（食品科学专业论文）乳酸菌增殖培养及直投式酸奶发酵剂的研究.pdf

l l 西华大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名：殍缸上i指? 教师签名 嘲：圳，8 。 日。 西华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，在校 攻读学位期间论文工作的知识产权属于西华大学，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，西 华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论 密后遵守此规定) 指导教师签名： 日期 以刀屯 l 西华大学硕士学位论文 摘要 随着乳制品工业的发展，发酵乳制品以其丰富的营养和令人愉悦的口感，越来越被 消费者和有关研究人员所关注。乳制品领域的研究者们目前主要将研究重点放在直投式 酸奶发酵剂上，这对于提高国产发酵剂的竞争力，推动乳制品工业发展等具有重要意义。 试验主要讨论了植物乳杆菌的增殖培养条件，菌体浓缩分离工艺，筛选并优化乳酸 菌基础增菌培养基及冻干保护剂，制备出优质高效的直投式酸奶发酵剂。 将购买的菌粉经过活化后接入四种不同的培养基中，最终选定增殖效果较佳的m r s 培养基作为前面试验阶段用的基础培养基，并为下一步的浓缩培养奠定基础。 为了了解植物乳杆菌的生长情况并掌握其生长规律，对植物乳杆菌的培养液进行了 3 0 h 的跟踪测定，根据p h 值，0 d 值及活菌数分别绘制出相应的生长瑚线。 通过添加缓冲剂适时调节培养液的酸度，以抑制植物乳杆菌的自溶，为其生长 繁殖创造一个良好的环境，从而有效减少死亡率。结果表明，添加2 缓冲剂i 能起到很 好的稳定作用。 添加缓冲剂后，乳酸菌的生长曲线发生一定的改变，需要进一步通过测定来确定其 变化规律。乳酸菌培养至1 5 h 开始出现“自溶 的前2 h 加入2 缓冲剂i ，此后6 h 内每 隔2 h 添加一次，适时测定其活菌数，绘制出相应的生长曲线。得知：添加缓冲剂后， 乳酸菌活菌数最大值时间由1 5 h 变为1 8 h ，使乳酸菌对数生长期延长了3 h 。 通过单因素及正交试验确定出合适的生长因子及较好的基础培养基配方，结果为： 蔗糖，酵母膏和马铃薯汁更能促进植物乳杆菌生长，在基础培养基中增加2 蔗糖，2 酵母膏和1 0 9 6 马铃薯汁，培养后活菌数由原来的6 8 8 1 0 加c f u m l 增加至 1 5 8 1 0 c f u m l 。 在浓缩分离阶段，采用离心法进行分离浓缩，经试验得出：0 1 2 ，3 0 0 0 r p m ，l o m i n 的离心条件可以较合理的获得乳酸菌菌泥及活菌数，同时也较好的考虑了成本问题 对喷雾干燥及冷冻干燥两种干燥法进行产品特征及活菌数分析，最后选择冷冻干燥 法作为最后采用的干燥方法。 乳酸菌经过离心浓缩后在其中加入冻千保护剂以防止乳酸菌在冷冻过程中的大量 死亡采用甘油，吐温8 0 及谷氨酸钠来进行冻干保护，添加后起到较好保护菌体的作 用，且按照添加量：吐温8 00 5 m l l ，甘油0 5 m l l ，谷氨酸钠5 9 l ，培养液经冻干后 活菌数达到2 6 9 x1 0 c f u m l 。 关键词：植物乳杆菌；增殖培养；冻干保护；直投式酸奶发酵剂 乳酸菌增殖培养及直投式酸奶发酵剂的研究 a b s t r a c t c o n s u m e r sa n ds c i e n t i f i cr e s e a r c h e r sp a ym o r ea t t e n t i o nt ot h ef e r m e n t e dg o o d sf o r t h e i rn u t r i t i o u sa n d j o y f u lt a s t ew i t ht h ed e v e l o p m e n to fd a i r yi n d u s t r y r e s e a r c h e r sp r e s e n t l y s t u d yo nd v sy o g u r ts t a r t e r i ti ss i g n i f i c a n c et oe n h a n c ec o m p e t i o np o w e ro fd o m e s t i c y o g u r ts t a r t e rc u l t u r e sa n dw i l lp r o m o t ed a i r yi n d u s t r y d i s c u s s i n g ：m u l t i p l i c a t i o nc u l t u r ec o n d i t i o n so ft h el a c t o b a c i l h sp l a n t a r u m ，t h a l l i c o n c e n t r a t i o na n ds e p a r a t i o nt e c h n i c s ，v a c u u mf r e e z ed r y i n gp r o c e s s p a r a m e t e r s s i f t i n ga n d o p t i m i z i n ge f f i c i e n t l yu 蛆p r o p a g a t i o nm e d i u m ，f r e e z e d r y i n gp r o t e c t a n ta n dp r e p a r i n gh i g h q u a l i t yd v sy o g u r ts t a r t e rc u l t u r e s f i r s t l y , a d o p t i n gv a c u u mf r e e z ed r y i n g l a c t o b a c i l h sp l a n t a m mp o w d e ra st r i a l m i c r o o r g a n i s mb o u g h tf r o ms i c c ( s o u t h w e s tc e n t e ro fi n d u s t r i a lc u l t u r ec o l l e c t i o ni n c h m a ) a c t i v a t e da n ds e v e r a lt i m e sc u l t u r et op u r e - b l o o da n di n o c u l a t e dt ov a r ym e d i u m s s e l e c tt h ep r o l i f e r a t er e s u l t sb e s tm r sm e d i u ma st h eb a s i cm e d i u mi nt h ei n i t i a ls t a g eo ft h i s r e s e a r c hu l t i m a t e l ya n dl a yf o u n d a t i o nf o rt h en e x tc o n c e n t r a t i o nc u l t u r c r e g u l a t eb r o t ha c i d i t yt i m e l yb ya d d i n gb u f f e r sa g e n t st o r e s t r a i nl a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m a u t o l y z e c r e a t eaw e l lg r o w i n ge n v i r o n m e n ta n dl e b e nt h en a t u r a lm o r t a l i t yr a t e e f f e c t i v e l y n er e s u l t si n d i c a t e d ：a d d e d2 b u f f e ri c 柚s t a b i l i z et h eb r o t h d r e wt h ec o r r e s p o n d i n gc u r v e sb y r u n n i n ga f t e rf o r3 0h o u r sa c c o r d i n gt op hv a l u e 、 o dv a l u ea n dt h ea m o u n to fl i v el a bf o rt h es a k eo ff i n d i n go u tt h e i rg r o w t hs t a t u sa n d r h y t h m l a bg r o w t hc u r v e sc h a n g e da f t e ra d d i n gb u f f e ra g e n t a d d i n g2 b u f f e ri2 hb e f o r e l a bc u l t u r e d1 5 ha n ds t a r t e dt o a u t o l y z e ，o n c ee v e r y2 h v i a b l ec o u n ta n dp r o t r a c t e d c o r r e s p o n d i n gg r o w t hc u r v em e a s u r e d r e s u l t si n d i c a t e d ：t h et i m el a bv i a b l ec o u n tm o s t v a r i e df r o m1 5 ht o1 8 h a n dm a d ei t se x p o n e n t i a lp h a s e p r o l o n g3 ha f t e ra d d i n gb u f f e ra g e n t a c c e l e r a t e dg r o w t hb ys u p e r a d d n gg r o w t hf a c t o rf o r 鲥n i n ga b u n d a n tl a b a d d e d c a l l es u g a r ，m i l ks u g a r ，d e x t r o s ea n df r u i ts u g a ra si t sc a r b o ns o u r c e 爆p e p t o n e ，b e e fe x t r a c t i y e a s te x t r a c ta n dt r y p t o n ea si t sn i t r o g e ns o u r o 瞄c a pf u n g u sf r u i t 、t o m a t oj u i c e 、c a r r o tj u i c e a n dp o t a t oj u i c ea si t sv e g e t a b l ej u i c eo r d e r e dt oo f f e rm i n e r a la n dv i t a m i n e d e t e r m i n e d a p p r o p r i a t eg r o w t hf a c t o r a n db e t t e rb a s i cm e d i u mp r e s c r i p t i o nb ys i n g l e - f a c t o ra n d o r t h o g o n a le x p e r i m e n t r e s u l t si n d i c a t e d , c a n es u g a r , y e a s te x t r a c ta n dp o t a t oj u i c ef e e di t b e t t e r , t h ev i a b l ec o u n ti n e a s e df r o m6 8 8 x 1 0 f u m lt o1 5 8 x 1 0 u e f u m 1 a d o p t e dc e n t r i f u g a t i o nm e t h o dt oc o n c e n t r a t ea n ds e p a r a t et h eb r o t h t h em o r e e a s o nc e n t r i f u g ec o n d i t i o ni s ：c e n t r i f u g et e m p e r a t u r eo c 、c e n t r i f u g es p e e d3 0 0 0 r p m 、 c e n t r i f u g e1 0 r a i n a c h i e v e dr a t i o n a lo o z er a t ea n dv i a b l ec o u n ta c c o r d i n gt ot h i sc e n t r i f u g e m e a n ，t a k e nc o s ti n t oa c c o u n t 。t o o 、 f r e e z ed r y i n gt og a i nf r e e z e - d r yp o w d e ra f t e rc o n c e n t r a t i n ga n ds e p a r a t i n gt h el a b 一一堕些奎堂堡主堂篁堡奎 b r o t h - ha d db u f f e r a g e n tt oa v o i dt h el a bt od i ei nt h ef r e e z e d r y i n g p r o c e s s a d o p t e d c o n v 髓t i o n a lf r e e z e - d r y i n gp r o t e c t a n t st o c a r r yt h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t ：g l y c e r o l 、 t w e e n8 0a n dm o n o s o d i u m g l u t a m a t e ：b u f f e rp r o t e c t a n t sf u n c t i o n i n ga f t e ra d d i n gi nb r o t h t h e v i a b l ec o u n tr e a c ht o2 6 9 x 1 0 1 1 c f u m la c c o r d i n gt ot h ea d d i t i v ea m o u m ：t w e e n8 00 5 m i l 、 g l y c e r o l0 5 m l l 、m o n o s o d i u m g l u t a m a t e5 9 l k e y w o r d s ：l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ；p r o p a g a t i o nc u l t u r e ；f r e e z e - d r y i n gp r o t c c t i v em a t e r i a l ； 乳酸菌增殖培养及直投式酸奶发酵剂的研究 目录 摘要。i a b s t r a c t i i 1 绪论1 1 1 弓l 言。i 1 1 2 酸奶发酵剂：1 1 2 1 酸奶发酵剂概述：1 1 2 2 酸奶发酵剂的种类和特点1 1 2 3 酸奶发酵剂的发展历史及现状2 ”1 3 直投式酸奶发酵剂妇3 1 3 1 直投式酸奶发酵剂的应用概况3 1 3 2 直投式酸奶发酵剂的主要研究方向。3 1 4 直投式酸奶发酵剂发展中存在的问题及其发展趋势和方向。5 1 4 1 直投式酸奶发酵剂发展中存在的问题5 1 a 2 直投式酸奶发酵剂发展趋势及发向5 1 5 直投式酸奶发酵剂制备关键技术5 1 5 1乳酸菌增殖培养基的选择5 1 5 2 乳酸菌培养技术5 1 5 3 乳酸菌浓缩培养j 6 1 5 4 菌体细胞浓缩分离技术7 1 5 5 直投式酸奶发酵剂干粉制备i 矧8 1 5 6 保护剂。：9 1 6 本实验研究的目的意义，研究内容及技术关键1 0 1 6 1 研究目的1 0 1 6 2 研究意义：1 0 1 6 3 研究内容：。1 0 1 6 4 技术关键。1 2 2 乳酸菌高效增殖条件筛选“1 3 2 1 引言。1 3 2 2 实验材料与方法：，j 1 3 2 2 1 实验菌种“。1 3 2 2 2 主要药品及设备：1 4 2 2 3 试剂及培养基配制“1 5 i v 西华大学硕士学位论文 2 2 4 实验检测项目：。1 7 2 2 5 实验方法与技术路线1 7 2 3 结果与分析：2 0 2 3 1 基础培养基的筛选结果2 0 2 3 2 植物乳杆菌在基础培养基中生长曲线测定2 0 2 3 3 缓冲剂筛选结果。2 2 2 3 4 添加缓冲剂后生长曲线测定o “2 4 2 3 5 基础培养基优化结果_ 2 5 2 4 本章小结。2 9 3 直投式酸奶发酵剂浓缩分离条件及冻干保护剂选择。o ：3 1 3 1 引言j ；。31 3 2 材料与方法j 3 2 3 2 1 材料与设备3 2 3 2 2 试剂配制：3 3 3 2 3 原料及培养基制备- ：3 3 3 2 4 实验方法：3 4 3 2 5 检测指标3 9 3 3 结果与分析：。k 4 0 3 3 1 培养液收集时间的确定：4 0 - 3 3 2 离心分离条件选择：4 0 3 3 3 干燥方法确定小：4 1 3 ，3 4 冻千保护剂优化结果j 4 2 ：3 3 5 冻干保护剂效果验证试验。：_ 4 2 3 4 本章小结4 3 3 4 1 确定了菌体细胞浓缩分离的条件o 4 3 。 3 4 2 选择了合适的干燥方法4 3 3 4 3 确定了冻干保护剂及其比例：钙 4 总结：，、，：z m 5 后续展望“j ：4 6 参考文献，：4 8 致谢：。5 3 v 西华大学硕士学位论文 1 绪论 1 1引言 s l n 品工业的发展带动了酸奶及乳酸菌饮料产品在世界范围内的迅速发展，这同时 也对酸奶发酵剂的品质、特性及种类提出了新的要求。酸奶发酵剂制备的技术水平和质 量优劣直接影响到酸奶及乳酸菌饮料的产品质量。在发酵剂发展方面，冻干发酵剂的使 用对简化发酵乳制品生产工艺，降低生产成本，提高产品质量等方面的作用越来越明显。 在发酵剂的研究领域，植物乳杆菌作为一种活性高、抑菌效果明显的益生菌群在发酵乳 制品工业中发挥着越来越重要的作用。 试验设计从以下几方面来研究植物乳杆菌的高效增殖条件，首先是从筛选基础培养 基出发，为其增殖条件奠定良好的基础；其次探索出一种合适的缓冲物质来调整培养过 程中的酸度变化，以此稳定培养液的酸度，并抑制培养过程中菌体的自溶，延长其。、 对数生长期，从而有利于其生长增殖；然后在基础培养基的基础上，通过单因素试验及 正交试验确定合适的生长因子来优化基础培养基，在丰富营养物质的条件下使得乳酸菌 大量生长，并通过缓冲剂适时调整来获得所需的大量菌体细胞，在合适的离心条件下通 过干燥制得需要的优质发酵剂菌粉。 1 2 酸奶发酵剂 ， 1 2 1 酸奶发酵剂概述 酸奶发酵剂是制作酸奶所用的特定的微生物培养材料1 1 1 。发酵剂在酸奶生产过程中 的作用非常重要，是酸奶产品产酸和产香的基础和主要原因。酸奶质量的好坏主要取决 于酸奶发酵剂的品质、类型及活力。 1 2 2 酸奶发酵剂的种类和特点 根据酸奶发酵剂的发展进程及其制作工艺，可以将酸奶发酵剂分为三种：天然型发 酵剂、传统继代型发酵剂以及高效浓缩型发酵剂： ( 1 ) 天然型酸奶发酵剂 天然型酸奶发酵剂是利用原料乳中的微生物自然发酵而成的液体发酵产物，早在公 元前2 0 0 年左右土耳其人就开始使用此种发酵剂，其优点是菌种复杂，易形成多种风味物 质，使产品具有独特风味f 2 3 1 。但是由于存在太多不确定因素，发酵产物性质不易控制， 而且其中的腐败细菌也会降低产品的贮藏稳定性。 ( 2 ) 传统继代型酸奶发酵剂 一传统继代型发酵剂又称为普通发酵剂。其特点是：菌种纯正；发酵性能较为稳定； l 乳酸菌增殖培养及直投式酸奶发酵剂的研究 发酵条件易于控制；可通过改变菌种来控制不同风味和口感等，但此种发酵剂制备需要 经过多级扩大培养，生产工序多、周期长、菌种易退化等也越来越不适应现在大规模酸 奶发酵生产的要求，且传统继代型酸奶发酵剂含菌量少( i 0 7 - i 0 8 c f u m l ) 1 4 l ，无菌条件要 求高。由于这些弊端的存在，迫使人们研制一种能直接用于生产的浓缩发酵剂，随着科 学技术的发展，超浓缩冷冻干燥乳酸菌发酵剂便应运而生，由于该发酵剂活力强、用量 少、污染低、品种多、便于运输保藏和保存，管理简单，接种方便，只需简单的复水处 理，就可直接用于生产，减少了污染环节【5 】，易于进行工艺管理和质量控制，在欧美等 发达国家已经得到广泛应用，特别是中小乳制品生产企业【6 l 。 ( 3 ) 高效浓缩型酸奶发酵剂 高效浓缩型酸奶发酵剂指不需要经过菌种活化、母发酵剂、中间发酵剂、生产发酵 剂的逐级扩大培养过程而直接可以应用于生产【7 j 的一类新型发酵剂。其主要优点是：活 菌含量很高，活力高，因而接种量小：菌的比例适宜：能直接使用，避免了繁冗的扩大培 养过程，既节约了劳动力，缩短生产周期，又可有效地防止菌种污染及退化，能提高产 品品质：保存管理方便：易于控制生产工艺，产品品质稳定：经简单复水处理后可直接应 用p 1 1 j 。高效浓缩型酸奶发酵剂根据制备工艺的不同，又可以分为高效浓缩型冷藏发酵 剂和高效浓缩型干燥发酵剂。 1 2 3 酸奶发酵剂的发展历史及现状 随着乳制品工业的发展及酸奶制作技术的提高，酸奶发酵剂的制各方法也得到了相 应的发展，人们使用发酵剂的历史经历了经验性发酵剂和选择性发酵剂两个阶段【1 2 1 7 l ， 其过程如图1 1 所示。 经验性发酵剂是指以少量经自然发酵而成的酸乳或其它乳酸菌发酵制品作为发酵 剂，将其接种在加热处理过的乳或其它食品原料中而制成的发酵制品，称为“天然发酵 剂 。其特点是：发酵剂中微生物复杂，除乳酸菌之外，还包含酵母菌等其它微生物。 我国酸奶发酵剂的制备技术大都停留在传统人工型发酵剂的水平，生产方式一般需 经过菌种活化、母发酵剂、中间发酵剂、生产发酵剂等工艺过程。在发酵剂制备过程中， 菌种经过多级扩大培养，极易退化和污染。这将直接导致酸奶及乳酸菌饮料产品质量不 稳和生产效率低下，阻碍了我国酸奶及乳酸菌饮料产业的发展。 2 、 西华大学硕士学位论文 图1 1 发酵剂发展历史 f i 9 1 1t h eh i s t o r yo fs t a r t e rc u l t u r e 1 3 直投式酸奶发酵剂 直投式酸奶发酵剂( d i r e c t - v a t - s e t ，d v s ) 是指发酵活力强，每克含活菌数1 0 1 1 个以上，在生产酸奶或发酵乳制品时可以直接接无须中间继代培养过程，使用方便，发 酵产品品质优良的一类新型的商品化生产菌种，它属于高效浓缩型干燥发酵剂，直投式 酸奶发酵剂由于含菌量高，活力强，使接种量较传统人工发酵剂降低1 0 0 1 0 0 0 倍，并 能够直接、安全有效的生产乳制品【1 8 j 。 1 3 1直投式酸奶发酵剂的应用概况 我国在这方面得到不断发展，但离心分离和真空干燥后的含菌量( 1 0 9 1 0 1 0 c f u g ) 仍未能达到国际先进水平( 1 0 1 0 1 0 1 2 c f u g ) ，且未进入商业化生产阶段，阻碍了我国 酸乳及发酵乳饮料产业的发展【1 9 2 1 1 ，且具有自主知识产权的乳酸菌发酵剂的研究和开发 几乎是个空白。 1 3 2 直投式酸奶发酵剂的主要研究方向 ( 1 ) 菌体的增殖培养技术 制备直投式酸奶发酵剂的关键是获得大量生长的乳酸菌及获得大量乳酸菌的培养 基，而这种培养基应具备繁殖速度快，易分离，成本低廉等特点，要使乳酸菌能大量生长 3 乳酸菌增殖培养及直投式酸奶发酵剂的研究 繁殖，配制合适的增殖培养基以及控制起培养条件是最关键的两个因素。 乳是乳酸菌的天然培养基，但菌体生长后凝乳，很难分离得到菌体，而在乳酸菌经 典培养基中菌体生长良好，也易分离，但成本较高。因此，现在很多这一领域的学者很 早就开始尝试对培养基进行改良来获得所需要的培养基。近年关于乳酸菌在天然植物汁 液中生长和培养的报道时有出现，这也给了研究者们更大的信心和选择。 ( 2 ) 菌体细胞的浓缩 离心法：离心法在一定程度上能引起菌体细胞的机械损伤。 化学中和法：乳酸菌在生长繁殖过程中分解代谢产生的乳酸会使乳酸菌的生长受到 抑制，为了减少乳酸对乳酸菌的抑制作用，在乳酸菌培养过程中可以向培养液中添加 n h 3 h 2 0 或c a ( o h ) 2 来中和所产生的乳酸，促进乳酸菌生长。 缓冲盐法：在菌体的培养过程中随着乳酸的积累，p h 值逐渐下降，乳酸菌的繁殖受到 、抑制。因此，通常在培养基中添加缓冲盐来缓解p h 值的下降。 膜渗析法：利用膜的选择性将培养液与营养液进行交换，使培养液中的乳酸部分渗 出，而营养液中的成分渗入培养液中以维持乳酸菌正常的生长繁殖。 ( 3 ) 菌体细胞的分离技术 菌体细胞的分离技术是制备浓缩型乳酸菌发酵剂重要的中间环节，分离方法主要有 离心法和超滤法。 离心法：离心方法简便、快速，处理量大，但离心过程中的剪切作用容易使细胞膜的 渗透性和机体抗冻能力减弱。另外，随菌体离心沉淀下来的丙酮酸盐和二乙酰等羰酰基 化合物，能与细胞内的氨基反应，从而加速细胞死亡。并且该方法实际操作过程烦琐，容 易感染杂菌，从而造成细胞大量死亡，所以在工业化生产中很少使用。 超滤法：应用超滤设备也可以成功地对菌体进行收集和浓缩。该法对茵体影响小，获 得的菌体浓度高，培养液可重复利用。但此种方法对发酵液澄清程度的要求很高，并且膜 装置的成本比较高，分离过程中很难控制无菌操作，滤膜的污染、清洗、杀菌、老化等一 系列问题均使其商业化受到一定程度的限制。 ( 4 ) 菌体的生物保藏技术 在冷冻过程中，细菌细胞由于受冷冻的影响而导致菌体大量死亡。加入保护剂是防 止冷冻损伤最为有效的方法，由此条件得出的活菌数可达1 0 1 1 个g 以上。真空冷冻干燥 法是先将湿物料冻结到共晶点温度以下，使水分变成固态的冰，然后在适当的温度和真空 度下，使冰升华为水蒸汽，再用真空系统的捕水器将水蒸汽冷凝，从而获得干燥制品的技 术，其在现代菌体细胞的生物保藏技术中应用广泛，作用也越发明显。 4 西华大学硕士学位论文 1 4 直投式酸奶发酵剂发展中存在的问题及其发展趋势和方向 1 4 1 直投式酸奶发酵剂发展中存在的问题 目前，直投式酸奶发酵剂存在质量良莠不齐、生命力相对较短等缺点，并且发酵剂市 场长期被国外知名企业垄断，从而导致发酵剂市场售价居高不下的局面，这在一定程度 上严重影响了我国发酵剂及乳制品工业的发展。 1 4 2 直投式酸奶发酵剂发展趋势及发向 过去，生产厂家选择酸奶发酵剂主要是根据工艺要求，产酸快、凝固好、能产生强酸 奶风味的酸奶发酵剂便是他们的首选。但现在，生产厂家首先考虑顾客的喜好，让酸奶产 品最大限度地符合顾客和市场的需要，生产温和可口、顺滑稠厚、有益健康的酸奶。而 产酸较快、质量稳定、使用方便、价格适中的直投式酸奶发酵剂就自然成为生产厂家的 首选，而这也是酸奶发酵剂的未来发展趋势。在工艺技术方面，选择冻干及深度冻藏作 为制备商品化发酵剂的主要方法则是未来技术发展的方向。选择高抗性优良菌株、优化 筛选适合乳酸菌大量生长繁殖的增殖培养基及冻干保护剂都将成为研究的方向和趋势。 而开发具有我国自主知识产权的、符合我国国情的、性能稳定的标准化商品发酵剂则是 未来我国需要面临的一个重大问题，也是我国- l n 品工业不断向前发展所要解决的实际 问题。 1 5 直投式酸奶发酵剂制备关键技术 直投式酸奶发酵剂是采用优质酸奶发酵剂，经液体培养基增殖培养、菌体浓缩，配 以生物保护剂并最后经冷冻或冷冻干燥而制成的冻干发酵剂。直投式发酵剂以其方便快 捷的使用方法逐渐代替了传统的继代式发酵剂，具有良好的市场需求和经济价值。制备 直投式酸奶发酵剂的一个重要环节就是要采用相应的方法来获得单位体积或单位重量 内最大的活菌数。在制备过程中，乳酸菌菌种经过增殖培养扩大活菌数后，再经过菌体 浓缩分离来进一步提高发酵剂中的活菌数量，并以此减少冷冻过程中的冷冻损伤来保护 菌体细胞。 1 5 1 乳酸菌增殖培养基的选择 制备直投式酸奶发酵剂的关键之一是要获得乳酸菌大量生长的培养基，这种增殖培 养基应具有如下特点：培养基应适合菌体的生长，且繁殖速度快，能在较短时间内得到 大量的细胞；菌体与培养基易于分离；成本低廉，使用的原材料最好能反复利用，且 容易获取；培养基缓冲能力强，能很好的降低培养过程中乳酸对菌体的抑制作用。 1 5 2 乳酸菌培养技术 制备高密度乳酸菌培养液是研制浓缩型发酵剂的关键步骤，也是研究直投式酸奶发 s 乳酸菌增殖培养及直投式酸奶发酵剂的研究 酵剂的重点课题，其基本原理是在培养过程中通过追加营养物质。排除代谢产物，调节 酸度来延长乳酸菌的对数生长期，获得高浓度培养液【2 2 , 2 3 l 。而且，菌体浓度越大，冷冻 干燥后乳酸菌的存活率也越高【2 4 1 。关于乳酸菌的培养，国内外一般采用如下几种方法【2 5 l ： ( 1 ) 化学中和法 乳酸菌在生长繁殖过程中，代谢乳糖产生乳酸。随着酸度的升高，p h 值的降低菌体 生长受到抑制，不同的菌种对培养中乳酸的耐性不同。为了解除乳酸菌的抑制，常用的 中和剂有n a o h ，n h 3 h 2 0 ，c a ( o h ) 2 ，n a ：c 0 3 等。国内外许多研究者认为氨水的效果最好，但 在实际的中和培养过程中，随着乳酸铵或乳酸钠等盐浓度的不断增加，达到一定水平时， 仍会抑制菌体的生长繁殖【2 6 】。 ( 2 ) 缓冲盐法【2 2 , 2 7 , 2 s 1 向培养基中添加缓冲盐，调节培养液中的酸在一定范围内变动，不致酸度过高，可 促进菌体生长及繁殖。关于缓冲剂，国际上有人利用乳本身蛋白质和磷酸盐。具体方法 是用超滤浓缩脱脂乳，再添加无脂固型物到2 0 一2 9 ，作为培养液，利用高浓度的蛋白 质和磷酸盐达到缓冲效果。磷酸盐不仅起到缓冲作用，还可起到抗噬菌体的作用。常用 的缓冲剂还有碳酸钙，钙离子对菌体冷冻干燥还有保护。 ( 3 ) 渗析法 ， 也称过滤培养法。这种方法是利用膜技术，选择合适的膜孔径来达到浓缩菌体的目 的。原理是向培养液中添加新的营养液，乳酸菌代谢产物则通过膜除去，促使乳酸菌繁 殖，此法培养的乳酸菌浓度可达1 0 1 1 c f u m l 。这种方法尽管达到了较高的菌体浓度，但 由于设备投资大，对膜材料的要求比较严格，同时在培养过程中易感染噬菌体，因此工 业生产上的应用并不广泛。 ( 4 ) 连续培养 国外有研究者对某种乳酸菌进行连续培养，并指出菌的生长情况受乳酸的抑制作用 及营养物提取的影响，菌体浓度达不到很高，成熟培养液中乳酸菌的收集多采用离心法， 但过高的转速对菌体损伤较大，影响菌体的活性。 1 5 3 乳酸菌浓缩培养 制备直投式酸奶发酵剂，需要获得高浓度的细胞培养物，因此，必须对乳酸菌培养 液进行浓缩。浓缩的原理是：在乳酸菌培养过程中，通过追加营养物质、排除代谢产物、 调节p h 值等措施。解除代谢产物一乳酸对细胞生长的抑制作用，延长乳酸菌的对数生 长期获得高浓度的细胞培养物，主要有以下几个方法【2 9 1 ： ( 1 ) 化学中和法 乳酸菌在生长繁殖过程中分解代谢产生乳酸，是乳酸菌生长受到抑制，为了减少乳 酸对乳酸菌的抑制作用，在乳酸菌培养过程中自动向培养液中添) j l ：l n a o h 或h 3 h 2 0 等来不 6 两华大学硕士学位论文 断中和培养过程中所产生的乳酸，促进乳酸菌生长。但是乳酸钱或乳酸钠的浓度将不 断增加，达到一定的水平时，仍会抑制菌体的生长繁殖。 ( 2 ) 缓冲盐法 向乳酸菌的培养液中加入缓冲盐。调节培养液的酸度在一定范围内不升高，促进 乳酸菌生长繁殖。刘宇峰等人i 刈发现，当p h 值降低至4 0 以下时，菌体的生长繁殖受到抑 制作用。选择一种符合要求的缓冲物质。在培养阶段调整生长培养基的p h 值，不仅可 以提高活菌数，还可以提高冷冻干燥的存活率，在细胞培养中，常用的有磷酸盐和碳 酸钙。 ( 3 ) 膜渗析法 向乳酸菌的培养液中不断添加营养物质，代谢产物通过膜而除去，促使乳酸菌生 长繁殖。用此法达到的菌体浓度比上述2 种方法都要高。 ( 4 ) 物理法 通过将培养的植物乳杆菌菌液进行离心分离，使菌体得到浓缩。但是在实际应用中， 应用离心分离方法会对乳酸菌产生一定的损伤作用，对菌体造成一定的伤害，从而使乳 酸菌降低其活菌数和活性。 1 5 4 菌体细胞浓缩分离技术 菌体细胞的分离技术是制备浓缩型乳酸菌发酵剂重要的中间环节，分离方法有超滤 和离心。超滤优于离心，而超速离心优于普通离心。离心比超滤操作简便、设备清洗和 消毒方便、不易污染，其应用较超滤普遍。在离心分离过程中，离心力机械作用以及温 度和基质p h 值等因素的影响，会造成部分菌体死亡。另一方面，部分菌体必然残留在 上清液中而损失。如果离心工艺掌握不当，菌体死亡率和损失率随之增高，使活菌收率 大大降低，直接导致发酵剂的活菌含量下降。 ( 1 ) 收获和菌龄 为了得到一定浓度的含菌量，实际操作中必须把菌体从培养基中收集起来，用于浓 缩或适于冷冻干燥的悬浮液，这样可以使菌体与代谢过程中产生的毒物( 乳酸盐等) 分 开，从生理状态来讲有利于提高冷冻干燥后菌体存活率。收获方法一般用高速离心和超 滤，它们对菌体冻干敏感性有一定提高。但收获过程中直接影响生存能力的则是菌龄。 c h a m p a g n e 等人1 3 1 l 实验证明，细菌冻干对数生长后期、静止期初期的细胞，其存活率 高于对数生长期初期和衰老期的细胞，静止期细胞因碳饥饿而产生大数量的压力感应蛋 白【3 2 】。 ( 2 ) 悬浮液细胞浓度 收获的菌细胞需加入一定量的保护剂， 形成悬浮液后进行冻干。实验证明， 悬浮 、液初始菌数对冻干存活率有影响。k il a r a 3 3 l 认为，当初始菌浓度最大时，冷冻干燥可获 7 乳酸菌增殖培养及直投式酸奶发酵剂的研究 得较高的存活率，高细胞浓度的保护作用主要是降低每个细胞暴露在介质中的面积来实 现的。刘振刚3 4 j 发现，随着悬浮介质中菌体密度降低，菌体的存活率下降。他认为，高 细胞浓度的保护作用可能是形成菌胶团的保护层，相对的降低了菌体细胞暴露在介质中 的面积。wr i g h t 3 5 l 等人也研究认为，较高的菌体密度可以增加对冷冻损伤的保护作用。 1 5 5 直投式酸奶发酵剂干粉制剖刈 浓缩液加入适当保护剂后，就可以进行干燥。干剂制备一般采用两种方阳：喷雾干 燥法和真空冷冻干燥法。这一类发酵剂一方面可减少液态发酵剂制备的许多工作，另 一方面可延长发酵剂的保存期，使其保存和分发更容易 ( 1 ) 喷雾干燥法 喷雾温度低( 进风温度4 0 8 0 ) ，设备利用率大幅度降低，有时出潮粉；若喷雾温 度高，会造成乳酸菌大幅度死亡，产品质量不够稳定，因而未能在实际生产中推广应用。 另有报道【3 8 l ，高浓度发酵剂与干混法工艺相结合，采用高温喷雾生产出乳酸菌奶粉，但 采用高温喷雾法必须解决一系列难题，因此目前采用的人并不多。 ( 2 ) 真空冷冻干燥法 真空冷冻干燥简称冻干1 3 9 一，基本原理：真空冷冻干燥是先将湿物料冻结到共晶点 温度以下，使水分变成固念的冰，然后在适当的温度和真空度下，使冰升华为水蒸汽， 再用真空系统的捕水器( 水汽凝结器) 将水蒸汽冷凝，从而获得干燥制品的技术。 干燥过程是水的在低温低压下的物态变化和移动的过程。可分为预冻、升华干燥和 解析干燥3 个阶段： 预冻阶段，预冻是将溶液中的自由水固化，使干燥后产品与干燥前有相同的形态， 防止抽真空干燥时起泡、浓缩、收缩和溶质移动等不可逆变化产生，减少因温度下降引 起的物质可溶性降低和生命特征的变化。徐成海认为，从冰点到物质的融点温度之间 需要速冷，否则容易使蛋白质变性，生命体死亡( 称溶质效应) ，为防止溶质效应发生， 在这一温度范围内，应快速冷却。同时他又强调，冷冻时形成的冰晶大小会影响干燥速 率和干燥后产品的溶解度。大冰晶利于升华但干燥后溶解缓慢，小冰晶升华慢，干燥 后溶解快，能反映出产品原来结构。为了得到较高的存活率和较好的物理性状及溶解度， 且有利于干燥过程中的升华，要通过实验得出一个合适的冷却速率。 升华干燥阶段：将冻结后的产品置于密闭的真空容器中加热，其冰晶就会升华成水 蒸汽溢出而使产品脱水干燥。干燥是从物料外表面开始逐步向内推移的，冰晶升华后残 留下的空隙便成为升华水蒸气的溢出通道。当全部冰晶除去时，第一段干燥结束，此时 可除去全部水分的9 0 左右。产品干燥部分的温度必须低于其崩解温度或允许的最高温 度( 不变性) 。 解析干燥：在干燥物质的毛细管和极性基团上还吸附有一部分水分，这些水分是未 8 西华大学硕+ 学位论文 被冻结的，当它们达到一定含量，就为微生物的生长繁殖提供条件。干燥水平在冻干 之后影响细菌的活性，也在贮藏中有影响。刘振民【4 2 j 等人发现，残余水分质量分数为 2 3 时，菌体的相对存活率较高；高于质量分数为5 时，菌体存活率明显降 低，贮存期