（分析化学专业论文）磷及纳米量子点探针的共振光散射分析.pdf

摘要 摘要 在天然水和废水中，磷以磷酸盐的形式广泛存在，磷是生物生长的必需元素之一， 但水中磷含量过高会造成水体的富营养化。磷的检测在很多领域包括环境、临床及工业 检测中至关重要。目前现有的磷测定方法虽各有优势，但都存在不同程度的局限性，因 此研究普遍适用性好、操作简便、灵敏度高的磷检测新方法具有重要意义。 自7 0 年代以来，生命科学研究的快速发展推动了具有高灵敏检测特点的荧光分析的 进一步发展。具有可识别功能的新型荧光探针的合成，特别是纳米荧光量子点分析技术 的提出，在基因和蛋白质分析过程中发挥了重要作用并显示出进一步的应用潜力。 本文研究了水中磷的共振光散射分析检测法，为水中痕量磷的测定提供了灵敏的检 测手段；以纳米量子点为探针，测定了牛血清蛋白，建立了一种利用荧光法和共振光散 射法测定蛋白质的新方法。本文分为两个部分： 第一部分：基于磷钼蓝法利用共振光散射技术测定磷 本文利用共振光散射技术，基于传统的钼锑抗分光光度法，建立了检测磷的新方法。 研究发现，在0 0 9m o l l 的硫酸溶液中，钼酸铵与磷酸根反应生成磷钼杂多酸并被抗坏 血酸还原生成磷钼蓝，磷钼蓝在3 4 0 5 5 0n l n 波长范围内能产生强烈的共振光散射信号。 基于此现象建立了一种简单、灵敏的检测磷的方法。线性范围是2 0 4 0 0n g m l ，检出 限( 3 0 ) 为o 7 6n g m l 。本法灵敏度比钼锑抗分光光度法提高一个数量级。 第二部分：利用纳米量子点探针测定牛血清蛋白 研究发现，在合适的条件下通过静电相互作用，纳米量子点c d s 在蛋白质模板上 聚集，大的聚集体形成或聚集体中相邻粒子之间电子的偶极一偶极相互作用和共轭效应 导致体系产生强烈而稳定的共振光散射，在0 0 1g g m l , - - 1g g m l 的蛋白质浓度范围内 共振光散射强度同蛋白质的浓度成正比。此外量子点本身有荧光，与蛋白质静电结合导 致荧光淬灭，在o 5i , t g m l - 5p , g m l 的蛋白质浓度范围内荧光强度同蛋白质的浓度成反 比，基于此现象我们建立了利用一种探针采用两种方法同时测定的蛋白质检测方法，实 现了两种方法互相验证。 关键词磷量子点牛血清蛋白共振光散射荧光 a b s t r a c t a b s t r a c t p h o s p h o r u se x i s t si naw i d ev a r i e t yo fp h y s i c o c h e m i c a lf o r m si nn a t u r a lw a t e r sa n d i n d u s t r i a lw a s t e r s p h o s p h o r u si sa ne l e m e n tm o s tl i k e l yt ol i m i tp l a n tg r o w t hi ni n l a n dw a t e r s a n di sa l s oi m p o r t a n ti nm a r i n ew a t e r sa n dt e r r e s t r i a le n v i r o n m e n t s ，b u tt h ei n c r e a s e d p h o s p h o r u s c o n c e n t r a t i o ns t i m u l a t e sa l g a lg r o w t ha n dc a nr e s u l ti ne u t r o p h i c a t i o n s o d e t e r m i n a t i o no fp h o s p h o r u si sac o m m o nt a s ki nm a n yf i e l d si n c l u d i n ge n v i r o n m e n t a l ， c l i n i c a la n di n d u s t r i a li n v e s t i g a t i o n a l t h o u g ht h et r a n d i t i o n a lm e t h o d sh a v em a n ya d v a n t a g e s t h e r ea r es t i l lm a n yp r o b l e m sa sw e l l ，i ti sv e r yn e c e s s a r yt od e v e l o pn e wa n a l y s i sm e t h o d s w i t hh i g hs e n s i t i v i t y , s i m p l eo p e r a t i o na n du n i v e r s a la p p l i c a t i o n s i n c e19 7 0s ，t h ef a s t d e v e l o p m e n to f l i f es c i e n c ei m p u l s et h ed e v e l o p m e n to f f l u o r e s c e n ta n a l y s i st e c h n i q u et h a th a sd e l i c a t em e a s u r ec h a r a c t e r i s t i c t h es y n t h e s i s eo fn e w t y p e f l u o r e s c e n c ep r o b ew i t hi d e n t i f i a b l e f u n c t i o n ，i np a r t i c u l a rt h ea p p e a r e a n c eo f f l u o r e s c e n c eq u a n t u md o t sa n a l y z i n gt e c h n i q u e ，p l a ys i g n i f i c a n tf u n c t i o na n dr e v e a lf a r t h e r p o t e n t i a la p p l i c a t i o na tt h ep r o c e s so fg e n ea n dp r o t e i na n a l y s i s i nt h i st h e s i s ，ar e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no ft r a c ep h o s p h a t e h a sb e e nd e v e l o p e db a s e do nt h ef o r m a t i o no fp h o s p h o m o l y l ：i d e n u mb l u e ，w h i c hp r o v i d e sa s i m p l e ，r a p i da n ds e n s i t i v em e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fp h o s p h a t e w ea l s ou s e dq u a n t u m d o t sa sp r o b et od e t e c tb o v i n es e r u ma l b u m i n ，e s t a b l i s h e dan e wm e t h o db a s e do nr e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n ga n df l u o r e s c e n c eo f t h eq u a n t u md o t s t h i st h e s i sc o n s i s to f t w op a r t s ： p a r to n e ：a n a l y s i so fp h o s p h a t eb a s e do nf o r m a t i o no fp h o s p h o m o l y b d e n u mb l u eu s i n g ar e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gt e c h n i q u e w ed e v e l o p e dan e wm e t h o db a s e do nf o r m a t i o no fp h o s p h o m o l y b d e n u mt od e t e c tt h e p h o s p h a t e i nt h em e d i u mo fo 0 9m o l ls u l p h u r i ca c i d ( h 2 s 0 4 ) ，a m m o n i u mm o l y b d a t e ( v i ) r e a c t 谢廿lp h o s p h a t et of o r mm o l y b d o p h o s p h o r i ch e t e r o p o l ya c i d ，w h i c hi n d u c e db ya s c o r b i c a c i dt op h o s p h o m o l y b d e n u mb l u e w ef o u n dt h a tt h ep h o s p h o m o l y b d e n u mb l u ec a l lp r o d u c e g r e a tr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gi nt h ew a v e l e n g t hr a n g ef r o m3 4 0t o5 5 0n n l t h er e s o n a n c e l i g h ts c a t t e r i n gi n t e n s i t ya t3 9 0n l ni sp r o p o r t i o n a lt op h o s p h o r u sc o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g e o f2 0 - - 4 0 0n g m l ，t h ec o r r e s p o n d i n gd e t e c t i o nl i m i t ( 3 a ) i so 7 6n g r r 儿t h es e n s i t i v i t y i i a b s t r a c t i n c r e a s e sa b o u to n eo r d e ro fm a g n i t u d et h a nt h a to fs p e c t r o p h t o m e t r i cm e t h o d p a r tt w o ：u s i n gq u a n t u md o t sa sp r o b ed e t e r m i n e sb o v i n es e r u n la l b u m i n q u a n t u md o t sa n dp r o t e i na l lh a v ean u m b e ro fp o s i t i v ea n dn e g a t i v ee l e c t r o ni nl i q u i d m e d i u m ，i na p p r o p r i a t ec o n d i t i o nt h eq u a n t u md o t sc a ni n t e r a c tw i t hp r o t e i nb ye l e c t r o s t a t i c f o r c e sa n dt h u sa g g r e g a t eo nt h ep r o t e i ns u r f a c e t h eb i ga g g r e g a t i o no rt h ee l e c t r i c d i p o l e - d i p o l ei n t e r a c t i o na n dc o u p l i n gb e t w e e nt h ep l a s m o n so fn e i g h b o r i n gp a r t i c l e sw i l l r e s u l ti ns t r o n gr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ，t h ee n h a n c e dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gi n t e n s i t yi s p r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e i ni nt h er a n g eo fo 0 1g g m l - 2 1 t g m l f u r t h e r m o r e ， q u a n t u md o t si n t e r a c t 、析t l lp r o t e i nb ye l e c t r o s t a t i cf o r c e sr e s u l ti ni t sf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g t h ed e p r e s s e df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi sw e l lp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i ni n t h er a n g eo f0 5 1 t g m l - 5 p g m l b a s e do nt h i s ，ah i g h l ys e n s i t i v em e t h o df o rp r o t e i n d e t e r m i n a t i o ni se s t a b l i s h e d k e y w o r d s ：p h o s p h a t e ；q u a n t u md o t s ；b o v i n es e r u ma l b u m i n ；r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ； f l u o r e c e n c e i n 河北大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了致谢。 作者签名：猩圈查连 日期： 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在：年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密。f ( 请在以上相应方格内打“4 ) 作者签名： 导师签名： 日期：三! 竺1 年上月兰鱼e 1 日期： 2 生1 2 年苎 月兰鱼 日 保护知识产权声明 ( 崔j 搁炳 ) ，是河北大学化学与环境科学学院的( 二oo - t , ) 届( 分：秆他勘研究生。 本人为获得河北大学( 铿学砍士) 学位证书所提交的题目为： ( 磷般纳未量子童稞耕1 钧龙掘尚散射分研 ) 的( 旅士) 学位论文，是我个人在导师( 橱教授) 指 i 导并与导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得的研究成果是在 河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完 全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法 律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本人以任何形式公开和传播科研成果和科研工作 时，包括发表的学术论文、学术交流、科技咨询和科技成果转让等行 为时，如果涉及到本论文所包含的研究内容和研究成果，本人将征得 指导教师( 霹皿平 教授) 和河北大学的书面同意和授权。如果 v i 违反本声明，本人承担法律责任。 声明人：签名( 章) 崔朋娟 日期：2 。0 1 辛岁只2 6 曰 第1 章引言 第1 章引言 在天然水和废水中，磷几乎都以各种磷酸盐的形式存在，它们分为正磷酸盐、缩合 磷酸盐( 焦磷酸盐、多磷酸盐和偏磷酸盐) 和有机磷酸盐( 如磷脂等) ，广泛存在于溶 液中、腐殖质粒子中或水生生物中。一般天然水中磷酸盐含量不高。化肥、冶炼、合成 洗涤剂等行业的工业废水及生活污水中常含有大量的磷。磷是生物生长的必需元素之 一，但水中磷含量过高，可造成藻类的过度繁殖，直至数量上达到有害的程度( 称为富 营养化) ，水体由于藻类的大量繁殖和腐烂分解，消耗水中的溶解氧，使鱼类等水生生 物死亡，造成河流、湖泊透明度降低，水质变坏i l 】。 水体富营养化及其引起的“水华”“赤潮 的发生，现已成为全球性的环境问题【2 1 ， 由于饮用发生水华的淡水引起家禽、家畜和野生动物死亡的事件时有报道【2 】，如北美的 五大湖区、欧洲瑞典的莱茵河水域、日本的濑户内海及琵琶湖等水域先后出现水质富营 养化现象。我国在“七五 期间，国家环保部门对我国主要湖泊、水库的富营养化问题 进行了全面调查，调查发现大部分湖泊、水库均存在不同程度的富营养化现象，如我国 著名的第四大淡水湖一巢湖、第六大淡水湖一滇池，以及许多市郊湖泊已发展到富营养 化甚至严重富营养化程度。近几年来，我国渤海、黄海、东海、南海等周围海域均出现 过大面积的“赤潮 现象。随着工业化、城市化进程的进一步加快，我国对可利用水资 源的需求量也越来越大。据报道，中国目前年总缺水量约为3 6 0 亿m 3 , 而这其中有6 0 7 0 是由污染造成的可利用性水资源短缺1 3 ，4 】。鉴于磷的排放会造成水资源的恶化，许多国 家已制定了严格的环保法规，控制磷的排放量，我国政府为了进一步落实可持续发展战 略，控制环境进一步恶化，目前正在加强有关方面的立法工作，水中磷含量已正式列入 环境监测项目，并且制订了环境质量标准和污水排放标准，作为水质评价的重要指标。 量子点是近几年发展起来的新型纳米材料，是直径在2 - 2 0n m 的一类半导体纳米粒 子，具有宽的激发光谱、窄的发射光谱、可精确调协的发射波长、可忽略的光漂白等优 越的荧光特性，可以很好地用于荧光标记，成为一类理想的生物荧光探针。随着研究的 逐步深入，将量子点用于生物标记，在药物筛选、细胞示踪、流式微流控芯片免疫分析、 快速诊断增敏等方面的研究与应用正蕴涵着突破性的潜能，量子点已成为分析科学中一 个新兴的、前沿的、最为活跃的研究领域。 1 河北大学理学硕士学位论文 1 1 磷分析检测方法的进展 水中磷的测定，通常按其存在的形式而分为测定总磷、溶解性正磷酸盐和总溶解性磷， 如图1 1 一l 所示 图1 1 1 测定水中各种磷的流程图 水中的缩合磷酸盐和有机磷酸盐通过消解可以转化为正磷酸盐。正磷酸盐的测定有 钼锑抗光度法、离子色谱法、氯化亚锡还原钼蓝法、孔雀绿一磷钼杂多酸法、罗丹明6 g 荧光分光光度法等。下面对主要方法简要叙述： 1 1 1 钼锑抗分光光度法 在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸铵、酒石酸锑钾反应，生成磷钼杂多酸，磷钼杂多 酸被还原剂抗坏血酸还原，生成蓝色络合物磷钼蓝。利用分光光度法测定。该方法最低 检出浓度为0 0 1m g l ；测定上限是0 6m g l 。可适用于测定地表水、生活污水及化工、 磷肥、机加工金属表面磷化处理、农药、钢铁、焦化等行业的工业废水中的正磷酸盐分 析。在环境监测中是水样中磷的测定标准方法。但是该方法灵敏度较低，络合物稳定时 间短，给测定带来一定的困难f 5 l 。 1 。1 2 离子色谱法 离子色谱法利用离子交换的原理，可以连续对多种阴离子进行定性和定量分析。以 碳酸盐碳酸氢盐溶液为流动相，基于待测阴离子对低容量强碱性阴离子树脂( 分离柱) 的相对亲和力不同而彼此分开，被分开的阴离子，在流经强酸性阳离子树脂( 抑制柱) 室时，被转换为高电导的酸型，碳酸盐碳酸氢盐则转变成弱电导的碳酸。用电导检测 第l 章引言 器测量被转变为相应酸型的阴离子，与标准进行比较，根据保留时间定性，峰高或峰面 积定量。一次进样可连续测定六种无机阴离子。检出限( 电导检测器的量程为1 0p s ， 进样量为2 5l x l 时) 为0 1 2m g m l 。但离子色谱法设备昂贵，操作过程复杂，且灵敏度 较低【5 。 1 1 3 孔雀绿一磷钼杂多酸分光光度法 在酸性条件下，利用碱性染料孔雀绿与磷钼杂多酸生成绿色离子缔合物并以聚乙烯 醇稳定显色液，直接在水相用分光光度法测定正磷酸盐。其摩尔吸光系数为 l x l 0 5 l ( m o l c m ) ，最低检出浓度为1p g 几，适用的范围为o o 3m g l 。适用于河流、湖 泊、水库等地表水及地下水中磷( 总磷、溶解性正磷酸盐和溶解性总磷) 的测定。但是 用于痕量磷的检测，还需要在检测结果的准确性、抗干扰性，显色剂的稳定性等方面作 进一步的改进【6 7 】。 1 1 4 氯化亚锡还原钼蓝法嘲 该方法原理基本与铝锑抗分光光度法相同，在酸性条件下，正磷酸盐与铝酸铵反应， 生成磷钼杂多酸，被还原剂氯化亚锡还原，生成蓝色络和物磷钼蓝，室温放置1 5m i n 后， 分光光度法测量。但是该法灵敏度较低，干扰也较多。 1 1 5 罗丹明6 g 荧光淬灭法嘲 在十二烷基苯磺酸钠存在下，吖啶橙与罗丹明6 g 能够发生有效的能量转移，使罗丹 明6 g 荧光大大增强；在酸性条件下，正磷酸根与钼酸胺反应生成磷钼杂多酸，磷钼杂多 酸与罗丹明6 g 形成离子缔合物，使罗丹明6 g 的荧光淬灭。测定范围为0 0 5 , - - 0 7 0 鹇l ， 检出限是5n g l 。灵敏度高。 1 。1 。6 流动注射分光光度法 在酸性条件并有锑盐存在下，正磷酸盐与钼酸铵反应生成磷钼杂多酸并立即由抗坏 血酸还原，生成蓝色络合物磷钼蓝，进行光电比色检测。利用流动注射分析技术法测定 总磷的系统分为多通道系统( 1 锄和单通道系统【l l 】，多通道系统的精确度和灵敏度不高，而 且多通道流量不易控制；单通道系统重现性好精确度高，适合在线连续检测，但是测定 灵敏度需进一步提高。 河北大学理学硕士学位论文 1 1 7 交流示波极谱滴定法 在六次甲基四胺一盐酸缓冲溶液中，用硝酸铅滴定磷酸根，生成磷酸氯化铅复盐沉 淀 1 2 , 1 3 ，根据过量的铅离子在交流示波极谱图上切1 2 1 出现指示滴定终点。根据消耗的硝 酸铅体积可求出样品中磷的含量。该方法准确性好，操作简便，灵敏度低，可用于高含 量磷的测定。 1 1 8 电感耦合等离子体发射光谱法( 1c p a e s 法) n 铂 该方法原理是利用等离子体发射光谱，注入磷溶液，雾化，以i r i 全谱直读等离子 体光谱仪检测。具有线性范围宽、灵敏度高、检出限低、化学干扰低，样品用量少等优 点。但是仪器太过昂贵，不能普及。 1 1 9 萃取分光光度法n 5 1 在钼酸铵分光光度法的基础上，利用磷钼杂多酸在有机相正丁醇中溶解度高的特 点，萃取分离富集水中磷，操作时将正丁醇溶液加入磷钼杂多酸溶液中，萃取分离后， 以正丁醇为参比液测定有机相吸光度。该方法简便、快速，可满足湖泊水库营养化调查 的需要，但是由于在萃取分离过程中，存在水样中部分磷损失的现象，测定准确度不高。 1 1 1o 鲁米诺化学发光法伽 在阳离子表面活性剂存在下，利用纸过滤器对磷铝杂多酸进行吸附预富集，然后与 碱性鲁米诺溶液反应产生化学发光。检测限为0 0 2 r l g l 磷，线性范围为o 0 6 - 1 7 i _ t g l 磷。 没有表面活性剂存在时，检测限是0 。l i _ t g l 磷，分析时f a - j 为2 5 m i n 。此时对s i 4 + 和a s 5 + 的选 择性是标准比色法的5 倍和4 0 倍。应用于环境水样的测定，取得满意的结果，灵敏度较 高，但操作较繁琐。 1 1 11 共振光散射( r l s ) 法 共振光散射技术是一项在普通荧光分光光度计上进行测量的光散射技术，它在物理 化学、胶体化学和高分子化学研究中有十分重要的地位。当瑞利( r a y l e i g h ) 散射的波 长位于或接近于分子的吸收带时，其散射程度将不再遵守瑞利散射定律并且某些波长的 散射程度急剧增强，这种现象成为共振瑞利散射。共振光散射作为瑞利散射的一种特殊 形式和分子的吸收带有关。但是，共振光散射光谱并非普通的共振瑞利散射，它还有其 他复杂的光散射成分如丁达尔( t y n d a l l ) 散射等。本文成功地将传统的钼锑抗分光光度 4 第1 章引言 法与共振光散射技术相结合，测定了水中的磷。检出限( 3 0 ) 为0 7 6p g l 。线性范围为 2 o 4 0 0h g 几本法灵敏度比钼锑抗分光光度法提高一个数量级。由此建立了一种简单、 灵敏的检测磷的方法。 1 1 1 1 1 共振光散射理论基础 光散射现象及其分类： 光散射是指一束光线通过介质时，在入射光方向以外的各个方向都能观测到光强的 现象。光是一种电磁波，传播时其交变的电磁场与介质分子发生强烈的相互作用。如果 这些分子是可极化的，就会被诱导产生以电磁场的频率振荡着的电偶极子。根据电磁理 论，振动着的电偶极子是一个二次波源，向各个方向上发射的电磁波就是散射波【1 7 】。如 果介质是完全均匀的，各个粒子的散射光将因相互干扰而抵消：如果介质是光学上不均 匀的，分散项与分散介质折光指数相差较大，则产生的诱导偶极距不同，次级辐射波不 能抵消，这就出现光散射现象。 介质中粒子大小不同，会产生不同的散射。当介质中的粒子直径远大于入射光波 长时，产生的散射可看成是反射和折射；当介质中的粒子直径与入射光波长相近时，将 产生丁达尔散射。混浊介质是一种典型的不均匀结构，乳状液、悬浮液、胶体溶液等都 是这样的体系。其中含有许多大质点，其折射率跟周围的均匀介质的折射率显然不同。 它们所引起的光散射即是丁达尔散射；当介质中的粒子直径小于入射光波长时 ( d 鱼2 0 ) ，便产生以瑞利散射为主的分子散射。一般情况下，分子散射比丁达尔散射 要小得多。 根据入射光与散射光的能量间的关系，散射现象又可分为弹性散射和非弹性散射。 在散射过程中没有能量变化( 即没有频率位移) 的称为弹性光散射( e l a s t i cl i g h t s c a t t e r i n g ) ，也常称为经典光散射( c l a s s i c a ll i g h ts c a t t e r i n g ) 或静态光散射。在散射过程 中发生能量变化( 即产生频率位移) 的称为非弹性散射( i n e l a s t i cl i g h ts c a t t e r i n g ) 。 对于弹性光散射，如果产生散射现象的质点是静止的，则散射光频率与入射光频率 严格相等，散射光强度是一个恒值。但实际情况并非如此，质点不停地作布郎( b r o w n ) 运动。由多普勒( d o p p l e r ) 效应可知，对处于静止参考系中的观察者来讲，质点辐射的 次波频率与其运动速度有关。结果是散射光以入射光频率为中心而展宽。此现象称为准 弹性散射( q u a s i - - e l a s t i cl i g h ts c a t t e r i n g ) 或动态光散射( d y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g ) 。 河北大学理学硕士学位论文 根据产生光散射的粒子相对于入射辐射波长的大小以及粒子相对于周围介质折射 率，弹性散射又可分为瑞利散射，得拜( d e b y e ) 散射和大粒子散射( 或m i e 散射) ，得拜 散射也常被称为瑞利一得拜( r a y l e i g h - - d e b y e ) 散射。 在非弹性散射中，最主要的是拉曼( r a m a n ) 散射。除了拉曼散射，在各向同性体系 中，因热激发引起的密度涨落( 可被认为是热激发的声波) ，也会引起散射光频率的变化， 这种非弹性散射称为布里渊( b r i l l o u i n ) 散射。布里渊散射和准弹性散射所产生的频移都 非常小，用一般的光谱仪是不能将其与弹性散射分辨开的。所以用普通的荧光仪或光散 射仪所测得弹性散射其实包含了布里渊散射和准弹性散射。 瑞利散射基础理论： 将尺寸比入射光波长小得多的散射质点看作是点散射源；假设质点的散射属于不相 干散射，即单位体积的散射光强是其中各质点散射的简单加和：且入射光波长远离散射 质点的吸收带，不考虑光的吸收的前提下，r a y l e i g h 从讨论个别质点的散射出发，给出稀 溶液散射光强的公式f 1 8 】： 褂9 ； 厂 2 n 几v 2 ( n _ 2 - 镪n 0 2 r ) 2 ( 半：| 式中堤单位散射体积在散射角为护，距离为，处的散射光强；l o 是入射光强，九是入 射光在介质中的波长，刀。和分别是分散相与介质的折射率，为单位体积中的散射质点 数，曜散射质点的体积。 上式表明：( 1 ) 瑞利散射光强度与妒成反比，即短波长的光的散射比长波长的光强 得多；( 2 ) 玎。一抑。的值越大，散射越强；( 3 ) 分散相粒子体积越大，单位体积的粒子数 越多，散射越强，这一点可作为定量分析的基础。( 4 ) 1 + c o s 2 矽与采用非偏振入射光有 关。前一项代表散射光的垂直偏振分量，后一项代表水平偏振分量。 瑞利散射理论是从计算个别质点的散射出发，其关键是要求各个分子相距足够远， 以便可以被作为独立的散射源。所以瑞利散射理论只适用于气体或极稀的溶液体系。对 于一般溶液来说，由于分子间的距离很短，从不同质点发射的散射光有强烈的干涉作用， 6 第1 章引言 瑞利散射理论会产生较大的偏差。 共振光散射基础理论： 当瑞利散射的波长位于或接近于分子的吸收带时，其散射程度将不再遵守瑞利散射定 律并且某些波长的散射程度急剧增强，这种现象成为共振瑞利散射( r c s o n a l l c er a y l e i g h s c a t t e r i n g ，r r s ) 1 9 】。公式( 1 ) 经过进一步的推导，得到公式( 2 ) ： ，= 篙筹b 黪 + 掣) 1 0 0 。c ( 2 ) 式中是真空中入射光和散射光的波长，九是整个分子吸收带中的任意波长，刀为均 匀介质的平均折光指数，c 是溶液的物质的量浓度，( 九) 为所研究波长处的摩尔吸光 系数，n a 是阿夫加德罗常数，v 是散射粒子的体积。 当测定条件一定时，( 2 ) 式中只有c 为变量，该式可化简为： 卢k c ( 3 ) 由式( 2 ) 、( 3 ) 可看出光散射强度与散射粒子浓度成正比，这是共振瑞利散射法测定 物质浓度的定量基础。由于共振瑞利散射具有瑞利散射和电子吸收光谱的双重特性，灵 敏度与选择性都有所提高，在很大程度上弥补了瑞利散射信号水平低的缺陷，可以用于 稀溶液中的分子研究。共振光散射理论主要是从共振瑞利散射增强的角度出发的，有时 也称共振光散射为共振瑞利散射。但是共振光散射光谱并非单纯的共振瑞利散射，它还 含有其他复杂的光散射成分，比如丁达尔散射等。其成分的多少取决于散射粒子的大小、 激发和发射波长及仪器的狭缝宽度。 共振光散射的研究不需要专门的仪器，在普通的荧光分光光度计上选择合适的激发 和发射通带宽度，采用相等的激发和发射波长同时扫描激发和发射单色器所得的同步光 谱( o p a x = 0 ) ，即为光散射粒子的共振散射光谱【2 0 1 。由于共振光散射光谱属于同步光谱， 可看作散射粒子是能发射出与激发光相等波长的发光体，故而共振光散射信号属于同步 发光。根据同步发光方程【2 l 】： i s l = k c b e c x ( 九眈) 展m ( 入戗+ ” ( 4 ) 河北大学理学硕士学位论文 ( 4 ) 式中如是在给定激发光波长处( h x = h m - 九) 的激发函数，最m 是在对应的发 射波长处( k = k x + 九) 的发射函数，k 是与仪器条件常数有关的常数，b g 液池厚度。 当入= o 时，即得共振光散射强度为【2 1 】： & l s = k c b e e 。( 入铡) 层m k x ( 5 ) 由公式( 5 ) 可知在仪器条件一定时，共振光散射强度与散射粒子的浓度c 成正比， 据此可以用于散射粒子的分析测定。 但是，通常由荧光分光光度计或散射光谱仪所得到的散射光谱只是一个表观的光 谱，它受到多种因素的影响。( 1 ) 由于散射光谱是在激发光与散射光波长同步变化( 九 = 0 ) 的情况获得的，散射光谱受仪器特性( 尤其是光源的发射能量随波长的变化) 的 影响更大；( 2 ) 当s t o k e s 位移很小，而分子的荧光较强时，分子在激发与发射波长同步 的情况下也会产生较强的荧光发射，它将叠加在散射光谱上而使之变形。( 3 ) 由于分子 吸收带与共振散射光谱峰之间的波长差别较小，当分子吸收较强时，分子的吸收对散射 光谱影响很大。经常会出现散射光谱对应于分子最大吸收波长处呈现一个峰谷，以至使 散射光谱变形，甚至出现最大散射波长明显地红移【2 2 1 。经校正仪器特性的影响和分子吸 收对光谱的影响后，共振散射光谱特征应该是具有波长选择性的、与分子吸收带相关的 一个明显的光谱峰【2 3 】。 1 1 1 1 2 共振光散射技术在分析化学中的应用 1 9 9 6 年，黄承志等人利用卟啉在核酸上聚集组装时产生的增强的共振光散射信号与 生物大分子浓度间的线性关系，建立了共振光散射技术定量测定生物大分子的新分析方 法f 2 4 ，2 5 1 。之后共振光散射技术因其操作简便、灵敏度高而受到广大学者的关注，目前已 经广泛应用于核酸、蛋白质、药物、纳米粒子、表面活性剂、金属离子等的分析研究中。 共振光散射首先被应用于核酸的分析中。水溶性卟啉试剂( m e s o - 四( 对一三甲基氨基) 卟啉，简称t a p p ) 是首先被用作核酸光散射分析的染料。它是一个带正电的大环共轭荷 分子。t a p p 及质子化t a p p 在核酸表面长距离组装，导致核酸超螺旋结构的形成。在 超螺旋结构中，堆积在核酸表面的卟啉分子结合产生了染料分子的高线性密度，导致了 有效的电子激发离域，共振光散射增强就是由于这种核酸超螺旋结构中电子激发离域所 第1 章引言 引起的【2 4 1 。用于测定小牛胸腺d n a 时，在p h7 4 8 、波长4 3 2n l n 附近产生特征共振光 散射峰，检出限达纳克级。 c o ( i i ) 5 c 1 p a d a b 分子含有大的共轭体系和高的摩尔吸光系数，当它结合于核酸 分子上时，能在核酸分子上进行堆积，由于“生色团 的聚集作用而产生强的r l s 信 号。在碱性条件下q h1 1 5 1 2 o ) ，在5 4 7n m 处产生强烈的共振光散射峰，据此可用于 纳克级核酸的测定，方法灵敏度高【2 5 】。 李正平等将大粒子散射( 直径在2 0 0 7 0 0n m ，其散射光的性质属于d e b y e 散射和m i e 散射) 技术用于核酸的共振光散射分析，效果很好。在0 1t o o l l 的h c l 、h 2 s 0 4 或h n 0 3 【2 6 】 溶液中，核酸首先变性，然后单链核酸聚集成尺寸相当于紫外一可见光波长的大粒子。 由大粒子产生的共振光散射强度在一定范围内与核酸的浓度成正比，该法操作简便、灵 敏度高、应用前景广泛。在酸性介质( p h2 2 4 4 ) b r i t t o n r o b i n s o n ( b - r ) 缓冲溶液中， 核酸和硫酸鱼精蛋白【2 7 】也能通过静电引力结合在一起，导致r l s 急剧增加，最大r l s 峰 位于3 6 5n n l 处。检测d n a 的线性范围在o 0 5 6 0 0m g l ，检出限分别是：小牛胸腺d n a ， 1 2 5 g l , 鱼精子d n a ，9 0 g l ；酵母r n a ，1 8 0 肛g l 。蛋白质、核苷酸和常见金属 离子的干扰都很小。同理，在酸性介质中( p h4 5 6 5 ) ，带正电荷的组蛋白也成功地用作 核酸的共振光散射探针【2 8 】，随着核酸的加入，在5 5 1n i n 处产生特征共振光散射增强峰。 近来，蛋白质的共振光散射测定法报道较多。基于品红酸与蛋白质相互作用在2 7 7 0 n n l 出产生的共振光散射峰，建立了一种灵敏的蛋白质分析方法，对于牛血清蛋白( b o v i n e s e r u ma l b u m i n ，b s a ) 、人血清蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i mh s a ) 、溶解酵素均可检测 到纳克级，并应用于体液样品中蛋白质的分析中【2 9 1 。基于f a s tg r e e n ( f c f ) 【3 0 1 、聚苯乙 烯一丙烯酸纳米粒子【3 1 1 、富勒烯【3 2 1 、派若宁y - s d s 体系3 3 1 等与蛋白质相互作用导致共振 光散射增强的蛋白质分析方法相继建立。 生化药物的r l s 分析法近年来也屡见报导，其原理基于染料试剂与药物分子通过 静电引力和疏水作用力发生电荷转移作用，形成离子缔合物导致强烈增加的r l s 信号。 与常见的生化药物分析方法分光光度法、荧光光度法相比，r l s 技术更灵敏。已报导的 有关生化药物的r l s 法主要涉及如下药物：肝素 3 4 , 3 5 l 、多糖3 6 , 3 7 】、硫酸奎宁、盐酸小 檗碱【3 8 , 3 9 】、四环素 4 0 , 4 1 1 等。 r l s 技术也广泛应用于金属离子和表面活性剂的分析检测中，金属离子r l s 探针有 河北大学理学硕士学位论文 罗丹明6 g 、结晶紫、孔雀石绿、亮绿、碘绿等三苯甲烷类染料，可以测定纳克级的金 属离子如h g ( i i ) 、c r ( 1 1 i ) 、s e ( ) 、m o ( v ) 等 4 2 捌】；表面活性剂r l s 检测探针常见的 有曙红y 【5 2 - 5 3 】等。 综上所述，共振光散射技术只需在普通的荧光分光光度计上进行操作，便可获得很 高的灵敏度、很低的检出限，可以与常用的荧光法相媲美。在近1 0 年来共振光散射技术 得到了飞速的发展。随着r l s 技术的进一步发展，其存在的一些问题也逐渐显现出来。 r l s 技术基于本体溶液测定，无法消除溶液中共存物质的光散射信号的干扰；r l s 信号 不稳定、重现性差、主要应用于形成稳定聚集体或微粒的的稳定体系研究，限制了不稳 定分析试剂在r l s 技术的应用，未能实现非平衡状态下的动态实时监测及在线和原位分 析。目前针对r l s 技术的现状，已产生了许多新的共振光散射光谱分析技术。如三维光 散射技术f 5 4 】、共振光散射成像技术1 5 5 1 、液液界面全内反射一共振光散射( t i r r l s ) 技 术【5 6 瑚】、后向光散射分析技术5 9 】等。这些新技术弥补了原有r l s 技术的不足之处，将r l s 技术的应用范围进一步扩大。 1 2 量子点在生化分析中的研究进展 半导体量子点，即一种特殊的纳米粒子，也称纳米量子点或半导体纳米微晶 ( s e m i c o n d u c t o rn a n o c r y s t a l ) ，简称为量子点( q u a n t u md o t s ) ，它是纳米尺度原子和分子 的集合体，一般粒径范围在2 2 0n m 。顾名思义，量子点即是将材料的尺寸在三维空间 进行约束，并达到一定的临界尺寸( 抽象成一个点) 后，材料的行为将具有量子特性( 类 似在箱中运动的粒子) ，结构和性质也随之发生从宏观到微观的转变。荧光量子点是在 受到光激发或加上电压后会产生强的荧光发射的一类纳米材料，i i 一族半导体( 如 c d s e 、c d s 、z n s 等) 和i i i v 族( 如i n p 、i n a s 等) 的量子点都是常见的荧光量子点。 由于其独特的光学和电子学性质，从物理到生物、化学、从材料科学到电子工程学量子 点的应用已迅速扩展到更多的领域。 1 2 1 荧光量子点的光学特性 1 9 9 8 年美国加州伯克利大学的a l i v i s a t o s t 6 0 1 小组和印第安纳大学i 拘n i e 6 1 】小组同时在 s c i e n c e ) 上发表了相应的研究结果，突破性地解决了量子点作为生物探针的生物相容 性问题，成功地把与生物大分子偶连的量子点应用于活细胞分析，拉开了荧光量子点在 生物技术中应用研究的序幕。作为新型的荧光标记物，量子点的优点主要体现在以下几 1 0 第1 章引言 个方面： ( 1 ) 量子点是无机半导体材料，其激发谱为连续谱带，用高于带隙能量的光均可 激发，而发射谱较窄，通常大约在2 0n l l l 左右。相反传统的有机染料具有窄的激发谱和 宽的发射谱，在进行多色标记时，有机染料宽的发射峰往往会使信号重叠难以区分，很 难或无法实现多组分同时检测并导致检测灵敏度下降，而荧光量子点利用单波长激发就 可以完全满足多组分标记同时检测的要求。 ( 2 ) 量子点的荧光强度和光稳定性要远高于有机染料分子，特别是核壳型纳米量 子点( 女n c d s e z n