生理研究交叉 的接口，可望为实验室的科研带来新的活力和发展前景。该系统不仅可以 用于细胞信号的提取，而且有可能将细胞或细胞膜膜片作为生物传感器的 生物识别部分予以利用，为生物传感器的发展提供了一个新的途径。，。 主里登堂垫查奎堂堕圭墅壅生望、业堡茎! 苎奎塑墨 a b s t r a c t o nt h eb a s i so fr e v i e w i n gt h ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sa n db i o l o g i c a l e l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i s ，n e wt y p eo fh y d r o g e np e r o x i d e ，c h o l i n e ( c h ) a n d a c e t y l c h o l i n e ( a c me l e c t r o c h e m i c a l b i o s e n s o r sw e r ef a b r i c a t e da n dc h a r a c t e r i z e d i nt h i sd i s s e r t a t i o nb e c a u s ea c hi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tn e u r o t r a n s m i t t e r s a n dc hs e r v e sa sap r e c u r s o ra n dam e t a b o l i t eo fa c h m u c ha t t e n t i o nh a sb e e n d e v o t e dt ot h ed e t e c t i o no fa c ha n dc hh o w e v e r ，n e i t h e ra c hn o rc hi s o x i d i z a b l ea n dt h e yu s u a l l yh a v et ob ec o n v e r t e dt om o r ee a s i l yd e t e c t a b l e c o m p o u n d s g e n e r a l l ya c h a n dc ha m p e r o m e t r i cb i o s e n s o rw e r eb a s e do nt h e d e t e c t i o no f h 2 0 2 ，t h eh y d r o l y s a t eo f c ha n da c ho u rw o r kf o l l o w st h i ss t r e a m ， h o w e v e r ，s y s t e m a t i ci n v e s t i g a t i o nw a sc a r r i e do u tf o rn o v e lp r e p a r a t i o no f t h e b a s ee l e c t r o d e ，h y d r o g e n p e r o x i d eb i o s e n s o r ，c h o l i n eb i o s e n s o ra n da c e t y l c h o l i n e b i o s e n s o ra p a r to f t h i sd i s s e r t a t i o nd e s c r i b e st h ew o r ko fs e t t i n gu pap a t c h c l a m ps y s t e mi no u rl a b o r a t o r y i nt h i sp a r t t h ep r e l i m i n a r yc h a r a c t e r i z a t i o na n d a p p l i c a t i o no f t h i ss y s t e m a r ep e r f o r m e df o r i n t e r d i s c i p l i n a r yr e s e a r c hb e t w e e n t h e e l e c t r o c h e m i c a l a n a l y s i s a n d e l e c t r o p h y s i o i o g y ，w h i c h w i l lb e n e f i ti n v i v o a p p l i c a t i o no f b i o s e n s o r f i r s to f a l l ，am e t h y l e n eb l u e ( v l b ) m o d i f i e dg r a p h i t ee l e c t r o d e ( m b w s g e ) w a sp r e p a r e d b ya d s o r b i n gt h e m o l e c u l e so na s p e c t r o g r a p h i cg r a p h i t e d i s c e l e c t r o d es a t u r a t e dw i t hw a x ( w s g e ) i tw a sf o u n dt h a tt h em bm o l e c u l e sw e r e v e r ys t a b l e o nt h es u r f a c eo ft h ew s g ea f t e rb e i n gs c a n n e dc o n t i n u a l l yi n p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o nf o r5h r s ，t h ep e a kc u r r e n to f t h em e t h y l e n eb l u eo n l y s l i g h t l yd e c r e a s e d t h i sm a yb er e s u l t e df r o mt h ea d d i t i o n a l a d s o r p t i o na c t i v i t y d u et ot h eh y d r o p h o b i ca f f i n i t yb e t w e e nt h e c h 3g r o u p so ft h em bm o l e c u l e s a n dt h ew a x p h a s eo f t h ew s g e t h e n ，an o v e lh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o rw a sf a b r i c a t e d b a s e do n i m m o b i l i z a t i o no f h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s eo nt h em b ，w s g eb yc r o s s 1 i n k i n gw i t h g l u t a r a l d e h y d e t h i se l e c t r o d ee x h i b i t e de x c e l l e n te l e c t r o c h e m i c a l a c t i v i t y i n a q u e o u ss o l u t i o n s ，a n dt h ee l e c t r o nt r a n s f e rr a t e c o n s t a n to ft h ea d s o r b e dm b w a sd e t e r m i n e da s012 s i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tt h em o d i f i e d 噼m o l e c u l e s c o u l ds h u t t l ee l e c t r o n sb e t w e e ni m m o b i l i z e dh r pa n dg r a p h i t es u b s t r a t ev e r y w e l lf o rh 2 0 2s e n s i n g t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h i ss e n s o rw e r ee v a l u a t e dw i t h r e s p e c t t oa p p l i e dp o t e n t i a la n d p h t h ea m p e r o m e t r i cr e s p o n do f t h i sb i o s e n s o r t oh 2 0 2s h o w sal i n e a rr e l a t i o ni nt h er a n g eo f 9 9 p m o j l t o6 4 9 9 m o i lw i t ht h e c o r r e l a t i o ne f f i c i e n to f09 9 7 9ad e t e c t i o nl i m i to f30 10 4 m o l l h y d r o g e n p e r o x i d e w a se x a m i n e da t s i m p l ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s d o p a m i n e a n d 主里型兰垫查查兰堕主堑塑兰兰些堡奎! 墨苎塑萋 一一 a s c o f b i ca c i dd i dn o ti n t e r f e r ew i t ht h ed e t e r m i n a t i o nt h i s s e n s o rw a sa l s os t a b l e ， r e p r o d u c i b l ea n do u t s t a n d i n g f o r l o n g t e r m u s e i na d d i t i o n , ac h o l i n eo x i d a s e ( c h o x ) o ra c e t y i c h o i i n e a s t e r a s e c h o l i n e o x i d a s e ( a c h e t c h o x ) e n z y m el a y e rw a sc o m p o s e d o np l a t i n u mb l a c km o d i f i e d e l e c t r o d e ( p t b l a c k g c e ) f o rf a b r i c a t i o no f ac ha n da c hm i c r o b i o s e n s o r a r r a y s ，t h e p t b l a c k g c ew a s p r e p a r e db y e l e c t r o c h e m i c a l l yd e p o s i t i n g u n i f o r m l yd i s t r i b u t e ds u b m i c r o m e t e rp l a t i n u mp a r t i c l e so n t h es u r f a c eo fag l a s s y c a r b o ne l e c t r o d e t h e o p t i m u mc o n d i t i o n s o fe l e c t r o d e p o s i t i o nw e r ea l s o d e t e r m i n e d 、t h a ti s ，( 1 ) t h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d ew a sf i r s te l e c t r o c h e m i c a l l y p r e t r e a t e d i nn a o hs o l u t i o na t 18 vf o r2m i nt o i m p r o v ei t sa m p e r o m e t r i c r e s p o n s e ，( 2 ) t h ed e p o s i t i n gp o t e n t i a l w a s o35 v ( v s s c e ) ，a n d ( 3 ) t h e d e p o s i t i n gt i m ew a s1 0 r a i n t a k i n gt h ea d v a n t a g eo f t h et r e m e n d o u ss u r f a c ea n dt h ee x c e l l e n tc a t a l y s i s a c t i v i t yo fp l a t i n u m b l a c kp a r t i c l e s ，c ha n da c h c a nb ed e t e r m i n e ds a t i s f a c t o r i l y b yd e t e c t i n gt h eo x i d a t i o nc u r r e n to fh 2 0 2o nt h ep t b l a c k g c e t h ed e t e c t i o n c o n d i t i o n so f c hb i o s e n s o ra n da c hb i o s e n s o rf o rc ha n da c h r e s p e c t i v e l y ，w e r e s i m i l a rt h e s u p p o r t i n ge l e c t r o l y t e w a s p h70 01m o l lp h o s p h a t e b u f f e r s o l u t i o nt h ei n i t i a l p o t e n t i a la n dw o r k i n gp o t e n t i a lw a s015 va n d05 v ( v s s c e ) r e s p e c t i v e l y t h ea m p e r o m e t r i cr e s p o n s eo f t h ec h 偿t - b l a c “g c em i c r o b i o s e n s o ra r r a yg a v eal i n e a rr e l a t i o ni nt h er a n g eo f2 4t o10 0 0p m o l la n da d e t e c t i o nl i m i to f 7 4 1 t m o l lc h o l i n e t h ec h r o n o a m p e r o m e t r i cr e s p o n s e so ft h e a c h p t - b l a c k g e em i c r o b i o s e n s o ra r r a yg a v eal i n e a rr e l a t i o ni nt h er a n g eo f 2 9 t o1 2 0 0g m o l la n dad e t e c t i o nl i m i to f87 i r t m o l l a c e t y l c h o l i n et h e ya l s o p o s s e s s e dv e r yg o o ds t a b i l i t ya n dr e p r o d u c i b i l i t yf o rl o n g - t e r m u s ea f t e rs t o r e d i n p h7 0p h o s p h a t e b u f f e rs o l u t i o na t 4 0 c ，t h e c u r r e n t r e s p o n s e o fb o t h b i o s e n s o r so n l yd e c r e a s e da b o u t5 f o ro v e ro n em o n t h d u r i n gt h es t u d yo ft h ep r e t r e a t m e n to ft h ec a r b o n b a s e de l e c t r o d e s ，a n u n u s u a lc u r r e n t r e s p o n s eo ft h o s ee l e c t r o d e s t o h y d r o g e np e r o x i d ew a sf i r s t o b s e r v e dt h i si r r e v e r s i b l er e d u c t i o nc u r r e n ta p p e a r e da tp e a kp o t e n t i a lo fa b o u t - 01 2 v ( v s s c e ) i na d d i t i o n ，t h i su n u s u a lc u r r e n tr e s p o n s ew a sr e p r o d u c i b l y o b s e r v e do nb o t hg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e sa n dw a x e ds p e c t r o g r a p h i cg r a p h i t e e l e c t r o d e st h e p r e l i m i n a r ys t u d y w a s r e p o r t e d i nt h ed i s s e r t a t i o na n dt h e c o r r e s p o n d e n tm e c h a n i s mf o rg e n e r a t i o no f t h i sc a t h o d i cp e a kw a sp r o p o s e d t h ec u r r e n tw a sr e l a t i v et oa d s o r p t i o no f h 2 0 2a n d c a t a l y t i cr e d u c t i o no f q u i n o n e s e m i q u i n o n er a d i c a lo n t h es u r f a c eo f t h ee l e c t r o d e t h i sv o l t a m m e t r i cr e s p o n s e i sp o s s i b l yu s e f u lf o rp r e p a r a t i o no f n o v e l h y d r o g e np e r o x i d es e n s o r sw i t h o u ta n y o t h e rm o d i f i c a t i o n i v 中国科学技术大学博士研究生毕业论文：英文摘要 i no r d e rt o i n c o r p o r a t e i n v i v o e l e c t r o a n a l y s i sw i t he l e c t r o p h y s i o l o g y ，a p a t c h c l a m ps y s t e m w a si n t r o d u c e dt oo u re l e c t r o a n a l y t i c a lc h e m i s t r yl a b o r a t o r y t h i sp a t c h c l a m ps y s t e mc o n s i s t so f av i b r a t i o ni s o l a t i o nt a b l e ，af a r a d a yc a g e ，a n i n v e r t e d m i c r o s c o p e ，ap a t c h c l a m pa m p l i f i e r , m i c r o m a n i p u l a t o r , a p c 5 8 6 c o m p u t e r ，a n dap a t c h c l a m pd a t as a m p l i n ga n da n a l y s i sp a c k a g eb yu s i n gt h e w h o l ec e l lr e c o r d i n go f t h ev o l t a g e c l a m pm e a s u r e m e n t ，t h ep o t e n t i a ld e p e n d e n c e o ft h es o d i u m p o t a s s i u ma n dc a l c i u mi o nc h a n n e l so ft h en na d r e n a lc h r o m a f f i n c e l lw a sc h a r a c t e r i z e dt h ea c t i o np o t e n t i a lw a so b t a i n e do nt h ec e l lb yc u r r e n t c l a m pm e a s u r e m e n tf u r t h e ra p p l i c a t i o no f t h ep a t c h c l a m ps y s t e mc a np r o v i d e a c h a n c ef o ri n t e r d i s c i p l i n a r yr e s e a r c hb e t w e e nt h ee l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i sa n d e l e c t r o p h y s i o l o g y t h u si tc a nd of a v o rt ot h ed e v e l o p m e n to ft h el a b o r a t o r y t h i ss y s t e mn o to n l yc a no b t a i nt h ei n f o r m a t i o no fc e l l sb u ta l s oc a nt a k e a d v a n t a g e s o fr e c e p t o r so nt h ec e l lm e m b r a n e st o f a b r i c a t en o v e l t y p e o f b i o s e n s o r v 主望型堂垫查查兰壁主里塑生兰些丝兰! 蔓堂 致谢 在学位论文完成之际，回想三年来的学习、工作和生活，不禁思绪万 千，深有感触。 首先要深深地感谢林祥钦教授在我博士生学习阶段对我的悉心指导和 关心。林老师高度的科学素养、敏锐的学术洞察力和严谨求实的治学态度 给我的启迪和鞭策极大，论文中的字里行间也处处凝聚了老师的心血和汗 水。老师为人师表的风范和献身科学的精神，给我留下了深刻的印象，必 将使我终身受益。 我还要感谢生命科学学院生物物理实验室周专教授、何玲林同学和张 晨同学对我的无私帮助。周博士在我组建膜片钳系统时，不仅提供了很多 的资料，而且提供了大量的实验材料。在此我向他表示由衷的感谢和深深 的敬意。 感谢本专业和实验室的吴守国副教授、张汉昌副教授、芮蕾老师、金 葆康教授、尹屹梅讲师和童中华讲师在实验上和生活上的大力支持与帮助。 本论文的完成还得到本课题组的所有成员邓兆祥同学、陈宗海同学、孙 玉刚同学、缪谦同学、张雷同学、李凤同学、汪夏燕同学、崔兴品同学、 杜鹏同学、郑赛晶同学和王树青同学对我的真诚帮助和关心。尤其要感谢 陈宗海同学对我精神上的大力支持和帮助。 最后，感谢我的祖母、我的父母和兄嫂对我的爱。他们是我生活和学 习的永远的动力。 陈峻 2 0 0 0 42 4 中国科学技术大学博士研究生毕业论文：电化学生物传感器与生物电些兰坌堑查鎏 第一章o a 4 9 学牛_ 物传感器与生物电化学分析方法 第一节电化学生物传感器 1 1 1 引言 生物传感器( b i o s e n s o r ) 作为化学传感器( c h e m i c a ls e n s o r ) 的一个 分支，早在十九世纪末就已经出现了。早期的研究是建立传感器理论、寻 找制备传感器的新技术和新材料。近二、三十年来，生物传感器研究有了 长足的进步，许多不同领域的研究人员如药物学家、物理学家、化学家、 电子工程人员都参与到生物传感器研究领域来。 一般人们认为第一个生物传感器是由c l a r k 和l y o n s 于1 9 6 2 年制作的 葡萄糖传感器 r 1 1 。术语“生物传感器”就来自于他们以及g u i l b a u l t 等人 的研究工作 r 2 ，r 3 。从那以后，有生物传感部分加入的物理化学换能器所 构成的各式传感器大大发展起来，这种装置被统称为生物传感器，它可以 对化学或生物化学物质的浓度产生电信号函数 r 4 1 。早期的传感器形式比 较简单，以物理捕获可逆性酶或将酶膜固定于电化学传感器上即可制作。 随后，这些体系通过直接固载大量生物分子于换能器上获得了发展。近年 来，人们则直接共价固载有机单层生物分子于半导体材料、波导管等换能 器上，获得了大量类型的生物传感器。由于微电子和光纤技术的发展，可 用于生物传感器制作的物理换能器的数量大大增加。而生化、免疫生化和 生物技术的发展，又大大提高了可应用于生物传感器的特性酶、抗体、组 织、活组织和受体的数量。这为生物传感器的迅速发展奠定了良好的物质 基础。 1 1 2 生物传感器的定义及其分类 国际纯粹和应用化学联合会( m r p a c ) 提出的生物传感器和化学传感 器的定义如下： 生物传感器：是化学传感器的一个分支，是利用生物机制检测分析底物的 化学传感器。 化学传感器：选择性并可逆地响应化学物质或离子的小型化换能器，可产 生依赖于分析底物浓度的电信号 r 5 】。 中国科学技术大学博士研究生毕业论文：电化学生翅篮壁壁兰生望皇垡堂坌塑查鎏 生物传感器的基本组成部分包括：生物识别部分、物理换能器、电子放 大器和数字处理等，如下图所示： 生物 化学环境 b i o l o g i c a l - + c h e m i c a l e n v i r o n m e n t 生物传感器 b i o s e n s o r 陌面蕊翮 l p h y s i c a l l l t r a n s d u c e ri 电信号 e l e c t r i c a l s i g n a l 冒| d 要 图1 1 生物传感器的基本组成部分 f i g1 - ie s s e n t i a lb i o s e n s o rc o m p o n e n t s 生物识别部分又称分子识别元件，是生物传感器的关键部分，是传感器 进行选择性检测的基础，可以包括任何生物材料，只要它可以选择性地识 别一个分析底物或一系列相关的分析底物，一般包括酶、受体、免疫化合 物、微生物、转运蛋白以及动植物组织。生物传感器按其分子识别元件， 可分为酶传感器、免疫传感器、组织传感器、微生物传感器和细胞传感器。 物理换能器有很多种，生物传感器的典型分类是按它们的物理换能器划 分，包括热、质量、电化学、光学、光一电化学传感器等，如表1 1 所示。 生物电化学传感器又可分电流型和电位型两种。 从理论上来讲，合适的生物物质如酶、受体、免疫物质等都可以与任何一 种类型的换能器结合，制作生物传感器来测量相应的分析物。但实际制作 时还应考虑以下若干方面，以备将来实际的应用需要j r 6 1 ( 1 ) 方法的可逆性以及其再生性； ( 2 ) 是否需加入除分析底物外的其他试剂如辅助剂或氧化一还原媒介体 等； ( 3 ) 传感器与其应用环境的界面状况； ( 4 ) 传感器的使用环境。 在上述生物传感器中，研究和应用最多的是酶传感器。并且因为作者 所做实验工作都基于酶传感器，所以本章重点论述酶的电化学生物传感器。 主里型兰垫查盔兰堕主至壅圭望些笙苎! 叟墨堂兰塑堡堕堡量生塑皇垡兰坌堑查垦一 表1 1 生物传感器组成 t a b l e1 - lb i o s e n s o rc o m p o n e n t s 生物识别部分 物理换能器 b i o l o g i c a lr e c o g n i t i o n e l e m e n t s 酶e n z y m e 受体r e c e p t o r s 抗体a n t i b o d i e s 细胞c e l l s 组织( 动植物) t i s s u e s ( b o t hp l a n ta n da n i m a l ) 传感器官s e n s i n go r g a n s p h y s i c a t r a n s d u c e r s 热t h e r m a l 质量，m a s s 电化学e l e c t r o c h e m i c a l 光学，o p t i c a l 光电化学o p t o - e l e c t r o n i c 1 1 3 酶的基本概念 酶是由活细胞合成，能在体内、体外起催化作用的一类特殊蛋白质， 又称生物催化剂。酶学中，常将受酶催化的物质称为底物或基质。所有酶 的突出特点就是它们催化作用的高度专性。 酶的催化效率比一般催化剂高1 0 6 一f o ”倍，远远超出一般催化剂的催 化能力。酶的催化效率可用酶的周转率来表示。所谓周转率是指l m o l 的酶， 在最适合的条件下，l m i n 内催化底物反应的摩尔数。酶的周转率大约在 1 0 0 。5 0 0 0 0 0 0 之间。如1 分子的过氧化氢酶( 肝) 在i r a i n 之内可催化5 0 0 0 0 0 0 个过氧化氢分子分解为水和氧。与铁催化剂相比，催化效率高1 0 0 亿倍。 大多数酶的本质是蛋白质。它对周围环境条件的变化很敏感，极易受 外界条件的影响而改变它的结构和性质，例如高温、紫外线、重金属盐、 强酸和强碱等都会导致蛋白质变性，使酶破坏而丧失催化活性。 目前已知的酶有数干种，并且还有许多酶正在被发现出来。为了更有 效地研究和应用各种酶，1 9 6 1 年国际酶学委员会根据各种酶所催化的反应 类型和机理，提出了一个分类系统，把酶分为六大类： 1 、氧化还原酶类：催化氧化还原反应。如葡萄糖氧化酶、胆碱氧化酶 等。 2 、转移酶类：催化分子基团从一个分子转移到另一个分子的反应。如 转甲基酶、转氨酶和磷酸化酶等。 主里型堂茎查查兰苎主堡塞生望、业堕奎! 皇些堂竺塑堡壁壁量生竺皇些兰坌堑立鲨 3 、水解酶类：催化加水分解的反应。如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。 4 、裂合酶类：催化从双键上除去个基团或加入一个基团的反应。如 碳酸酐酶、醛缩酶等。 5 、异构酶类：催化分子间重排的有关反应。如磷酸葡萄糖异构酶、丙 氨酸消旋酶等。 6 、合成酶类：催化两分子化合物互相结合，同时使a t p 分子( 或其 他三磷酸核苷) 中的高能磷酸键断裂提供能量。如谷氨酰胺合成酶、 谷酰甘肽合成酶等。 在上述六大类的基础上，每一大类又分成若干亚类，每一亚类再分为 若干组，每一组直接包括若干酶，各级分类及个别的酶均以阿拉伯数字表 示其固定的编号。所以每一种酶的分类编号都用四个数字来表示。例如谷 丙转氨酶的固定编号为2 61 2 ，其含意如下： 2 大 类 转 移 酶 类 6 亚 类 一 转 含 氮 基 者 1 组 一 转 氨 基 者 2 直 接 包 括 个 别 酶 1 1 4 分子识别 1 1 4 1 物理化学性质 分子识别中被选定的生物物质需要一系列适合的物理化学性质，包括提 供可以专一地与底物反应或相互作用的反应位点：在一定温度范围内的稳 定性；被化学方法修饰和固载于载体而不危及本身性能的可能性等。 酶用于生物识别部分有其优点和局限性。主要优点包括酶的可逆本质和 大量的固载方法及其相对稳定性 r 7 】。一般描述酶动力学的表达式为米氏 方程 r 8 1 ： 里型兰垫查奎兰整主堕塑生兰些丝兰! 皇垡堂兰塑生堕堡量生望皇些兰坌丝变鳖一 ，圪。【跚 肛莓满 其中矿代表反应速率，单位为m o ls ； s 】是底物浓度；。是最大反应速 率：k m 是米氏常数，即反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。当 底物浓度很低，如 s k 时，反应速率与底物浓度呈正比，反应为一级反 应。而一般包括酶生物传感器在内的酶应用实例中，底物浓度都比k 要小 很多，所以酶传感器的动力学范围和检测限主要由酶的米氏常数值决定。 人们已广泛使用各种酶如葡萄糖氧化酶、胆碱氧化酶、尿酸酶、过氧化 氢酶等来制作酶生物传感器，但是，这类传感器的局限性是检测物必须是 酶的底物或酶的抑制剂。 受体和抗体应用于生物传感器的识别部分比用酶更具优势。这些大分子 与它们的配体间亲和力的范围更广泛，因此可检测的化合物范围更宽。抗 体可以面向许多不同种类的分析底物，从细菌的专一应变的决定子到小分 子量的药物和污染物都可被检测 r 9 。抗体与特殊分析底物的亲和力可以 使检测限降低至1 0 4 到1 0 。o m o l l r 1 0 。虽然大量的抗体生物传感器是基于 不可逆的键合化学，这一局限性可通过降低缓冲溶液的p h 值来解离抗体， 使抗体再激活应用 r 1 1 ，也可以应用与抗原之间的可逆键合来固载单克隆 抗体加以克服 r 1 2 。 生物大分子，主要是蛋白质，亦可运用于底物识别。但是由于其化学和 热不稳定性，在实际应用时不很理想。而人工亲和体系，如超分子化学中 的人造“受体”可以具有理想的选择性和一定的催化活性j r l 3 1 。 1 1 4 2 检测原理 酶生物传感器的检测原理实际上是依赖于酶的催化作用，将不可检测 的底物转化为可被光学方法或电化学方法检测的产物。这可扩展为运用第 二种酶将不可检测的第一代产物转化为可检测的第二代产物。另外，抑制 剂、辅助因子和酶活性调节子也能被检测。其原理是基于在基质存在下这 些物质对生物传感器输出信号的影响。举例来说，有机磷和氨基甲酸酯药 物和杀虫剂可采用酶( 如乙酰胆碱脂酶 r 1 4 ) 光学和电化学传感器进行检 测。图1 - 2 概括了酶生物传感器的检测原理。 主里整兰垫查查兰堡主堑塑圭兰些笙奎! 皇些兰生塑堡堕堡兰兰兰皇些兰坌堑互鲨一 a sub常strate(non-detectable 底物( 不可检测的) ) j 口 b 产物( 可检测的) p r o d u c t ( d e t e c t a b l e ) 底蒹淼、底物( 不可检测的) 驰h 打匮影 产物( 可检测的) p r o d u c t ( d e t e c t a b l e ) 换能器 t r a n s d u c e r 图1 - 2 酶生物传感器的检测原理 f i g1 - 2d e t e c t i o np r i n c i p l ef o re n z y m e b a s e db i o s e u s o r s 换能器 t r a n s d u c e r 1 1 4 3 固定化方法 除了前两部分讨论的因素外，生物传感器发展的另一要素就是如何将 生物传感部分与换能器联合到一起来。而固定化方法决定了生物传感器最 终的可靠性和性能。 早期的生物活性物质测量法，如酶分析法，是在溶液状态下进行的， 由于酶在水溶液中一般不太稳定，且只能使用一次，因此很不方便。将酶 固定在各种载体上，即通过酶的固定化使酶作为生物敏感膜使用，与常规 方法相比有很多诱人的优点【r 1 5 】： i 、酶被限制性固载在电极表面上，得以与反应混合物分离，因而能重 中国科学技术大学博士研究生毕